專利名稱：衍生自cap18的抗菌肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌化合物，其抑制或殺滅包括格蘭氏陰性細(xì)菌和真菌的微生物。另外，該化合物對(duì)于毒素并且尤其對(duì)于真菌和細(xì)菌毒素如脂多糖(LPS)或脂磷壁酸質(zhì)(LTA)具有親和力，以及該化合物可抑制或使這樣的毒素?zé)o效。此外，本發(fā)明涉及該化合物的治療和診斷應(yīng)用，以及涉及包括該化合物的藥物組合物及其給藥方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代的藥物療法在抗擊細(xì)菌感染方面已經(jīng)非常成功，直至上世紀(jì)中葉，細(xì)菌感染通常是引起過(guò)早死亡的主要原因之一。然而，最近，由于持續(xù)增加的細(xì)菌抗藥性，已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)廣泛使用高度有效抗生素的日益增加的關(guān)注。事實(shí)上，在過(guò)去的25年中，對(duì)大范圍的抗生素化合物的抗生素抗藥性-尤其是多種抗藥性實(shí)質(zhì)上在所研究的每種細(xì)菌中都已增大。目前認(rèn)為，不受一般抗藥性機(jī)制影響的最先進(jìn)劑型的抗菌劑是利用似乎選擇用于多藥抗性突變體的化合物。
基于這種開(kāi)發(fā)，在農(nóng)業(yè)和人類醫(yī)藥兩方面，專家推薦使用抗生素要比過(guò)去要遠(yuǎn)遠(yuǎn)嚴(yán)格得多。例如，小部分感染-尤其是即使通常不是由細(xì)菌引起的感染如感冒，就不應(yīng)該用抗生素進(jìn)行治療，而是應(yīng)當(dāng)將其保留用于更嚴(yán)重的癥狀。此外，有必要開(kāi)發(fā)用于治療細(xì)菌感染的具有完全不同類型的藥物活性的新化合物，優(yōu)選具有部分不依賴于對(duì)普通抗生素的細(xì)菌抗藥性的活性。
在其中廣泛使用抗生素引起爭(zhēng)論性討論的癥狀之一是極性形式或慢性形式的中耳炎。已證實(shí)，患有滲出性中耳炎(OME)(即，一類特征在于在沒(méi)有極性感染癥狀的情況下中耳中存在液體的耳炎)的患者數(shù)量對(duì)于早期急性中耳炎(AOM)在引入抗生素療法后顯著增加，表明抗生素本身參與了OME。(Lim et al.，Laryngoscope92，278-286，1982)。認(rèn)為諸如青霉素的抗生素干擾局部免疫應(yīng)答的形成，如利用在中耳中的局部IgM的生成(Howie et al.，Ann.Otol.Rhinol.Laryngol.85Suppl.25，18-19，1976)。傳統(tǒng)抗生素療法的另一缺點(diǎn)在于殺滅了細(xì)菌，但其毒素仍然是活性的。
已表明，對(duì)于治療這些和其它由細(xì)菌或真菌感染導(dǎo)致的癥狀，可以有利地使用這樣的化合物，該化合物不是殺滅微生物或細(xì)菌本身而是使其毒素?zé)o效并且允許天然宿主防御機(jī)制控制感染的傳播(Nell，The Role of Endotoxinin the Pathogenesis of Otitis Media With Effusion，PhD Thesis，Leiden，1999)。同時(shí)，這種方案有利于受損粘膜功能的快速恢復(fù)。
在大量感染的癥狀如中耳炎中涉及的細(xì)菌毒素如真菌毒素并且尤其是細(xì)菌毒素之中的主要作用是通過(guò)內(nèi)毒素來(lái)實(shí)施的，內(nèi)毒素是在格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的一類脂多糖(LPS)，由結(jié)合有高毒性脂質(zhì)部分(脂質(zhì)A)的多糖組成。用于治療OME的最新治療方法之一是給予使內(nèi)毒素或LPS無(wú)效的化合物(Nell，ibid.)。
能夠使內(nèi)毒素或LPS無(wú)效的各種化合物目前是已知的。例如，已開(kāi)發(fā)了多種抗內(nèi)毒素抗體，如HA-1A和E5(分別為人類和胞壁單克隆IgM抗體)。已證實(shí)這些抗體提高患有某些重癥如敗血病性休克的患者的存活率(Ziegler etal.，New Engl.J.Med.324，429-436，1991)。然而，其活性和特異性被認(rèn)為是不滿意的。
另一類對(duì)內(nèi)毒素是活性的物質(zhì)衍生自人內(nèi)源性蛋白，稱為細(xì)菌可滲透性增加的蛋白(BPI)，其被儲(chǔ)存在中性白細(xì)胞的嗜天青顆粒(Gazzano-Santoro et al.，Infection and Immunity6011，4754-4761，1992)為強(qiáng)陽(yáng)離子蛋白的BPI不僅使游離內(nèi)毒素?zé)o效，而且本質(zhì)上通過(guò)增大其外膜的滲透性來(lái)抑制或殺滅細(xì)菌細(xì)胞。BPI是真正有效的天然抗生素，由LPS和一些包括腫瘤壞死因子(TNF)的其它引發(fā)物的存在所引入的。然而，其大部分活性與合成它的免疫細(xì)胞，即多形核白細(xì)胞巨噬細(xì)胞有關(guān)。
也已開(kāi)發(fā)了若干種衍生自BPI的重組蛋白，如rBPI23(Kohn etal.，1993)和rBPI21(Horwitz et al.，1996)，其較大程度地代表了分別具有分子量為23kDa和21kDa的BPI的N-末端部。例如，在WO-A-00/71149中已描述了BPI和BPI衍生化合物在治療OME中的應(yīng)用。
具有抗菌活性的天然化合物的另一家族是cathelicidin，一類由呼吸上皮細(xì)胞(肺泡巨噬細(xì)胞)和其它組織所產(chǎn)生的肽。以其天然形式，這些化合物是線性、α-螺旋、無(wú)半胱氨酸的肽或蛋白。Cathelicidin是陽(yáng)離子性的并且包括高度保守的信號(hào)序列和正面區(qū)域(cathelin區(qū)域)。然而，其編碼成熟肽的C-末端結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出基本上的異質(zhì)性(heterogeneity)。該肽具有12至80個(gè)氨基酸。
最著名的人cathelicidin是18kDa陽(yáng)離子抗菌蛋白CAP18。CAP18的37C-末端氨基酸，即肽LL-37表示負(fù)責(zé)高親和力的結(jié)構(gòu)域并使對(duì)于LPS的形成能力無(wú)效(Sawa et al.，Antimicr.Agents Chemother.4212，3269-3275，1998)。已開(kāi)發(fā)和測(cè)試了衍生自CAP18或LL-37的若干截短肽，如由Sawa(Sawaet al.，ibid.)、Gutsmann(Gutsmann et al.，Biophys.J.80，2935-2945，2001)以及在美國(guó)專利第6,040,291號(hào)中所披露的那些截短肽。通常，相對(duì)較小的肽優(yōu)選諸如CAP18的蛋白作為用于治療用化合物的首選，這有幾個(gè)原因，首先，它們可以更易于被優(yōu)化、調(diào)整和修飾以保留或增加其希望的活性和特異性；其次，它們易于獲得或合成，因而更易于得到；再次，它們易于配制和遞送，由于蛋白質(zhì)在非腸胃外給藥后經(jīng)常是不穩(wěn)定的和非生物可利用的。
臨時(shí)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/NL2004/00060(將其內(nèi)容結(jié)合于此作為參考)披露了肽化合物，其對(duì)細(xì)菌和真菌毒素如LPS和LTA具有親和力。該化合物包括氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6(在下文中，也稱為核心氨基酸序列)，其中X1表示序列的N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，以及X6表示C-末端部；并且其中，該核心序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被衍生化。該序列的進(jìn)一步特征在于N-末端部被乙?；?，和/或C-末端部被酰胺化，和/或該氨基酸序列不同于X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。
所述專利申請(qǐng)進(jìn)一步描述了用于制備這樣的化合物的方法。該方法包括氨基酸單體或寡聚物的化學(xué)和酶促連接以裝配該化合物。它們還包括在宿主細(xì)胞中編碼該化合物的核酸序列的表達(dá)，其中利用用于通過(guò)該核酸序列來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的載體。一種根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的用于制備化合物的方法，其中氨基酸單體、氨基酸寡聚物、或氨基酸類似物或模擬物的單體或寡聚物通過(guò)化學(xué)或酶促連接進(jìn)行裝配，這在液相中和/或功能化固相的界面處進(jìn)行。
已發(fā)現(xiàn)這些化合物在處理與感染相關(guān)或由感染所導(dǎo)致的癥狀中很有用。已表明它們?cè)谥委熒媳仍谥委熌承┞愿腥救缰卸字械膫鹘y(tǒng)抗生素更有用。然而，在嚴(yán)重急性感染的情況下，仍然認(rèn)為有效控制細(xì)菌生長(zhǎng)是必不可少的，而這是通過(guò)給予抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

發(fā)明內(nèi)容
盡管有現(xiàn)有技術(shù)中的工作，但是對(duì)于在感染疾病(包括系統(tǒng)或局部細(xì)菌和真菌感染)的預(yù)防性或治療性治療中仍然需要加以改進(jìn)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的療法，該療法是安全、有效的，并且其導(dǎo)致有效控制感染性微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供不容易導(dǎo)致微生物抗藥性的療法。此外，本發(fā)明的目的是提供同樣減少傳統(tǒng)抗菌療法不希望的作用，如在體內(nèi)通過(guò)抗菌化合物殺滅微生物時(shí)所釋放的細(xì)菌毒素的毒性作用的療法。
基于以下描述，本發(fā)明的這些和其它目的將變得更清楚。
