專利名稱：穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物。本發(fā)明所述穩(wěn)定的組合物可以用于在持續(xù)時(shí)期內(nèi)給哺乳動(dòng)物(包括人、牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗和貓)遞送治療有效量的包括集落刺激因子，例如牛粒細(xì)胞集落刺激因子(bG-CSF)在內(nèi)的蛋白質(zhì)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的穩(wěn)定的組合物含有穩(wěn)定緩沖液如HEPES、TES和TRICINE，它們能夠保持體內(nèi)和體外持續(xù)的時(shí)期的蛋白質(zhì)活性。
制備具有延長(zhǎng)的保存期的體內(nèi)和體外活性的治療有效的蛋白質(zhì)制劑(如G-CSF)仍是一個(gè)難題。這種蛋白質(zhì)制劑必須能在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期內(nèi)保持其活性和生物學(xué)完整性以便保證有效的治療。另外，這種蛋白質(zhì)制劑必須是可制備的，并且能以藥物可接受的方式給藥動(dòng)物。
已有提供冷凍或凍干形式的蛋白質(zhì)藥物組合物，在能將蛋白質(zhì)活性維持期延長(zhǎng)的儲(chǔ)存條件下進(jìn)行體外保藏。在使用前將凍干制品與藥物可接受的稀釋劑(例如注射用無(wú)菌水)重新組合。蛋白質(zhì)醫(yī)藥組合物也有以液體形式提供的。由于蛋白質(zhì)隨時(shí)間喪失活性，這種液態(tài)蛋白質(zhì)制劑難以儲(chǔ)存，特別是在高溫狀態(tài)。
治療有效的蛋白質(zhì)制劑，無(wú)論是固態(tài)(凍干)或液體形式，很難以那些不會(huì)在給藥后突然失活的方式給藥動(dòng)物，例如通過(guò)皮下注射給予動(dòng)物。蛋白質(zhì)在注射位點(diǎn)的迅速失活使蛋白質(zhì)不便用于治療哺乳動(dòng)物感染，因?yàn)橛行У闹委熞笤谒杌謴?fù)期間保證每日的劑量。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSFs)(如牛粒細(xì)胞集落刺激因子(bG-CSF)在40℃或更高溫度由于失去二級(jí)結(jié)構(gòu)、二硫鍵交換而不穩(wěn)定并由此導(dǎo)致失活。因?yàn)榕５捏w溫約40℃，注射部位處于生理pH范圍，在注射部位即會(huì)發(fā)生失活。
已知有多種有延長(zhǎng)的保存期的蛋白質(zhì)制劑。美國(guó)專利5,104,651(Boone等人，1992年4月14授權(quán))涉及一種G-CSF和pH在3.0-3.7的酸組成的藥物組合物，其導(dǎo)電率低于1000μmhos/cm。美國(guó)專利4,992,271(Fernandes等，1991年2月12授權(quán)，)涉及一種藥物組合物，它含有溶于pH6.8-7.8的水基載體介質(zhì)的生物學(xué)活性重組白介素2蛋白質(zhì)，它還含有蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑(如人血清白蛋白)。美國(guó)專利4,623,717(Fernandes等，1986年11月18授權(quán))涉及巴斯德滅菌的治療活性蛋白質(zhì)組合物，它是通過(guò)在滅菌前將能產(chǎn)生穩(wěn)定作用的用量的糖或還原糖以及氨基酸與蛋白質(zhì)混合使該熱敏感的治療活性蛋白質(zhì)巴斯德滅菌。美國(guó)專利4,645,830(Yasushi等，1987年2月24日授權(quán))涉及一種穩(wěn)定的白介素2組合物，在pH 3到6的溶液中含有白介素2、人血清白蛋白和一種還原化合物。美國(guó)專利4,647,454(Cymbalista，1987年3月3日授權(quán))涉及一種用聚乙烯吡咯烷酮穩(wěn)定人成纖維細(xì)胞干擾素的方法。美國(guó)專利4,675,184(Hasegawa等，1987年6月23日授權(quán))涉及一種治療病毒感染的藥物組合物，其中含有干擾素、三或多羥糖醇，有機(jī)緩沖液和藥用載體或稀釋劑，這種組合物的pH大約3到6。上述文獻(xiàn)全文引作參考。
一例有療效的蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSFs)。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是幾種糖蛋白生長(zhǎng)因子(稱為集落刺激因子)之一。這類集落刺激因子能支持造血祖細(xì)胞的增殖，并刺激特異骨髓前身細(xì)胞的增殖及它們分化形成粒細(xì)胞。另外，G-CSF能夠刺激嗜中性粒細(xì)胞集落的形成并體外誘導(dǎo)鼠骨髓單核白血病細(xì)胞的晚期分化。G-CSF還顯示出能刺激嗜中性粒細(xì)胞的功能活性導(dǎo)致其殺微生物活性增強(qiáng)。已知G-CSF有174個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
已經(jīng)制備出重組形式的CSFs和G-CSFs。編碼人G-CSSF的DNA的克隆和表達(dá)是已知技術(shù)(Nagata，S等，自然319415-418(1986))。WO-A-8604606和WO-A-8604506描述了編碼人G-CSF的基因。美國(guó)專利5,606,024(Boone等，1997年2月25日授權(quán))和美國(guó)專利5,472,857(1995年12月5日授權(quán))描述了編碼犬粒細(xì)胞集落刺激因子(cG-CSF)的DNA序列以及一種通過(guò)將有效量的人和犬G-CSF給予犬科或貓科動(dòng)物來(lái)治療或抑制這些動(dòng)物感染的方法。美國(guó)專利4,810,643(Souza，1989年3月7日授權(quán))描述了人G-CSF樣多肽。歐洲專利申請(qǐng)719860(1996年7月3日公開)描述了天然存在的牛粒細(xì)胞集落刺激因子(bG-CSF)的氨基酸序列、編碼bG-CSF的DNA序列以及通過(guò)給予動(dòng)物有效量G-CSF來(lái)治療或抑制動(dòng)物乳腺炎的方法。WO-A-8702060描述了人G-CSF樣多肽、它們的編碼序列和制備方法。美國(guó)專利4,833,127(Ono等，1989年5月23日授權(quán))描述了一種新的生物活性人粒細(xì)胞集落刺激因子。歐洲專利申請(qǐng)612846(1994年8月31日公開)描述了某些G-CSF類似物和含有這些類似物的組合物(上述文獻(xiàn)全文引作參考)。
粒細(xì)胞集落刺激因子可以用作抗感染試劑，它能提高動(dòng)物的免疫力，而不是作用在特定的生長(zhǎng)或毒性必需的微生物靶上。很少有其他獸醫(yī)用商品試劑作用于非特異性免疫反應(yīng)，從而提高對(duì)微生物感染的抗性，已有的有效控制方法僅限于常規(guī)抗菌藥和有限數(shù)量的生物制品。牛奶減產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失限制了常規(guī)抗菌藥的使用。目前的疫苗僅作用于有限數(shù)量的種類，并且這些試劑在野外的藥效變化很大。最成功的疫苗(大腸桿菌J5)由于其內(nèi)毒素污染引發(fā)的安全問(wèn)題限制了它們?cè)谑澜绶秶氖褂谩?br>
乳腺炎是影響全世界奶制品生產(chǎn)者的主要疾病。在美國(guó)，每年由乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億元。損失涉及死亡率、奶品丟棄、產(chǎn)奶量急速和緩慢減少、早年殺死的牛以及獸藥和畜牧勞力費(fèi)用增多。圍生期的奶牛免疫反應(yīng)性(嗜中性粒細(xì)胞的功能)減弱，這就使它們的乳腺更易受到細(xì)菌感染。大約40％新出現(xiàn)的臨床乳房?jī)?nèi)感染發(fā)生在分娩后的頭兩周內(nèi)，這一事實(shí)可以說(shuō)明易感性增加所造成的影響。乳腺炎與很多種病源菌(包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌)有關(guān)。已知能引發(fā)乳腺炎的病源微生物有大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。這些病源菌通過(guò)奶道進(jìn)入乳房，使產(chǎn)奶組織發(fā)炎，導(dǎo)致形成疤痕組織，造成永久喪失產(chǎn)奶力。各種形式的乳腺炎包括乳房感染、慢性乳腺炎、臨床乳腺炎和亞臨床乳腺炎。
目前的抗菌素療法和疫苗有許多缺陷，限制了它們?cè)诓溉槠谀膛Ｖ械氖褂?。已?jīng)發(fā)現(xiàn)用抗生素療法控制乳腺炎是不夠的。因此需要一種有助于恢復(fù)正常的免疫力，降低乳腺炎發(fā)生率和嚴(yán)重程度的生物治療劑。
牛呼吸道疾病，又稱為斑疹傷寒，是另一種常見的侵染牛的疾病。牛被船運(yùn)到飼養(yǎng)廠或牧場(chǎng)后由于受到各種壓力(包括斷奶、閹割、割角、禁食、擁擠、接觸感染物質(zhì)、飲食和溫度變化)，同時(shí)受到某種已知病原菌的感染而染上牛呼吸道疾病。溶血性巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)即是一種常見的導(dǎo)致牛呼吸系統(tǒng)損傷的病原菌。
還知道另外幾種感染性疾病(包括各種生殖疾病)能侵染人、豬、牛、狗、貓、馬、山羊、綿羊。一例這種疾病(在牛中發(fā)病)是子宮炎。
因此需要一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，它在體內(nèi)保持延長(zhǎng)的療效期。另外，還需要體外儲(chǔ)存保存期和儲(chǔ)存期延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)制劑。
本發(fā)明涉及一種包含蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，所述組合物能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持該蛋白質(zhì)的療效水平。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，所述組合物處于生理pH值。
本發(fā)明的其他具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，所述組合物處于生理溫度。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
本發(fā)明還有其它實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述持續(xù)時(shí)期是至少大約3天。
本發(fā)明還有其它實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自集落刺激因子、生長(zhǎng)激素、白介素、干擾素、細(xì)胞因子、抗體和抗原。
本發(fā)明更具體的實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自人G-CSF、牛G-CSF和犬G-CSF。
本發(fā)明更具體的實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是G-CSF，該G-CSF的濃度在0.01到5mg/ml范圍內(nèi)。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是G-CSF，穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
本發(fā)明其它更具體的實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是G-CSF，穩(wěn)定緩沖液的濃度在大約0.05M到大約2M范圍內(nèi)。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是G-CSF，所述組合物處于生理pH值。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是G-CSF，所述組合物處于生理溫度。
本發(fā)明更具體的實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF，該bG-CSF的濃度在0.01到5mg/ml范圍內(nèi)。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF，穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF，穩(wěn)定緩沖液的濃度在大約0.05M到大約2M范圍內(nèi)。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF，所述組合物處于生理pH值。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF，所述組合物處于生理溫度。
