專利名稱：用于抑制腫瘤性損傷的化合物的鑒定方法和含所述化合物的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用一種或多種形式的磷酸二酯酶2型(PDE2)和磷酸二酯酶5型(PDE5)和/或蛋白激酶G鑒定用于治療和預防哺乳動物前癌損傷和癌損傷的用途，并涉及含所述化合物的藥物組合物，以及用所述化合物治療腫瘤的方法。
目前，癌治療的非手術方法包括在患者的癌癥發(fā)展到化療/激素治療的益處比其副作用更重要的時候，給患者施用一種或多種高毒性的化療或激素治療方法。所述副作用是任何癌癥學家熟知的，并且因藥物的不同而不同。但是，標準化療方法僅用很短的時間，經(jīng)常一段時間停止治療，即交替地進行化療，以便不會因藥物的副作用而使患者難以承受。因此，如果風險-益處做比較，當患者有前癌損傷時，因副作用的存在通常人們不使用化療，或者在明顯的癌已經(jīng)被消除而需防止其復發(fā)時，也不在長期基礎上繼續(xù)進行化療或激素治療。
從十年前左右開始，一種意想不到的來源-非甾類抗炎藥物(NSAIDs)出現(xiàn)了一線希望。癌癥和前癌研究領域充斥了許多文獻，所述文獻描述了在腫瘤組織中過表達的各種生物化學分子，一組接一組地研究是否是特異性過表達的分子引起了所述疾病，而且，如果抑制所述過表達，是否腫瘤就可消除。例如，在家族性腺瘤息肉病(FAP)中，Waddell在1983年(Waddell，W.R.et al.，“Sulindac for Polyposis of theColon，”Journal of Surgical Oncology，2483-87，1983)認為由于在所述息肉中前列腺素過表達，所以，非甾類抗炎藥物(NSAIDs)應該可以消除所述疾病，因為NSAIDs抑制前列腺素合成酶(PGE2)的活性。因此，可以給數(shù)個FAP患者施用非甾類抗炎藥物(NSAID)舒林酸(一種PGE2抑制劑)。Waddell發(fā)現(xiàn)息肉退化并在所述治療后，不會復發(fā)。PGE2抑制產(chǎn)生于NSAID對環(huán)加氧酶(COX)的抑制作用。Waddell利用舒林酸的成功以及PGE2/COX關系似乎可證明其它兩種生物化學靶-PGE2和COX在癌形成中的作用，而且隨后的文獻進一步加強了這些觀點。
腫瘤患者的一線希望是舒林酸比常規(guī)化療藥物或激素藥物有確實小得多的副作用，而且提出了在癌癥早期治療癌癥的可能性，并比常規(guī)化療藥物有更長的應用時間。但是，所述希望因化合物如舒林酸是否可用于治療已顯癌癥問題的提出而不得不有所削弱，因為Waddell僅給患前癌、FAP的患者施用了舒林酸。
由于NSAID具有一系列副作用而使該希望有所破滅。長期施用舒林酸和其它NSAID時，會加重消化泳道的負擔，而PGE2在消化泳道中起保護作用。另外，當長期施用時，所述藥物對腎有副作用并會干擾正常的血液凝集。正如Waddell所不幸經(jīng)歷過的，他的一些舒林酸患者由于副作用而停止服用所述藥物(參見Waddell，W.R.et al.，“Sulindac for Poluposis of the Colon，”The American Journal of Surgery，157175-79，1989)，大部分需再進行外科手術以控制息肉的形成。因此，對于腫瘤患者來說，所述藥物不是一種可行的長期治療藥物，例如對于FAP、發(fā)散(sporadic)息肉或男人前列腺切除后產(chǎn)生的PSA(在所述男人中產(chǎn)生PSA表明了疾病的復發(fā)，可能還不是明顯可見的癌癥)。這些副反應也限制了NSAID在任何其它需長期進行藥物治療的腫瘤中的用途。最近，有些人提出可使用COX-2特異性NSAID如celecoxib。但是，認為所述化合物對腎和其它的副作用限制了所述化合物用于長期抗腫瘤指征的劑量和治療時間的長度。另外，最近公開的數(shù)據(jù)表明象celecoxib這樣的藥物需要很高的劑量以便僅在結腸息肉的預定區(qū)域?qū)Y腸息肉有明顯的作用。關于結腸癌癥治療可能更重要的是據(jù)報道某些結腸腫瘤(如HCT-116)不表達COX-2，而且所述抑制劑對所述腫瘤是無效的(參見，Sheng，et al.，“Inhibition of Human ColonCancer Cell Growth By Selective Inhibition of Cyclooxygenase-2，”J.Clin.Invest.，99(9)2254-9，1997)。
最近的發(fā)現(xiàn)已使科學家放棄COX/PGE2靶，因為這些靶對于成功地長期治療腫瘤患者不是主要的(或者可能甚至是二級靶)。Pamukcu等在美國專利5401774中公開了磺?；衔锟沙鋈艘饬系匾种贫喾N腫瘤細胞，包括結腸息肉細胞的生長，而據(jù)以前報道在實踐中磺?；衔锊灰餚GE2和COX抑制作用(因此它不是NSAID或抗炎類化合物)。在結腸癌形成的大鼠模型中，證明這些磺?；苌锸怯行У?，而在對患FAP患者的人臨床試驗中，已證明一種變體(現(xiàn)稱為exisulind)是有效的，而在明顯癌癥前列腺癌本身中，在下列所列的對照臨床研究中效果甚至更顯著。此外，最新研究已令人信服地表明在所有腫瘤中基本上都不表達COX I和/或COX II，削弱了將COX I或COX II特異性抑制劑廣泛用于腫瘤治療的希望(參見，Lim et al.，“SulindacDerivatives Inhibit Growth and Induce Apoptosis in Human ProstateCancer Cell Lines，”Biochem.Pharmacology，Vol.58，pp.1097-1107”(1999)，在印刷中)。
因此，象在腫瘤中過表達的許多其他蛋白質(zhì)一樣，PGE2/COX可能不是一些腫瘤形成的原因，而是其結果。但是，將這些發(fā)現(xiàn)結合起來，提出了象exisulind(對抑制表達COX和不表達COX的腫瘤有一定的活性)這樣的化合物如何起作用的問題？所述化合物對腫瘤細胞有什么影響的問題？Piazza等(在美國專利申請08 866027和09/046,739)發(fā)現(xiàn)化合物(如exisulind)抑制特異性環(huán)GMP磷酸二酯酶(例如PDE5)，發(fā)現(xiàn)其他這類化合物可用所述酶來篩選，這一發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)其他化合物并將其配制成抗腫瘤藥物組合物。所述藥物組合物是高度抗腫瘤的，并在實踐中可避免與常規(guī)化療藥物有關的副作用，或甚至避免COX或PGE2抑制作用的副作用，如果人們想避免所述副作用的話。另外，抗腫瘤形成的cGMP特異性PDE抑制化合物可誘導腫瘤細胞而不是正常細胞中的編程性細胞死亡(程序化細胞死亡或自殺的一種形式)。因此，所述新化合物已成為一類新的抗腫瘤藥物，它們是選擇性的編程性細胞死亡抗腫瘤藥物(SAAND)。因此，SAAND已經(jīng)向下列常規(guī)觀點提出挑戰(zhàn)(1)不殺死正常細胞的抗腫瘤化合物不可能是有效的；(2)COX’s引起腫瘤；和(3)NSAID的結腸腫瘤預防作用可能是由對一種或兩種COX的抑制作用介導的。
但是，下文所列的新研究已經(jīng)表明不是所有表現(xiàn)出典型PGE5抑制作用的化合物均可誘導腫瘤細胞中的編程性細胞死亡。例如，熟知的PDE5抑制劑，zaprinast和sildenafil不能單獨誘導編程性細胞死亡，或者從我們來看，甚至不能抑制腫瘤細胞生長。但是，由于前編程性細胞死亡PDE5抑制劑選擇性地誘導編程性細胞死亡(即，在腫瘤細胞，而不是正常細胞中)，而且這一點可以做到，而基本上沒有COX抑制作用，那么PDE5作為篩選理想抗腫瘤化合物的工具是不成問題的。
但是，對發(fā)現(xiàn)抗腫瘤、前編程性細胞死亡但安全的化合物的PDE5篩選方法是進行改進是人們所希望的，這樣可配制新的藥物組合物用于治療腫瘤包括前癌和癌癥。
在研究為什么一些PDE5抑制劑能夠單獨誘導編程性細胞死亡而其他一些則不能的過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一種以前未描述過的環(huán)GMP特異性磷酸二酯酶活性。以前從未表征過這種新的磷酸二酯酶活性。不受具體理論的限制，我們認為這種新PDE2活性可能是PDE2的一種新構型，它基本上沒有cAMP水解活性，即是cGMP特異性的。經(jīng)典的PDE2不是cGMP特異性(它也水解cAMP)，在腫瘤細胞中也發(fā)現(xiàn)了典型的PDE2。這種新PDE和PDE2可用于篩選具有理想抗腫瘤特性的藥物化合物。主要而言，在腫瘤細胞中，當抗腫瘤的PDE5抑制性化合物抑制PDE5和PDE2活性(以其新的和常規(guī)構型)時，結果就是編程性細胞死亡。當僅有PDE5(但不是PDE2的數(shù)種形式)受到抑制時，不會發(fā)生編程性細胞死亡。
從最廣泛的方面而言，這種新PDE構型有下列活性(a)對cGMP的特異性高于對cAMP的；(b)存在cGMP底物時，表現(xiàn)出積極的動力學行為；(c)對cGMP有亞微摩爾親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶一起保溫不敏感。
這種新PDE的其他特征包括對zaprinast和E4021引起的抑制作用的敏感性降低，通過陰離子交換色譜可與典型的PDE5活性分開，不受鈣/鈣調(diào)蛋白的激活，對咯利普蘭(rolipram)、長春西汀和引哚利旦(indolidan)不敏感。
本發(fā)明的另一實施方案涉及評估一種化合物在腫瘤細胞中是否可提高cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)活性和/或減少β-連環(huán)蛋白。已發(fā)現(xiàn)SAAND出人意料的特征包括提高與SAAND接觸的腫瘤細胞的PKG活性并減少β-連環(huán)蛋白。我們認為如上所述，PKG的升高至少部分是由于cGMP增加引起的，而cGMP的增加是由適宜PDE的SAAND抑制作用引起的。SAAND的其他特征是(1)在上述，694專利中報道的PDE5的抑制作用，(2)對新cGMP特異性PDE構型的抑制作用，(3)PDE2的抑制作用；(4)它們增加腫瘤細胞中細胞內(nèi)cGMP的事實，和(5)它們減少某些腫瘤細胞中的cAMP水平的事實。
因此，本發(fā)明新方法的一個實施方案是評估化合物是否會引起腫瘤細胞內(nèi)PKG活性提高以及所述化合物是否會抑制PDE5。本發(fā)明新篩選方法的另一實施方案是評估化合物是否會引起腫瘤細胞中PKG活性的增加以及所述化合物是否抑制上述新cGMP特異性PDE和/或PDE2。第三個實施方案是評估化合物是否會引起腫瘤細胞中PKG活性增加以及所述化合物是否引起腫瘤細胞中cGMP增加和/或引起cAMP水平下降。用所述方式評估的化合物用作SAAND。
其中本發(fā)明涉及用于篩選安全地治療和預防腫瘤，特別是前癌損傷的化合物的能力的新體外和體內(nèi)方法。具體地講，本發(fā)明是一種篩選化合物的方法，所述化合物用于治療和預防腫瘤，包括前癌損傷。所鑒定的化合物可能具有最小的副作用，所述副作用為COX抑制作用和與常規(guī)化療藥物有關的其他非特異性相互作用。通過將上述新PDE與所述化合物接觸，如果一種化合物抑制這種新PDE，則進一步評估(例如體外或體內(nèi)動物或人檢測模型或試驗)該化合物的抗腫瘤特性，由此來檢測所需的化合物。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及鑒定可有效治療腫瘤的化合物的篩選方法，該方法包括確定所述化合物對這種新PDE和/或PDE2的抑制作用和對COX的抑制作用。優(yōu)選本發(fā)明的篩選方法還包括確定所述化合物在體外或體內(nèi)是否抑制腫瘤細胞的生長。
與過去為開發(fā)藥物組合物和對腫瘤進行治療而篩選化合物相比，用這種方式篩選化合物，其好處和可用于治療腫瘤的更好的化合物可以更快更精確地被識別出來。其它的益處將由以下的詳細描述而顯而易見。
本發(fā)明還包括含所述化合物的藥物組合物以及利用所述化合物的治療方法。附圖描述

圖1是從SW480腫瘤細胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用從DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖2是從SW480腫瘤細胞得到的在負載有cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用從DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖3是本發(fā)明新PDE的動力學行為圖。
圖4說明舒林酸的硫化物衍生物和舒林酸的砜衍生物(a.k.a.exisulind)對純化的環(huán)加氧酶活性的影響。
圖5說明待測化合物B和E對COX抑制作用的影響。
圖6說明硫化舒林酸和exisulind對從培養(yǎng)的腫瘤細胞中純化的PDE4和PDE5的抑制作用。
圖7說明硫化舒林酸對HT-29細胞中環(huán)核苷水平的影響。
圖8說明化合物B的磷酸二酯酶抑制活性。
圖9說明化合物E的磷酸二酯酶抑制活性。
圖10說明硫化舒林酸和exisulind對HT-29細胞的編程性細胞死亡和壞死的影響。
圖11說明硫化舒林酸和exisulind對HT-29細胞生長抑制作用和用DNA斷裂確定的編程性細胞死亡誘導作用的影響。
圖12說明化合物E誘導編程性細胞死亡的特性。
圖13說明化合物B誘導編程性細胞死亡的特性。
圖14說明硫化舒林酸和exisulind對腫瘤細胞生長的影響。
圖15說明硫化舒林酸和對照(DMSO)的生長抑制作用和編程性細胞死亡誘導活性。