在第一方面，本發(fā)明提供了肽化合物在制備用于預(yù)防或治療性治療哺乳動(dòng)物的細(xì)菌或真菌感染的藥物中的應(yīng)用，其中該化合物包括氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中X1表示N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，以及X6表示C-末端部。該核心序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被可選地衍生化。此外，N-末端部被乙?；?，和/或C-末端部被酰胺化，和/或該氨基酸序列不同于天然氨基酸序列X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。
驚人地發(fā)現(xiàn)，這樣的化合物不僅具有對(duì)于脂多糖(LPS)或脂磷壁酸質(zhì)(LTA)的親和力，而且具有直接抗菌或殺菌活性。也就是說(shuō)，這些化合物可用于制備殺滅細(xì)菌和真菌的藥物。該化合物具有殺菌和殺真菌活性。借助這種活性，該化合物可治療性地用作抗生素，即使在不能用僅能夠使細(xì)菌毒素?zé)o效的化合物來(lái)治療的疾病和病癥中。這樣的疾病的實(shí)例是急性細(xì)菌或真菌感染，如敗血病性休克，眼、肝、腎、肺、支氣管、鼻或額竇、耳、陰道、尿道、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、脾、以及其它器官和組織的急性感染。
在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及適用于預(yù)防和/或治療類似細(xì)菌或真菌感染、或與細(xì)菌或真菌感染有關(guān)的疾病和病癥的藥物。
在下面的詳細(xì)敘述中以及所附權(quán)利要求書中將陳述本發(fā)明的其它方面。
具體實(shí)施例方式
驚人地發(fā)現(xiàn)，在臨時(shí)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/NL2004/00060中披露的肽化合物不僅使細(xì)菌毒素和真菌毒素如脂多糖(LPS)和脂磷壁酸質(zhì)(LTA)無(wú)效，而且具有顯著抗菌活性。這些化合物包括核心氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中X1表示該序列的N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，X6表示C-末端部；并且其中該核心序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被衍生化。此外，或者該序列的N-末端部被乙?；?，和/或C-末端部被酰胺化，和/或該氨基酸序列不同于X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。通過(guò)對(duì)細(xì)菌毒素的親和力，該化合物可被治療地用來(lái)處理與體內(nèi)存在這樣的毒素有關(guān)的病癥。然而，通過(guò)它們的直接抗菌活性，它們也可被用作或代替抗生素。該雙重活性使得這些化合物在單獨(dú)給藥和結(jié)合其它抗生素給藥時(shí)都非常有用，其中抗生素的不希望的副作用如耐藥性微生物的產(chǎn)生或在大量微生物在體內(nèi)被殺滅時(shí)釋放入體內(nèi)的細(xì)菌毒素的毒性作用可以被抑制或減輕。
在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中，術(shù)語(yǔ)“其中N-末端部被乙酰化”具有下面的意思。N-末端部通過(guò)與羧酸反應(yīng)以獲得連接有穩(wěn)定或保護(hù)基團(tuán)的酰胺而被保護(hù)。例如，有可能將肽與甲酸反應(yīng)而獲得甲酰基穩(wěn)定的肽；與乙酸反應(yīng)而獲得乙酰基保護(hù)的肽。該肽可進(jìn)一步與丙酸和其它在碳水化合物部分R中具有多達(dá)6個(gè)碳原子以及甚至多達(dá)10個(gè)碳原子的有機(jī)酸進(jìn)行反應(yīng)。在這些有機(jī)酸中，碳水化合物基團(tuán)是具有多達(dá)10個(gè)碳原子的R，可以是直鏈或支鏈，或環(huán)狀的和/或可以包含一個(gè)或多個(gè)不飽和部分。此外，烷基鏈可以被例如羥基、鹵素、氨基、巰基以及硫氧化物基團(tuán)所取代。因此，在N-末端部，可以存在下列基團(tuán)-C(O)-R’。可替換地，不是與羧酸反應(yīng)，而是可以用磺酸來(lái)進(jìn)行反應(yīng)以獲得相應(yīng)的磺酰胺鍵。因此，在N-末端部，可以存在基團(tuán)-SO2-R?？商鎿Q地，所述術(shù)語(yǔ)也涵蓋烷基化和二烷基化作用，以便在N-末端部可以存在仲或叔胺基團(tuán)-N-(R)1或N-(R)2，其中每個(gè)R具有上述的意思。
在更進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，“乙?；焙w肽與異氰酸酯或異硫氰酸酯(鹽)進(jìn)行反應(yīng)，在這種情況下，分別形成了脲或硫脲R-N-C(O)-或R-N-C(S)-，其中R如上文所定義。
最后，N-末端可由酸穩(wěn)定的封端基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，該基團(tuán)傳統(tǒng)地在肽合成過(guò)程中被引入，但現(xiàn)在將不會(huì)去除。熟知的封端基團(tuán)是Fmoc和Z-基團(tuán)。
至于術(shù)語(yǔ)“其中C-末端部被酰胺化”的意思將在下面進(jìn)行解釋。術(shù)語(yǔ)“酰胺化”意思是當(dāng)C-末端被基團(tuán)-X代替后自然存在的-OH，其中X是(i)-NY2基團(tuán)，Y獨(dú)立地為H、或R，其中R如上文所定義，或者兩個(gè)Y-基團(tuán)一起可以是與其連接的N-基團(tuán)一起的環(huán)狀部分，優(yōu)選存在至少一個(gè)R基團(tuán)；(ii)-OR基團(tuán)，其中R如上文所定義，或(iii)-R基團(tuán)。優(yōu)選酰胺化肽，因?yàn)樗鼈兙哂凶罡叩姆€(wěn)定性。
已發(fā)現(xiàn)，相比于從權(quán)利要求1排除的天然氨基酸序列，本發(fā)明的肽化合物(肽類化合物)具有最優(yōu)化的穩(wěn)定性。
肽化合物是肽如寡肽或多肽，蛋白質(zhì)或衍生自肽的物質(zhì)。超出肽本身，肽化合物還涵蓋肽類似物、肽衍生物、經(jīng)修飾的肽、以及肽軛合物。肽化合物具有共性，即它們包含氨基酸序列。更準(zhǔn)確地，肽被定義為通過(guò)將一個(gè)酸的氨基與另一個(gè)的羧基進(jìn)行結(jié)合而衍生自兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的酰胺(Merriam Webster Medical Dictionary 2001)。相反，肽化合物還可以指分子內(nèi)的肽結(jié)構(gòu)。通常，肽由天然存在的(L-)α-氨基酸，尤其是丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、以及纈氨酸(Val或V)所構(gòu)成。
肽的類似物或功能等同物是肽類分子，包含相同的活性，并且尤其是對(duì)微生物特別是對(duì)種類上而不必是數(shù)量上的細(xì)菌毒素的相同親和力，并且可以是例如經(jīng)修飾的肽、類肽(peptoids)、肽類似物和肽模擬物。
經(jīng)修飾的肽是通過(guò)引入通常在天然存在的氨基酸中不存在的取代基或功能基團(tuán)的衍生自肽的分子。該術(shù)語(yǔ)也包括通過(guò)肽與來(lái)自其它化學(xué)種類的分子(不管這些分子是否是天然存在或不是天然存在)進(jìn)行反應(yīng)而獲得的化合物。例如，經(jīng)常在自然界中發(fā)現(xiàn)磷酸化、磺化以及生物素化的肽、糖蛋白、以及脂蛋白，而用聚乙二醇修飾的肽是化學(xué)修飾的肽的實(shí)例，其被設(shè)計(jì)以改變部分但不是所有的肽的性能。
類肽(和肽一樣)也是肽化合物，它們也通常是兩種或更多種氨基酸的酰胺。然而，它們經(jīng)常不是直接衍生自天然存在的氨基酸，而是衍生自各種類型的化學(xué)合成的L-和/或D-氨基酸。
肽模擬物(以其最廣的意思)是在其功能結(jié)構(gòu)上或多或少類似于肽的化合物，但其在主鏈中還可以包含非肽鍵、或D-氨基酸。通常，肽模擬物在受體與酶的相互作用中用作天然肽的替代物(Pharmaceutical Biotechnology，Ed.D.J.A.Crommelin and R.D.Sindelar.Harwood Academic Publishers，1997，p.138)。假肽(pseudopeptide)(一類肽模擬物)是包含酰胺鍵異酯(isoester)而不是酰胺鍵的化合物(ibid.，PP.137-140)。
用于實(shí)施本發(fā)明的化合物還包括肽或功能等同物的鹽，如藥學(xué)上可接受的酸或堿加成鹽、以及加合物。它們還包括肽或功能等同物的多聚體。
此外，該化合物對(duì)至少一種毒素，并且尤其是細(xì)菌毒素具有親和力。在大量感染性疾病中，在疾病的表現(xiàn)中涉及細(xì)菌毒素，如在格蘭氏陰性細(xì)菌情況下的脂多糖(LPS)類和在格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌情況下的脂磷壁酸質(zhì)類。這些毒素可誘導(dǎo)實(shí)質(zhì)上的發(fā)炎反應(yīng)。例如，在上氣道感染中，發(fā)炎可以導(dǎo)致中耳或鼻竇上皮的粘膜損傷，致使粘膜纖毛清潔系統(tǒng)(MCS)(其為上氣道的主要防御系統(tǒng)之一)的損傷。對(duì)真菌或細(xì)菌毒素的親和力是任何無(wú)效作用能力的前提，并且優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物不僅結(jié)合至LPS和其它毒素，而且具有使這些毒素?zé)o效或抑制這些毒素的能力或者另外減少所述毒素的作用的能力。
在肽化合物滿足根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)要求時(shí)觀察到希望的對(duì)細(xì)菌和真菌以及對(duì)細(xì)菌和真菌毒素的活性類型，根據(jù)權(quán)利要求1，該化合物包括氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，
其中X1表示該序列的N-末端部，X2是K或E，X3是Q或E，X4是D或R，X5是N或E，以及X6表示C-末端部。這些堿性基序衍生自天然抗菌蛋白CAP18、或其本身衍生自CAP18的肽LL-37。