優(yōu)選，本發(fā)明所述穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物是含有溶于HEPES緩沖液的牛G-CSF的組合物。更優(yōu)選的是，HEPES緩沖液濃度為大約0.05M到大約2M。該牛G-CSF制劑優(yōu)選處于生理pH值(例如7.5)。而且，這種優(yōu)選的牛G-CSF制劑能夠在持續(xù)時(shí)間內(nèi)(從大約至少3天到7天或更長(zhǎng))維持牛G-CSF的療效水平。
另外，本發(fā)明所述穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物是含有溶于HEPES緩沖液的牛G-CSF的組合物，該組合物能保證延長(zhǎng)的保存期和保存期。優(yōu)選HEPES緩沖液濃度為大約0.05M到大約2M。更優(yōu)選該組合物pH維持在大約4.0-大約7.5，優(yōu)選4.0，溫度維持在低于大約40℃，優(yōu)選大約4℃。延長(zhǎng)的保存期和保存期為大約3周到大約18個(gè)月，優(yōu)選，在大約6周到大約1年。
本發(fā)明還涉及非腸道給予哺乳動(dòng)物的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的藥物學(xué)可接受劑型，它包含蛋白質(zhì)和藥用可接受的穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持所述蛋白質(zhì)的療效水平，其中的蛋白質(zhì)含量足夠?qū)⒉溉閯?dòng)物保護(hù)延長(zhǎng)的一段時(shí)期。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括一種藥物學(xué)可接受劑型，其中該劑型還包含選自粘性調(diào)節(jié)劑和表面活性劑的組分。
本發(fā)明還涉及非腸道給予哺乳動(dòng)物的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的藥物學(xué)可接受劑型的制備方法，該方法包括將蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液組合的步驟，這種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持所述蛋白質(zhì)的療效水平，其中蛋白質(zhì)含量足夠?qū)⒉溉閯?dòng)物保護(hù)至少3天。
本發(fā)明還涉及治療或防止哺乳動(dòng)物感染的方法，該方法包含給予哺乳動(dòng)物穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，包含給予哺乳動(dòng)物治療有效量的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，其中所述穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物含有蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平維持持續(xù)時(shí)期。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括這種治療或防止哺乳動(dòng)物感染的方法，其中所述蛋白質(zhì)是G-CSF。
本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防牲畜乳腺炎、子宮炎或牛呼吸道疾病的方法，它包括給予哺乳動(dòng)物穩(wěn)定的G-CSF組合物，包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的穩(wěn)定的G-CSF組合物，其中所述穩(wěn)定的G-CSF組合物含有G-CSF和穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持所述蛋白質(zhì)的療效水平。
本發(fā)明還涉及將蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的療效水平維持一段持續(xù)時(shí)期的方法，該方法包括以穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物對(duì)哺乳動(dòng)物給藥，其中所述穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物含有蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持所述蛋白質(zhì)的療效水平。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的療效水平的方法，其中所述穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的療效水平的方法，其中所述持續(xù)時(shí)期是至少大約3天。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的療效水平的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自集落刺激因子、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、抗體和抗原。細(xì)胞因子的具體例子包括白介素(例如白介素1-18)和干擾素(例如干擾素α、β和γ)。
本發(fā)明更具體的實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的療效水平的方法，其中所述蛋白質(zhì)是一種集落刺激因子。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的療效水平的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自人G-CSF、牛G-CSF和犬G-CSF。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)G-CSF的療效水平的方法，其中所述G-CSF的濃度為0.01到5mg/ml。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)G-CSF的療效水平的方法，其中所述穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)G-CSF的療效水平的方法，其中所述穩(wěn)定緩沖液的濃度在大約0.05M到大約2M。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)G-CSF的療效水平的方法，其中所述G-CSF是牛G-CSF。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)bG-CSF的療效水平的方法，其中所述bG-CSF的濃度為0.01mg/ml到5mg/ml。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)bG-CSF的療效水平的方法，其中所述穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
本發(fā)明其它具體實(shí)施方案包括這種在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)bG-CSF的療效水平的方法，其中所述穩(wěn)定緩沖液的濃度為大約0.05M到大約2M。
本發(fā)明還涉及用于將穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物給藥哺乳動(dòng)物的試劑盒，它包括含有治療有效量蛋白質(zhì)的第一個(gè)容器和含有藥物可接受的穩(wěn)定緩沖液的第二個(gè)容器，其中當(dāng)所述第一個(gè)容器中的治療有效量蛋白質(zhì)與第二個(gè)容器中的藥物可接受的穩(wěn)定緩沖液合并時(shí)，能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)維持該蛋白質(zhì)的療效水平。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括其中所述蛋白質(zhì)含量足夠?qū)⒉溉閯?dòng)物保護(hù)至少3天的試劑盒。
本發(fā)明優(yōu)選的組合物是含有牛G-CSF和HEPES緩沖液的穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物，這種組合物能夠在體內(nèi)將哺乳動(dòng)物中的牛G-CSF的療效水平維持至少3天，其中該組合物pH值約為7.5，溫度約為生理溫度或40℃。這種組合物在所述哺乳動(dòng)物是奶牛時(shí)特別有用。更具體地說(shuō)，HEPES緩沖液濃度在大約0.05M到大約2M范圍內(nèi)。特別優(yōu)選的是HEPES緩沖液濃度約為1M。優(yōu)選，牛G-CSF濃度為大約0.01到5mg/ml。最優(yōu)選bG-CSF濃度約為0.1mg/ml。
優(yōu)選，本發(fā)明還涉及一種含有牛G-CSF和HEPES緩沖液的穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物，該組合物能夠保證約3周到約18個(gè)月范圍內(nèi)的延長(zhǎng)保存期。特別優(yōu)選其中所述HEPES緩沖液濃度為大約0.05M到大約2M。同時(shí)優(yōu)選組合物pH值約為7.5，其溫度低于大約40℃，最優(yōu)選大約4℃。同樣特別優(yōu)選延長(zhǎng)的保存期從約6個(gè)月到約1年?；蛘撸@種保存期延長(zhǎng)的穩(wěn)定組合物能維持組合物的溫度在大約40℃。
圖1表示0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖。在40℃，HEPES緩沖液濃度為0.1M、1M和2M的儲(chǔ)存條件下。
圖2表示0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖，在40℃，TES緩沖液濃度為0.1M、1M和2M的儲(chǔ)存條件下。
圖3表示0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖，在40℃，TRICINE緩沖液濃度為0.1M、1M和2M的儲(chǔ)存條件下。
圖4表示2mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖，在40℃，HEPES緩沖液濃度為0.1M、1M和2M的儲(chǔ)存條件下。
圖5表示2mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖，在40℃，TES緩沖液濃度為0.1M、1M和2M的儲(chǔ)存條件下。
圖6表示2mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖，在40℃，TRICINE緩沖液濃度為0.1M、1M和2M的儲(chǔ)存條件下。
圖7表示牛外周血PMN總數(shù)(用對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示，0小時(shí)的數(shù)值)，牛是用在水、1M HEPES緩沖液、1M TES緩沖液和1M TRICINE緩沖液中制備的bG-CSF處理過(guò)的。
圖8表示bG-CSF(mg/ml濃度)的穩(wěn)定性對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖，bG-CSF溶在Neupogen緩沖液(對(duì)照，pH4.0)、HEPES緩沖液(pH7.4)、PBS緩沖液(pH7.0)、Hanks緩沖液(pH8.5)和重碳酸鹽緩沖液(pH8.2)中。
圖9表示于40℃，溶在1000mM、500mM、100mM、50mM和20mM的HEPES緩沖液中的bG-CSF(mg/ml濃度)的穩(wěn)定性(回收率％)對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖。
圖10表示兩種bG-CSF溶液對(duì)溫度(℃)的兩個(gè)溫譜圖(kcal/mole/deg)。上面的圖(最高溫度為47℃)是在PBS(pH7.5)中制備的bG-CSF，下面的圖(最高溫度為59℃)是在1M HEPES(pH7.5)中制備的bG-CSF。