圖16說明化合物E的生長抑制活性。
圖17說明舒林酸代謝產(chǎn)物對小鼠乳腺器官中的前惡性腫瘤損傷的抑制作用。
圖18A是不存在加入的cGMP的條件下，來自經(jīng)藥物處理的細胞溶解產(chǎn)物的SW480細胞溶解產(chǎn)物的SDS蛋白質(zhì)凝膠，其中將細胞在含DMSO(0.03％，泳道1和2)，exisulind(200、400和600μM；泳道3、4、5)和E4021(0.1、1和10μM，泳道6、7、8)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。
圖18B是在存在加入的cGMP條件下，來自經(jīng)藥物處理的細胞溶解產(chǎn)物的SW480細胞溶劑產(chǎn)物的SDS(X射線膠片暴露)凝膠PKG檢測，其中將細胞在含DMSO(0.03％，泳道1和2)，exisulind(200、400和600μM；泳道3、4、5)和E4021(0.1、1和10μM，泳道6、7、8)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。
圖19是相對于對照，exisulind對腫瘤細胞中β-連環(huán)蛋白和PKG水平的影響的Western印跡試驗柱圖。
圖20是從HTB-26腫瘤細胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用來自DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖21是從HTB-26腫瘤細胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用低和高底物濃度，用來自DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖22是從LnCAP腫瘤細胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用來自DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖23是從LnCAP腫瘤細胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用低和高底物濃度，用來自DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖24是說明環(huán)腺苷酸類似物和所選的PDE5抑制劑的PDE5的非催化cGMP結合位點的特異性結合柱圖。
圖25是從SW480腫瘤細胞得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用乙二醇緩沖液洗脫DEAE-Trisacryl M柱而得的洗脫液檢測的。
圖26是從在旋轉(zhuǎn)瓶中生長的SW480腫瘤細胞中得到的cGMP磷酸二酯酶的cGMP活性圖，是用DEAE-Trisacryl M柱的洗脫液檢測的。
圖27A說明用50μM化合物I處理后，LNCaP細胞培養(yǎng)物中的組蛋白相關的片段化DNA的數(shù)量隨時間增加。
圖27B說明用化合物I(50μM)處理PrEC前列腺細胞的過程，在處理4天內(nèi)不影響DNA斷裂。優(yōu)選實施方案的詳細描述I.來自腫瘤細胞的新cGMP特異性磷酸二酯酶和PDE2A.新PDE構型的分離首先從得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(位于Rockville，Maryland，U.S.A)的通常稱為SW480的人癌細胞系制備分離的cGMP特異性磷酸二酯酶(該酶看來一種新的PDE2構型)。SW480是一種人結腸癌細胞系，來源于中度分化的上皮腺癌。如下文所討論的，從乳腺(即HTB-26細胞系)和前列腺(即LNCAP細胞系)的腫瘤也可分離出相似的構型。
我們所說的“分離”(正如本領域所理解的)不僅是從腫瘤細胞中分離，還可用重組方法制備(例如在細菌和其它非人宿主載體細胞系中表達)。但是，我們目前認為從人腫瘤細胞系分離是優(yōu)選的，因為我們認為這樣分離出的靶蛋白質(zhì)的結構，如果與腫瘤細胞中的天然構型之一不完全相同的話，也可能更相近。該構型有助于篩選在體內(nèi)抑制靶酶的抗腫瘤化合物。
在SW480結腸癌細胞系中首先發(fā)現(xiàn)了新的PDE活性。為了從SW480中分離出新的磷酸二酯酶，將大約4億個SW480細胞在150cm2組織培養(yǎng)皿中生長至匯合，然后用10mL冷PBS洗滌兩次后，從培養(yǎng)基皿中刮下，然后離心沉淀。將細胞再懸浮于勻漿緩沖液(20mLTMPI-EDTA-Triton pH 7.420mM Tris-HOAc，5mM MgAc2，0.1mMEDTA，0.8％ Triton-100，10μM芐脒，10μM TLCK，2000 U/mL抑肽酶、2μM亮肽素、2μM胃酶抑素A)中，并用Polytron tissumizer在冰浴上勻漿(3次，20秒/脈沖)。用Beckman L8超離心器在4℃，將勻漿的物質(zhì)以105000g離心60分鐘，用TMPI-EDTA(60毫升)稀釋上清液，然后用于將之加到已用TMPI-EDTA緩沖液預平衡過的10毫升DEAE-Trisacryl M柱。將上述樣的柱用60毫升TM-EDTA洗滌，用120毫升線性梯度NaOAC(0-0.5M)的TM-EDTA溶液洗脫PDE活性組分，流速為0.95mL/分鐘，1.4mL/餾分。收集8個餾分并立即檢測cGMP水解活性(即數(shù)分鐘內(nèi))。圖1表示柱的洗脫圖譜，揭示了兩個開始的cGMP PDE活性峰，峰A和B，它們分別是用40-50mM和70-80mMNaOAC洗脫的。如下文所解釋的，峰A是PDE5，而峰B是新的cGMP-特異性磷酸二酯酶活性峰。
用Thompson等(Thompson W.J.等Adv.Cyclic Nucleotide Res.1069-92，1979)改進的兩步放射性同位素法，按下文所述來確定各餾分的環(huán)腺苷酸PDE活性。反應在400μl含Tris-HCl(40mM；pH8.0)、MgCl2(5mM)、2-巰基乙醇(4mM)、牛血清白蛋白(30μg)，cGMP(0.25μM-5μM)和恒定氚化底物(200,000cpm)的溶液中進行。調(diào)整保溫時間以便只有不到15％的水解。將混合物在30℃保溫，然后煮沸45秒以停止反應。然后，將混合物冷卻，加入蛇毒(50μg)并將混合物在30℃保溫10分鐘。加入MeOH(1毫升)終止反應，然后將所述混合物轉(zhuǎn)移到陰離子交換柱(Dowex 1-X8，0.25mL樹脂)中。將洗脫液與另1毫升MeOH合并，加到樹脂上，加入6毫升閃爍液后，用Beckman LS 65000測量1分鐘氚活性。
為了進一步分離具cGMP水解活性的峰A和峰B組分，將頭80份餾分中的第15至30份再負載到DEAE-Trisaryl M柱上，然后用線性梯度NaOAC(0-0.5M)的TM-EDTA溶液洗脫。再立即檢測各餾分的cGMP水解作用(用上述方法，使用0.1，2，5μM底物)，其結果繪于圖2中。觀察到圖2中的峰B的一個結果是，與峰A相比，增加cGMP的底物濃度，其活性顯著增加。盡管此觀察結果與其作為一種PDE2是一致的，但是，圖2中表征的酶是一種cGMP特異性(見下文)的事實說明，與文獻中報道的典型PDE2相比，它是一種新構型。峰A活性說明了高親和性催化位點的表現(xiàn)底物飽和性。
B.從SW480中分離典型PDE2發(fā)現(xiàn)有兩種方法可以從SW480中分離“峰B”，以致該酶有典型PDE2活性(即不是cGMP特異性的，但是受cGMP刺激的)。第一種方法包括使SW480在850cm2康寧旋轉(zhuǎn)瓶中而不是150cm2組織培養(yǎng)燒瓶中生長。使SW480在0.5rpm的旋轉(zhuǎn)瓶中生長，各瓶含有200毫升RPMI 1640、2mM谷氨酸和25mM HEPES。按下列方法收集細胞。將PBS加熱至37℃至少15分鐘。制備200毫升5％ FBS/RPMI 1640完全培養(yǎng)基并加入5毫升谷氨酸。再加入5毫升抗生素/抗真菌素。
將70毫升PBS溶液加至10毫升4X Pancreatin中。將該混合物在室溫保持。除去培養(yǎng)基，將燒瓶用以確保燒瓶的底部被覆蓋的4毫升PBS漂洗。用移液管取出所有溶液。將4毫升稀釋的Pancreatin加至燒瓶中，搖動燒瓶以覆蓋其底部。將燒瓶在37℃保溫8-10分鐘。保溫后，在反轉(zhuǎn)顯微鏡下迅速觀察燒瓶以確保所有細胞均變圓。在燒瓶邊上仔細敲數(shù)次以幫助細胞剝離下來。將10毫升冷的完全培養(yǎng)基加至燒瓶中以終止Pancreatin蛋白水解。將溶液在底部渦漩以收集細胞。用25毫升移液管取出培養(yǎng)基，將細胞放在置于冰上的50毫升離心管中。在4℃，用臨床離心機將所述離心管以1000rpm離心5分鐘以沉淀細胞。倒掉上清液，將各沉淀用液氮冷凍15秒?？蓪⑹占募毎?70℃冷凍器中冷凍。
用FPLC方法分離來自所收集的SW480細胞的PDEs。用PharmaciaAKTA FPLC控制向18毫升DEAE TrisAcryl M柱的上樣和洗脫。用約6億個SW480細胞作圖。將細胞重懸于勻漿緩沖液(20mL TMPI-EDTA-Triton pH 7.420mM Tris-HOAc，5mM MgAc2，0.1mMEDTA，0.8％ Triton-100，10μM芐脒，10μM TLCK，2000 U/mL抑肽酶、2μM亮肽素、2μM胃酶抑素A)后，將樣品手工勻漿。FPLC緩沖液A是8mMTRIS-醋酸，5mM醋酸鎂，0.1mM EDTA，pH7.5，緩沖液B是8mMTRIS-醋酸，5mM醋酸鎂，0.1mM EDTA，1M醋酸鈉，pH7.5。將上清液以1mL/分鐘的流速上載到柱上，然后用60毫升緩沖液A以1mL/分鐘的流速洗滌。梯度是60毫升0-15％緩沖液B，60毫升15-50％緩沖液B，和16毫升50-100％緩沖液B。在所述梯度洗脫期間，收集1.5mL餾分。
所得的圖(圖26)與上述所得的新PDE活性(參見例如圖1)相似，不同的是，用該方法分離的峰B顯示出在0.25μM底物濃度時的cAMP水解活性，可以由5μM cGMP激活2-3倍。
從SW480中分離典型PDE2的第二種方法是用上述非FPLCDEAE柱方法(參見IA部分)完成，不同的是所述緩沖液含30％乙二醇、10mM TLCK和3.6mM β-巰基乙醇。將這些試劑加到緩沖液中使從低至高醋酸鈉的洗脫圖譜(參見圖25)有一個位移，使峰A從40mM移至150mM，峰B從75mM移至280mM，峰C從200mM移至500mM醋酸鈉(參見圖25)。圖25中的峰B用2μM cAMP底物檢測，表明被5μM cGMP激活2倍(參見圖-Y)。選擇性PDE2抑制劑EHNA在該B峰中抑制2μM cGMP PDE活性，其IC50為1.6μM；在B峰中也抑制2.0μM cAMP PDE活性，其IC50為3.8μM(加入10μM咯利普蘭的IC50為2.5μM)。
C.PDE A峰和新B峰活性的cGMP特異性在存在或不存在Ca++或Ca++-CaM和/或EGTA的條件下，檢測按上文IA部分所述的來自DEAE柱的各餾分的cGMP水解活性，在存在或不存在5μM cGMP的條件下，檢測所述餾分的cAMP(0.25μMcAMP)水解活性。PDE A峰和B峰(第5-22餾分，見圖1)都明顯不水解cAMP，這表明它們都沒有PDE的典型cAMP-水解家族(即PDE1、2、3)的活性。
Ca++(在或不存在鈣調(diào)蛋白的情況下)不能激活A峰或B峰的cAMP或cGMP水解活性，cGMP不能激活或抑制cAMP水解。所述結果表明A和B峰構成了cGMP-特異性PDE活性，但不是典型的或以前已知的PDE1、PDE2、PDE3或PDE4活性。
如上所討論的，對于新PDE B峰，環(huán)GMP激活該酶的cGMP水解活性，但不能激活任何cAMP活性(與上文IB部分的B峰相反)。這表明新PDE B峰--本發(fā)明新的磷酸二酯酶--不具有一種受cGMP--刺激的cAMP水解(“cGS”)或典型或以前已知的PDE2家族活性，因為已知的PDE2同種型即水解cGMP也水解cAMP。
D.A峰是一種典型PDE5，但新的B峰--一種新cGMP-特異性PDE-不是典型的PDE5為了表征任何PDE同種型，應評估其動力學行為和底物偏好。
A峰表現(xiàn)出典型的“PDE5”特征。例如，該酶對cGMP的Km是1.07μM，其Vmax是0.16nM/分鐘/mg。另外，如下文所討論的，zaprinast(IC50＝1.37μM)，E4021(IC50＝3nM)，sildenafil抑制A峰活性。另外，zaprinast抑制A峰的cGMP水解活性，這與文獻中報道的結果一致。
來自上文IA部分的PDE B峰與PDE A峰的動力學特性明顯不同。例如，在A峰的Eadie-Hofstee圖中，隨底物濃度的增加，環(huán)GMP水解是一條有負斜率的直線，這是Michaelis-Menten動力學行為的標志。但是，在不存在減少的cAMP的條件下，B峰有新的cGMP水解特性(表觀Km＝8.4)，隨cGMP底物的增加，Eadie-Hofstee圖的斜率增加(Km＜1)。
與動力學研究(即圖3)和存在cGMP底物的條件下正協(xié)同動力學行為一致，隨cGMP底物濃度的增加，cGMP水解活性增加。這是在第二次DEAE分離排除cAMP水解并排除該新酶是以前鑒定的PDE5后，在存在PDE B峰的條件下，通過比較0.25μM、2μM和5μM cGMP而發(fā)現(xiàn)的。如圖2所示，較高濃度的cGMP使PDE B峰引起不成比例的較大程度的cGMP水解。
這些觀察結果表明cGMP與B峰酶的結合引起該酶構型的改變。這證明了使用來自腫瘤形成細胞的天然酶的優(yōu)點，但本發(fā)明不限于有上述特征的所述酶的天然形式。