如本文所使用的，N-末端部是表示化合物N-末端部分或結(jié)構(gòu)域的基團(tuán)、原子、或序列，即連接至核心序列的末端α-氨基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，在該序列中不包含酰胺鍵。在游離α-氨基基團(tuán)的情況下，N-末端部可以簡(jiǎn)單地是氫原子；或者其可以由連接至末端α-氨基氮原子的化學(xué)基團(tuán)如酰基基團(tuán)構(gòu)成。其也可以表示較大基團(tuán)如兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的序列，或者不是由或不是單獨(dú)由氨基酸構(gòu)成的化學(xué)結(jié)構(gòu)。以類似形式定義C-末端部。
優(yōu)選地，該化合物包括一共超過(guò)18個(gè)確定核心基序的氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，N-末端部包括兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的序列。在這些氨基酸中，為這個(gè)序列的合適成員的是I和G，并且優(yōu)選N-末端部是IG。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，C-末端部也包含氨基酸序列。該序列可以包含1、2、3、4或多于4個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，C-末端部包含4個(gè)氨基酸。所述4個(gè)氨基酸的C-末端部的C-末端可以是E，如在肽LL-37中的等同位置。然而，這個(gè)C-末端也可以通過(guò)R來(lái)定義。位于緊鄰C-末端氨基酸的氨基酸可以是T，如在LL-37中，或者其可以是L。P和R是C-末端部的4個(gè)氨基酸序列的兩個(gè)其它優(yōu)選成員(在兩個(gè)剩余位置的任何位置)。最優(yōu)選地，C-末端部選自序列PRTE和RPLR。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，N-末端部和C-末端部選自上述的優(yōu)選方案以生成具有總數(shù)為24個(gè)氨基酸的肽結(jié)構(gòu)。在這些當(dāng)中，當(dāng)前最優(yōu)選的化合物是肽IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE和IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR，其或者作為肽本身，或者作為修飾或衍生的肽。
這些當(dāng)中，優(yōu)選的修飾體是酰胺化和/或乙?；碾摹Ｆ渲絮０坊坪跆貏e有利的位置之一是肽的C-末端。另一方面，乙?；瘍?yōu)選地在N-末端氨基酸處進(jìn)行。在目前優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，肽IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE和IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR都被N-末端乙?；虲-末端酰胺化。初步檢測(cè)表明這些修飾體在存在外肽酶下具有增大的穩(wěn)定性。
該化合物通?？赏ㄟ^(guò)已知的用于制備肽和類似物質(zhì)的方法加以制備。僅包含少數(shù)氨基酸或類似單元(優(yōu)選不多于30～50個(gè)單元)的較小化合物可通過(guò)化學(xué)或酶促結(jié)合技術(shù)，或者利用其中反應(yīng)發(fā)生在溶液或懸浮液中的典型方法或者采用更現(xiàn)代的固相方法(其中肽在被固定至固體表面如聚合物珠的同時(shí)被裝配)來(lái)制備。較大的化合物通常通過(guò)自動(dòng)化固相肽合成器來(lái)合成。
可替換地，該化合物可通過(guò)已知的遺傳工程技術(shù)來(lái)制備。如果該化合物真正是肽或稍微修飾的肽，則這種方法尤其有效。例如，編碼該化合物的DNA序列可以與能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)載體進(jìn)行連接或組合。在該方法的另一步驟中，宿主細(xì)胞或靶細(xì)胞在可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染的條件下，通過(guò)接觸具有載體和載體相關(guān)DNA的細(xì)胞，利用所述DNA加以轉(zhuǎn)染。在進(jìn)一步的步驟中，宿主或靶細(xì)胞在允許表達(dá)該化合物的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。隨后，可分離該化合物。如果該化合物本身不能被編碼或被表達(dá)，但非常類似于可被編碼或表達(dá)的肽，則該方法可被用來(lái)制備該化合物類似的肽，接著通過(guò)一個(gè)或多個(gè)步驟，其中肽通過(guò)化學(xué)或酶促技術(shù)進(jìn)行修飾以制備該化合物。
為此可使用各種類型的載體，如病毒載體、lipoplex、polyplex、微球體、納米球體、樹(shù)形化合物、裸DNA、肽遞送體系、脂質(zhì)、尤其是陽(yáng)離子脂質(zhì)、或其形成的脂質(zhì)體、聚合物載體、尤其是由多陽(yáng)離子聚合物制成的聚合物載體。在這些當(dāng)中，優(yōu)選的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄酶病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、以及病毒顆粒。優(yōu)選的非病毒載體包括殼聚糖、SPLP、基于PLGA的聚合物體系、聚乙烯亞胺、多熔素、聚氨基磷酸酯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚磷腈、DOPE、DOTAP、以及DOTMA。
可用于制備本發(fā)明化合物的方法的更全面概括描述于W.F.Anderson，Nature392Supp.，30 April 1998，p.25-30；PharmaceuticalBiotechnology，Ed.D.J.A.Crommelin and R.D.Sindelar，Harwood AcademicPublishers，1997，p.53-70，167-180，123-152，8-20；Protein SynthesisMethodsand Protocols，Ed.R.Martin，Humana Press，1998，p.1-442；Solid-PhasePeptide Synthesis，Ed.G.B.Fields，Academic Press，1997，p.1-780；AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxford University Press，1997，p.1-89。
肽或功能性等同物的鹽通過(guò)已知方法進(jìn)行制備，其通常涉及將肽或類肽或者與藥學(xué)上可接受的酸進(jìn)行混合以形成酸加成鹽，或者與藥學(xué)上可接受的堿進(jìn)行混合以形成堿加成鹽。酸或堿是否是藥學(xué)上可接受，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在考慮到該化合物的具體打算用途后可以很容易地加以確定。例如，不是所有的對(duì)于體外診斷組分可接受的酸和堿可用作治療組合物。取決于預(yù)計(jì)的用途，藥學(xué)上可接受的酸包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、丙二酸、肉桂酸、硫酸、鹽酸、氫溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸、以及硫氰酸，其與肽和功能性等同物的游離氨基形成銨鹽。藥學(xué)上可接受的堿(其與肽和功能性等同物的游離羧基形成羧酸鹽)包括乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、異丙胺、二異丙胺、以及其它單烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，以及芳胺。此外，也包括藥學(xué)上可接受的溶劑化物、復(fù)合物或加合物，如水合物或ethurate。
肽的部分優(yōu)選修飾可以在合成過(guò)程中或合成結(jié)束時(shí)容易地被引入。例如，當(dāng)利用固相技術(shù)合成肽時(shí)，N-末端乙?；稍诎被嵝蛄?其仍然結(jié)合至樹(shù)脂)的端部與乙酸反應(yīng)而不是另一個(gè)氨基酸來(lái)完成。
另一方面，C-末端酰胺化可通過(guò)在固相肽合成中利用特定種類的樹(shù)脂，如可商購(gòu)獲得的Tengagel SAM(ex Rapp，Tübingen，Germany)來(lái)完成。這些樹(shù)脂包括化學(xué)“柄”，酰胺化的肽在切割過(guò)程中從其釋放。這些和進(jìn)一步的修飾肽的方法對(duì)于本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是已知的。
如前所述，本發(fā)明的化合物對(duì)于微生物毒素尤其對(duì)于細(xì)菌毒素如脂多糖(LPS)和脂磷壁酸質(zhì)(LTA)具有親和力。因此，該化合物可有利地用于其中涉及這些毒素存在的癥狀和疾病的預(yù)防、治療以及診斷用途。結(jié)合能力通常導(dǎo)致毒素的無(wú)效，化合物通過(guò)其可被認(rèn)為是拮抗劑和部分拮抗劑。而且，它們可以被用作對(duì)于其它能夠使毒素?zé)o效的化合物的靶向試劑或配體，并且通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)配體結(jié)合于該化合物，或通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵接于藥物載體如脂質(zhì)體、納米顆粒或微粒、納米膠囊或微膠囊、脂質(zhì)復(fù)合物、或膠束的表面，其可以特異性地靶向于這些毒素。