圖11表示三種制劑的牛PMN(嗜中性粒細(xì)胞)％對(duì)時(shí)間的函數(shù)圖溶于水的bG-CSF(對(duì)照)、溶于1M HEPES的bG-CSF以及溶于1M HEPES+10％polaxamer的bG-CSF。
圖12表示溶于1M HEPES緩沖液(pH7.5)的bG-CSF的溶解度，相對(duì)bG-CSF濃度(mg/ml)測(cè)得的310nm吸光度。
圖13表示溶于1M HEPES緩沖液和PBS的牛G-CSF在40℃的穩(wěn)定性(起始濃度的％)。
圖14表示溶于1M HEPES緩沖液和PBS的人G-CSF在40℃的穩(wěn)定性(起始濃度的％)。
圖15比較了溶于1M HEPES緩沖液(pH7.5)的人G-CSF和牛G-CSF的穩(wěn)定性(起始濃度的％)。
圖16表示40℃時(shí)，溶于1M HEPES緩沖液(pH4.0)的bG-CSF隨時(shí)間(天)的起始濃度百分比。
圖17表示40℃時(shí)，溶于1M HEPES緩沖液(pH7.5)的bG-CSF隨時(shí)間(天)的起始濃度百分比。
圖18表示40℃時(shí)，溶于1M TES緩沖液(pH4.0)的bG-CSF隨時(shí)間(天)的起始濃度百分比。
圖19表示40℃時(shí)，溶于1M TES緩沖液(pH7.5)的bG-CSF隨時(shí)間(天)的起始濃度百分比。
圖20表示儲(chǔ)存于5℃的樣品隨時(shí)間(周)的RP HPLC結(jié)果(％起始bG-CSF濃度)。
圖21表示儲(chǔ)存于5℃的樣品隨時(shí)間(周)的SE HPLC結(jié)果(％起始bG-CSF濃度)。
圖22表示儲(chǔ)存于30℃的樣品隨時(shí)間(周)的RP HPLC結(jié)果(％起始bG-CSF濃度)。
圖23表示儲(chǔ)存于30℃的樣品隨時(shí)間(周)的SE HPLC結(jié)果(％起始bG-CSF濃度)。
圖24表示儲(chǔ)存于40℃的樣品的RP HPLC結(jié)果(％起始bG-CSF濃度)。
圖25表示儲(chǔ)存于40℃的樣品隨時(shí)間(周)的SE HPLC結(jié)果(％起始bG-CSF濃度)。
圖26是bG-CSF的CD(圓二色性)譜。
圖27是222nm波長(zhǎng)的摩爾橢圓率對(duì)溫度的函數(shù)圖。
圖28表示40℃時(shí)，溶于各種濃度HEPES緩沖液(pH7.5)的bG-CSF隨時(shí)間(天)的起始濃度百分比。
圖29是在1M HEPES中制備的bG-CSF比照對(duì)照制劑的WBC，相對(duì)注射后時(shí)間(以小時(shí)計(jì))的圖。
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，本發(fā)明是基于這一驚人的發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)向蛋白質(zhì)中添加穩(wěn)定緩沖液，例如HEPES、TES和TRICINE來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)，具體說(shuō)是用于治療哺乳動(dòng)物(例如人、狗、貓、山羊、綿羊、馬和豬)感染的蛋白質(zhì)，從而穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物能在持續(xù)時(shí)間內(nèi)維持蛋白質(zhì)活性(體內(nèi)和體外)。就體內(nèi)活性而言，本發(fā)明所述穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物能在持續(xù)時(shí)間內(nèi)將這些蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)維持在療效水平。
具體說(shuō)，本發(fā)明是溶于穩(wěn)定緩沖液(例如HEPES或TES)的bG-CSF緩釋(有持續(xù)活性)制劑，它能提供延長(zhǎng)的藥物活性。已知bG-CSF在40℃左右變性，在中性pH不穩(wěn)定。這是問(wèn)題所在，因?yàn)槟膛５纳韕H即接近中性，體溫約為40℃。
本發(fā)明所述穩(wěn)定組合物中的蛋白質(zhì)可以是天然存在的蛋白質(zhì)、分離或純化的蛋白質(zhì)或者是重組方法制備的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括所有的化學(xué)修飾過(guò)的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾體(例如甲硫氨酸氧化、半胱氨酸S-烷基化和β-巰基乙醇添加的二硫化物、賴氨酸氨基的烷化等)。用于本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的優(yōu)選蛋白質(zhì)是G-CSF，最優(yōu)選bG-CSF。
G-CSF是指粒細(xì)胞集落刺激因子，包括天然形態(tài)的粒細(xì)胞集落刺激因子及各種變體和突變體，包括例如有1或多個(gè)氨基酸缺失、取代和/或添加的重組變體。這些變體和突變體保留了全部或足夠在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮療效的生物學(xué)活性。天然形態(tài)的G-CSF是一種糖蛋白，它包括174個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)和有三個(gè)附加氨基酸的形式。兩種形式都有5個(gè)半胱氨酸殘基，4個(gè)形成兩個(gè)二硫鍵，一個(gè)處于游離形態(tài)。
其他適用于本發(fā)明所述穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的蛋白質(zhì)的例子包括例如激活素、粘著分子(如L-選擇蛋白、CD-18和IGAM-1)、趨化因子、趨化因子、促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)因子、抑制素、胰島素、干擾素(如α、β、γ)；白介素(如白介素1-18)、leptin、巨噬細(xì)胞炎性蛋白、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子、巨噬細(xì)胞刺激蛋白、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白、嗜中性粒細(xì)胞抑制因子、制瘤素、生長(zhǎng)抑素、生長(zhǎng)激素(所有種的，例如豬、?；蛉?、干細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、血小板生成素以及上述所有蛋白質(zhì)的細(xì)胞相關(guān)和可溶受體及在給藥哺乳動(dòng)物時(shí)能提供有益或治療效果的任何和所有其它蛋白質(zhì)。能夠應(yīng)用在本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的具體蛋白質(zhì)的例子見表1。其它能夠用于本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的蛋白質(zhì)包括引作參考文獻(xiàn)的R&D Systems Catalogue(614 McKinley PlaceNE，Minneapolis MN 55413，USA)中描述的蛋白質(zhì)。
表1潛在的療效蛋白質(zhì)β2-微球蛋白(β2-M)6-組氨酸6Ckine雙調(diào)蛋白(AR)血管生成素(ANG)膜聯(lián)蛋白VB-淋巴細(xì)胞粘著分子(BL-CAM)β內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(β-ECGF)β神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-NGF)β肌動(dòng)蛋白(β-Actin)β動(dòng)物纖維素(BTC)腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)CD31(PECAM-1)CDIO睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNIF)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體α(CNTF Rα)CRG-2(IP-10)CXCR-1(IL-8 RA)CXCR-2(IL-8 RB)CXCR-3CXCR-4(融合素)細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子1(CINC-1)細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2β(CINC-2β)細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化因子2α(CINC-2α)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)分子4(CTLA-4)E-選擇蛋白內(nèi)皮素-1(ET-1)
表1(續(xù))潛在的療效蛋白質(zhì)Eotaxin(Eot)Eotaxin-2(Eot-2)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)上皮衍生嗜中性粒細(xì)胞吸引劑78(ENA-78)紅細(xì)胞生成素受體(Epo R)紅細(xì)胞生成素(Epo)Fas(CD95)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF-4)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(FGF-5)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6(FGF-6)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7/KGF(FGF-7)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF-8)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b(FGF-8b)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8c(FGF-8c)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(FGF-9)酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(酸性FGF)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(堿性FGF)纖連蛋白(FN)Fit-1Fit-3配體Fractalkine膠質(zhì)細(xì)胞系-衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)糖蛋白130(gp130)粒細(xì)胞趨化蛋白(GCP-2)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSF R)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(GM-CSF)
表1(續(xù))潛在的療效蛋白質(zhì)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GRO)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白α(GROα)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白β(GROβ)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白γ(GROγ)血過(guò)濾CC趨化因子I(HCC-1)肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)Heregulin α(HRG-α)Heregulin β1(HRG-β1)I-309胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)干擾素γ(IFNγ)白介素1受體拮抗劑(IL-1ra)白介素11受體(IL-11R)白介素12 p70(IL-12 p70)白介素13(IL-13)白介素16(IL-16)白介素2受體α(IL-2 Rα)白介素2受體β(IL-2 Rβ)白介素3(IL-3)白介素4受體(IL-4 R)白介素5(IL-5)白介素7受體(IL-7 R)白介素9(IL-9)IP-10JE/MCP-1角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子/FGF-7(KGF)