E.相對于A峰，PDE B峰的Zaprinast-和Silednafil-不敏感性，以及其對其它PDE抑制劑的影響用0.01-100μM的12種濃度的藥物和0.25μM3H-cGMP底物，研究不同PDE抑制劑。用不同斜率、采用Prism 2.01(GraphPad)的乙形曲線吻合法計算IC50值。結果列于表1。盡管化合物E4021和zaprinast抑制A峰，但是，用B峰的新PDE活性(上文IA部分)計算的IC50值(有高親和性)顯著增加(＞50倍)。這表明A峰是PDE5。這些數(shù)據(jù)進一步說明，對于所有實踐目的來說，本發(fā)明的新PDE活性均是zaprinast不敏感和E4021不敏感的。
表1A峰和上文IA部分B峰的PDE抑制劑的比較(cGMP水解)化合物 PDE家族抑制劑 A峰IC50(μM) B峰IC50(μM) 比例(IC50A峰/B峰)E4021 5 0.003 8.4 0.0004Zaprinast 5 1.4 ＞30 ＜0.05化合物E 5和其它0.38 0.37 1.0硫化舒林酸 5和其它50501.0長春西汀1 ＞100 ＞100EHNA2.5＞100 3.7引哚利旦3 31＞100 ＜0.31咯利普蘭4 ＞100 ＞100Sildenafil 5 .0003 ＞10 ＜.00003相反，硫化舒林酸和化合物E以相同的效力競爭性抑制A峰和B峰(對于PDE A峰，IC50＝0.38μM；對于PDE B峰，IC50＝0.37μM)。
B峰(其任一種形式)是zaprinast-不敏感的，而A和B峰均對硫化舒林酸和化合物E敏感的這一事實，對于治療腫瘤并選擇有用的化合物用于所述治療是極其重要的。我們已對zaprinast、E4021和sildenafil進行了試驗，以確定它們是否可誘導腫瘤細胞的編程性細胞死亡或抑制腫瘤細胞的生長，我們對化合物E進行了相同的試驗。如下文所解釋的，zaprinast自身沒有顯著的編程性細胞死亡-誘導或生長-抑制特性，而硫化舒林酸和化合物E正相反。換句話說，一種化合物抑制PDEA峰和B峰的能力與其誘導腫瘤細胞中編程性細胞死亡的能力成正比，而如果一種化合物(如zaprinast)僅對PDE A峰是特異性的，則該化合物本身不能誘導編程性細胞死亡。
F.新的PDE B峰對與cGMP-依賴性蛋白激酶G一起保溫不敏感在存在不同濃度的cGMP-依賴性蛋白激酶G(可使典型的PDE5磷酸化)的條件下，根據(jù)其不同的cGMP-水解活性，來觀察PDE A峰和新B峰(上文IA部分)之間的其它不同。具體地講，在30℃，將來自上文IA部分中A峰和B峰餾分與不同濃度的蛋白激酶G一起保溫30分鐘。在試圖磷酸化后，檢測兩個峰的環(huán)GMP水解。與以前公開的有關PDE5的資料一致，隨與蛋白激酶G一起保溫，A峰的cGMP水解活性增加，這表明A峰被磷酸化了。但是B峰沒有變化(即未被磷酸化，并對與cGMP-依賴性蛋白激酶G一起保溫不敏感)。這些數(shù)據(jù)與A峰作為已知PDE5家族的一種同種型相一致，而來自上文IA部分的B峰則具有一種新的cGMP-特異性PDE活性。
G.在前列腺和乳腺癌細胞系中的新B峰用與上述從SW480中分離新B峰相似的方法，再從其它兩種腫瘤細胞系乳腺癌細胞系HTB-26和前列腺癌細胞系LnCAP中分離新B峰。在一些方面對所述方法加以改進。為了提供更高的重復性以比較不同的細胞系，用Pharmacia AKTA FPLC來控制向18毫升DEAETrisAcryl M柱的上樣和洗脫。用相同的方法，將SW480處理多次以提供B峰的參照。用200-400百萬個SW480細胞作圖。用70百萬個LnCAP細胞作圖(參見圖22和23)，在另一試驗中，用32百萬個HTB-26細胞作圖(參見圖20和21)。將細胞重懸于勻漿緩沖液后，將樣品手工勻漿。FPLC緩沖液A是8mM TRIS-醋酸，5mM醋酸鎂，0.1mMEDTA，pH7.5；緩沖液B是8mM TRIS-醋酸，5mM醋酸鎂，0.1mMEDTA，1M醋酸鈉，pH7.5。將上清液以1mL/分鐘的流速上載到柱上，然后用60毫升緩沖液A以1mL/分鐘的流速洗滌。進行洗脫采用的梯度是60毫升0-15％緩沖液B，60毫升15-50％緩沖液B，和16毫升50-100％緩沖液B。在所述梯度洗脫期間，收集1.5mL餾分。在位于400mM醋酸鈉的第65餾分前后洗脫下cGMP PDE活性峰(見圖20-23)。用0.25μM cGMP測量該活性(表明cGMP的亞微摩爾親和性)。咯利普蘭，一種PDE4特異性藥物，它抑制大部分cAMP PDE活性(即cAMP活性來自于PDE4)，這表明B峰的cGMP活性對cGMP的特異性超過對cAMP的。所有這三個B峰(來自SW480、HTB-26和LnCAP)都不受鈣/鈣調(diào)蛋白的刺激，對100nM E4021有抗性，E4021與zaprinast一樣是一種PDE5-特異性抑制劑(見圖20和22)。當?shù)孜飶?.25μM增加至5μM cGMP時，B峰的活性明顯增加(表明積極的合作動力學)(見圖21和23)。另外，這三個峰被exisulind和化合物I的抑制也很相似。
II. 一般與蛋白激酶G和β-連環(huán)蛋白有關完成一系列試驗以確定抗腫瘤的cGMP-特異性PDE抑制劑如exisulind對腫瘤細胞中的cGMP依賴性蛋白激酶G(PKG)有什么影響(如果有的話)，所述腫瘤細胞含有腺瘤息肉coli基因(即APC基因)缺陷或β-連環(huán)蛋白編碼基因的缺陷。如下文所解釋的，所述抑制劑可提高所述腫瘤細胞中的PKG活性。在含上述任一種缺陷的細胞中，所述活性的增加不僅是由于PKG激活作用的增加，而且還歸因于含APC缺陷的細胞中PKG表達的增加。另外，當將來自具有任一缺陷的腫瘤細胞的PKG進行免疫沉淀時，它與β-連環(huán)蛋白一起沉淀。
β-連環(huán)蛋白與各種不同的癌癥有關，因為研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在患腫瘤的患者中，其水平很高，所述腫瘤含有在APC腫瘤抑制基因中的突變。出生時，帶有該基因缺陷的人常常會在其結腸襯中發(fā)展成數(shù)千小腫瘤。當其適當發(fā)揮功能時，APC基因編碼正常APC蛋白，認為該蛋白與β-連環(huán)蛋白結合并調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白。因此，發(fā)現(xiàn)含APC基因缺陷或β-連環(huán)蛋白缺陷的腫瘤細胞中的PKG與β-連環(huán)蛋白結合，這一發(fā)現(xiàn)確實有力地說明主要細胞途徑之一中的PKG會導致癌癥。另外，由于用SAAND治療后，cGMP-特異性抑制作用與PKG增加之間的關系而將所述細胞中的cGMP與PKG/β-連環(huán)蛋白/APC缺陷聯(lián)系起來。
含APC缺陷或β-連環(huán)蛋白缺陷的腫瘤細胞與SAAND接觸后，觀察到β-連環(huán)蛋白本身減少的結果進一步支持了后一種聯(lián)系。β-連環(huán)蛋白的這種減少是由PKG本身引起的。PKG使β-連環(huán)蛋白磷酸化--這是與本發(fā)明有關的另一新的觀察結果。β-連環(huán)蛋白的磷酸化可以β-連環(huán)蛋白被遍在蛋白-蛋白質(zhì)體系統(tǒng)降解。
PKG對β-連環(huán)蛋白的磷酸化在腫瘤細胞中是很重要的，因為它繞開了APC和β-連環(huán)蛋白突變的影響。突變的APC蛋白質(zhì)影響β-連環(huán)蛋白與突變的APC蛋白的結合，迄今為止，認為結合方面的變化抑制了GSK-3b激酶對β-連環(huán)蛋白的磷酸化。在突變β-連環(huán)蛋白的情況下，PKG活性的增加也可以使突變β-連環(huán)蛋白被磷酸化。通過用cGMP-PDE抑制作用來升高腫瘤中的PKG活性，可以使含任一種突變的腫瘤細胞中的β-連環(huán)蛋白被磷酸化(導致其降解)。
簡而言之，這些發(fā)現(xiàn)不僅導致了鑒定其它SAAND候選化合物的新的藥物篩選方法，而且還支持了cGMP-特異性PDE抑制作用在腫瘤治療方法中的作用。如上文所解釋的，該觀察結果也可解釋SAAND可抑制出人意料的寬范圍的腫瘤，因為含和不含APC的腫瘤均可被治療。
III.用PDEs篩選藥物組合物A. 綜述本發(fā)明的新PDE和PDE2與或不與PDE5一起可用來鑒定用于治療或預防腫瘤的化合物，所述化合物沒有嚴重的副作用。
癌癥和前癌被認為是與細胞生長失調(diào)有關的疾病。細胞生長涉及許多不同的因素。一方面是細胞如何快速增殖，另一方面是細胞如何快速死亡。根據(jù)環(huán)境刺激的類型，細胞可以因壞死或編程性細胞死亡而死亡。細胞分化是影響腫瘤生長動力學的另一因素。確定影響細胞生長的哪一種因素受化合物的影響，對于發(fā)現(xiàn)用于藥物療法的相關的治療靶是非常重要的。以該技術為基礎的篩選方法可以與其它檢測方法相結合以篩選出有生長抑制和前編程性細胞死亡活性的化合物。
本發(fā)明是數(shù)個重要發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)物。首先，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)理想的抑制腫瘤細胞生長抑制劑可通過編程性細胞死亡來誘導癌細胞的成熟前死亡(見，Piazza，G.A.，et al.，Cancer Research，55(14)，3110-16，1995)。第二，數(shù)位本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了一些化合物，所述化合物選擇性地誘導編程性細胞死亡，而基本上沒有COX抑制作用，這些化合物還抑制PDE5。具體地講，與以前的科學研究相反，治療腫瘤性損傷的理想化合物可抑制PDE5(EC3.1.4.17)。PDE5是磷酸二酯酶至少10個基因家族中的一個。PDE5和本發(fā)明的新PDE是獨特的，即它們選擇性地降解環(huán)GMP，而不降解cAMP，而其它PDE家族選擇性地降解/水解cAMP，而不降解cGMP或者非選擇性地降解cGMP和cAMP。優(yōu)選，用于治療腫瘤的理想化合物基本上不抑制非選擇性的或cAMP降解性磷酸二酯酶。
B.COX篩選本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括測定給定化合物的環(huán)加氧酶抑制活性，測定所述化合物的PDE5抑制活性。通過評估試驗化合物的活性與特定截斷值而直接地或通過將受試化合物的活性與用于治療腫瘤損傷的已知化合物的活性加以比較而間接地，來評價試驗化合物治療腫瘤損傷的能力。已知可有效治療腫瘤損傷而不會引起胃刺激的標準化合物是5-氟-2-甲基-1-(對-甲基磺?；鶃喥S基)-3-茚基乙酸(exisulind)。其它可用于比較目的的有用的化合物包括已知抑制COX的那些化合物，如消炎痛和舒林酸5-氟-2-甲基-1-(對-甲基磺?；鶃喥S基)-3-茚基乙酸的硫化物代謝物(舒林酸硫化物)。其它用于比較目的的有用化合物包括已知抑制PDE5的那些化合物，如1-(3-氯苯胺基)-4-苯-2，3-二氮雜萘(MY5445)。
文中所用術語“前癌損傷”包括以異常腫瘤形成為代表的綜合征，包括異型增生、組織改變。實例包括結腸、乳腺、前列腺或肺組織內(nèi)的異型增生，或如異型增生痣綜合征、皮膚惡性黑素瘤的前體等病癥。除異型增生痣綜合征外，實例還包括息肉病、結腸息肉、子宮的前癌損傷(即子宮異型增生)、食管、肺、前列腺異型增生、前列腺內(nèi)腫瘤、乳腺和/或皮膚以及相關疾病(如actinic keraosis)，不論所述損傷在臨床上是否是可鑒定的。
文中所用術語“癌”或“癌癥”指癌性損傷。實例包括惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌。文中所用術語“腫瘤”和“瘤”指癌性的和前癌性損傷。
文中所用縮寫PG指前列腺素；PS指前列腺素合成酶；PGE2指前列腺素E2；PDE指磷酸二酯酶；COX指環(huán)加氧酶；環(huán)核苷酸；RIA指放射性免疫檢測。
可用兩種方法中的任一種測定COX抑制作用。一種方法包括將完整HL-60細胞與待篩選化合物接觸，然后測定HL-60細胞分泌PGE2的量。另一種方法包括在存在所述化合物的條件下，測量純化的環(huán)加氧酶(COX)的活性。這兩種方法涉及在以前的文獻中描述過的操作方案，但優(yōu)選的是下列方法。
通過測量PGE2，評估本發(fā)明的化合物，以確定其是否可抑制前列腺素E2(PGE2)的生產(chǎn)。通過采用用于PGE2的酶免疫檢測(EIA)試劑盒(如從Amersham，Arlington Heights，IL USA購買的)測量細胞分泌的PGE2。適宜的細胞包括產(chǎn)生豐富PG的那些細胞，如HL-60細胞。HL-60細胞是人早幼粒細胞成熟粒細胞中，用DMSO分化。(參見Collins，S.J.Ruscetti，F(xiàn).W.，Gallagher，R.E.and Gallo，R.C.，“Normal FuctionalCharacteristics of Cultured Human Promyelocytic Leukemia Cells(HL-60)After Induction of Differentiation By Dimethylsulfoxide”，J.Exp.Med.，149969-974，1979)。在用鈣離子載體A23187刺激后這些分化的細胞產(chǎn)生PGE2(參見Kargman，S.，Prasit，P.and Evans，J.F.，“Translocation ofHL-60 Cell 5-Lipoxygenase”，J.Biol.Chem.，26623745-23752，1991)。HL-60細胞可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到(ATCCCCL240)。在37℃，5％CO2下，它們可在補加有20％熱滅活胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長。為了誘導骨髓分化，將細胞與1.3％ DMSO接觸9天，然后洗滌并將之以3×106細胞/ml重懸在Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液中。