在診斷中，化合物可以用于檢測(cè)或量化存在于生理液體(如血液、血漿、血清、連著諸如呼吸道的粘膜上皮的粘液)、或在其存在引起病癥的液體(如在滲出性中耳炎(OME)的中耳中發(fā)現(xiàn)的液體)中的細(xì)菌毒素的量。對(duì)于這種應(yīng)用，化合物可以被組合到體外使用的診斷試劑盒中，或組合到可以給予至患者的診斷組合物中。對(duì)于這種應(yīng)用，一種選擇是將本發(fā)明的化合物與螯合劑加以軛合，其隨后與可通過(guò)合適監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)的同位素標(biāo)記物進(jìn)行復(fù)合。
在優(yōu)選的應(yīng)用中，將化合物作為活性藥物給予以預(yù)防或治療與真菌和細(xì)菌感染相關(guān)以及與體內(nèi)存在真菌和細(xì)菌毒素有關(guān)的疾病和病癥。如前面提到的，傳統(tǒng)抗生素在治療急性或慢性感染中存在某些缺陷和局限，其中的感染如誘導(dǎo)耐藥性和選擇耐藥性細(xì)菌變體、由于微生物被殺滅而抑制患者的天然防御系統(tǒng)、損傷天然生長(zhǎng)在粘膜的菌落、釋放大量的細(xì)菌毒素等。而且，可能存在其中存在毒素尤其是細(xì)菌毒素而本身不存在微生物是主要原因的病癥和疾病，如在OME中，其中毒素在中耳中的局部保留可顯著有利于疾病的表現(xiàn)，即使缺少急性感染的癥狀。
然而，由于該化合物也具有顯著的抗菌活性，所以它們可以即使在其中必需實(shí)際上減少感染主體的微生物數(shù)量的那些癥狀，如嚴(yán)重急性感染中被利用。在這方面，它們可以代替或補(bǔ)足其他抗生素，即使在不能利用僅能夠使微生物毒素?zé)o效的化合物來(lái)治療的疾病和病癥中。這樣的疾病的實(shí)例是急性細(xì)菌或真菌感染，如敗血病性休克，眼、肝、腎、肺、支氣管、鼻或額竇、耳、陰道、尿道、皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、脾、或其它組織和器官的急性感染。特別與感染相關(guān)的嚴(yán)重病癥的實(shí)例是敗血病性休克。
在所有這些情況下，不用抗生素藥物而是用能夠使細(xì)菌毒素?zé)o效的物質(zhì)來(lái)治療疾病是可行的。為此，本發(fā)明的化合物是尤其有利的，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出對(duì)最相關(guān)的微生物毒素如在格蘭氏陰性細(xì)菌情形下的脂多糖(LPS)和在格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌情形下的脂磷壁酸質(zhì)(LTA)的較高結(jié)合和無(wú)效活性。在上氣道的感染中，對(duì)于治療這種感染，本發(fā)明的化合物是特別優(yōu)選的，這些細(xì)菌產(chǎn)物可誘發(fā)在中耳或鼻竇中的炎性反應(yīng)，并且可誘發(fā)上氣道上皮的粘膜損傷。涉及的使毒素?zé)o效可以允許粘膜損傷(包括粘膜纖毛清潔系統(tǒng)(MCS)的損傷)被防止、控制、或減少，從而將強(qiáng)化天然防御系統(tǒng)。在包括OME的那些情形中，其中細(xì)菌毒素可以代表即使在缺少多數(shù)活的細(xì)菌細(xì)胞中的主要問(wèn)題，依賴于給予本發(fā)明化合物(例如直接給予至中耳)的療法可以代表主要的治療方法。但同樣在其它氣道感染如急性或慢性鼻竇炎、或急性或慢性耳炎中，該化合物對(duì)于恢復(fù)正常粘膜功能及其天然防御系統(tǒng)可以是高度有用的。
更通常地講，本發(fā)明的化合物在預(yù)防和治療由感染性細(xì)菌構(gòu)成和來(lái)自感染性細(xì)菌的癥狀中是很有用的藥劑，其中感染性細(xì)菌包括肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、A群β-溶血鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、格蘭氏陰性腸桿菌、化膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、格蘭氏陰性桿菌、海綿假單胞菌(Pseudomonas sp.)。
用本發(fā)明化合物預(yù)防或處理的感染可以是由實(shí)質(zhì)上是浮游生物的微生物引起的，即，其習(xí)性是單個(gè)微生物。例如，如果浮游微生物已經(jīng)感染了哺乳動(dòng)物的生理液體如血液，則它們可以利用血流被輸送到哺乳動(dòng)物的全身。
其可以至少部分是由浮游微生物引起的系統(tǒng)或通?；腥景毙曰蚵哉婢腥救绶啪€菌病、芽生菌病、諾卡菌病、隱球菌病、孢子絲菌病、孢子絲菌病、球胞子菌病、和曲霉病，以及急性或慢性細(xì)菌感染如炭疽熱、破傷風(fēng)、壞疽、肉毒中毒、李斯特菌病、斑疹傷寒、軍團(tuán)病、霍亂、黃熱病等。急性嚴(yán)重系統(tǒng)感染可能與敗血病性休克相關(guān)，其是敗血癥的威脅生命的嚴(yán)重形式，其通常由于在血流中存在大量格蘭氏陰性細(xì)菌及其毒素所導(dǎo)致的，并且其進(jìn)一步特征在于減少血液流至器官和組織、低血壓、器官功能障礙、損傷的精神狀態(tài)、以及經(jīng)常性多器官功能衰竭，并且其經(jīng)常影響免疫缺失個(gè)體。
然而，在最近幾年，已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病和癥狀也是(至少部分)由形成更多無(wú)柄群落的微生物(通常稱為生物膜)所引起的。這對(duì)于許多系統(tǒng)感染并且尤其是對(duì)于大量更多局部感染來(lái)說(shuō)是真實(shí)的。如本文所使用的，生物膜是微生物衍生的無(wú)柄群落，其特征在于附著至基質(zhì)或界面或相互附著的細(xì)胞被嵌入胞外聚合物(它們產(chǎn)生的)的基質(zhì)中，并且相對(duì)于生長(zhǎng)速率和基因轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)出變化的顯型。通常，胞外基質(zhì)包括高度水合的顯性陰離子基質(zhì)聚合物。生物膜可以粘附至表面和界面；事實(shí)上，粘附可以引發(fā)控制胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和前述浮游微生物轉(zhuǎn)化為其無(wú)柄顯型的基因的表達(dá)。
認(rèn)為無(wú)柄微生物及其生物膜在大量感染疾病中起主要作用，并且對(duì)于它們中的部分，這已由大量證據(jù)所支持。在這些疾病之中，例如是牙周炎、天生瓣膜心內(nèi)膜炎、囊性纖維化病、慢性細(xì)菌性前列腺炎、支氣管炎、肺炎、鼻竇炎、蛀牙(老年齲)、慢性扁桃體炎、心內(nèi)膜炎、壞死性筋膜炎、肌與骨骼的感染、骨髓炎、膽管感染、感染性腎結(jié)石、以及中耳炎。最可能地，許多其他(尤其是局部)的涉及身體的具體區(qū)域或器官的感染(還涉及無(wú)柄微生物)，如肝、脾、牙周組織、眼、腎、皮膚、陰道、尿道、或心臟的感染。
在研究如權(quán)利要求1中所定義的肽化合物的活性中，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，這些化合物對(duì)于無(wú)柄的形成生物膜的微生物也是活性的。因此，它們代表對(duì)于預(yù)防或治療涉及這樣的微生物或涉及微生物的無(wú)柄狀態(tài)的疾病的有用化合物。例如，已發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)生物膜試驗(yàn)中，能夠在某些表面如PVC上形成生物膜的某些微生物例如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)可被抑制和阻止形成生物膜。
當(dāng)本發(fā)明的化合物以至少約0.001μM，并且更優(yōu)選地以至少約0.01μM，以及還更優(yōu)選地以至少約0.1μM的濃度存在時(shí)可獲得抑制效應(yīng)。在進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該化合物的濃度為約0.1至約100μM。然而，取決于接觸生物膜的液體的種類和數(shù)量，以及涉及的特定微生物，這些濃度可以被調(diào)整。
此外，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物不僅通過(guò)另外能夠形成微膜的微生物阻止生物膜的形成，而且對(duì)于已形成的微膜也是活性的。取決于其濃度，它們能夠破壞或降解生物膜，例如在標(biāo)準(zhǔn)生物試驗(yàn)中可檢測(cè)的生物膜。同樣，化合物的濃度應(yīng)通過(guò)考慮接觸該生物膜和涉及的特定微生物的液體的種類和數(shù)量加以選擇。例如，已發(fā)現(xiàn)低至約0.001μM的濃度對(duì)于預(yù)先形成的生物膜已經(jīng)可以具有破壞性作用。因此，優(yōu)選選擇化合物的濃度為至少約0.001μM。其它優(yōu)選的濃度分別為至少約0.01μM、0.1μM、1μM、10μM以及100μM。
由生物膜感染的特別危險(xiǎn)起因于不管是用于診斷或治療用途的在人或其它哺乳動(dòng)物的體內(nèi)插入或植入醫(yī)療裝置。例如，已證實(shí)生物膜的涉及來(lái)自隱形眼鏡、心臟瓣膜、靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、宮內(nèi)避孕器、縫合、人造血管、分流管、腹膜透析裝置、陰莖修補(bǔ)物、以及矯形修補(bǔ)物的感染。因此，另一優(yōu)選具體實(shí)施方式
是利用本發(fā)明的化合物來(lái)預(yù)防或處理由這樣的裝置導(dǎo)致的感染。
本發(fā)明的化合物相對(duì)其衍生自的天然蛋白質(zhì)和肽如CAP18和LL-37的特別優(yōu)點(diǎn)是其較低程度的不希望的發(fā)炎活性。這種活性與各種細(xì)胞過(guò)程，包括編碼在前發(fā)炎介質(zhì)如細(xì)胞因子的基因的增生、分化和表達(dá)相關(guān)。細(xì)胞因子是炎癥的直接介質(zhì)并且影響許多免疫反應(yīng)的進(jìn)展和趨向。細(xì)胞因子生產(chǎn)中平衡的擾動(dòng)被廣泛識(shí)別為若干疾病狀態(tài)的關(guān)鍵因素。在諸如滲出性中耳炎或鼻竇炎的癥狀中，這種平衡已被破壞。T細(xì)胞增生在這種情況下也不是有利的，因?yàn)檫@將進(jìn)一步刺激已失去控制的免疫應(yīng)答。
因此，該化合物可有利地用于藥物組合物中。根據(jù)本發(fā)明，提供了這樣的藥物組合物以及化合物本身。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”指的是治療和診斷組合物，以及包含這樣的組合物的藥物和診斷處方。治療用組合物和藥物用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的疾病和其它癥狀(希望進(jìn)行改善)。診斷處方和診斷組合物用于這樣的疾病的體內(nèi)和體外的診斷。