表1(續(xù))潛在的療效蛋白質(zhì)L-選擇蛋白潛伏相關(guān)肽(TGF-β1)(LAP TGF-β1)潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(潛在TGF-β1)Lepfln(OB)Leptin受體(Leptin R)白血病抑制因子受體α(LIF Rα)白血病抑制因子(LIF)LFA-1胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體(IGF-I R)胰島素樣生長(zhǎng)因子II(IGF-II)胞間粘著分子3(ICAM-3)胞間粘著分子1(ICAM-1)白介素11(IL-11)白介素1受體I型(IL-1 R1)白介素10(IL-10)白介素10受體(IL-10 R)白介素12(IL-12)白介素12p40(IL-12p40)白介素13受體α(IL-13 Rα)白介素15(IL-15)白介素17(IL-17)白介素18/1G1F(IL-18)白介素2(IL-2)白介素2受體γ(IL-2 Rγ)白介素3受體α(IL-3 Rα)白介素4(IL-4)白介素5受體α(IL-5 Rα)
表1(續(xù))潛在的療效蛋白質(zhì)白介素6(IL-6)白介素6受體(IL-6R)白介素7(IL-7)白介素8(IL-8)白介素9受體(IL-9R)白介素Iα(IL-Iα)白介素Iβ(IL-Iβ)白介素I受體II型(IL-I RII)Mac-1α鏈巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(M-CSF R)巨噬細(xì)胞炎性蛋白1γ(MIP-1γ)巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(MIP-3α)巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β(MIP-3β)巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP-1α)巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP-1β)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)巨噬細(xì)胞衍生趨化因子(MDC/DC-CK1)MARC/MCP-3Midkine(MK)MIG單核細(xì)胞趨化蛋白1/MCAF(MCP-1)單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP-2)單核細(xì)胞趨化蛋白3(MCP-3)單核細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4)
表1(續(xù))潛在的療效蛋白質(zhì)單核細(xì)胞趨化蛋白5(MCP-5)神經(jīng)細(xì)胞粘著分于(NCAM)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3(NT-3)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白4(NT-4)有潛在療效制瘤素M(OSM)P-選擇蛋白(CD62P)胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)胎盤生長(zhǎng)因子2(PIGF-2)血漿硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶血小板GPIIb/GPIII a(CD41a)血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PD-ECGF)血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)血小板衍生生長(zhǎng)因子A鏈(PDGF A鏈)血小板衍生生長(zhǎng)因子AA(PDGF-AA)血小板衍生生長(zhǎng)因子AB(PDGF-AB)血小板衍生生長(zhǎng)因子B鏈(PDGF B鏈)血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α(PDGF Rα)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β(PDG-F Rβ)多向素(PTN)前B細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子/SDF-1(PBSF)RANTES分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(SLPI)干細(xì)胞因子受體(SCF R)干細(xì)胞因子(SCF)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1β/PBSF(SDF-1β)
表1(續(xù))潛在的療效蛋白質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/PBSF(SDF-1)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α/PBSF(SDF-1α)血小板生成素(Tpo)胸腺和激活調(diào)節(jié)趨化因子(TARC)胸腺表達(dá)趨化因子(TECK)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1.2(TGF-β1.2)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白I(TGF-βbpI)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體(TGF-βRII)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βIII型受體(TGF-βRIII)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子/β5(YGF-β5)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGF-β3)TrkB腫瘤壞死因子α(TNF-α)腫瘤壞死因子β(TNF-β)腫瘤壞死因子I型受體(TNF RI)腫瘤壞死因子II型受體(TNF RII)血管細(xì)胞粘著分子1(VCAM-1)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)優(yōu)選的蛋白質(zhì)是能用于治療或防止哺乳動(dòng)物(如人、狗、牛、豬、山羊、綿羊、馬和貓)感染的蛋白質(zhì)。所述感染可以是細(xì)菌感染或原生動(dòng)物感染，或者是由病毒引起的。
本文中(除非另有說(shuō)明)的術(shù)語(yǔ)“感染”包括發(fā)生在哺乳動(dòng)物中的細(xì)菌性、原生動(dòng)物、真菌和病毒感染，以及與這些感染有關(guān)的，可以通過(guò)給藥本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物進(jìn)行治療或預(yù)防的疾病。
能用本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物進(jìn)行治療的感染性疾病包括(不僅限于)牛的感染性疾病，例如與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、克雷伯氏桿菌、棒狀桿菌(不僅限于這些菌)相關(guān)的牛乳腺炎；與感染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)、副流感病毒(PI3)、牛病毒性腹瀉病毒(BVD)、溶血性巴斯德氏菌、出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)相關(guān)的牛呼吸道疾??；生殖系統(tǒng)疾病(如子宮炎)；與大腸桿菌和艾美球蟲(Eimeria sp.)(不僅限于這些)相關(guān)的牛腹瀉。
其它能用本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物治療的感染疾病包括(但不限于)狗的感染性疾病(如膿皮病)以及狗的呼吸道疾病，又稱為kennel cough。
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物還能提供治療或預(yù)防感染之外的療效。治療或預(yù)防感染之外的療效的一個(gè)例子是將重組人G-CSF給藥狗和貓來(lái)改進(jìn)化學(xué)療法導(dǎo)致的骨髓抑制，從而使它們能接受更具攻擊性的癌癥治療手段。
本文中(除非另有說(shuō)明)的“穩(wěn)定”一詞表示在一段持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持蛋白質(zhì)的療效水平。所述維持蛋白質(zhì)的療效水平是發(fā)生于將本發(fā)明所述蛋白質(zhì)組合物給予哺乳動(dòng)物之后，或者體外使用前或儲(chǔ)存期間。可以利用文中描述的方法，通過(guò)相對(duì)于時(shí)間的起始濃度的百分比測(cè)定本發(fā)明所述蛋白質(zhì)組合物的穩(wěn)定性。
將本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物給藥哺乳動(dòng)物后，它能使蛋白質(zhì)維持療效水平，從而蛋白質(zhì)能在持續(xù)時(shí)期內(nèi)提供治療或有益效果。本文中(除非另有說(shuō)明)術(shù)語(yǔ)“持續(xù)時(shí)期”表示在將本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物給予哺乳動(dòng)物后或者可選擇地體外使用前或儲(chǔ)存期間能維持蛋白質(zhì)療效水平的一段時(shí)間。
持續(xù)時(shí)期的蛋白質(zhì)療效水平能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)保證更長(zhǎng)時(shí)期的改善或治療作用，比將同樣的蛋白質(zhì)給予哺乳動(dòng)物而沒(méi)有穩(wěn)定緩沖液的可能時(shí)間更長(zhǎng)，例如與蛋白質(zhì)溶于水或PBS的對(duì)照溶液比較。或者，在體外儲(chǔ)存的條件下，持續(xù)時(shí)期的蛋白質(zhì)療效水平能提供更長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)增強(qiáng)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，比沒(méi)有穩(wěn)定緩沖液存在時(shí)可能將相同的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存的時(shí)間更長(zhǎng)，例如與蛋白質(zhì)溶于水或PBS的對(duì)照溶液相比)。優(yōu)選，持續(xù)期至少3天。最優(yōu)選，持續(xù)期大約7天或更長(zhǎng)。
文中(除非另有說(shuō)明)使用的術(shù)語(yǔ)“療效水平”表示在各種給藥療法中產(chǎn)生治療作用的蛋白質(zhì)的用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定這個(gè)量。蛋白質(zhì)的用量取決于感染的類型和嚴(yán)重程度、給藥途徑等。
“穩(wěn)定緩沖液”是指任何在與本發(fā)明所述穩(wěn)定組合物中的蛋白質(zhì)結(jié)合后，能提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的緩沖液，該組合物能夠在持續(xù)時(shí)期內(nèi)維持所述蛋白質(zhì)的療效水平。療效水平的維持可以通過(guò)本領(lǐng)城已知的方法(例如，測(cè)量蛋白質(zhì)活性)確定。優(yōu)選，穩(wěn)定緩沖液在生理pH下操作。穩(wěn)定緩沖液包括，但不限于有機(jī)緩沖液(例如通常稱為“優(yōu)良緩沖液”，在pH6到8.5操作的那些兩性離子緩沖液)。這樣的穩(wěn)定緩沖液實(shí)例包括HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)、TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)和TRICINE(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)、二甲次砷酸、雙(2-羥乙基)-亞氨基-三(羥甲基)甲烷(BISTRIS)、哌嗪-N，N’-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)、咪唑和三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)。能夠用于本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的緩沖液的例子見表2。