在存在所需濃度的受試化合物的條件下，于37℃將分化的HL-60細胞(3×106細胞/ml)保溫15分鐘。然后用A23187(5×10-6M)對細胞刺激15分鐘。按上述測量分泌到外部培養(yǎng)基中的PGE2。
如上所述，評估化合物的COX抑制作用的第二種方法是在存在試驗化合物的條件下，檢測COX活性。文獻已經(jīng)報道有兩種不同形式的環(huán)加氧酶(COX-1和COX-2)可調(diào)節(jié)前列腺素合成。已知COX-2代表COX的可誘導形式，而COX-1代表構成形式。采用按Boopathy &Balasubramanian所述(“Purification And Characterization Of SheepPlatelet Cyclooxygenase”(Biochem.J.，239371-377，1988，該文獻引入本文作為參考))從公羊精囊純化的COX-1，通過Mitchell等描述的方法(“Selectivity of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs as Inhibitors ofConstitutive and Inducible Cyclooxygenase”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011693-11697，1993，該文獻引入本文作為參考)可測量COX-1的活性。按Mitchell等(1993，同上文)所述，用從羊胎盤中純化的COX-2可測量COX-2的活性。
用本領域已知的方法可測定藥物的環(huán)加氧酶抑制活性。例如，Boopathy & Balasubramanian(1988，同上文)描述了一種方法，其中在37℃將前列腺素H合酶1(Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan)與100μM花生四烯酸(Sigma Chemical Co.)、輔因子(如1.0mM谷胱甘肽、1.0mM氫醌、0.625μM血紅蛋白和1.25mM CaCl2，在100mMTris-HCl中，pH7.4)和待測藥物一起保溫20分鐘。保溫后，用三氯乙酸終止反應。通過加入硫代巴比土酸和丙醛終止反應后，可在530nm通過分光光度計測量酶活性。
顯然，相對于其較大的PDE5/新PDE/PDE2組合抑制活性而言，表現(xiàn)出最小COX-1或COX-2抑制活性的化合物可能是合乎需要的化合物。
在存在和不存在試驗化合物的條件下，通過比較環(huán)加氧酶的活性，來確定COX抑制的量。在約100μM有殘留(即小于約25％)或沒有COX抑制活性表示應進一步評估所述化合物是否可用于治療腫瘤。
C.確定磷酸二酯酶抑制活性用按上述分離出的酶、重組酶或者用新PDE和/或PDE2與PDE5一起，就對本發(fā)明新磷酸二酯酶的抑制作用來篩選化合物?；蛘?，通過RIA測量全細胞中的環(huán)核苷酸水平并與未處理的和經(jīng)zaprinast處理的細胞進行比較。
用本領域已知的方法，如用放射性3H環(huán)GMP(cGMP)(環(huán)3′，5′--鳥苷單磷酸)作為PDE酶的底物來測定磷酸二酯酶活性。(Thompson，W.J.Teraski，W.L.，Epstein，P.M.，Strada，S.J.，Advances in CyclicNucleotide Research，1069-92，1979，該文獻引入本文作為參考)。簡言之，在共400μl體積中，將確定底物3H-cGMP比活性的溶液(0.2μM；100,000cpm；含40mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2和1mg/mlBSA)與待測藥物混合。將混合物與本發(fā)明所分離的PDE一起在30℃保溫10分鐘。例如通過將反應混合物煮沸75秒鐘來終止反應。在冰上冷卻后，加入100μl 0.5mg/ml蛇毒(可從Sigma得到的O.Hannah蛇毒)，然后在30℃保溫10分鐘。然后通過加入例如1ml 100％甲醇來終止反應。將檢測樣品施加到1ml Dowex 1-X8柱上，用1ml 100％甲醇洗滌。然后用閃爍計數(shù)器測量背景和柱洗滌物中的放射性量。通過計算藥物處理反應中的放射性量，然后與對照樣品(不含試驗化合物的反應混合物)進行比較來確定磷酸二酯酶抑制的程度。
另外，通過與待篩選化合物接觸的腫瘤細胞中cGMP的增加，來反映本發(fā)明理想化合物抑制本發(fā)明磷酸二酯酶的能力。通過用放射性免疫檢測法(RIA)來檢測經(jīng)處理的細胞提取物中環(huán)GMP的量可確定PDE活性的量。在該方法中，將HT-29或SW-480細胞鋪開并使之生長至匯合。如上所述，SW480含有PDE5和本發(fā)明的新PDE，這樣當用這種方式評估PDE活性時，同時可測量組合的cGMP水解活性。然后，將試驗化合物以約200μM至約200pM的濃度，與細胞培養(yǎng)物一起保溫。約24至48小時后，將細胞與培養(yǎng)基分開，然后溶解細胞。用0.2N HCl/50％MeOH終止反應。取樣進行蛋白質(zhì)檢測。用陰離子交換色譜如Dowex柱，從細胞的酸/醇提取物中純化環(huán)GMP。將cGMP干燥，按照公開的方法如用醋酸酐三乙胺溶液(Steiner，A.L.，ParkerC.W.，Kipnis，D.M.，J.Biol.Chem.，247(4)1106-13，1971，該文獻引入本文作為參考)進行乙?；?。用放射性免疫檢測法(Harper，J.，Brooker，G.，Advances in Nucleotide Research，101-33，1979，該文獻引入本文作為參考)定量分析經(jīng)乙?；腸GMP。在存在抗血清和適宜緩沖液的條件下，將衍生的環(huán)GMP的碘化配體(酪氨酸甲酯)與標準物或未知物一起保溫。用環(huán)核苷酸半抗原介導的技術可生產(chǎn)抗血清。所述抗血清來自用琥珀酰-cGMP-白蛋自結合物注射的羊并以1/20,000進行了稀釋。按以前所述(Seibert，A.F.，Thompson，W.J.，Taylor，A.，Wilbourn，W.H.，Barnard，J.and Haynes，J.，J.Applied Physiol.72389-395，1992，該文獻引入本文作為參考)使用標準曲線進行劑量插入和誤差分析。
另外，將培養(yǎng)基酸化、冷卻(-70℃)并進行cGMP和cAMP分析。
除觀察到由所述理想化合物在腫瘤細胞中引起cGMP含量的增加外，還觀察到cAMP含量的減少。已觀察到特別理想的化合物(即選擇性誘導腫瘤細胞的編程性細胞死亡，而基本上不誘導正常細胞的編程性細胞死亡的化合物)具有與cGMP特異性PDE抑制相一致的時間過程，這是一種在數(shù)分鐘內(nèi)導致cGMP含量增加的起始作用。第二，用理想的抗腫瘤化合物處理腫瘤細胞導致cAMP在24小時內(nèi)減少。藥物作用的細胞內(nèi)靶還需進一步研究，但目前的數(shù)據(jù)表明開始時的cGMP含量增加和隨后cAMP含量的減少都是在與理想化合物接觸的腫瘤細胞中的編程性細胞死亡以前。
兩種環(huán)核苷酸比例的變化是一種更精確地評估試驗化合物的cGMP-特異性磷酸二酯酶抑制作用的工具，而不是僅僅測量cGMP的絕對值、cGMP-特異性磷酸二酯酶抑制作用，或者僅僅測量cGMP水解的水平。在未用抗腫瘤化合物處理的腫瘤細胞中，cGMP含量/cAMP含量的比例為0.03-0.05(即300-500fmol/mg蛋白質(zhì)的cGMP含量比6000-8000fmol/mg蛋白質(zhì)的cAMP含量)。與理想的抗腫瘤化合物接觸后，由于開始的環(huán)GMP增加和隨后環(huán)AMP的減少，該比例增加數(shù)倍(優(yōu)選至少增加3倍)。
具體地講，已觀察到特別理想的化合物可以使處理過的腫瘤細胞中在起始時cGMP含量增加達到大于約500fmol/mg蛋白質(zhì)的cGMP水平。另外，特別優(yōu)選的化合物使處理過的腫瘤細胞中隨后cAMP含量的減少達到小于約4000fmol/mg蛋白質(zhì)的cAMP水平。
為了確定環(huán)AMP的含量，使用與上述用于cGMP的相似的放射性免疫檢測技術。簡而言之，用陰離子交換色譜從細胞的酸/醇提取物中純化環(huán)核苷酸，干燥，按照公開的方法進行乙酰化并用放射性免疫檢測法定量分析經(jīng)乙?；腸GMP。在存在抗血清和適宜緩沖液的條件下，將衍生的環(huán)AMP和環(huán)GMP的碘化配體與標準物或未知物一起保溫。
通過確定完整細胞中環(huán)狀核苷酸的轉(zhuǎn)化或累積，可以驗證環(huán)狀核苷酸的含量。為測定完整細胞的cAMP，按照已經(jīng)公開的方法，采用3H-腺嘌呤預標記(Whalin，M.E.，Garrett Jr，R.L.，Thompson，W.J.，和Strada，S.J.“無細胞腦組織環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性與未處理的腦組織切片中環(huán)AMP衰減的相互關系”，Sec.Mess.and Phos.ProteinResearch，12311-325，1989，作為參考引入本文)。該方法測定標記ATP到環(huán)AMP的轉(zhuǎn)化量，它可以按照個別方案評價完整細胞腺苷酸環(huán)化酶或環(huán)狀核苷酸磷酸二酯酶的活性。環(huán)GMP累積量太低而不能按照公開的方法用完整細胞預標記研究(Reynolds，P.E.，S.J.Strada和W.J.Thompson，“通過完整細胞標記測量肺微血管內(nèi)皮細胞中環(huán)GMP的累積”《生命科學》60909-918，1997，作為參考引入本文)。
化合物的PDE抑制活性作用也可以從組織樣品中測定出來。從與試驗化合物接觸的受試體中采集人活組織切片或麻醉動物組織。簡單地說，組織樣品在500μl 6％的TCA中勻化。取出一定量的組織勻漿用于蛋白質(zhì)分析。其余的勻漿放置于冰面上20分鐘，以使蛋白沉淀。接著，勻漿在15,000g、4℃條件下離心30分鐘。取出上清液，收集沉淀。上清液用5倍體積的水飽和乙醚洗四次。每次清洗時棄去上層醚層。水醚提取物在快速真空下干燥。干燥后，樣品可以冷凍保存留作將來使用，或者立即使用。干燥提取物溶于500μ1分析緩沖液。如上所述利用RIA法通過分析環(huán)核苷酸的量確定cGMP的特異性抑制量。
通過比較存在和缺乏化合物情況下新PDE的活性，確定抑制量。新PDE(或PDE2)活性的抑制表明化合物在治療腫瘤中是有用的。當濃度為10μM或更低時，化合物的抑制活性明顯高于基準物——exisulind，優(yōu)選高出50％，表明應該進一步評價化合物的抗腫瘤性質(zhì)。當進一步考慮化合物的應用潛力時，新PDE抑制的IC50值最好應當?shù)陀?0μM。
D.測定A化合物是否降低了腫瘤細胞的生長在一個替換實施例中，本發(fā)明的方法涉及進一步測定化合物是否降低了腫瘤細胞的生長。在依賴受測組織的樣品中可以使用各種細胞系。例如，上述細胞系包括SW-480-結腸腺癌；HT-29-結腸腺癌；A-427-肺腺癌；MCF-7-乳腺癌；和UACC-375-黑素瘤系；以及DU145-衰竭性癌。通過這些細胞系獲得的細胞毒性數(shù)據(jù)顯示出對腫瘤損傷的抑制作用。這些細胞系的特征已有詳細描述，并且美國國家癌癥研究所在他們篩選抗癌藥物的程序中用到這些細胞系。
可以利用從ATCC得到的HT-29人結腸癌細胞系測定化合物抑制腫瘤細胞生長的能力。HT-29細胞以前曾作為相關結腸癌細胞培養(yǎng)模型描述(Fogh，J.，和Trempe，G.離體人腫瘤細胞，J.Fogh(編)，Plenum Press，New York，115-159頁，1975)。HT-29細胞在添加5％胎牛血清(Gemini生物制品有限公司，Carlsbad，CA)、2mm谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌劑的RPMI培養(yǎng)基中，在95％空氣、5％二氧化碳的潮濕大氣下，于37℃維持培養(yǎng)。簡要地說，HT-29細胞在96孔的微量滴定平板上鋪板，密度為500個細胞/孔，在添加化合物之前，先于37℃培養(yǎng)24小時。每次測定細胞數(shù)目重復六遍。培養(yǎng)六天后，加入冷三氯乙酸至終濃度為10％，固定細胞，利用Skehan，P.，Storeng，R.，Scudiero，D.，Monks，A.，McMahon，J.，Vistica，D.，Warren，J.T.，Bokesch，H.，Kenney，S.，和Boyd，M.R.，(“用于抗癌藥物篩選的新的比色分析法”天然癌癥研究雜志，821107-1112，1990，作為參考引入本文)描述的硫氰酸胺B(SRB)蛋白染色比色分析法測定蛋白濃度。
除了SRB分析法，很多其他方法也可以用來測定生長抑制，并且可以代替SRB分析法。這些方法包括錐蟲藍染色后統(tǒng)計活細胞數(shù)、用BrdU或放射性標記的胸苷標記能夠進行DNA合成的細胞、活細胞的中性紅染色、或者活細胞的MTT染色。