通常，這樣的藥物或組合物包括至少一種作為活性成分的本發(fā)明化合物以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
在一個(gè)
具體實(shí)施例方式
中，所述藥物包括另一活性成分，其可以選自如權(quán)利要求1所述的化合物的相同組?？商鎿Q地，另一化合物屬于不同的組。例如，可以為這樣的化合物，其也已知具有抗生素或抗真菌活性但具有不同的作用機(jī)制。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，另一化合物沒(méi)有被組合到同一藥物中，而是作為單獨(dú)制劑同時(shí)給予。
此外，將組合物以這樣的方式進(jìn)行加工和成型，使得其可以被給予至人或動(dòng)物。如本文所使用的，載體或賦形劑是任何藥學(xué)上可接受的物質(zhì)或基本上不具有藥理活性的物質(zhì)的混合物，其可作為賦形劑或作為輔助物質(zhì)使用以將化合物制成劑型，該劑型穩(wěn)定并適合給藥。藥學(xué)上可接受的賦形劑的實(shí)例對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的并且可在專業(yè)藥典的專著中找到。
在一個(gè)
具體實(shí)施例方式
中，配制和加工該組合物以用于非腸道注射、滴注或灌注，優(yōu)選用于血管內(nèi)注射，如靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射，但也用于肌內(nèi)、皮下、傷口內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部區(qū)域或其它非腸道給藥途徑。在另一優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，將組合物直接給予至感染的上氣道的粘膜，如中耳。管理用于這些給藥途徑的其它藥物制劑的相同原則也將教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員如何制備這樣的組合物。例如，非腸道劑型的要求之一是其無(wú)菌性。其它要求描述于所有專業(yè)藥典，如在USP 24、專著“General Requirements for Tests and Assays.1.Injections”，p.1775-1777。為了增加非腸道制劑的穩(wěn)定性，可能有必要提供干的劑型，其必須在可被給藥之前重組。這樣的劑型的實(shí)例是冷凍干燥或凍干的制劑。合適地，本發(fā)明的組合物也可包含粘液溶解的溶劑。
將本發(fā)明化合物作為非腸道受控釋放劑型給予可能是理想的，以避免頻繁注射并且增進(jìn)治療的有效性和便利性。各種制備這樣的貯存制劑的方法是已知的。緩釋可以由固態(tài)植入物、納米顆粒、微粒、微膠囊、乳劑、懸液、油溶液劑、脂質(zhì)體、或類似結(jié)構(gòu)來(lái)提供。
在用于局部給予至受感染粘膜的組合物的情況下，提供具有在給藥部位處的局部保持延長(zhǎng)時(shí)間的性質(zhì)的制劑可能是很有用的，以增加藥物的有效性。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，粘膜粘附(mucoadhesive)賦形劑可以組合到制劑中。這樣的功能性賦形劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的；它們包括聚合物如聚丙烯酸及其衍生物、聚甲基丙烯酸及其衍生物、包括羥丙基甲基纖維素的纖維素醚、羧甲基纖維素、淀粉、殼聚糖等。適合或可替換地，本發(fā)明的組合物也可以包含粘液溶解的溶劑。尤其是，粘液溶解的溶劑可以用來(lái)影響本發(fā)明的肽化合物進(jìn)入粘液(例如在呼吸道中)的滲透性。合適的溶劑可以包括已知的粘液調(diào)節(jié)劑或粘液溶解劑如N-乙酰基半胱氨酸、S-羧甲基半胱氨酸、溴己新(bromhexine)、ambroxyl、脫氧核糖核酸酶、厄多司坦(erdosteine)、鹽水溶液以及奈索司坦(nesosteine)。優(yōu)選地，使用溴己新。
以其最寬定義，對(duì)于制備非腸道制劑特別有用的其它賦形劑是溶劑、助溶劑以及液態(tài)或半固態(tài)載體，如無(wú)菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、丁二醇、脂油、短鏈和中鏈甘油三酸酯、卵磷脂、聚氧化乙烯蓖麻油衍生物；用于調(diào)節(jié)摩爾滲透壓濃度和pH的物質(zhì)，如糖類尤其是葡萄糖、糖醇尤其是甘露醇、氯化鈉、碳酸鈉、檸檬酸、醋酸鹽(酯)、磷酸鹽(酯)、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉等；穩(wěn)定劑、抗氧化劑、以及防腐劑，如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉、EDTA、芐醇等；其它賦形劑和凍干助劑如白蛋白、葡聚糖等。
類似地，可以有利地以跨粘膜劑型給予本發(fā)明的化合物。這種給藥途徑是非攻擊性和患者友好的；同時(shí)，當(dāng)與口服給藥相比時(shí)，其通常導(dǎo)致本發(fā)明化合物改進(jìn)的生物可利用性，尤其是在該化合物在消化系統(tǒng)的液體中不穩(wěn)定的情形，或其太大而不能從內(nèi)臟有效被吸收的情形下?？缯衬そo藥例如借助于鼻、口腔、舌下、齒齦、或陰道劑型是可能的。這些劑型可通過(guò)已知技術(shù)來(lái)制備；可將它們配制成滴鼻劑或噴霧劑、插入劑、膜劑、藥膏、凝較劑、油膏、或片劑。優(yōu)選地，用于跨粘膜劑型的賦形劑還包括一種或多種提供粘膜附著力的物質(zhì)，因此，延長(zhǎng)劑型與吸收部位的接觸時(shí)間，從而有效地增大吸收程度。
可替換地，藥物組合物可以被設(shè)計(jì)用于口服給藥并相應(yīng)地進(jìn)行加工。合適的口服劑型包括片劑、硬膠囊、軟膠囊、粉末、顆粒、口服分解劑型、糖漿、滴劑、懸浮液、泡騰片劑、可咀嚼片劑、口含軟片(oral film)、凍干劑型、緩釋劑型、控釋劑型。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
之一中，口服劑型是腸道涂覆的固態(tài)劑型以在胃的酸性和蛋白水解的環(huán)境中為化合物提供保護(hù)。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，借助于肺部途徑給予該化合物，利用計(jì)量吸入器、噴霧器、氣溶膠噴射、或干粉吸入器。合適的制劑可通過(guò)已知方法和技術(shù)來(lái)制備。經(jīng)皮的、直腸或眼給藥在一些情形下也是可行的。
可以有利地利用先進(jìn)的藥物遞送或靶向方法來(lái)更有效地遞送本發(fā)明的化合物。例如，如果選擇非注射給藥途徑，則合適的劑型可以包含生物可利用性增強(qiáng)劑，其可以是任何增加該化合物的可利用性的物質(zhì)或物質(zhì)的混合物。這可以通過(guò)例如防止化合物降解來(lái)實(shí)現(xiàn)，如通過(guò)酶抑制劑或抗氧化劑。更優(yōu)選地，該增強(qiáng)劑通過(guò)增大吸收壁(其通常是粘膜)的可滲透性來(lái)增加化合物的生物可利用性。滲透增強(qiáng)劑可通過(guò)各種機(jī)制起作用；一部分增大粘膜的流動(dòng)性，而其它的則打開(kāi)或加寬在粘膜細(xì)胞之間的間隙連接。還是其它的降低覆蓋在粘膜細(xì)胞層上的粘液的粘度。在這些之中，優(yōu)選的可生物利用性增強(qiáng)劑是兩性物質(zhì)如膽酸衍生物、磷脂、乙醇、脂肪酸、油酸、脂肪酸衍生物、EDTA、卡波姆(carbomer)、聚卡波非(polycarbophil)、以及殼聚糖。
利用化合物的抗菌活性和抗真菌活性，可選地將它們用于制備或者不包含防腐劑或者僅包含減少含量的防腐劑的藥物。“減少含量”意思是指防腐劑的含量低于需要用來(lái)有效防腐(保存)相應(yīng)的安慰劑組合物的防腐劑含量，其中的安慰劑組合物是含有除了活性成分外的相同組分的組合物。
組合物是否有效地防腐可利用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)如用于防腐效力的試驗(yàn)(例如USP<51>)來(lái)確定，其中取決于產(chǎn)物類別，以確定的時(shí)間間隔檢測(cè)了五種置疑的微生物。以適當(dāng)系列進(jìn)行檢測(cè)，還可實(shí)施這樣的檢測(cè)以確定對(duì)于所給組合物如對(duì)應(yīng)于上述組合物的無(wú)藥物的組合物的特異性防腐劑的最小有效濃度。
例如，可以發(fā)現(xiàn)，為了利用山梨酸來(lái)有效地防腐特定的安慰劑組合物，防腐劑必須以至少約0.1％(w/v)的濃度存在。在這種情況下，包含權(quán)利要求1所述化合物的參照組合物可含有以基本上較低濃度如約0.05％(w/v)或更低的山梨酸。在另一具體實(shí)施方式
中，選擇防腐劑的濃度不高于約1/5，并且更優(yōu)選不高于約1/10的需要用來(lái)有效地防腐相應(yīng)的安慰劑組合物的濃度。