表2
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的pH可以在大約4.0到大約8的范圍內(nèi)。
文中(除非另有說(shuō)明)使用的術(shù)語(yǔ)“生理pH”表示存在于哺乳動(dòng)物(包括人、牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗和貓)的pH范圍。哺乳動(dòng)物的生理pH通常在大約6.5到大約8.0的范圍內(nèi)。
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的溫度可以在約20℃到約50℃的范圍內(nèi)。
文中(除非另有說(shuō)明)使用的術(shù)語(yǔ)“生理溫度”表示存在于哺乳動(dòng)物(包括人、牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗和貓)的體溫范圍。哺乳動(dòng)物的生理溫度通常在大約37℃到大約41℃的范圍內(nèi)。某些代表性哺乳動(dòng)物的生理溫度如下人37℃；牛39℃；貓38℃；狗39℃；山羊39℃；馬37℃；和豬37℃。
優(yōu)選，本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物含有蛋白質(zhì)G-CSF，更優(yōu)選，溶于穩(wěn)定緩沖液的牛G-CSF，該緩沖液選自HEPES緩沖液、TES緩沖液和TRICINE緩沖液。所得穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物能在牛的生理pH和其大約40℃的生理溫度，將療效水平的bG-CSF活性維持至少3天的持續(xù)時(shí)間。
利用已知的常用結(jié)合技術(shù)，通過(guò)結(jié)合蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液制備穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物。制備穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的特定方法包括使用根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)制備的純化形式的蛋白質(zhì)。
對(duì)于有醫(yī)療價(jià)值的特定蛋白質(zhì)，可以將該蛋白質(zhì)(以其最大溶解度)溶于不同濃度，如從0.05到2M的各種緩沖液，例如HEPES、TES、TRICINE或其它緩沖液。另外，溶液的pH是可變的，通常從大約pH4.0到大約8.0。蛋白質(zhì)在特定緩沖液中的最大溶解度可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)手段確定。隨后可將溶液儲(chǔ)存于該蛋白質(zhì)溶液將要給藥的哺乳動(dòng)物的生理溫度，確定蛋白質(zhì)在溶液中的量(作為時(shí)間的函數(shù))。溶液中的療效水平的蛋白質(zhì)可以通過(guò)蛋白質(zhì)的回收％確定(作為時(shí)間的函數(shù))?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)的殘留量或回收％與已知的蛋白質(zhì)產(chǎn)生療效所需閾值水平進(jìn)行比較。然后可將溶液中殘留的蛋白質(zhì)的量等于或大于已知的蛋白質(zhì)產(chǎn)生療效所需閾值水平的天數(shù)定為持續(xù)時(shí)間?？勺鳛榉€(wěn)定緩沖液的緩沖液是這樣的緩沖液，當(dāng)其與特定蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，能將蛋白質(zhì)的療效水平維持延長(zhǎng)的時(shí)間，即比沒(méi)有穩(wěn)定緩沖液時(shí)，將相同蛋白質(zhì)給藥哺乳動(dòng)物可能的時(shí)間長(zhǎng)。
可以通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)活性(對(duì)時(shí)間的函數(shù))確定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的伸展溫度(Tm)可以作為溶液穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)在體內(nèi)的穩(wěn)定性的標(biāo)志。特定蛋白質(zhì)的伸展溫度表示蛋白質(zhì)失去二級(jí)結(jié)構(gòu)，通常也失去活性的溫度，這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法，例如差示掃描熱量測(cè)定法測(cè)定。
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物中的蛋白質(zhì)含量可以在大約0.1mg/ml到大約5mg/ml。對(duì)于G-CSF，優(yōu)選的范圍在大約0.1mg/ml到大約3mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的一個(gè)例子是一種含有bG-CSF和HEPES緩沖液的組合物，其中所述bG-CSF濃度范圍在大約0.1mg/ml到大約5mg/ml，HEPES緩沖液的濃度范圍為大約0.1M到大約2M。更優(yōu)選bG-CSF濃度范圍在大約0.1mg/ml到大約3mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的另一個(gè)例子是一種含有bG-CSF和TES緩沖液的組合物，其中所述bG-CSF濃度范圍在大約0.1mg/ml到大約5mg/ml，TES緩沖液的濃度范圍為大約0.1M到大約2M。更優(yōu)選bG-CSF濃度范圍在大約0.1mg/ml到大約3mg/ml。
根據(jù)本發(fā)明，穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的再一個(gè)例子是一種含有bG-CSF和TRICINE緩沖液的組合物，其中所述bG-CSF濃度范圍在大約0.1mg/ml到大約5mg/ml，TRICINE緩沖液的濃度范圍為大約0.1M到大約2M。更優(yōu)選bG-CSF濃度范圍在大約0.1mg/ml到大約3mg/ml。
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)手段制備成冷凍形式或凍干形式。凍干形式的蛋白質(zhì)可以用穩(wěn)定緩沖液重配?；蛘?，儲(chǔ)存液態(tài)形式的溶液以便立即使用。優(yōu)選，本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物處于液態(tài)，它能在長(zhǎng)期保存中保持活性。
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物可以經(jīng)口、腸胃外(皮下、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌內(nèi))、鼻(例如通過(guò)吸入)、眼內(nèi)或皮內(nèi)或用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式通過(guò)灌輸方法給藥。優(yōu)選腸胃外給藥。
無(wú)論哪種給藥途徑，都可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或顯而易見的常規(guī)方法將本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物配制成藥物學(xué)可接受的劑型。
本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的醫(yī)藥可接受的劑型，優(yōu)選適于皮下給藥。用于皮下給藥的醫(yī)藥可接受的劑型通常體積不大于20ml(例如給藥馬和牛)，是無(wú)菌的(適用于哺乳動(dòng)物)，并且哺乳動(dòng)物對(duì)其耐受性好(即不會(huì)誘發(fā)注射部位腫脹、疼痛或壞死)。
通常，本發(fā)明所述醫(yī)藥可接受的劑型可以含有其它醫(yī)藥可接受的成分，例如表面活性劑或去污劑、粘性調(diào)節(jié)劑、糖或蛋白質(zhì)，這些附加成分用量適合有效、安全的藥用給藥。例如，可以按照慣例用載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑和/或防腐劑將本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物制成醫(yī)藥可接受的劑型。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲添加劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨醇和乳糖等。穩(wěn)定劑可以包括清蛋白等。其它的合適載體和添加劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知或顯而易見的。
可以用試劑盒形式提供本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物，該試劑盒包括含有治療有效量蛋白質(zhì)的第一個(gè)容器和含有醫(yī)藥可接受的穩(wěn)定緩沖液的第二個(gè)容器。蛋白質(zhì)可以是固態(tài)(如冷凍或凍干形式)或液態(tài)。然后可將穩(wěn)定緩沖液與蛋白質(zhì)合并，并給藥哺乳動(dòng)物，從而第一個(gè)容器的治療有效量蛋白質(zhì)在與第二個(gè)容器的醫(yī)藥可接受的穩(wěn)定緩沖液合并時(shí)，能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平在哺乳動(dòng)物體內(nèi)維持一段延長(zhǎng)的時(shí)期。
本發(fā)明具體實(shí)施方案包括其中的蛋白質(zhì)的量足夠保護(hù)哺乳動(dòng)物至少3天的試劑盒。
本發(fā)明醫(yī)藥可接受的劑型可以在大約0.1μg/kg到大約50μg/kg的范圍，優(yōu)選從大約1μg/kg到大約25μg/kg，最優(yōu)選從大約3μg/kg到大約25μg/kg。對(duì)bG-CSF最優(yōu)選的劑型是大約24μg/kg。該劑量至少在大約3天內(nèi)有效。
以下的實(shí)施例用于闡明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但本發(fā)明的范圍并非僅限于列舉的實(shí)施例所描述。
實(shí)施例1bG-CSF在HEPES、TES和TRICINE緩沖液中的持續(xù)穩(wěn)定性分別制備濃度為0.1M、1M、2M的三種緩沖液HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸)、TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸)和TRICINE(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)。緩沖液購(gòu)自Fluka Biochemica USA。用氫氧化鈉(J.T.Baker，USA)將每種緩沖液的pH調(diào)至7.5。緩沖液用0.2μm GV濾膜(Millipore USA)過(guò)濾除菌。制得的緩沖液濃度為HEPES緩沖液0.1M、1M和2M；TES緩沖液0.1M、1M和2M；TRICINE緩沖液0.1M、1M和2M。
在具有上述濃度的各種緩沖液(TES、TRICINE和HEPES)中制備含有0.1mg/mlbG-CSF的溶液。方法是將4.69mg的bG-CSF(根據(jù)效價(jià)為53.3％)加入25ml體積燒瓶，然后用適宜的緩沖液濃度補(bǔ)足體積。
在具有表1所述濃度的各種緩沖液(TES、TRICINE和HEPES)中制備含有2mg/ml bG-CSF的溶液。方法是將93.8mg的bG-CSF(根據(jù)效價(jià)為53.3％)加入25ml體積燒瓶，然后用適宜的緩沖液濃度補(bǔ)足體積。