當劑量為100μM或更低時，高出約50％的顯著的腫瘤細胞生長抑制進一步顯示，化合物在治療瘤變中是有用的。最好，測定IC50值，其目的是用于比較。該值是化合物相對于對照抑制腫瘤細胞生長達50％時需要的藥物的濃度。當考慮化合物進一步用于治療瘤變的應用潛力時，IC50值優(yōu)選應當?shù)陀?00μM。
E.測定化合物A是否誘導編程性細胞死亡在第二個替換實施例中，本發(fā)明的篩選方法進一步包括測定化合物是否誘導腫瘤細胞培養(yǎng)物的編程性細胞死亡。
可以通過形態(tài)學和生化標準描述細胞死亡的兩種不同形式壞死和編程性細胞死亡。壞死伴隨著原生質(zhì)膜的滲透性增加；細胞漲大，隨后原生質(zhì)膜在幾分鐘內(nèi)破裂。編程性細胞死亡的特征在于氣泡狀膜、細胞質(zhì)濃縮和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活。
在正常組織更新過程中和胚胎的器官和四肢形成過程中發(fā)生自然編程性細胞死亡。細胞毒性T-淋巴細胞和自然殺傷細胞、電離輻射和某些化療藥物也可以誘導編程性細胞死亡。然而非適宜性的編程性細胞死亡調(diào)節(jié)在一些包括癌癥、AIDS、或Alzheimer′s病等的病理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用?？梢岳迷谏鲜鰲l件下維持生長的腫瘤細胞培養(yǎng)物篩選誘導編程性細胞死亡的化合物。用試驗化合物處理細胞包括前期加入培養(yǎng)物或者后期加入培養(yǎng)物，以各種濃度處理2-7天。分別測定培養(yǎng)物的附著單元和“漂浮”單元中的編程性細胞死亡細胞。通過除去上清液收集這兩個單元，用胰蛋白酶處理附著細胞，混合這兩種配制品，隨后是離心沖洗步驟(10分鐘，2000rpm)。為獲得明顯的細胞編程性細胞死亡量，已有文獻描述用舒林酸和相關化合物處理腫瘤細胞培養(yǎng)物(參見，Piazza，G.A.等，癌癥研究，553110-16，1995，作為參考引入本文)。新的特征包括收集漂浮細胞和附著細胞，確定可觀察到編程性細胞死亡的最優(yōu)處理時間和劑量范圍，確定優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件。
用化合物處理之后，可以用丫啶橙和溴乙啶標記，然后通過熒光顯微鏡分析培養(yǎng)物的編程性細胞死亡和壞死。測定編程性細胞死亡細胞數(shù)的方法以前已經(jīng)由Duke和Cohen描述過，參見“細胞編程性細胞死亡的形態(tài)學和生化分析方法”《免疫學當代方法》Coligan等編，3.17.1-3.17.16(1992，通過參考引入本文)。
例如，可以通過胰蛋白酶處理收集漂浮細胞和附著細胞，然后在PBS中沖洗三次?？梢噪x心分離出細胞部分。然后沉淀重懸浮于培養(yǎng)基和PBS中配制的含丫啶橙和溴乙啶的染料混合物中，然后輕輕混勻。然后混合物放置于顯微鏡載玻片上，檢查細胞編程性細胞死亡的形態(tài)學特征。
也可以通過測定試驗化合物處理過的細胞中的DNA片段的增加，來定量編程性細胞死亡。用于定量測定離體細胞質(zhì)組蛋白相關-DNA-片段(單和寡核小體)的商業(yè)光度測定EIA已有提供(細胞死亡檢測ELISAokys，Cat.No.1,774,425，Boehringer Mannheim)。BoehringerMannheim分析法基于間接酶免疫分析原理，分別使用定向抗DNA和組蛋白的鼠單克隆抗體。它可以專屬性測定細胞溶解產(chǎn)物的細胞質(zhì)碎片中的單和寡核小體。
按照廠家介紹的方法，以下列模式測定編程性細胞死亡。樣品(溶胞液)置于鏈霉抗生素蛋白涂層的微滴定平板(“MTP”)中。隨后，加入配對的抗組蛋白生物素和抗DNA過氧化酶混合物，保溫2小時。保溫期間，抗組蛋白抗體結合到核小體的組蛋白成分上，同時免疫復合物通過生物素標記固定到鏈霉抗生素蛋白涂層的MTP中。另外，抗DNA過氧化酶抗體與核小體的DNA成分反應。通過沖洗步驟除去未結合的抗體后，通過保留在免疫復合物中的過氧化酶測定核小體的量。用ABTS7(2，2′-疊氮基-[3-乙基苯噻唑啉-磺酸鹽])作為底物光比色測定過氧化酶。
例如，SW-480結腸腺癌細胞以每孔10000個細胞的密度在96孔MTP中鋪板。然后用試驗化合物處理細胞，并在37℃培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)后，MTP離心，除去上清液。然后各孔中的細胞沉淀重懸浮于溶胞緩沖液30分鐘。然后離心溶胞液，上清液部分(即，細胞質(zhì)碎片)轉(zhuǎn)移到鏈霉抗生素蛋白涂層的MTP中。需要注意不能震搖起MTP中的溶胞沉淀(即，含高分子量未成片段的DNA的細胞核)。然后分析樣品。
測定以給定濃度試驗的每個化合物的刺激倍增化(foldstimulation)(FS＝ODmax/ODveh)，它是編程性細胞死亡反應的指標。也可以通過評價試驗化合物的一系列濃度確定EC50值。
統(tǒng)計學上編程性細胞死亡效果顯著增加(即，濃度為100μM時刺激倍增比大于2)，進一步表明化合物在治療腫瘤損傷時有用。當進一步考慮化合物治療腫瘤損傷的應用潛力時，其表示編程性細胞死亡活性的EC50值最好應當?shù)陀?00μM。此處，EC50值定義為相對于溶媒處理，誘導50％編程性細胞死亡的化合物濃度。
F.乳腺器官培養(yǎng)模型試驗通過上述方法鑒定的試驗化合物，可以通過它們抑制乳腺器官培養(yǎng)系統(tǒng)中早期腫瘤損傷的發(fā)生率，來檢測其抗腫瘤活性。這種鼠乳腺器官培養(yǎng)技術已經(jīng)由其他研究者成功地用于研究抑制抗腫瘤試劑例如某些NSAID、類維生素A、他莫昔芬、硒、和某些天然產(chǎn)物的效果，該技術有效地保證了本發(fā)明的篩選方法。
例如，用雌二醇和黃體酮的混合物每日處理雌性BALB/c鼠，以便使與體外激素反應的腺體飽滿。處死動物，無菌條件下切下胸部乳腺，在添加胰島素、催乳素、氫化可的松、和醛甾酮的生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天。培養(yǎng)基中加入DMBA(7，12-二甲基苯并蒽)，以誘發(fā)癌癥前期損傷的形成。然后將完全成熟腺體脫離催乳素、氫化可的松、和醛甾酮的支持，導致腺體的衰退，而不是癌癥前期損傷。
試驗化合物溶解于DMSO，加入培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基。培養(yǎng)末期，腺體用10％福爾馬林固定，用明礬卡紅染色，在玻璃片上制作標本。形成乳腺損傷的發(fā)生率為乳腺損傷腺體和無損傷腺體的比值。比較由試驗化合物處理腺體的乳腺損傷發(fā)生率和未處理腺體的乳腺損傷發(fā)生率。
乳腺損傷占據(jù)的面積范圍可以通過將腺體圖像投射到數(shù)字比襯墊上定量。腺體覆蓋的面積描記在襯墊上，計作100％的面積。每個由無衰退結構覆蓋的空間也描記到數(shù)字比襯墊上，然后通過計算機定量。試驗結果在各種試驗方案中檢測了一系列化合物，并篩選其中具有治療腫瘤應用潛力的化合物。這些試驗的結果記錄如下。此后試驗化合物以字母代碼指示下列相應化合物。
A-外消旋-蘇-(E)-1-(N，N’-二乙基氨基乙硫基)-1-(丁-1’，4’-交酯基(olido))-[3’，4’1，2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺?；鶃喥S基)-2，3-二氫化茚；B-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3，4，5-三甲氧基亞芐基)-3-乙酸；C-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(對氯亞芐基)-3-乙酸；D-外消旋-(E)-1-(丁-1’，4’-交酯基)-[3’，4’1，2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺酰基亞芐基)-1S-2，3-二氫化茚基-N-乙酰半胱氨酸；E-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(3，4，5-三甲氧基亞芐基)-3-茚基-N-芐基乙酰胺；F-(Z)-5-氟-2-甲基-1-(對甲基磺?；鶃喥S基)-3-茚基-N，N’-二環(huán)己基乙酰胺；G-ribo-(E)-1-三唑并-[2’，3’1″，3″]-1-(丁-1’，4’-交酯基)-[3’，4’1，2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺?；鶃喥S基)-2，3-二氫化茚；和H-外消旋-(E)-1-(丁-1’，4’-交酯基)-[3’，4’1，2]-6-氟-2-甲基-3-(對甲基磺?；鶃喥S基)-1S-2，3-二氫化茚基-谷胱甘肽。實施例1-COX抑制分析法按照COX分析法(同上)的方案分析參比化合物和試驗化合物的COX抑制活性。圖4顯示各種濃度的硫化舒林酸和exisulind對純化環(huán)氧化酶(1型)活性的影響。如同以前的描述(Mitchell等，同上)，采用來源于公羊精囊中的純化環(huán)氧化酶測定環(huán)氧化酶的活性。計算出硫化舒林酸的IC50值為1.76μM，而exisulind的IC50值為10000μM。這組數(shù)據(jù)表明硫化舒林酸是COX-I抑制劑，而exisulind不是。COX-2同功酶得到類似的數(shù)據(jù)(Thompson，等，國家癌癥研究所雜志，871259-1260，1995)。
圖5顯示試驗化合物B和E對COX的抑制作用。測定了圖4顯示的化合物的COX活性。數(shù)據(jù)顯示試驗化合物B和E都不能顯著地抑制COX-I。
表2一系列化合物的環(huán)氧化酶抑制活性參比化合物 100μM時的％抑制率消炎痛 95MY5445 94硫化舒林酸 97exisulind ＜25試驗化合物 100μM時的％抑制率A ＜25B ＜25C 87D ＜25E ＜25按照上述方案，化合物A到E的COX抑制活性的評價如上表2所示。發(fā)現(xiàn)化合物C在劑量為100μM時，COX抑制率高于25％，因此，它不能用于進一步篩選。實施例2-cGMP PDE抑制分析法按照上述分析方法的方案，分析參比化合物和試驗化合物的cGMPPDE抑制活性。圖6顯示各種濃度的硫化舒林酸和exisulind對從人結腸HT-29腫瘤細胞培養(yǎng)物中純化出來的PDE4和cGMP PDE活性的影響，PDE4和cGMP PDE的純化方法同以前的描述(W.J.Thompson等，同上)。硫化舒林酸抑制PDE4的IC50值為41μM，抑制cGMP PDE的IC50值為17μM。exisulind抑制PDE4的IC50值為181μM，抑制cGMPPDE的IC50值為56μM。這組數(shù)據(jù)表明硫化舒林酸和exisulind都抑制磷酸二酯酶活性。這兩種化合物都表現(xiàn)出對cGMP PDE同功酶的選擇性高于PDE4同種型。
圖7顯示硫化舒林酸對cGMP或cAMP產(chǎn)生的影響作用，cGMP或cAMP按照上述分析方法在培養(yǎng)的HT-29細胞中測定。HT-29細胞用硫化舒林酸處理30分鐘，用常規(guī)放射免疫分析法測定cGMP或cAMP。結果表明，硫化舒林酸使cGMP水平增加超過50％，EC50值為7.3μM(圖7A)。cAMP的水平不受化合物處理影響，然而一種公知PDE4抑制劑——咯利普蘭，增加了cAMP水平(圖7B)。數(shù)據(jù)論證了相對于PDE4，抑制cGMP PDE具有更重要的藥理學意義。
圖8顯示標示量的試驗化合物B對cGMP PDE和PDE4磷酸二酯酶同功酶的影響。計算出cGMP PDE的IC50值為18μM，PDE4的IC50值為58μM。
圖9顯示標示量的試驗化合物E對PDE4和cGMP PDE的影響。計算出cGMP PDE的IC50值為0.08μM，比PDE4的IC50值高25μM。
表3 一系列化合物的cGMP PDE抑制活性參比化合物10μM時的％抑制率消炎痛 34MY5445 86硫化舒林酸 97exisulind 39試驗化合物 10μM時的％抑制率A ＜25B ＜25C ＜25D 36E 75如上面方案中的描述，評價表3中化合物的PDE抑制活性。不能夠抑制COX的化合物中，僅發(fā)現(xiàn)化合物E在10μM時產(chǎn)生超過50％的抑制率。從圖8中注意到，化合物B在劑量為20μM時顯示超過50％的抑制率。因此，根據(jù)單劑量試驗使用的劑量水平，可以篩選出在略微較高劑量時可能具有活性的某些化合物。使用的劑量是主觀的，當在某一劑量水平發(fā)現(xiàn)活性化合物后，可以降低使用劑量，以便篩選出甚至更強效的化合物。實施例3-編程性細胞死亡分析按照上面的分析方案，分析參比化合物和試驗化合物的新PDE抑制活性。按照這些方案，圖10顯示硫化舒林酸和exisulind對編程性細胞死亡性和壞死性細胞死亡的影響。用標示量的硫化舒林酸和exisulind處理HT-29細胞6天。如同以前的描述測定編程性細胞死亡性和壞死性細胞死亡(Duke和Cohen，當代免疫學試驗方法，3.17.1-3.17.16，New York，John Wiley和Sons，1992)。數(shù)據(jù)表明硫化舒林酸和exisulind都能夠促使編程性細胞死亡性細胞死亡，而不誘導細胞壞死。所有的數(shù)據(jù)從相同試驗中得到。
圖11顯示硫化舒林酸和exisulind對通過DNA斷裂測定的腫瘤生長的抑制作用和編程性細胞死亡的誘導作用。上圖(11A)exisulind的生長抑制(空心符號，左軸)和DNA斷裂(實心符號，右軸)。下圖(11B)硫化舒林酸的生長抑制(空心符號，左軸)和DNA斷裂(實心符號，右軸)。用SRB分析法測定處理6天后的生長抑制。處理8天后測定DNA斷裂。所有數(shù)據(jù)從相同試驗中得到。