以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不是用來(lái)將其范圍限制于本文提供的具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例1化合物的制備在自動(dòng)化多重肽合成器(SyroII，MultiSyntech，Witten，Germany)上通過(guò)固相方案制備了下列肽化合物，其每一個(gè)都包含24個(gè)氨基酸，將本文的化合物編碼為P60、P60.4、P60.Ac、以及P60.4Ac。對(duì)于P60和P60.4，將Tentagel S AC(Rapp，Tübingen，Germany)(聚乙二醇和聚苯乙烯的接枝聚合物)用作樹(shù)脂(加載0.2meq，粒徑90μm)。對(duì)于P60.Ac和P60.4Ac，使用Tentagel S AM，其生成C-末端酰胺化肽。通過(guò)向反應(yīng)容器中加入6倍摩爾過(guò)量(基于加載的樹(shù)脂)的在NMP中的適當(dāng)Fmoc氨基酸的0.60M溶液、6倍摩爾過(guò)量的在NMP中的0.67M PyBOP以及12倍摩爾過(guò)量的在NMP中2/1(v/v)的NMM來(lái)實(shí)施重復(fù)連接。側(cè)鏈保護(hù)如下tBu用于D、E、S、T；Boc用于K；Trt用于N、Q以及Pmc用于R。通過(guò)向每個(gè)反應(yīng)器中加入3倍的哌啶/NMP 1/4(v/v)進(jìn)行Fmoc去保護(hù)。連接時(shí)間和去保護(hù)時(shí)間分別為45分鐘和3次3分鐘。在連接和Fmoc去保護(hù)之后用NMP進(jìn)行洗滌6次。對(duì)于P60.Ac和P60.4Ac，在肽仍然結(jié)合于樹(shù)脂的同時(shí)利用醋酸實(shí)施N-末端乙?；?。在合成之后，將肽基樹(shù)脂分別用NMP、二氯甲烷、二氯甲烷/乙醚1/1(v/v)和乙醚充分洗滌，并空氣干燥。然后將肽基樹(shù)脂切割并將側(cè)鏈在TFA/水95/5(v/v)(每10μmol肽1.5ml)中去保護(hù)2.5h，通過(guò)過(guò)濾去除樹(shù)脂并利用乙醚/戊烷1/1(v/v)(每10μmol肽10ml)將肽從TFA溶液中沉淀出來(lái)。將該溶液在-20℃下冷卻1h并通過(guò)離心(-20℃，2500g，10min)分離出沉淀的肽。在用10ml乙醚/戊烷1/1(v/v)的小球搗碎和渦旋以及通過(guò)相同工序的分離之后，將肽在室溫下空氣干燥1小時(shí)。將肽溶解在2ml水或2ml 10vol％的乙酸中，將該溶液在液氮中冷凍約5min，接著冷凍干燥同時(shí)離心(1,300rpm，8～16h)。利用RP-HPLC和Maldi-tof質(zhì)譜儀對(duì)肽進(jìn)行分析。
該化合物的氨基酸序列是P60 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTEP60.Ac*IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTEP60.4 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLRP60.4Ac*IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR*后綴Ac意思是指肽被N-末端乙酰化并且C-末端酰胺化。
實(shí)施例2毒素的無(wú)效根據(jù)實(shí)施例1制備的化合物，利用鱟變形細(xì)胞溶解物(LAL)試驗(yàn)以及利用全血(WB)試驗(yàn)對(duì)它們使細(xì)菌毒素LPS無(wú)效的能力進(jìn)行檢測(cè)。LTA無(wú)效也利用全血試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。將肽LL-37用作陽(yáng)性對(duì)照。將使50％LPS無(wú)效的肽濃度用作肽活性的測(cè)量值。這些濃度值列于表1中。在每個(gè)試驗(yàn)中的化合物之間的差異統(tǒng)計(jì)上不是顯著性的。總的來(lái)說(shuō)，所測(cè)試的本發(fā)明化合物同天然抗菌肽LL-37一樣表現(xiàn)出大約相同程度的抗毒素活性。
表1對(duì)于使50％LPS和LTA無(wú)效的化合物濃度(μg/ml±SD)

實(shí)施例3通過(guò)化合物的免疫細(xì)胞活化根據(jù)實(shí)施例1制備的化合物，通過(guò)利用Elispot、T-細(xì)胞增生、ERK-活化、以及嗜中性白細(xì)胞趨化性試驗(yàn)對(duì)其治療上不希望的免疫原活性進(jìn)行測(cè)試。Elispot試驗(yàn)用來(lái)確定藥物、化學(xué)品或其它化合物對(duì)體外細(xì)胞因子分泌的作用，從而提供關(guān)于其對(duì)體內(nèi)免疫功能的推定調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)的結(jié)果以對(duì)IFN-γ的陽(yáng)性(正)響應(yīng)的分?jǐn)?shù)給出。ERK(胞外信號(hào)相關(guān)激酶)-1/2是部分MAP激酶信號(hào)途徑，其已被證實(shí)涉及各種細(xì)胞過(guò)程，包括編碼前發(fā)炎介質(zhì)如細(xì)胞因子的基因的增生、分化和表達(dá)。細(xì)胞因子是炎癥的直接介質(zhì)并且影響許多免疫反應(yīng)的進(jìn)展和趨向。細(xì)胞因子生產(chǎn)中的平衡的擾動(dòng)被廣泛識(shí)別為若干疾病狀態(tài)的關(guān)鍵因素。在諸如滲出性中耳炎或鼻竇炎的癥狀中，這種平衡已被破壞。T細(xì)胞增生在這種情況下也不是有利的，因?yàn)檫@還將刺激已失去控制的免疫應(yīng)答。因此，希望本發(fā)明的化合物并不刺激嗜中性白細(xì)胞的細(xì)胞因子生產(chǎn)、T細(xì)胞增生、ERK活化或趨化性。
對(duì)于T細(xì)胞增生，在沒(méi)有或存在10μg/ml化合物下，在96孔圓底平板(Costar Inc.Cambridge，MA)中，以最終全部體積為150μlIMDM，將150,000個(gè)周圍血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)5天。作為陽(yáng)性對(duì)照，將PBMC在存在25U/ml重組IL-2下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的最后20小時(shí)期間，用[3H]胸腺嘧啶(0.5微Ci/孔)脈動(dòng)PBMC，之后通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)3H-并入。對(duì)于通過(guò)Elispot分析的T細(xì)胞細(xì)胞因子IFN和IL-10的檢測(cè)，在沒(méi)有或存在各種濃度的合成肽下，在全部0.5ml IMDM中培養(yǎng)1.5×106個(gè)PBMC。作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)10μg/ml商陸促分裂原(PWM)來(lái)刺激PBMC。在培養(yǎng)48h后，通過(guò)用溫和IMDM輕輕漂洗孔以收集非附著性細(xì)胞(其被洗滌到較大體積的IMDM中)而獲得PBMC。接下來(lái)將PBMC置于預(yù)涂覆了抗體的ELISA平板上并在37℃、5％CO2下、在補(bǔ)加了2％混合人AB血清的IMDM中培養(yǎng)5h，之后根據(jù)制造商協(xié)議(U-CyTech，Utrecht，The Netherlands)將平板展開(kāi)。在Olympus顯微鏡上計(jì)數(shù)斑點(diǎn)并用Olympus Micro Image 4.0軟件(Paes Nederland，Zoeterwoude，The Netherlands)進(jìn)行分析。將最終的結(jié)果表示為陽(yáng)性刺激指數(shù)的分?jǐn)?shù)(陽(yáng)性＞2)。
利用來(lái)自粘液表皮樣肺腫瘤細(xì)胞系NCI-H292(ATCC，Rochville，MD)的細(xì)胞測(cè)試ERK-1/2活化，將該細(xì)胞在補(bǔ)加了2mM L-谷氨酰胺(Bio Wittaker，Walkersville，MD)、200U/ml青霉素(Bio Wittaker)、200μg/ml鏈霉素(Bio Wittaker)以及10％(v/v)熱失活胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)中、在24孔或6孔組織培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。在達(dá)到接近匯合之后，將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)整夜。接著用指定刺激物刺激細(xì)胞15分鐘。細(xì)胞溶解產(chǎn)物利用溶胞緩沖液(0.5％[v/v]Triton X-100，0.1MTris-HCl pH7.4，100mM NaCl，1mM MgCl2，1mM Na3VO4，小型完整蛋白酶抑制劑混合物[Boeringer Mannheim，Roche，Basel，Switzerland])加以制備。在10％甘氨酸基的凝較上將樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并將溶解的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。非特異性結(jié)合部位通過(guò)PBS/0.05％吐溫-20/1％酪蛋白被阻斷。利用對(duì)磷酸化ERK-1/2(New England Biolabs，Beverly，MA)的兔多克隆抗體和結(jié)合有抗兔IgG抗體的次級(jí)辣根過(guò)氧物酶孵育印跡。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotech，Upsala，Sweden)來(lái)顯示免疫反應(yīng)性。
利用Percoll密度離心(密度1.082g/ml)，用分離自周邊血的嗜中性白細(xì)胞來(lái)測(cè)量嗜中性白細(xì)胞趨向性。在趨向性介質(zhì)(20mMN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES緩沖液)HEPES，132mMNaCl，6mM KCl，1.2mM KH2PO4，1mM MgSO4，5.5mM葡萄糖，0.1mM CaCl2和用無(wú)血清的RPMI 1∶1稀釋的0.5％(wt/vol)人血清白蛋白[Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood TransfusionService(CLB)，Amsterdam，The Netherlands])中，將細(xì)胞以2.5×106細(xì)胞/ml的濃度進(jìn)行再懸浮。利用改進(jìn)的Boyden Camber技術(shù)來(lái)評(píng)估化合物的趨化活性。簡(jiǎn)而言之，將稀釋在HEPES緩沖液的26μl刺激物加到下部區(qū)室的孔中，并將50μl的嗜中性白細(xì)胞懸浮液(2.5×106個(gè)細(xì)胞/ml)加到上部區(qū)室中。區(qū)室由兩個(gè)過(guò)濾器分隔開(kāi)下面的過(guò)濾器的孔徑為0.45μm(Millipore Products，Bedford，MA)并且上面的過(guò)濾器的孔徑為8μm(Sartorius Filter，San Francisco，CA)。在37℃下孵育90min后，取下上面的過(guò)濾器，固定在乙醇-丁醇(80∶20，v/v)中，并用Weigert溶液染色。為了確定嗜中性白細(xì)胞趨向活性，在6個(gè)自由度的較高功率場(chǎng)(x400)中計(jì)數(shù)嗜中性白細(xì)胞，并計(jì)算相比于陽(yáng)性對(duì)照(10-8M N-甲酰甲硫氨?；?亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP，Sigma)，在膜上的嗜中性白細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。