隨后用0.22μm低蛋白結(jié)合濾膜(Millipore USA)過(guò)濾bG-CSF制劑。將1ml各鐘制劑裝入1ml小瓶中，然后在40℃烤箱放置9天。制得的bG-CSF緩沖液穩(wěn)定溶液為0.1mg/ml bG-CSF溶于(1)HEPES緩沖液0.1M、1M和2M；(2)TES緩沖液0.1M、1M和2M；和(3)TRICINE緩沖液0.1M、1M和2M。每3天從各個(gè)瓶中取樣，進(jìn)行體積排阻HPLC(SEC-HPLC)分析。結(jié)果示于圖1到6及表3和4。
表3<
表3顯示如上所述制備的0.1mg/ml bG-CSF溶液的回收率％(剩余)(時(shí)間的函數(shù))。溶液保存在40℃。
表4
表4顯示如上所述制備的2.0mg/ml bG-CSF溶液的回收率％(剩余)(時(shí)間的函數(shù))。溶液保存在40℃。
圖1至3顯示分別溶于各種濃度(0.1M、1M和2M)HEPES、TES和TRICINE緩沖液的0.1mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)，在40℃保存條件下的穩(wěn)定性。如圖1至3所示，當(dāng)緩沖液濃度增加到1M和更高時(shí)，bG-CSF活性的穩(wěn)定性或殘余量提高。在0.1mg/ml bG-CSF時(shí)，1M HEPES中的bG-CSF回收率為90％(圖1)。
圖4至6顯示分別溶于各種濃度(0.1M、1M和2M)HEPES、TES、TRICINE緩沖液的2.0mg/ml bG-CSF溶液(pH7.5)，在40℃保存條件下的穩(wěn)定性。如圖4至6所示，當(dāng)緩沖液濃度增加到1M和更高時(shí)，bG-CSF活性的穩(wěn)定性或殘余量同樣提高。
表3和4以及圖1至6中的數(shù)據(jù)表明緩沖液(HEPES、TES和TRICINE)的存在顯著地將bG-CSF活性維持持續(xù)時(shí)期，3到9天。
實(shí)施例2在水、1M HEPES、1M TES和1M TRICINE緩沖液中制備的bG-CSF的體內(nèi)效果取牛進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在水、1M HEPES、1M TES和1M TRICINE緩沖液中制備的bG-CSF的體內(nèi)效果。按24μg/kg的劑量對(duì)牛給藥，監(jiān)測(cè)PMN(嗜中性粒細(xì)胞)的數(shù)量。
圖7顯示用在水、1M HEPES、1M TES和1M TRICINE緩沖液中制備的bG-CSF處理的牛的外周血PMN總數(shù)(以對(duì)照的百分比，0小時(shí)的數(shù)值表示)。注射一次，三種緩沖液都給出接近100小時(shí)的康復(fù)期。這表明三種緩沖液都在體內(nèi)使注射部位的蛋白質(zhì)活性延遲。
實(shí)施例3HEPES緩沖液對(duì)bG-CSF的體外穩(wěn)定性的影響在各種緩沖液體系中配制bG-CSF(如下所述)，使其濃度為0.1mg/ml，pH在大約7.0到大約8.5。上樣前，用0.2微米濾膜(GV Millipore USA)將全部樣品過(guò)濾。于40℃將穩(wěn)定樣品裝柱，經(jīng)反相HPLC(RP HPLC)、SEC HPLC和生物測(cè)試監(jiān)測(cè)7到10天。用VP-DSC MicroCalorimetry系統(tǒng)(USA)測(cè)量bG-CSF的伸展溫度。
圖8給出bG-CSF在各種緩沖液體系中的穩(wěn)定性的比較結(jié)果，緩沖液體系包括作為對(duì)照的Neupogen(市場(chǎng)有售，USA，人G-CSF)、HEPES(pH7.4)、PBS(pH7.0)、Hanks緩沖液(市場(chǎng)有售，USA)和重碳酸鹽緩沖液。結(jié)果表明配制于1M HEPES緩沖液的bG-CSF是所有被測(cè)制劑中最穩(wěn)定的，并且顯示出與Neupogen緩沖液(pH4.0)相似的穩(wěn)定性。由于以前認(rèn)為bG-CSF在中性或生理pH及大約40℃或更高溫度是不穩(wěn)定的，HEPES緩沖液中的bG-CSF的穩(wěn)定性(圖8所示)是令人驚奇、出乎意料的。在PBS(pH7.0)、Hanks緩沖液和重碳酸鹽緩沖液中制備的bG-CSF不穩(wěn)定。表5證實(shí)了這一結(jié)果。
表5
*較高數(shù)值對(duì)應(yīng)較低活性溶于Neupogen和HEPES緩沖液的bG-CSF，于40℃保存7天未失去活性。還表明，較之起始活性，PBS中的bG-CSF活性低10倍，而Hanks和重碳酸鹽緩沖液中的bG-CSF活性低100到1000倍。
圖9顯示40℃時(shí)，HEPES緩沖液濃度(1000mM、500mM、100mM、50mM和20mM)對(duì)HEPES中的bG-CSF的穩(wěn)定性的影響。如圖9所示，隨HEPES濃度下降，bG-CSF的穩(wěn)定性顯著減弱。
圖10是兩種不同bG-CSF溶液的溫譜圖。上面的溫譜圖(最高溫度為47℃)是在PBS(pH7.5)中制備的bG-CSF，下面的溫譜圖(最高溫度為59℃)是在1MHEPES(pH7.5)中制備的bG-CSF。沒(méi)有HEPES緩沖液時(shí)，bG-CSF在pH7.5的伸展溫度約為40℃(開始的溫度)，而在1M HEPES中的bG-CSF伸展溫度增加10℃。伸展溫度的增加代表更穩(wěn)定。
實(shí)施例4在1M HEPES中制備的bG-CSF的體內(nèi)效果取牛進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在1M HEPES中制備的bG-CSF的體內(nèi)效果。按12μg/kg的劑量對(duì)牛給藥，監(jiān)測(cè)白細(xì)胞(WBC)和PMN(嗜中性粒細(xì)胞)的數(shù)量。結(jié)果見圖11。
圖11是隨時(shí)間變化的PMN％(嗜中性粒細(xì)胞)圖，它將三種制劑進(jìn)行了比較溶于水(作為對(duì)照)、1M HEPES、1M HEPES+10％ polaxamer的bG-CSF。如圖11所示，PMN的數(shù)量在閾值(與保護(hù)力相關(guān)的水平)以上停留了3天或72小時(shí)。每種制劑檢測(cè)了6頭牛。
在第二項(xiàng)研究中，按24μg/kg的劑量對(duì)牛給予，用溶于1M HEPES+10％polaxamer的bG-CSF，一次注射能提供約200小時(shí)的保護(hù)，或接近8天的康復(fù)期。這一結(jié)果顯示HEPES緩沖液提高了bG-CSF的體內(nèi)穩(wěn)定性，從而使其活性維持期延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的遞送期延長(zhǎng)。
實(shí)施例5bG-CSF在1M HEPES中的溶解度確定bG-CSF在1M HEPES(pH7.5)中的溶解度。將接近80mg bG-CSF溶解在30ml 1M HEPES緩沖液(pH7.5)中。蛋白質(zhì)溶液經(jīng)0.2μm GV Millipore濾膜過(guò)濾，然后轉(zhuǎn)入50ml超濾池。該池裝有截留分子量(MW)為10000的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜。用超濾池將蛋白質(zhì)溶液濃縮。在不同時(shí)刻，從池中取樣于310nm進(jìn)行UV-Vis分析(測(cè)量光散射)，并經(jīng)RP HPLC濃縮。用310nm的吸光度對(duì)濃度作圖。310nm的吸光度隨濃度線性升高；在飽和濃度處310nm曲線突然變化，吸光度劇增。在該點(diǎn)的濃度就是最大溶解度。這種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，常用于測(cè)定蛋白質(zhì)溶液度。如圖12所示，bG-CSF在1M HEPES(pH7.5)中的最大溶解度約為5mg/ml。曲線突變處的濃度表示蛋白質(zhì)的最大溶解度。在濃度約為5mg/ml的地方，310nm的吸光度突然升高，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的最大溶解度。
實(shí)施例6HEPES、TES和TRICINE緩沖液對(duì)bG-CSF伸展溫度的影響制備1M HEPES、2M HEPES、1M TES、2M TES和1M TRICINE中含有0.5mg/mlbG-CSF的溶液；以及1M HEPES、2M HEPES、1M TES、2M TES和1M TRICINE中含有2mg/ml bG-CSF的溶液。這些溶液是以與實(shí)施例1所述相同的方式制備的。用PBS(Dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液，pH7.4)制備對(duì)照溶液。bG-CSF溶液的pH為7.5。用差式掃描量熱法(Microcal Inc.USA)取每小時(shí)60度的掃描速率，在20℃到90℃的溫度范圍測(cè)定bG-CSF的伸展溫度。結(jié)果見表6。
表6伸展溫度(℃)
伸展溫度是溶液穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)在體內(nèi)穩(wěn)定性的標(biāo)志。表6中的結(jié)果表明溶于1M和更高濃度HEPES、TES或TRICINE緩沖液的bG-CSF的伸展溫度Tm)比PBS對(duì)照顯著升高。三種緩沖液使Tm升高了大約2℃到11℃。緩沖液的濃度極大地影響Tm升高的程度。bG-CSF的Tm隨緩沖液濃度增加而增加。當(dāng)HEPES濃度由1M增加到2M，升高大約3℃，當(dāng)TES濃度由1M增加到2M，升高大約5℃。而bG-CSF濃度增加時(shí)，其Tm下降。HEPES和TES中的bG-CSF濃度由0.5mg/ml增加到2mg/ml時(shí)，均降低了2℃左右。TES緩沖液在緩沖液濃度為2M、bG-CSF濃度為0.5mg/ml時(shí)使bG-CSF的Tm升高11℃以上。
表6中的結(jié)果顯示，與PBS相比，三種緩沖液(HEPES、TES和TRICINE)都使bG-CSF的Tm顯著升高。較之其他緩沖液，溶于2M TES的bG-CSF溶液穩(wěn)定性最高。
實(shí)施例7溶于PBS和HEPES的人和牛G-CSF制劑的穩(wěn)定性比較在磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s PBS，pH7.4)和1M HEPES緩沖液(1M HEPES，pH7.5)中制備0.15mg/ml hG-CSF和bG-CSF制劑。將制劑裝入1ml瓶(容積400ml)中，于40℃儲(chǔ)存10天。每3天通過(guò)體積排阻層析(SEC-HPLC)和目視檢測(cè)一次樣品。
圖13顯示與PBS相比，溶于1M HEPES緩沖液的人G-CSF穩(wěn)定性顯著提高。在PBS(pH7.4)中制備時(shí)，人G-CSF于40℃儲(chǔ)存10天即降解，而在1M HEPES緩沖液中制備時(shí)，觀察到回收率為65％。
圖13和14顯示牛G-CSF在HEPES和PBS制劑中的穩(wěn)定性略好于人G-CSF。溶于1M HEPES的牛G-CSF制劑于40℃儲(chǔ)存10天后的回收率約為80％，而人G-CSF為65％。兩種蛋白質(zhì)(人和牛G-CSF)在1M HEPES緩沖液中比在PBS中穩(wěn)定得多。
實(shí)施例8人和牛G-CSF在1M HEPES制劑中的穩(wěn)定性在1M HEPES緩沖液(1M HEPES，pH7.5)中制備0.1mg/ml hG-CSF和bG-CSF的制劑。將制劑裝入1ml瓶(容積400□l)中，于40℃儲(chǔ)存10天。每3天通過(guò)體積排阻層析(SEC-HPLC)和目視檢測(cè)一次樣品。
圖15顯示牛G-CSF和人G-CSF在1M HEPES制劑中的穩(wěn)定性。于40℃儲(chǔ)存10天后，牛G-CSF的回收率約90％，人G-CSF的回收率約70％。
實(shí)施例9制劑的pH值對(duì)bG-CSF穩(wěn)定性的影響在pH4.0和pH7.5的1M HEPES和1M TES緩沖液中制備0.1mg/ml bG-CSF溶液的制劑。將制劑裝入1ml瓶(容積400□l)中，于40℃儲(chǔ)存10天。每3天通過(guò)體積排阻層析(SEC-HPLC)檢測(cè)一次樣品。
如圖16和18所示，在pH4.0，于40℃儲(chǔ)存10天后bG-CSF回收率約100％，而圖17和19顯示bG-CSF制劑為pH7.5時(shí)，回收率約80-85％。
實(shí)施例10溶于1.0M HEPES和TES制劑中的bG-CSF 6個(gè)月取樣的長(zhǎng)期熱穩(wěn)定性研究以下給出該項(xiàng)研究包括的制劑。商品1.0M HEPES制劑購(gòu)自GibcoBRL(Lot#1016436)，1.0M Tes用購(gòu)自Fluka Scientific的粉末(Lot#PA12602)制備。調(diào)節(jié)緩沖液pH值至7.5。BG-CSF(純度為53.3％)由Bioprocess(Lot#BP185-11)提供。