圖12顯示化合物E誘導編程性細胞死亡的特性。HT-29結腸腺癌細胞用標示濃度的化合物E處理48小時，用DNA斷裂分析法測定編程性細胞死亡。計算出EC50值為0.05μM。
圖13顯示化合物B誘導編程性細胞死亡的特性。HT-29結腸腺癌細胞用標示濃度的化合物B處理48小時，用DNA斷裂分析法測定編程性細胞死亡。計算出EC50值約為175μM。
表4一系列化合物的編程性細胞死亡誘導活性參比化合物 100μM時的誘導倍數(shù)消炎痛＜2.0MY54454.7硫化舒林酸7.9exisulind ＜2.0E4021 ＜2.0Zaprinast ＜2.0Sildenafil＜2.0EHNA ＜2.0試驗化合物100μM時的誘導倍數(shù)A ＜2.0B 3.4C 5.6D ＜2.0E 4.6按照上述倍數(shù)誘導方案，試驗了化合物A到E的誘導編程性細胞死亡活性，結果如上表4所示。當劑量為100μM時，化合物B、C和E表現(xiàn)出顯著的編程性細胞死亡誘導活性，超過2.0倍。當然這三個化合物在此劑量下，僅化合物B和E不抑制COX但是抑制cGMP-特異性PDE。
測定了一系列磷酸二酯酶抑制劑的誘導編程性細胞死亡活性。數(shù)據(jù)在下表5中列出。HT-29細胞用各種磷酸二酯酶抑制劑處理6天。按照上述試驗方法用丫啶橙和溴乙啶標記后，從形態(tài)學上確定編程性細胞死亡和壞死。數(shù)據(jù)表明新cGMP-特異性PDE對于篩選誘導HT-29細胞編程性細胞死亡的化合物有利。
表5PDE抑制劑的編程性細胞死亡誘導數(shù)據(jù)抑制劑 顯示出的選擇性編程性細胞死亡％壞死％溶媒 8 68-甲氧基- PDE1 2 1IBMX米力農(nóng) PDE3 18 0RO-20-1724 PDE4 11 2MY5445 PDE5 80 5IBMX 無選擇性 4 13實施例4-生長抑制分析法按照上面的分析方案，分析參比化合物和試驗化合物的PDE5抑制活性。圖14顯示各種濃度的硫化舒林酸和exisulind對HT-29細胞生長都有抑制作用。如指示用各種劑量exisulind(三角形)或硫化舒林酸(方塊形)處理HT-29細胞6天。如以前的描述，利用硫氰酸胺分析法測定細胞數(shù)目(Piazza等，癌癥研究，553110-3116，1995)。硫化舒林酸的IC50值約為45μM，exisulind約為200μM。數(shù)據(jù)表明硫化舒林酸和exisulind都能夠抑制腫瘤細胞生長。
圖15顯示硫化舒林酸的生長抑制活性和誘導編程性細胞死亡活性。記載的時間曲線試驗包括用溶媒——0.1％的DMSO(空心符號)或硫化舒林酸120μM(實心符號)分別處HT-29細胞。通過錐蟲藍染色后記活細胞數(shù)確定生長抑制狀況(15A，上圖)。如以前的描述(Duke和Cohen，當代免疫學試驗方法，3.17.1-3.17.16，New York，John Wiley和Sons，1992)，通過丫啶橙和溴乙啶染色后進行形態(tài)學鑒定，測定編程性細胞死亡(15B，下圖)。數(shù)據(jù)表明硫化舒林酸能夠抑制腫瘤細胞生長，同時該作用伴隨著編程性細胞死亡的增加。所有的數(shù)據(jù)從相同試驗中得到。
圖16顯示試驗化合物E的生長抑制活性。用標示濃度的化合物E處理HT-29結腸腺癌細胞6天，用SRB法測定細胞數(shù)目。計算出IC50值為0.04μM。
表6 一系列化合物的生長抑制活性參比化合物100μM時的誘導率％消炎痛 75MY5445 88硫化舒林酸 88exisulind ＜50E4021 ＜50Sildenafil ＜50Zaprinast ＜50試驗化合物 100μM時的抑制率％A 68B 77C 80D 78E 62按照前面的篩選方案，檢測化合物A到E的生長抑制活性，結果如上表6所示。所有試驗化合物均顯示活性超過100μM單劑量試驗。
測定了一系列磷酸二酯酶抑制劑的生長抑制活性。數(shù)據(jù)如下表7所示。用各種磷酸二酯酶抑制劑處HT-29細胞6天。用上述SRB法測定細胞生長。上面試驗得到的數(shù)據(jù)表明新PDE的抑制劑對于抑制腫瘤細胞生長有效。
表7 PDE抑制劑的生長抑制數(shù)據(jù)抑制劑 表現(xiàn)出的選擇性生長抑制(IC50，μ M)8-甲氧基-IBMXPDE1 ＞200μMMilrinonePDE3 ＞200μMRO-20-1724 PDE4 ＞200μMMY5445 PDE5 5μMIBMX 無選擇性 ＞100μMZaprinastPDE5 ＞100μMSildenafil PDE5 ＞100μME4021PDE5 ＞100μM為了表明這種篩選方法對各種形式的腫瘤都有效，對大量細胞系進行化合物試驗。測定了硫化舒林酸和exisulind對各種細胞系的影響作用。數(shù)據(jù)如表8所示。用SRB法測定IC50值。數(shù)據(jù)表明這些化合物對很寬范圍的腫瘤表現(xiàn)出廣泛有效性，有效性在可比較的劑量范圍內(nèi)。因此，通過本發(fā)明驗證和選擇的化合物對于治療多種形式的腫瘤應該是有用的。
表8多種細胞系的生長抑制數(shù)據(jù)細胞類型/IC50(μM)組織特異性硫化舒林酸exisulind化合物E*HT-29，結腸 60120 0.10HCT1 16，結腸 4590MCF7/S，乳房 3090UACC375，黑素瘤 50100A-427，肺 90130支氣管上皮細胞3090NRK，腎(非大鼠肉瘤轉(zhuǎn)化型) 50180KNRK，腎(大鼠肉瘤轉(zhuǎn)化型) 60240人前列腺癌PC3 82 0.90Colo 2051.62DU-145 0.10HCT-15 0.60MDA-MB-23 10.08MDA-MB-435 0.04*利用Schmid等描述的中性紅法測定(AACR匯編，39卷，第195頁，1998)。實施例5-乳腺器官培養(yǎng)模型中的活性圖17顯示舒林酸代謝物抑制乳腺器官培養(yǎng)物中的癌癥前期損傷。乳腺器官培養(yǎng)試驗按照以前的描述進行操作(Mehta和Moon，《癌癥研究》，465832-5835，1986)。結果證明舒林酸和exisulind有效地抑制癌癥前期損傷的形成，而硫化舒林酸無效。這組數(shù)據(jù)支持這樣一個假設環(huán)氧化酶抑制作用對于所需藥物的抗腫瘤性質(zhì)不是必須的。分析為了篩選治療腫瘤的化合物，本發(fā)明提供了一種對從若干試驗方案中得出的試驗化合物的試驗數(shù)據(jù)進行比較的基本原理。本發(fā)明的構思中，試驗化合物可以根據(jù)它們治療人類腫瘤的應用潛力分級。具有理想效果的化合物可以篩選出來進行進一步試驗，隨后應用于人類。
各種試驗化合物和這幾種試驗方案的定量數(shù)據(jù)顯示于下表9中。數(shù)據(jù)顯示exisulind、化合物B和化合物E表現(xiàn)出合適的活性，通過四次分析的篩選無COX抑制作用、具有有效的cGMP-特異性PDE抑制作用、生長抑制和誘導編程性細胞死亡。這些化合物在乳腺器官培養(yǎng)物中的活性證實本發(fā)明的有效性。篩選方案的定量評價確定化合物E最佳、其次是化合物B，然后是exisulind。
表9各種化合物的活性譜化合物COX抑制PDE抑制生長抑制編程性乳腺器官培養(yǎng)物細胞死亡Exisulind - ++ ++ +++++硫化舒林酸++++ ++++++ +++ -MY5445++++ ++++++ +++ +A - - +++ ++++B - ++++++ +++ ++D - - ++ - -E - ++++ ++++++++ ++++F - - ++ + -G - - +++ +++++H - - ++ - -表9的代碼化合物活性的評價基于一系列包括測試最大活性和效力的試驗。
-無活性+微弱活性++中度活性
+++較高活性++++高度活性同時還公開了一種新的PKG活性分析法，該方法用在本發(fā)明的篩選方法中，并且它在分析其他目的的PKG活性中具有較高的通用性(例如，研究PKG在正常細胞功能中的作用)。作為解釋的目的，當描述PKG活性在確定一種化合物是否具有治療腫瘤的應用潛力的藥物評價中如何有用之前，首先描述PKG分析方法是有用的。新的PKG分析法本發(fā)明的新的PKG分析法涉及將多個氨基酸序列結合到一個固相上，每個氨基酸序列都至少含有cGMP結合區(qū)和5型磷酸二酯酶(“PDE5”)磷酸化位點。這些序列是已知的，在下面描述。結合的PDE5序列優(yōu)選不包括下述PDE5的催化片段。將PDE5序列結合到固相上的一種方法是作為PDE5序列和一種氨基酸結合對之一的融合蛋白表達這些序列，然后將這種氨基酸結合對的另一個成分化學連接到固相(例如，小珠)上。可以使用的一種結合對是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(“GST”)和谷胱甘肽(“GSH”)，GST作為與上述PDE5序列的融合蛋白表達，GSH公價結合到固相上。在這種模式中，可以如下述通過將包含融合蛋白的溶液浸過固相，即可使PDE5序列/GST融合蛋白簡單地結合到固相上。
RT-PCR法用于獲得PDE5的cGB區(qū)，其中使用根據(jù)牛PDE5AcDNA序列設計出來的正向和反向引物(McAllister-Lucas L.M.等，生物化學雜志，26822863-22873，1993)并在PDE1-10組中進行選擇。總RNA的5′-3′，Inc.試劑盒以及其后mRNA的寡(dT)柱純化用HT-29細胞進行。使用正向引物(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)和反向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686)合成1484bp的片段，該片段編碼磷酸化位點以及人PDE5A的低親合和高親合cGMP結合位點(203-1686bp，cGB-PDE5)。合成的cGB-PDE5核苷酸片段編碼494個氨基酸，它與牛PDE5有97％的相似性。然后用tac啟動子以及EcoRI和XhoI切割位點，將它克隆到pGEX-5X-3谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合載體(Pharmacia Biotech)上。然后將融合載體轉(zhuǎn)染到E.Coli BL21(DE3)細菌中(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染的BL21細菌生長到對數(shù)生長期時，加入IPTG作為誘導子。誘導在20℃進行24小時。收獲細菌并溶解細菌。細胞溶解產(chǎn)物的溶液部分加入GSH結合的Sepharose 4B(GSH-Sepharose 4B)保溫。GST-cGB-PDE5融合蛋白可以結合到GSH-Sepharose小珠上，其他蛋白用大量冷PBS從小珠上洗脫。
表達出來的GST-cGB-PDE5融合蛋白在7.5％的SDS-PAGE凝膠上顯示為85Kd的蛋白。它表現(xiàn)出其cGMP結合特性和能夠被蛋白激酶G和A磷酸化的特性。它顯示具有兩個cGMP結合位點，Kd為1.6±0.2μM，該值接近其來源牛的PDE5，Kd＝1.3μM。在結合GSH的Sepharose小珠上的GST-cGB-PDE5可以用cGMP-依賴蛋白激酶和cAMP-依賴蛋白激酶A在體外磷酸化。用PKD進行的GST-cGB-PDE5磷酸化中，Km為2.7μM，Vmax為2.8μM，而BPDEtide磷酸化的Km為68μM。PKG的磷酸化顯示一分子磷酸插入一分子GST-cGB-PDE5蛋白的比例。
為了用上述PDE5-結合固相分析可能含有PKG的液體樣品，將樣品和固相與含有32P-γ-ATP的磷酸化緩沖液混合。溶液在30℃保溫30分鐘，那么如果存在PKD，通過PKG進行的PDE5序列的磷酸化將得以發(fā)生。然后從溶液中分離固相(例如，通過離心或過濾)，用磷酸鹽緩沖液(“PBS”)沖洗除去所有殘留溶劑同時除去所有未反應的32P-γ-ATP。
然后可以直接檢測固相(例如，液體閃爍計數(shù)器)，以驗證是否插入32P。如果插入了，表明樣品含有PKG，因為PKG已將PDE5磷酸化。如果PDE5通過上述融合蛋白結合，含PDE5的融合蛋白可以用SDS緩沖液從固相上洗脫下來，然后洗脫液可以用于分析是否插入32P。如果具有存在其它蛋白的可能性，該方法顯得尤其有利，因為可以處理洗脫液(例如，通過凝膠分離)以分開各種蛋白，從而可以分析融合蛋白組分的32P插入狀況。磷酸化的融合蛋白可以用SDS緩沖液從固相洗脫下來，隨后進一步通過電泳分辨。如果進行凝膠分離，可以對蛋白染色以便看到蛋白的位置，融合蛋白PDE5部分通過PKG的32P磷酸化可以通過與凝膠接觸的X線膠片曝光測定。如果X線膠片上可以觀察到32P，表明含有PKG的原始樣品中存在PKG，其將從固相上洗脫下來的融合蛋白的PDE5部分磷酸化。
在該分析方法中，最好應當在分析緩沖液中加入過量(例如，100倍)蛋白激酶抑制劑(“PKI”)，它可以特異地和強烈地抑制蛋白激酶A(“PKA”)而不抑制PKG。對PKA的抑制是需要的，因為PKA也可能對PKG底物(例如，PDE5)進行磷酸化。通過加入PKI，將完全取消PKA磷酸化的作用，檢測到的全部磷酸化將十分接近PKG自身的磷酸化。
可以制作用于本發(fā)明分析方法的試劑盒，該試劑盒含有下列預先包裝好的置于單獨容器中的試劑1.溶胞緩沖液50mM Tris-HCl，1％ NP-40，150mM NaCl，1mMEDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF，500μM IBMX，蛋白酶抑制劑。
2.蛋白激酶G固相基質(zhì)重組GST-cGB-PDE5結合的Sepharose4B(50％懸液)。
3.2×磷酸化緩沖液32P-γ-ATP(3000mCi/mmol，5-10μCi/次分析)，10mM KH2PO4，10mM K2HPO4，200μM ATP，5mM MgCl2。