在表2中給出了結(jié)果。概括地講，所測(cè)試的本發(fā)明化合物，尤其是P60.4，誘發(fā)了非常低的免疫應(yīng)答，低于天然肽LL-37。它們表現(xiàn)出了較低的ERK活化并且基本上沒(méi)有嗜中性白細(xì)胞趨向性。
表2化合物的免疫原性

實(shí)施例4體內(nèi)耐受度根據(jù)實(shí)施例1制備化合物P60.4Ac并測(cè)試其體內(nèi)耐受性。更具體地，在兔子中對(duì)其引起皮膚和眼刺激的效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，而在豚鼠模型中對(duì)其耳毒性進(jìn)行研究。此外，在靜脈內(nèi)給藥后對(duì)其系統(tǒng)毒性進(jìn)行評(píng)估。
對(duì)于皮膚和眼刺激試驗(yàn)，將3只兔暴露于0.5ml磷酸緩沖的肽溶液(2mg/ml)，用半塞音敷料施用到夾緊的皮膚上4h。在暴露后1、24、48和72小時(shí)進(jìn)行觀察。將0.1ml磷酸緩沖(pH7.5)的肽溶液(2mg/ml)的單個(gè)樣品慢慢灌注到3只兔各自的一個(gè)眼中，以進(jìn)行急性眼刺激/腐蝕研究。在灌注后1、24、48以及72小時(shí)進(jìn)行觀察。
結(jié)果，沒(méi)有檢測(cè)到皮膚刺激。肽溶液的眼部灌注導(dǎo)致節(jié)間膜(其在灌注后在24小時(shí)內(nèi)完全溶解)發(fā)紅。
P60.4Ac的系統(tǒng)毒性在大鼠中以單一和重復(fù)劑量毒性研究進(jìn)行評(píng)估。以增加的劑量每天靜脈內(nèi)給予肽。在這個(gè)階段，建立了最大耐受劑量(MTD)。重復(fù)劑量毒性也在MTD階段進(jìn)行研究。在劑量增加階段，將9只兔分成3組并接受0.4、2或8mg/kg/天達(dá)兩天。在給予劑量當(dāng)天每天記錄兩次臨床信號(hào)而在給予劑量之后每天記錄一次，在給予第一次劑量之前記錄體重而在給予劑量之后每天記錄一次體重。在MTD階段，5只雌大鼠和5只雄大鼠接受8mg/kg/天達(dá)連續(xù)的5天。在給予劑量當(dāng)天每天記錄兩次臨床信號(hào)，在第1天和第6天記錄體重。在尸體剖檢前進(jìn)行臨床試驗(yàn)室觀察。在MTD階段結(jié)束時(shí)進(jìn)行肉眼檢查。
結(jié)果，在系統(tǒng)劑量增加研究中沒(méi)有出現(xiàn)死亡。此外，在臨床信號(hào)和體重方面沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的反常。在MTD階段期間，也沒(méi)有出現(xiàn)死亡并且在臨床信號(hào)、體重、血液學(xué)以及臨床生物化學(xué)參數(shù)方面和肉眼檢查中沒(méi)有明顯的肽相關(guān)發(fā)現(xiàn)。
實(shí)施例5耳毒性為了評(píng)價(jià)肽P60.4Ac的耳毒性，將這種肽在豚鼠中進(jìn)行測(cè)試(HsdPocDH；Harlan，Horst，The Netherlands)。在這個(gè)研究中使用7只健康的雄白化體豚鼠(500～1200g)(無(wú)外部耳病狀)。通過(guò)腹膜內(nèi)注射40mg/kg克他命(Eurovet Animal Health B.V.，Bladel，TheNetherlands)和10mg/kg若朋(rompun)(Bayer A.G.，Leverkusen，Germany)來(lái)麻醉動(dòng)物。在實(shí)施對(duì)照聽(tīng)覺(jué)試驗(yàn)后，將聽(tīng)覺(jué)大皰手術(shù)地打開(kāi)以將小片海綿體施加于圓窗膜(RWM)，并將各種溶液(約10μl)加到海綿體上。將皮膚縫合并接著進(jìn)行聽(tīng)覺(jué)測(cè)試。在RWM上的施加在右耳中實(shí)施，左耳保持未處理。一只動(dòng)物接受作為第一個(gè)安慰劑溶液的PBS(安慰劑I)，而另一只動(dòng)物接受第二個(gè)安慰劑溶液(安慰劑II)，其為在等滲[NaCl]中的7％聚乙二醇(Macrogol)10 000并保存在
20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH5.5)。兩只豚鼠接受順鉑(在PBS中的0.66mg/ml，獲自Sigma Chemicals，Zwijndrecht，The Netherlands)，其用作試驗(yàn)[39]的陽(yáng)性對(duì)照。在一只動(dòng)物中肽P60.4-Ac(2mg/ml)在PBS溶液(制劑I)中進(jìn)行測(cè)試，而在其它兩只動(dòng)物中，在對(duì)應(yīng)于第二個(gè)安慰劑的緩沖液(制劑II)中進(jìn)行測(cè)試。
在藥物給予之前并在手術(shù)后和3、7、14以及22天之后，利用基于計(jì)算機(jī)的信號(hào)平均化系統(tǒng)(Tucker-Davis Technology，Alucha，F(xiàn)L，USA)直接進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)。將豚鼠加以麻醉并且將插入式聽(tīng)筒置入外耳道。將皮下電極置于頭頂(活性的)上和置于身體同側(cè)的大皰(參照)上。將接地電極置于頸部肌肉上。記錄響應(yīng)于在電屏蔽的、雙壁的、輻射頻率屏蔽的聲室中的1kHz的10m猝發(fā)音的ABR。測(cè)量刺激強(qiáng)度并表達(dá)為dB。將ABR閾值定義為能夠引起可重復(fù)的、視覺(jué)上可察覺(jué)的響應(yīng)的最低強(qiáng)度。將處理后的ABR閾值與處理前的ABR閾值進(jìn)行比較。
結(jié)果，PBS(用作對(duì)照)的圓窗應(yīng)用在手術(shù)后22天沒(méi)有導(dǎo)致閾值發(fā)生變化。制劑緩沖液在22天后導(dǎo)致2dB的閾值變化。另一方面，順鉑分別引起-49dB和-64dB的閾值變化，其表明嚴(yán)重的聽(tīng)力喪失(表3)。這部分的實(shí)驗(yàn)用作耳毒性研究的陽(yáng)性對(duì)照。在PBS中的肽P60.4-Ac(2mg/ml)在手術(shù)后22天引起-7dB的閾值變化。接受作為制劑II的P60.4-Ac的動(dòng)物都產(chǎn)生1dB的閾值變化。
表3P60.4Ac的耳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

數(shù)值以dB為單位，表示Δ手術(shù)前。
a為PBSb為在等滲[NaCl]中的7％聚乙二醇10,000并保存在
20mM磷酸鹽緩沖溶液(pH5.5)c為由于劣質(zhì)電線的不可靠測(cè)量實(shí)施例6抗菌活性根據(jù)實(shí)施例1制備化合物P60.4Ac并通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾到10mL帶有螺旋蓋子的玻璃瓶中進(jìn)行消毒殺菌。不加入防腐劑。單獨(dú)地，制備相應(yīng)的安慰劑溶液，即具有除了化合物P60.4Ac外的相同組分的溶液。將從兩種制劑各自取出的樣品用于實(shí)施抗菌活性的試驗(yàn)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)含有化合物P60.4Ac的溶液以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或甚至減少微生物的數(shù)量，而相應(yīng)的安慰劑溶液表現(xiàn)出沒(méi)有抗菌活性。
實(shí)施例7抗菌活性根據(jù)R.Hancock′s″Modified MIC method for cationicantimicrobial peptides″[13]的修訂版，在96孔微量滴定板上，通過(guò)微量稀釋易感性試驗(yàn)將P60.4Ac和LL-37的體外抗細(xì)菌和抗真菌活性確定為最低抑制濃度(MIC)。在參照菌株大腸桿菌ATCC 8739、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027上測(cè)試抗細(xì)菌活性。在白念珠菌(candida albican)ATCC 10231和黑曲霉(aspergillusniger)ATCC14406上評(píng)價(jià)抗真菌活性。利用不同濃度的P60.4Ac和LL-37來(lái)實(shí)施抗菌活性試驗(yàn)，以比較它們對(duì)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的作用。利用在37℃下、在胰胨豆胨培養(yǎng)液中的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)的細(xì)菌來(lái)研究抗菌活性。將培養(yǎng)物利用10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)加以稀釋以得到大約5.0×106CFU/ml。將10μl的稀釋試驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)移至96孔平板并將100μl的不同肽濃度加到每個(gè)孔中。將該平板在37℃下孵育24小時(shí)，然后在光盒(light box)上通過(guò)視覺(jué)檢查評(píng)價(jià)生長(zhǎng)。然后將它們返回進(jìn)一步孵育24小時(shí)，在此之后，再次評(píng)價(jià)它們的生長(zhǎng)。如上所述制備酵母菌株白念珠菌。將絲狀真菌黑曲霉用作孢子懸液，在20～25℃下在殺氏葡萄糖瓊脂平板上培養(yǎng)6～10天或直至出現(xiàn)足量孢子形成。通過(guò)刮下來(lái)收獲孢子，并且如果必要，將濃度調(diào)節(jié)至5×106CFU/ml的最終濃度。
因此，對(duì)兩種格蘭氏陰性菌株和真菌白念珠菌和黑曲霉來(lái)評(píng)價(jià)P60.4Ac的抗菌活性，并與LL-37進(jìn)行比較。在表4中給出了每種肽的MIC值。相比于LL-37，P60.4Ac表現(xiàn)出較高或相等的抗格蘭氏陰性菌株大腸桿菌和綠膿桿菌活性。在一些情況下，對(duì)于兩種肽還確定了殺菌活性。P60.4Ac表現(xiàn)出對(duì)白念珠菌的MIC為6μM并且在18μM的MIC是良好殺真菌的。在18μM的P60.4Ac抑制黑曲霉孢子的發(fā)芽達(dá)24小時(shí)，而LL-37對(duì)黑曲霉沒(méi)有表現(xiàn)出活性。