在1.0M HEPES和1.0M TES緩沖液中制備0.1mg/ml和2.0mg/ml的bG-CSF制劑。
樣品儲(chǔ)存使用帶有13mm 1888 Gray T/F塞子(Lot#R05619-7487)的3.5mlFlint Type 1瓶(Lot#R04105-7322)，用1.0ml容積。表7給出全部樣品儲(chǔ)存和取樣點(diǎn)。每種制劑儲(chǔ)存5瓶用于各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。
表7樣品儲(chǔ)存和效價(jià)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)一覽表
進(jìn)行HPLC檢測(cè)前將2.0mg/ml bG-CSF制劑稀釋10倍。
從每個(gè)儲(chǔ)存室中取出各制劑的3個(gè)樣品(5、30、40℃)，通過(guò)RP和SEHPLC檢測(cè)bG-CSF的效價(jià)。每個(gè)樣品測(cè)3次。用預(yù)先繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。確定每組檢測(cè)樣品的占起始bG-CSF濃度的百分率(％)，計(jì)算各制劑在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的均值。將每個(gè)儲(chǔ)存溫度下的起始bG-CSF濃度的百分率％均值對(duì)時(shí)間做圖，示意bG-CSF效價(jià)的下降。圖20和21分別是RP和SE HPLC的結(jié)果(樣品儲(chǔ)存于5℃)。圖22和23給出樣品儲(chǔ)存于30℃的結(jié)果，樣品儲(chǔ)存于40℃的結(jié)果可見圖24和25。
除了溶于1M TES的0.1mg/ml蛋白質(zhì)制劑，儲(chǔ)存于5和30℃的樣品中的bG-CSF降解很小。
實(shí)施例11HEPES緩沖液對(duì)生物治療蛋白質(zhì)的穩(wěn)定能力用MicroCal(VP-DSC型)微熱量計(jì)測(cè)定以下討論的蛋白質(zhì)在磷酸和HEPES緩沖液中的Tm值。用購(gòu)自Aldrich的Na2HPO4(Lot#08019PQ)制備25mM磷酸緩沖液，調(diào)pH至7.5。1.0M HEPES緩沖液購(gòu)自GibcoBRL(pH7.5，Lot#1016436)。用攪拌超濾池(8010型，Amicon Inc.)，結(jié)合使用YM10或YM30 Diaflo超濾膜(Amicon Inc.)(取塊于蛋白質(zhì)大小)進(jìn)行緩沖液交換。
將購(gòu)自Bioprocess的2.0mg凍干的pST(Lot#41509-217-2)在2.0mlMilli-Q水中重新配置。交換5次后，用YM10膜將1.0ml重配蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入25mM磷酸緩沖液。剩下的1.0ml交換到1.0M HEPES緩沖液中。制備1.0mg/ml蛋白質(zhì)濃度的樣品，然后進(jìn)行微量量熱分析。pST的微量量熱分析在磷酸和HEPES緩沖液中均進(jìn)行兩次。
約2.0ml濃度為2.97的NIF(Lot#440631-22-7)購(gòu)自Bioprocess。將來(lái)自Bioprocess的樣品分成兩份。1.0ml該蛋白質(zhì)交換到25mM磷酸緩沖液中，剩下的NIF交換到1.0M HEPES緩沖液中。每種情況中，均用YM30膜交換5次。在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備濃度為1.0mg/ml的溶液，通過(guò)微量量熱法測(cè)定Tm值。
檢測(cè)的生物治療蛋白質(zhì)及在磷酸和HEPES緩沖液中測(cè)定的各自的Tm值列于表8。
表8用微量量熱法得到的四種生物治療蛋白質(zhì)在磷酸鹽和HEPES緩沖液中的Tm值
表8顯示HEPES緩沖液使NIF、pST的穩(wěn)定性都得以提高。
實(shí)施例12用HEPES緩沖液延長(zhǎng)重組牛粒細(xì)胞集落刺激因子(rbG-CSF)的體內(nèi)活性牛粒細(xì)胞集落刺激因子(bG-CSF)購(gòu)自Bioprocess Research andDevelopment-Pfizer(Grotor，CT)，甘露糖醇購(gòu)自E.M.Industries(Hawthorne，NY)，1×Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自GibcoBRL(GrandIsland，NY)，檸檬酸鈉和醋酸鈉購(gòu)自Aldrich(Milwaukee，WI)，Tween-80、氯化鈉和鹽酸購(gòu)自J.T.Baker(Phillipsburg，USA)。
RP-HPLC體積排阻層析(SEC)通過(guò)RP-HPLC和SEC監(jiān)測(cè)溶液的穩(wěn)定性。用Vydac Protein C4柱子進(jìn)行RP-HPLC，流動(dòng)相0.1％TFAH20(溶劑A)和0.1％TFA CAN(溶劑B)；流速1ml/min；UV監(jiān)測(cè)220nm；溫度25℃。用TosoHaas，TSK-GEL SWXL(7.8mm ID×30cm)柱子做體積排阻層析，其中利用流動(dòng)相溶于0.05M檸檬酸緩沖液(pH5.75)的0.3MNaCl；流速1ml/min；UV監(jiān)測(cè)280nm；溫度25℃。
微量量熱法檢測(cè)用VP DSC系統(tǒng)(MicroCal，Inc.)測(cè)量變性溫度(TD)。將約1ml溶液加入池中，以大約10℃/min.的速率相對(duì)參比的空白對(duì)照制劑進(jìn)行。
圓二色性用配備溫度掃描測(cè)量附件的圓二色性分光光度儀(CD*ORD J-710/720型-Japan Spectroscopic Co.，LTD)監(jiān)測(cè)bG-CSF的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
生物學(xué)測(cè)試用鼠骨髓細(xì)胞增殖檢測(cè)(BMC法)確定bG-CSF制劑的體外活性。從雌性CF1小鼠(Charles River)的股骨中無(wú)菌操作收集骨髓細(xì)胞，方法是取下股骨，用3cc/23G注射器和Hanks平衡鹽溶液(Gibco BRL)輕輕地從骨中沖出骨髓。細(xì)胞懸液經(jīng)尼龍篩過(guò)濾除去殘?jiān)?，于室溫?100rpm離心10分鐘。棄上清，將沉淀重懸于15ml補(bǔ)加10％胎牛血清(Gibco BRL)、1％青霉鏈霉素(10000單位/ml)、1％L-谷氨酰胺(Gibco BRQ)的RPM1培養(yǎng)基(Gibco BRL).用Coulter Channelyzer256測(cè)定骨髓細(xì)胞的數(shù)量，將細(xì)胞濃度調(diào)至6.67×105細(xì)胞/ml。向96孔平板的每個(gè)孔中加入約105細(xì)胞。然后在每個(gè)孔中加入不同濃度牛粒細(xì)胞集落刺激因子(一式三份)。于37℃保溫3天后，于5％CO2保溫3天，向每個(gè)孔中加入3H-胸苷(New England Nuclear，Boston，Mass)至終濃度2μCi/ml。放射性標(biāo)記于37℃，(5％CO2)進(jìn)行至少18小時(shí)。將板在-20℃冷凍，融化后用Brandel細(xì)胞收集器(Biomedical Research and DevelopmentLaboratories，Gaithersburg，Maryland)將細(xì)胞收集到玻璃96孔纖維片。用Wallac 1205 Betaplate液體閃爍計(jì)數(shù)儀(Wallac Gaithersburg，Maryland)測(cè)定活性。將每分鐘的樣品計(jì)數(shù)除以每分鐘的介質(zhì)對(duì)照計(jì)數(shù)(對(duì)背景的倍數(shù))確定bG-CSF制劑的活性。對(duì)背景的3或更高倍作為陽(yáng)性。
bG-CSF體內(nèi)活性在年輕的雜交牛(體重在約100-150kg范圍)中測(cè)試bG-CSF制劑的體內(nèi)活性。將買到的牛運(yùn)至動(dòng)物健康研究中心(Terre Haute，Indiana)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前使其對(duì)設(shè)備至少適應(yīng)兩天。多數(shù)牛用于一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，讓它們休息至少一周，然后進(jìn)行第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。不用牛做兩項(xiàng)以上實(shí)驗(yàn)。進(jìn)入一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前，在實(shí)驗(yàn)開始前1-3天將牛通過(guò)評(píng)估直腸溫度、體重、體質(zhì)和總的白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)和分類進(jìn)行預(yù)篩。通常直腸溫度≥104℃及總的WBC數(shù)<4000/mm3>或12000/mm3的牛被排除在外。在0天，處理前取牛血并稱重。根據(jù)體重計(jì)算在處理時(shí)間內(nèi)給予每頭牛的bG-CSF制劑的劑量(24μg/kg)，并經(jīng)頸部前肩胛處皮下注射給藥。處理后，于預(yù)定時(shí)間在頸部經(jīng)靜脈穿刺將血樣收集到EDTA抗凝血?jiǎng)┲羞M(jìn)行WBC/分類計(jì)數(shù)。在NovaCelltrak I血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中用1∶250稀釋在等壓稀釋液的全血計(jì)數(shù)總WBC。利用用Diff-Quik染色裝置(Dade)染色的干燥血液涂片，進(jìn)行分類WBC計(jì)數(shù)。在帶有100×油鏡和12.5×目鏡(總放大倍數(shù)＝1250×)的Zeiss光學(xué)顯微鏡上計(jì)數(shù)100個(gè)WBC并分類。
pH和溫度對(duì)bG-CSF溶液穩(wěn)定性的影響表9顯示溫度對(duì)bG-CSF穩(wěn)定性的影響。用溫度影響bG-CSF溶液的穩(wěn)定性后，進(jìn)行RP-HPLC、SEC-HPLC、生物學(xué)檢測(cè)和目測(cè)(制劑0.1mg/ml bG-CSF，5％甘露糖醇，10mM醋酸緩沖液，0.004％Tween-80，pH4.0)。從表9可看出bG-CSF的穩(wěn)定性在40℃或更高溫度有中斷。RP-HPLC和SEC-HPLC中，在40℃和更高溫度均丟失了母體蛋白質(zhì)峰。在較高溫時(shí)，母體蛋白質(zhì)峰消失，隨之溶液中的微粒增加。目測(cè)和在310nm光散射監(jiān)測(cè)均觀察到這一結(jié)果。于40℃儲(chǔ)存3周的牛G-CSF溶液比儲(chǔ)存在5℃和30℃的活性低10-100倍。于50℃儲(chǔ)存3周后，bG-CSF比儲(chǔ)存在5℃和30℃的溶液低100-1000倍。
表9 bG-CSF的穩(wěn)定性與溫度關(guān)系(3周的穩(wěn)定性)
在鼠BMC中檢測(cè)到的活性(注意高值代表低活性)用圓二色性(CD)跟蹤溫度對(duì)bG-CSF的影響。bG-CSF的CD光譜如圖26所示。這個(gè)譜圖提示bG-CSF的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋，與人G-CSF在結(jié)構(gòu)上非常相似。在不同溫度測(cè)定CD光譜以確定變性溫度(TD)。圖27是222nm(α-螺旋的特征波長(zhǎng))波長(zhǎng)下的摩爾橢圓率與溫度的關(guān)系圖。在40-50℃之間，摩爾橢圓率增加表明二級(jí)結(jié)構(gòu)的喪失及bG-CSF變性。
還測(cè)試了pH對(duì)bG-CSF溶液穩(wěn)定性的影響。為了僅描述pH對(duì)穩(wěn)定性的影響，而不包括溫度造成的變性的影響，將溶液保存在30℃(bG-CSF的TD在40-50℃之間)。表10總結(jié)了在30℃保存2周中，bG-CSF穩(wěn)定性與pH的關(guān)系。蛋白質(zhì)活性喪失速率隨pH升高而增加。數(shù)據(jù)表明在低pH，bG-CSF中的半胱氨酸質(zhì)子化，因此制劑更穩(wěn)定。在高pH，該游離半胱氨酸參與二硫鍵交換反應(yīng)，是導(dǎo)致不穩(wěn)定的可能原因。
表10 bG-CSF穩(wěn)定性與pH的關(guān)系(在30℃保存2周的穩(wěn)定性