4.PKA蛋白激酶I抑制劑。
試劑盒中還可以包括進行上述反應的一次性容器等。
根據(jù)上面的描述，分析領域的技術人員很容易想出多種將所述分析步驟調(diào)整為其他步驟的方法。簡短地說，利用至少一部分PDE5(或者任何可以由PKG選擇性磷酸化的其它蛋白)，即可以用經(jīng)標記的磷酸化試劑，通過評價可磷酸化蛋白的磷酸化作用確定PKG的存在和相對含量(與對照相比)。SAAND促進腫瘤細胞中PKG活性增加利用上述PKG分析法，進行下面的試驗，以證實SAAND通過增加經(jīng)SAAND處理的腫瘤細胞中PKG的表達或者增加cGMP水平(或者使二者都增加)，從而促進PKG活性的增加。試驗步驟評價了兩種不同類型的PDE抑制劑對腫瘤細胞中PKG的影響。對于SAAND，選擇評價exisulind，因為它具有抗腫瘤作用。對于非-SAAND型的典型PDE5抑制劑，選擇評價E4021，以確定PKG的增高是否僅由于典型的PDE5抑制作用，或者PKG的增高是否涉及SAAND抑制PDE5和一種新的PDE的前編程性細胞死亡作用，上述新的PDE在Liu等人于1998年10月15日申請的美國專利申請No.09/173375中公開。
為了檢測cGMP-特異性PDE抑制作用對含APC突變的腫瘤的影響，使用SW480結腸癌細胞。已知SW480含有APC突變。將約5百萬個SW480細胞分散于含5％血清的RPMI中，并將之分置于8個培養(yǎng)皿中2個10cm培養(yǎng)皿——30μL DMSO溶媒對照(沒有藥物)，3個10cm培養(yǎng)皿——溶于DMSO中的200μM、400μM、600μM exisulind3個10cm培養(yǎng)皿——E4021；溶于DMSO中的0.1μM、1μM、10μM。
平皿在37℃，5％ CO2的恒溫箱中保溫48小時。
將液體培養(yǎng)基從平皿中吸出(細胞將自動附著到平皿上)。每個平皿中的附著細胞用冷PBS沖洗，各皿均加入200μL溶胞緩沖液(即，50mM Tris-HCl，1％ NP-40，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF，含有蛋白酶抑制劑的500μM IBMX)。加入溶胞緩沖液后，立即從每個平皿上刮下細胞以收集溶解的細胞。將各皿中的細胞溶解產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)移到微量離心管中，將微量離心管在4℃保溫15分鐘，同時輕輕震搖微量離心管，以使細胞溶解完全。完全溶解后，全速離心(14000r.m.p.)微量離心管15分鐘。將各微量離心管的上清液轉(zhuǎn)移到一個新的微量離心管中。
然后對每個微量離心管中的內(nèi)容物進行蛋白質(zhì)分析，因為如果藥物抑制細胞生長，對照中的總蛋白量將高于經(jīng)藥物處理的樣品中的總蛋白量。顯然，如果藥物不起作用，經(jīng)藥物處理的樣品中的總蛋白量應該基本上與對照相同。在上述情況下，對照和E-4021微量離心管需要稀釋，以使它們符合經(jīng)高劑量exisulind處理的樣品的標準(exisulind的較低劑量組應該達到最高劑量exisulind樣品的標準)。因此，進行蛋白分析之后，各種樣品的總蛋白濃度應當標準化(例如，通過稀釋)。
對每個濃度的藥物和對照，分別進行兩次PKG分析，一次加cGMP，一次不加cGMP，詳細描述該分析如下。進行這兩次不同PKG分析的原因在于cGMP特異地激活PKG。當通過本發(fā)明的新PKG法分析PKG活性時，研究者不能確定是否所有PKG活性的增加都是由于細胞中cGMP的增加引起(可能通過cGMP-特異性PDE抑制作用實現(xiàn))，或者PKG活性水平的升高是否是由于PKG蛋白的表達量增加引起的。通過測定同一樣品在加和不加cGMP時其PKG的活性，研究者可以確定PKG活性是否增加，如果增加了，該增加是否是由于PKG的表達量增加引起的。因此，如果一種抗腫瘤藥物相對于對照促使PKG活性增高，研究者可以基于以下兩點確定經(jīng)藥物處理的樣品中，藥物誘導的PKG活性的增加是否是由于PKG蛋白的表達量增加所致(而不是活化作用)，如果(1)加入額外cGMP的經(jīng)藥物處理的樣品與加入額外cGMP的對照樣品相比，表現(xiàn)較高的PKG活性，并且(2)沒有加cGMP的經(jīng)藥物處理的樣品相對于對照也表現(xiàn)較高的PKG活性。
之后，制備加和不加cGMP的平行樣品，將各50μL的細胞溶解產(chǎn)物分別加入20μL上述的PDE5/GST固相底物懸液中。對于進行評價的各對照或藥物細胞溶解產(chǎn)物樣品，分別向各混合物中加入含10μCi32P-γ-ATP的磷酸化緩沖液(200μM ATP，4.5mM MgCl2，5mMKH2PO4，5mM K2HPO4)，以此開始反應。將所得到的混合物在30℃保溫30分鐘。然后離心混合物以分離出固相，棄去上清液。各管中的固相用700μL冷PBS沖洗。將Laemmli樣品緩沖液(BIO-Rad)(30μL)加入固相。將混合物煮沸5分鐘，裝載到7.5％ SDS-PAGE上。將凝膠在150V電泳1小時。所獲得的譜帶用考馬斯亮藍染色，如果存在的話，即可以看到85Kd的GST-PDE5融合蛋白色帶。將凝膠干燥，然后將凝膠置于X線膠片上，如果PDE5已經(jīng)磷酸化，那么膠片將顯示相應的黑色條帶。各帶的暗度與磷酸化程度相關。
如圖18A和18B所示，SAAND exisulind以劑量依賴性模式使加和不加cGMP的樣品的PKG活性相對于加和不加cGMP的對照樣品均增高。這通過經(jīng)各藥物處理的樣品中出現(xiàn)較黑85Kb帶的現(xiàn)象得以證實。另外，分析中加入cGMP的經(jīng)exisulind處理的SW480樣品相對于用exisulind單獨處理樣品(即不加cGMP)，表現(xiàn)出較高的PKG磷酸化活性。因此，當SAAND抑制cGMP-特異性PDE時，經(jīng)藥物處理的樣品中PKG活性的增加就不僅僅是因為胞內(nèi)cGMP增加導致的PKG激活，在含APC突變的腫瘤形成中，PKG活性的增加還源于PKG表達量增加。
經(jīng)E4021處理的SW480樣品相對于對照也不表現(xiàn)PKG激活作用(見圖18A和18B)的事實表明，在含APC突變的腫瘤中，SAAND引起的PKG活性增加不僅僅是由于典型PDE5的抑制。
在評價PKG活性的分析技術中，可以不必如上述與X-射線膠片接觸來評價SDS膠上的85Kd蛋白的磷酸化程度，而可以通過從凝膠上切下該色帶，在32P視窗中用閃爍(β)記數(shù)儀記錄所切下的色帶中摻入的所有32P的量。
為了檢測cGMP特異性PDE抑制作用對含β-連環(huán)蛋白突變的腫瘤的影響，使用HCT116結腸癌細胞。已知HCT116結腸癌細胞含有β-連環(huán)蛋白突變，而不含APC突變。
使用如上述關于SW480所用的方法同樣的程序培養(yǎng)HCT116細胞。該實驗中，僅使用exisulind和對照。經(jīng)exisulind處理的細胞相對于對照產(chǎn)生較大程度磷酸化的PKG，表明在經(jīng)藥物處理的細胞中出現(xiàn)的PKG活化作用與APC突變無關。
因此，為本發(fā)明目的，我們在權利要求中指出的“減少的β-連環(huán)蛋白”指該蛋白質(zhì)的野生型和/或突變型。
通過Western印跡確定SW 480中PKG表達的增加和β-連環(huán)蛋白的降低如上面所論述的，SAAND促使PKG表達量增加以及cGMP水平增加，這兩方面都能夠促使經(jīng)SAAND處理的腫瘤細胞中PKG活性增加。PKG蛋白表達的增加由下述相對定量性的western印跡進一步證實。
如前所述，將經(jīng)exisulind處理的SW 480細胞用冰冷的PBS清洗一次，從微量離心管中收獲。細胞用改良RIPA緩沖液溶解15分鐘，同時震搖。將細胞溶解產(chǎn)物在低溫室中離心沉降。離心后，立即將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中。進行BioRad DC蛋白質(zhì)分析(Temecula，CA)，確定樣品中的蛋白濃度。將樣品如上述標準化以測定蛋白濃度。
將每個樣品各50μL裝載到10％的SDS凝膠上，進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素薄膜上。將含有印跡的硝化纖維素薄膜浸沒在新鮮配制的含5％脫脂奶粉的TBST中，室溫下保持1小時，同時不斷震搖。
將山羊-抗-PKG一級抗體用含5％脫脂奶粉的新鮮TBST稀釋至推薦的濃度/稀釋度。硝化纖維素薄膜置于所述一級抗體溶液中，并在室溫下保溫1小時，同時震搖。硝化纖維素薄膜用TBST漂洗三次，每次10分鐘。硝化纖維素薄膜在含POD結合的次級兔抗-山羊抗體的溶液中于室溫下保溫1小時，同時震搖。硝化纖維素薄膜用TBST再漂洗三次，每次10分鐘。用Boehringer Mannheim BM蘭色POD底物進行檢測。
如圖19的照片所示，exisulind使β-連環(huán)蛋白降低，使PKG增加，這些數(shù)據(jù)是通過Western印跡獲得的。SW480細胞用exisulind或溶媒(0.1％ DMSO)處理48小時。將各細胞溶解產(chǎn)物的50μg上清液裝載到10％的SDS-凝膠上，并印跡到硝化纖維素薄膜上，用兔抗-β-連環(huán)蛋白和兔抗-PKG抗體作為探針檢測薄膜。SAAND降低腫瘤細胞中β-連環(huán)蛋白的水平通過分別用200、400、和600μM exisulind或溶媒(0.1％ DMSO)培養(yǎng)SW480細胞，進行這一步的觀察。細胞在處理后48小時收獲，進行免疫印跡處理?？梢杂肳estern印跡檢測免疫反應蛋白質(zhì)。Western印跡分析證明經(jīng)exisulind處理的細胞與對照相比，β-連環(huán)蛋白的表達降低了50％。該結果表明由于SAAND的處理，β-連環(huán)蛋白水平降低。將上面已經(jīng)確立的因exisulind處理使PKG活性增加，以及下面所確立的PKG使β-連環(huán)蛋白磷酸化的結果綜合起來，這些結果表明在腫瘤細胞中由于PKG的活化引起β-連環(huán)蛋白降低。因此，利用腫瘤中PKG活性作為選擇抗腫瘤化合物的篩選工具是有用的。PKG使β-連環(huán)蛋白磷酸化在體外，PKG使β-連環(huán)蛋白磷酸化。確立該結果的試驗涉及使來源于SW480細胞(沒有用任何藥物處理)的含β-連環(huán)蛋白的復合物按照下文“β-連環(huán)蛋白免疫沉淀”描述的方式進行免疫沉淀。將免疫沉淀的復合物(仍然被捕獲在固相(即小珠)上)與32P-γ-ATP和純品PKG(100單位)混合。制備不加PKG的相應對照樣品。
用SDS緩沖液使蛋白質(zhì)從固相上釋放下來，將含蛋白質(zhì)的混合物在7.5％ SDS-凝膠上跑膠?；旌衔镌谀z上電泳跑膠可以除去混合物中過量的32P-γ-ATP。因此，在93Kd β-連環(huán)蛋白帶中檢測出的任何32P-γ-ATP均是β-連環(huán)蛋白磷酸化的結果。相對于不加額外PKG處理的對照組，在用額外PKG處理的93Kd β-連環(huán)蛋白帶中檢測的32p-γ-ATP的任何增加均是由于用額外PKG處理的帶中的β-連環(huán)蛋白的磷酸化。
我們獲得的結果是與顯示最少、基本上不能檢測到磷酸化的對照組相比，用PKG處理的帶中的磷酸化顯著增加。該結果表明β-連環(huán)蛋白可被PKG磷酸化。PKG對突變β-連環(huán)蛋白的磷酸化用HCT116細胞進行在緊接的上一部分中描述的相同的過程，其中HCT116細胞不包含APC突變，但包含β-連環(huán)蛋白突變。那些實驗的結果還表明突變的β-連環(huán)蛋白也被PKG磷酸化。
因此，為了本發(fā)明的目的，我們將權利要求中所述的β-連環(huán)蛋白的磷酸化認為是該蛋白的野生型和/或突變型的磷酸化。使用PKG沉淀β-連環(huán)蛋白用上面在蛋白質(zhì)印跡實驗中描述的相同方法制備SW480和HCT116細胞溶解產(chǎn)物的上清液。通過向每500ug細胞溶解產(chǎn)物中加入150ul蛋白A Sepharose珠勻漿(50％)將細胞溶解產(chǎn)物預澄清，并在4℃下在管式搖床中保溫10分鐘。4℃下，通過以14,000×g離心10分鐘除去蛋白A珠。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。將10ug多克隆兔抗β-連環(huán)蛋白抗體(Upstate Biotechnology，Lake Placid，紐約)加入到500ug細胞溶解產(chǎn)物中。4℃下在管式搖床中將細胞溶解產(chǎn)物/抗體混合物輕輕混合2小時。通過加入150ul蛋白A Sepharose珠勻漿(75ul填充珠)并通過4℃下在管式搖床中將混合物輕輕震搖過夜，來捕獲免疫復合物。通過脈沖離心(在微離心機中以14,000rpm離心5秒)收集Sepharose珠。棄去上清液部分，并將珠用800ul冰冷的PBS緩沖液洗滌3次。將Sepharose珠重新懸浮在150ul 2×樣品緩沖液中，并輕輕混合。將Sepharose珠煮沸5分鐘以從珠中解離出免疫復合物。離心收集珠并對上清液進行SDS-PAGE分析。
對上清液進行蛋白質(zhì)印跡，用兔抗β-連環(huán)蛋白抗體探測膜。用TBST將膜洗滌3次，每次10分鐘，以除去過量的抗β-連環(huán)蛋白抗體。加入與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔抗體，接著在室溫下保溫1小時。當完成后，可使用HRPO底物觀察到β-連環(huán)蛋白的存在。在該實驗中，我們可清楚地觀察到β-連環(huán)蛋白的存在。