實(shí)施例8生物膜形成的抑制根據(jù)實(shí)施例1制備化合物P60.4Ac并對(duì)其作為惡臭假單胞菌PCL1445生物膜形成的抑制劑的有效性進(jìn)行測(cè)試。利用標(biāo)準(zhǔn)PVC生物膜試驗(yàn)，其中生物膜形成在微量滴定平板的孔的聚氯乙烯表面上。向孔中的惡臭假單胞菌懸液中加入P60.4Ac溶液(0.9μM和9μM)并孵育10小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于沒(méi)有肽的緩沖溶液，在9μM的P60.4Ac抑制超過(guò)90％的生物膜形成，而0.9μM的P60.4Ac導(dǎo)致大約50％的降低。
實(shí)施例9形成的生物膜的抑制根據(jù)實(shí)施例1制備化合物P60.4Ac并對(duì)其在破壞惡臭假單胞菌生物膜的有效性進(jìn)行測(cè)試。如實(shí)施例7，利用標(biāo)準(zhǔn)PVC生物膜試驗(yàn)來(lái)形成生物膜。允許生物膜由惡臭假單胞菌PCL1445懸液在微量滴定平板的孔中形成超過(guò)7小時(shí)。在此之后，加入不同量的P60.4Ac以及對(duì)照物，即分別為DMSO和緩沖介質(zhì)溶液M63。在孵育18小時(shí)后，通過(guò)其在595nm處的光學(xué)密度(OD595)來(lái)評(píng)估生物膜。結(jié)果，相比于M63，DMSO僅導(dǎo)致較少的OD595的減少，而P60.4Ac取決于其濃度，基本上破壞了生物膜。


圖1示出了對(duì)于各種摩爾濃度的P60.4Ac(條1至5)、DMSO和M63的OD595值。
表4P60.4Ac相比于LL-37的抗菌活性

a將MIC定義為抑制在37℃下培養(yǎng)24或48小時(shí)后的細(xì)菌可見(jiàn)生長(zhǎng)的肽的最低濃度。給出的結(jié)果是三個(gè)獨(dú)立確定值的平均值。
b在18μM處的殺菌性c在6μM處的殺菌性d細(xì)菌抑制e當(dāng)在所有孔中的生長(zhǎng)可見(jiàn)時(shí)，沒(méi)有進(jìn)行可存活微生物的恢復(fù)f在18μM處可能的殺滅真菌性、在6μM處可能的抑制真菌性。
權(quán)利要求
1.肽化合物在制備用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物的細(xì)菌或真菌感染的藥物中的應(yīng)用，其中所述化合物包含氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中X1表示N-末端部；X2是K或E；X3是Q或E；X4是D或R；X5是N或E；X6表示C-末端部；其中，所述核心序列的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可選地被衍生化，并且其中(a)所述N-末端部被乙?；?，和/或(b)所述C-末端部被酰胺化，和/或(c)所述氨基酸序列不同于X1KEFKRIVQRIKDFLRNLVX6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述N-末端部X1包含氨基酸I和/或G。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述C-末端部X6包含至少4個(gè)氨基酸或氨基酸衍生物的序列。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述C-末端部X6包含選自PRTE和RPLR的氨基酸序列，其中所述序列的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可選地被衍生化。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述化合物類似具有24個(gè)氨基酸或其衍生物的序列的肽，所述序列選自IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE和IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR，并且其中所述氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可選地被衍生化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述N-末端被乙?；⑶宜鯟-末端被酰胺化。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)菌或真菌感染是由浮游微生物引起的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)菌或真菌感染是急性或慢性系統(tǒng)感染。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其中，所述系統(tǒng)感染與敗血病性休克有關(guān)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)通過(guò)疾病或藥物來(lái)抑制。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)菌或真菌感染是由能夠?yàn)闊o(wú)柄的并形成生物膜的微生物所引起的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)菌或真菌感染是急性或慢性局部或區(qū)域感染。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中，所述局部或區(qū)域感染是下氣道或上氣道或呼吸系統(tǒng)的感染，如中耳炎、支氣管炎、肺炎、或鼻竇炎。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動(dòng)物遭受囊腫性纖維化。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)通過(guò)疾病或藥物被抑制。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中，所述局部或區(qū)域感染是肝、脾、牙周組織、眼、腎、皮膚、陰道、尿道、或心臟的感染。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述局部或區(qū)域感染與醫(yī)療裝置如心臟瓣膜、靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、隱形眼鏡、語(yǔ)音按鈕、鼓膜造孔管、宮內(nèi)避孕器、或人造骨植入或插入所述哺乳動(dòng)物內(nèi)有關(guān)。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動(dòng)物同時(shí)用不同于以下肽化合物的其它抗菌劑或抗真菌劑加以治療，所述肽化合物包含氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6，其中X1表示所述N-末端部；X2是K或E；X3是Q或E；X4是D或R；X5是N或E；X6表示所述C-末端部；其中，所述核心序列的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可選地被衍生化。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其中，所述其它抗菌劑或抗真菌劑與肽化合物組合在單一藥物中。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述細(xì)菌或真菌感染不是同時(shí)用包含活性成分的藥物加以治療的，其中所述活性成分不是包含氨基酸序列X1KEFX2RIVX3RIKX4FLRX5LVX6的肽化合物，其中X1表示所述N-末端部；X2是K或E；X3是Q或E；X4是D或R；X5是N或E；X6表示所述C-末端部；其中，所述核心序列的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可選地被衍生化。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物被配制、加工，并適用于非腸道給藥，優(yōu)選適用于血管內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、或傷口內(nèi)注射。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物被配制、加工，并且適用于局部給予至受感染區(qū)域或組織的粘膜，如以灌注液形式、滴耳劑、滴鼻劑、氣溶膠、粉末氣溶膠、用于噴霧的液體、凝膠、懸液、或粘膜粘附性劑型。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物進(jìn)一步包含藥物靶向劑、生物可利用性增強(qiáng)劑、和/或受控遞送劑。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物進(jìn)一步包含至少一種防腐劑，并且其中所述防腐劑的含量低于需要用來(lái)有效地防腐所述相應(yīng)的安慰劑組合物的含量。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物基本上沒(méi)有防腐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類具有抗菌活性的肽化合物。該化合物對(duì)于毒素并且尤其是對(duì)于細(xì)菌毒素如脂多糖和脂磷壁酸質(zhì)具有親和力。該化合物可以用來(lái)制備對(duì)于治療細(xì)菌或真菌感染很有用的藥物。該藥物可以系統(tǒng)或局部地進(jìn)行給予。
文檔編號(hào)A61P31/10GK101018563SQ200580025512
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者約翰內(nèi)斯·雅格布斯·格羅特, 揚(yáng)·沃特·德費(fèi)豪特, 彼得·西科·西姆斯特拉, 馬爾特耶·約翰娜·內(nèi)爾, 馬賽爾·揚(yáng)·翁卡, 吉多·文森特·布隆伯格 申請(qǐng)人:奧托巴斯科學(xué)有限公司, 萊頓教學(xué)醫(yī)院