在鼠BMC測(cè)試中檢測(cè)到的活性(注意較高值代表較低活性)HEPES緩沖液對(duì)bG-CSF溶液穩(wěn)定性的影響我們觀察到即使于40℃保存幾天，溶于1M HEPES緩沖液中的bG-CSF制劑也顯示更高的溶液穩(wěn)定性。這是出乎意料的，因?yàn)橐阎猙G-CSF在中性pH不穩(wěn)定，在40℃或更高溫度會(huì)變性。圖28顯示在保存溫度為40℃，pH7.5時(shí)，HEPES緩沖液濃度對(duì)bG-CSF溶液穩(wěn)定性的影響。bG-CSF的穩(wěn)定性隨HEPES緩沖液濃度下降而顯著降低。通過(guò)微量量熱法確定了1M HEPES對(duì)bG-CSF的變性溫度(TD)的影響。圖10(溫譜圖)比較了兩種制劑(有和沒(méi)有1M HEPES)對(duì)bG-CSF的TD的影響。沒(méi)有HEPES緩沖液，吸熱轉(zhuǎn)換在大約40℃開始，而溶于1M HEPES的bG-CSF的TD起點(diǎn)在50℃左右。變性溫度的升高通常是穩(wěn)定作用的標(biāo)志。
bG-CSF的體內(nèi)活性我們?cè)谀膛Ｖ性u(píng)估了這種制劑的體內(nèi)活性。圖29是隨時(shí)間的WBC計(jì)數(shù)圖，將在1M HEPES中制備的bG-CSF與“對(duì)照”制劑進(jìn)行了比較。“對(duì)照”是含有5％甘露醇、10mM醋酸緩沖液、Tween-80(pH4.0)的制劑。
由圖29可知，WBC計(jì)數(shù)僅在大約24-30小時(shí)內(nèi)停留在閾值(能防止感染的水平)以上(200％基線水平)。但是，當(dāng)在1M HEPES中制備bG-CSF時(shí)，PMN數(shù)量最少在3天或72小時(shí)內(nèi)(某些情況下WTC停留在閾值以上近一周)停留在閾值以上。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)有再現(xiàn)性(每次實(shí)驗(yàn)中，每種制劑用6頭牛)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HEPES緩沖液不僅可作為體外穩(wěn)定劑，還能以某種方式提高bG-CSF的體內(nèi)效果。
HEPES緩沖液影響bG-CSF的效果這一意外發(fā)現(xiàn)促使我們考察了類似的緩沖液，例如MOPS、HFPPS、TES和TRICINE。這些緩沖液與HEPES相似，也能提高bG-CSF的體外穩(wěn)定性。對(duì)溶于TES和TRICINE緩沖液的bG-CSF進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，與HEPES制劑相似，兩種制劑均使bG-CSF在奶牛體內(nèi)活性延長(zhǎng)。
將bG-CSF溶于1M HEPES使bG-CSF在體內(nèi)的活性延長(zhǎng)。這種延長(zhǎng)的活性可能是注射部位的bG-CSF穩(wěn)定性提高的結(jié)果。在1M HEPES中制備bG-CSF時(shí)，bG-CSF在中性pH和40℃的溫度下溶液穩(wěn)定性顯著提高。其它有機(jī)緩沖液(例如MOPS、HEPPS、TES和TRICINE)也能使bG-CSF穩(wěn)定性提高。
權(quán)利要求
1.一種含有蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，所述組合物能使該蛋白質(zhì)的療效水平維持延長(zhǎng)的時(shí)期。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自集落刺激因子、生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、抗體和抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是集落刺激因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自人G-CSF、牛G-CSF和犬G-CSF。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是牛G-CSF。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5的組合物，其中所述組合物處于生理pH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5的組合物，其中所述組合物處于約4.0到約7.5的pH范圍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或5的組合物，其中所述組合物處于生理溫度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或5的組合物，其中所述穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5的組合物，其中所述延長(zhǎng)期至少約為3天。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或5的組合物，其中所述延長(zhǎng)期至少為在體內(nèi)大約3天。
12.根據(jù)權(quán)利要求4或5的組合物，其中所述G-CSF的濃度從0.01mg/ml到5mg/ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5的組合物，其中所述穩(wěn)定緩沖液濃度為大約0.05M到大約2M。
14.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述穩(wěn)定緩沖液是HEPES，濃度為大約1M。
15.一種非腸道給藥哺乳動(dòng)物的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的醫(yī)藥可接受劑型，它包含蛋白質(zhì)和藥用可接受的穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平維持一段時(shí)期，其中所述蛋白質(zhì)含量足夠給哺乳動(dòng)物在預(yù)定時(shí)期內(nèi)提供療效。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的醫(yī)藥可接受劑型，其中所述劑型還含有選自粘性調(diào)節(jié)劑和表面活性劑的組分。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的醫(yī)藥可接受劑型，其中所述蛋白質(zhì)是以大約0.01mg/ml到5mg/ml的濃度存在的牛G-CSF，穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE，哺乳動(dòng)物是奶牛，預(yù)定的時(shí)間是至少約3天，組合物pH約7.5。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的醫(yī)藥可接受劑型，其中所述緩沖液是HEPES，該HEPES濃度為大約0.05M到大約2M。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的醫(yī)藥可接受劑型，其中所述牛G-CSF給藥劑量為大約0.1μg/kg到大約50μg/kg。
20.一種非腸道給藥哺乳動(dòng)物的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物的醫(yī)藥可接受劑型的制備方法，包含將蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液組合的步驟，這種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平維持持續(xù)時(shí)期，其中蛋白質(zhì)的量足夠保護(hù)哺乳動(dòng)物至少大約3天。
21.一種治療或防止哺乳動(dòng)物感染的方法，包含以治療有效量的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物給哺乳動(dòng)物給藥，其中這種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物含有蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平維持至少大約3天的持續(xù)時(shí)期。
22.一種治療或預(yù)防牛乳腺炎、子宮炎或牛呼吸疾病的方法，包括以治療有效量的穩(wěn)定的G-CSF組合物給奶牛給藥，其中這種穩(wěn)定的G-CSF組合物含有G-CSF和穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平維持至少大約3天的持續(xù)時(shí)期。
23.一種將蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的療效水平維持持續(xù)時(shí)期的方法，該方法包括以穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物給藥哺乳動(dòng)物，其中這種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物含有蛋白質(zhì)和穩(wěn)定緩沖液，該組合物能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)的療效水平維持大約至少3天的持續(xù)時(shí)期。
24.根據(jù)權(quán)利要求20、21、22或23的方法，其中所述蛋白質(zhì)是約0.01mg/ml到5mg/ml的牛G-CSF，穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE，所述組合物pH大約為7.5。
25.用于將穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物給藥哺乳動(dòng)物的試劑盒，它包括含有治療有效量蛋白質(zhì)的第一個(gè)容器和含有醫(yī)藥可接受的穩(wěn)定緩沖液的第二個(gè)容器，其中當(dāng)所述第一個(gè)容器中的治療有效量蛋白質(zhì)與第二個(gè)容器中的醫(yī)藥可接受的穩(wěn)定緩沖液合并時(shí)，能夠?qū)⑺龅鞍踪|(zhì)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的療效水平維持至少大約3天的持續(xù)時(shí)期。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)是約0.01mg/ml到5mg/ml濃度范圍的牛G-CSF，所述穩(wěn)定緩沖液選自HEPES、TES和TRICINE，所述組合物pH大約為7.5。
27.含有牛G-CSF和HEPES緩沖液的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物，該組合物能使延長(zhǎng)保存期在大約3周到大約18個(gè)月的范圍內(nèi)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中所述HEPES緩沖液的濃度為大約0.05M到大約2M，該組合物pH約為7.5，該組合物的溫度低于約40℃。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其中所述溫度是大約4℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組合物、該穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物的制備方法、將該穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物給藥哺乳動(dòng)物的劑型以及通過(guò)將該穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物給藥哺乳動(dòng)物預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物感染的方法。具體說(shuō),本發(fā)明所述穩(wěn)定蛋白質(zhì)組合物含有治療有效量的G－CSF(例如牛G－CSF),與穩(wěn)定緩沖液例如HEPES、TES或TRICINE結(jié)合,可用于治療和預(yù)防牛感染,包括乳腺炎。
文檔編號(hào)A61K38/19GK1250668SQ99122020
公開日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1999年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月17日
發(fā)明者P·C·肯寧, B·J·卡米克, K·卡斯萊恩 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司