為了在相同的膜中檢測PKG，通過在55℃水浴中保溫0.5小時，用62mM tris-HCl緩沖液(pH7.6)、2％ SDS和100μM 2β-巰基乙醇首先將抗β-連環(huán)蛋白抗體結合物從膜上剝離下來。接著在室溫下，在攪動膜的同時，將剝離下抗β-連環(huán)蛋白抗體結合物的膜在含5％脫脂奶粉的TBST中封閉1小時。接著用與HRPO結合的山羊抗兔次級抗體檢測的兔多克隆抗PKG抗體(Calbiochem，LaJolla，CA)探測該被封閉的膜。用HRPO底物檢測印跡膜中的PKG的存在。在該實驗中，實際上觀察到了PKG。假定膜上的蛋白僅為那些在細胞上清液中被β-連環(huán)蛋白免疫沉淀下來的那些蛋白，該結果清楚地證實PKG與細胞上清液中包含β-連環(huán)蛋白的蛋白復合物物理性地相連。
在剝離下抗體結合物后，還用抗GSK3-β抗體探測相同的蛋白質(zhì)印跡膜以證實它還是否與β-連環(huán)蛋白一起沉淀。在該實驗中，我們還在膜中檢測到GSK3-β，表明GSK3-β與β-連環(huán)蛋白和PKG一起沉淀，因此表明這三種蛋白可能為相同復合物的一部分。由于在正常細胞中GSK3-β與β-連環(huán)蛋白形成APC復合物的一部分，因此，PKG可能為相同復合物的一部分，并可能參與作為該復合物一部分的β-連環(huán)蛋白的磷酸化。包含cGMP PDE抑制劑的抗腫瘤藥物組合物如上所述，exisulind為一種顯示所希望的抗腫瘤特性的化合物。在認識到該化合物通過抑制腫瘤中的cGMP特異性PDE活性而起作用之前已發(fā)現(xiàn)了其作為抗腫瘤劑的功效和用途。
其中，在患有腫瘤的病人中的人體臨床實驗中獲得本發(fā)明的選擇方法可被用來選擇用于人體治療的化合物的證據(jù)。根據(jù)exisulind為抗腫瘤劑(體外)的事實，認識到其具有滿足本發(fā)明的選擇標準的所希望的化合物的圖譜，該化合物在兩個人體臨床實驗中的成功，表明也可選擇出滿足本發(fā)明選擇標準的其它化合物。
如上所述，許多腫瘤帶有APC突變。其中在患有帶有APC突變的腫瘤的病人的人體臨床試驗中確立了本發(fā)明選擇方法的證據(jù)。
在具有遺傳性瘤，即腺瘤息肉coli(“APC”)的病人中首先發(fā)現(xiàn)APC突變。APC疾病的特征在于在青少年時期在結腸中出現(xiàn)成百上千的息肉，常規(guī)治療是在20歲以前手術切除結腸。
第一例臨床試驗涉及具有APC的病人。
使用exisulind。在該研究中，各病人已切去結腸，但保留鄰近直腸的小部分結腸(其中與小腸相連)以保持直腸的功能。然而，該病人經(jīng)常在小部分余下的結腸部分形成息肉，這些息肉需要周期性地切除(例如，通過電烙)。
選擇exisulind的試驗是被設計用來通過比較藥物和安慰劑組在12個月中所形成的新的息肉的累積數(shù)量來評價藥物抗腫瘤特征的預防性試驗。適宜的病人為每年形成9至44個息肉的病人。在研究開始、6個月末和12個月末時，病人的息肉被完全切除(切除所有息肉)。試驗包括34位適宜的病人。根據(jù)在每年周期性形成9至44個息肉的APC病人在一年中形成的息肉的估測平均數(shù)目，exisulind組在降低息肉形成速率方面從臨床和統(tǒng)計上顯著優(yōu)于安慰劑組。根據(jù)研究開始6個月中產(chǎn)生的息肉的平均數(shù)目，用exisulind治療的病人形成的息肉數(shù)量大約是用安慰劑治療的病人的息肉的數(shù)量的三分之一(分別為中間值9個息肉/年和26個息肉/年；p＝0.013)。根據(jù)在研究整個12個月中產(chǎn)生的息肉的平均數(shù)目，用exisulind治療的病人形成的息肉數(shù)量大約是用安慰劑治療的病人的息肉的數(shù)量的一半(分別為中間值18個息肉/年和38個息肉/年；p＝0.020)。
還在患有前列腺癌并因此而切除了他們的前列腺的男性病人中進行了獨立的臨床試驗。在進行完全前列腺切除后其可檢測水平PSA(前列腺特異性抗原)上升的病人中進行該研究，PSA水平的上升表明重新出現(xiàn)了前列腺癌。
將96位病人編入前列腺癌的評價中雙盲，安慰劑對照，包括以500mg/天對受藥病人給藥exisulind的多中心試驗。如下所示，數(shù)據(jù)表明在exisulind治療組和安慰劑組之間的PSA水平在統(tǒng)計學上差異顯著。與安慰劑治療組的PSA水平相比，exisulind治療組中的PSA水平顯著降低。雖然PSA水平的增加本身不是疾病狀態(tài)，但在醫(yī)學界它被廣泛認為是在這些男性中出現(xiàn)前列腺癌復發(fā)的替代性標記指示。
除了進行基于exisulind和安慰劑組之間平均PSA水平差異的評價外，中間分析包括亞組分析。根據(jù)他們發(fā)展成轉(zhuǎn)移性疾病的危險，研究中的病人被分成高、中和低危組。使用在美國醫(yī)學協(xié)會雜志(JAMM，1999年5月5日，pp1591-97)中的方法進行該分類。為了確定哪些研究病人落入何種危險組，給不知病人是否使用藥物或安慰劑的研究者提供病史；他根據(jù)上面提及的公開的方法確定把病人分配到適宜的危險組。統(tǒng)計分析表明在高和中危組中exisulind和安慰劑病人之間的平均PSA水平具有統(tǒng)計學上的顯著性差異。
來自前列腺研究的數(shù)據(jù)如下表10exisulind對在前列腺切除后具有增加的PSA的男性的平均PSA水平的影響組安慰劑 exisulind “p”值全部 4.492.850.0004高危 4.982.910.0002中等危險 6.242.950.0053在這些exisulind試驗以及一些其它包括其它適應癥的藥物的試驗中，通過監(jiān)測副作用(AEs)，臨床實驗室實驗(血液學，血清化學和尿分析)，活體信號(血壓、脈搏速率、呼吸速率、體溫和體重)，物理測定和上內(nèi)窺鏡學來評價安全性。
目前在四百多位病人中使用exisulind進行的臨床試驗證實了沒有明顯的安全性問題。exisulind不顯示任何與傳統(tǒng)化療相關的血質(zhì)不調(diào)，劑量限制性嘔吐或神經(jīng)或腎毒性。其也沒有造成活體信號的任何臨床顯著性變化。事實上，在APC病人的息肉和正常結腸組織的成對活體組織檢查中，發(fā)現(xiàn)exisulind增加息肉，而非正常結腸組織中的編程性細胞死亡速率，這表明exisulind對正常組織的影響極小。
在高于最大耐受劑量(在進行了亞整體結腸切除術的病人中MTD＝600mg；在具有完整結腸的病人中為400mg；在兒童病人中為350mg)的劑量下，發(fā)現(xiàn)的唯一的劑量限制性副作用為在治療早期見到的肝功能試驗(LETs)的升高。在試驗時，LET的升高可迅速地逆轉(zhuǎn)，當降低劑量時不復發(fā)。其它作用(例如偶然的腹痛)通常持續(xù)短時間和弱至中等強度，并不必需中斷或降低exisulind劑量。
簡單地說，這些試驗證實exisulind為一種有效的、耐受性好的可用于對腫瘤進行長期臨床處治的治療法。因此，這些結果表明選擇尤其是在體內(nèi)抑制cGMP特異性PDE活性(以及滿足本發(fā)明其它選擇標準)的另一種化合物可產(chǎn)生有療效的藥物。
在發(fā)現(xiàn)其作用機理涉及cGMP抑制和獲知其滿足本發(fā)明選擇標準之前發(fā)明的第二種藥物為(Z)-5-氟-2-甲基-(4-吡啶亞基)-3-(N-芐基)茚基乙酰胺鹽酸鹽(化合物I)。在體外和體內(nèi)評價中它被證實是一種具有抗多種腫瘤活性的抗腫瘤劑。在動物研究和單獨的升高劑量的人體研究中它也是安全的。
如本領域技術人員從下面提供的數(shù)據(jù)認識到的，化合物I可被安全地以遠遠超過可耐受劑量的常規(guī)化療劑或抗腫瘤劑NSAIDs(和在許多情況下有毒性)的劑量對動物給藥。例如，在大鼠的急性毒性研究中，以高達和包含2000mg/kg的劑量給藥的化合物I的單口服劑量(在0.5％羧甲基纖維素賦形劑中)未產(chǎn)生可觀察的毒性跡象。在4000mg/mg時，體重的增加稍有降低。以腹膜內(nèi)給藥的1000mg/mg單劑導致體重增加減緩，在尸體解剖時在來自該組的一些動物中見到腸系膜的粘附。
在狗中，以1000mg/kg以膠囊劑形式給藥化合物I，對于為兩只雄性和兩只雌性狗的一組未產(chǎn)生毒性跡象。由于化合物I膠囊的特性，對于每只動物該劑量必需使用至少13顆膠囊，其被判斷為在不使動物產(chǎn)生緊張時的最大數(shù)目。因此，這些狗隨后被給藥1000mg/kg/天的連續(xù)七次的劑量。在每次給藥期間均未觀察到任何明顯的藥物相關性作用的跡象。
因此，在單劑基礎上，化合物I不是急性毒性的。根據(jù)這些研究的發(fā)現(xiàn)，化合物I的口服LD50被認為比狗中的1000mg/mg和大鼠中的4000mg/kg大，腹膜內(nèi)LD50被認為比大鼠中的1000mg/kg大。
在大鼠的有關劑量范圍的七天研究實驗中，其中通過以0，50，500或2000mg/kg/天給藥來評價化合物I，在為50mg/kg/天時未產(chǎn)生可觀察的毒性跡象。在雌性大鼠中，在為500mg/kg/天時，治療相關的作用僅為肝臟重量的絕對和相對增加。在2000mg/kg/天時，在雄性大鼠中，作用包括加重的呼吸和/或異常呼吸聲音，體重增加減緩和食物消耗減少，在雌性大鼠中為肝臟重量增加。在任何劑量水平，未觀察到血液學或血液化學變化和任何顯微病理學變化。
還以0，50，500和2000mg/kg/天用大鼠進行28天研究。未觀察到由CP-461引起的異常臨床跡象，體重的變化、眼底鏡檢查、血液學和血液化學值和尿分析實驗值不顯著。在尸體解剖中未見到肉眼可見的組織變化。器官重量的數(shù)據(jù)表明在2000mg/kg/天時肝臟重量在統(tǒng)計學意義上顯著增加，和對于2000mg/kg/天組的甲狀腺重量在統(tǒng)計學意義上顯著增加。在低劑量時的輕微增加不具有統(tǒng)計學顯著性。對組織的組織病理學評價表明在甲狀腺中存在濾泡細胞肥大的痕跡，有絲分裂相的數(shù)目增加(表明可能的細胞增殖)和肝臟中存在中度的中心小葉肥大。在2000mg/kg/天劑量時，這些變化通常局限于少量動物，雖然在500g/kg/天時一只雌性大鼠在甲狀腺中具有增加的有絲分裂相。在肝臟中的這些發(fā)現(xiàn)可能是導致甲狀腺激素的代謝增加的微粒體酶受到非常適宜的刺激的指征，它反過來導致甲狀腺的刺激。因此，本領域技術普通人員認識到與在類似劑量的常規(guī)化療劑或NSAIDs時所達到的效果相比較，這些作用極小。
為了進一步建立化合物I的安全性范圍，進行研究以評價由化合物I誘導的前列腺腫瘤細胞系的編程性細胞死亡是否可與其對來自正常組織的前列腺上皮細胞的作用相比。在標準條件下，使用包含5％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的RPMI 160培養(yǎng)基使對雄激素敏感的前列腺腫瘤細胞系，LNCaP(來自ATCC(Rockville，MD))增殖。將來自正常前列腺的原前列腺上皮細胞培養(yǎng)物(PrEC)培養(yǎng)在與腫瘤細胞系相同的條件下，不同的是使用優(yōu)化用于這些培養(yǎng)物生長的無血清培養(yǎng)基(Clonetics公司)。為了實驗，將LNCaP或PrEC細胞以10,000細胞/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板中。24小時后，將細胞用賦形劑(0.1％ DMSO)或溶解在DMSO中的50μM化合物I(游離堿)處理。經(jīng)過不同的藥物處理時間后(4，24，48，72或99小時)，將細胞溶解并進行測定作為編程性細胞死亡的指標的與組蛋白相關的DNA(參見Piazza等，癌癥研究572452-2459，1997)。
圖27表明在用50μM化合物I(游離堿)處理后，在LNCaP細胞培養(yǎng)物中的與組蛋白相關的斷裂DNA的量隨時間增加。24小時處理后，檢測出斷裂DNA有顯著增加，將該誘導保持長達4天的連續(xù)處理。相反，在長達4天的處理中，用化合物I(50μM)對PrEC(“正?！鼻傲邢?細胞進行的處理不影響DNA的斷裂。這些結果證實與正常細胞相反，在腫瘤細胞中的對編程性細胞死亡具有選擇性誘導。這與在迅速生長的正常和腫瘤細胞等中誘導編程性細胞死亡或壞死的常規(guī)化療劑明顯相反。
最后，對于安全性，采用單獨的提高劑量的人臨床試驗，其中在對口服藥物的病人的安全性研究中，在任何劑量下，化合物I沒有產(chǎn)生顯著的副作用，包括在被預測對于產(chǎn)生抗癌作用為必需的用量之上的劑量。
如上所述，化合物I還顯示可能的抗腫瘤特性。在SW-480細胞系中，對于化合物I所獲得的生長抑制IC50值為0.7μM。該結果通過使用異常小囊轉(zhuǎn)化灶(“ACF”)作為致癌作用的指示物在嚙齒類動物中評價化合物I而得以證實(參見Bird，癌癥通訊37147-151，1987)。這種由氧化偶氮甲烷(“AOM”)誘導的癌癥發(fā)生的嚙齒類動物模型被用來評價化合物I(游離堿和鹽)在體內(nèi)對結腸癌發(fā)生的影響。ACF為結腸癌的前體，ACF的抑制是化療預防有效的表示。
在該試驗的大鼠中，通過連續(xù)兩周注射致癌物來完成ACF的啟動。在啟動ACF之前一周和在試驗中給藥化合物I。治療5周后，計數(shù)ACF。對雄性Fisher 344大鼠口服給藥化合物I。在試驗過程中改變每天的食物消耗(mg/kg體重)，因此，化合物I的劑量以g/kg食物表示以提供劑量之間比較的基礎。為了確定化合物I是否對生長和/或飼養(yǎng)行為具有副作用，在整個實驗過程中測定體重。實驗組比對照組獲得較少的增重，增重是生物利用率的表現(xiàn)。然而，體重的差異小于10％，并不被認為影響ACF的形成。
如通過每根結腸的小囊數(shù)減少所測定的，化合物I的游離堿抑制ACF的形成。數(shù)據(jù)總結在表11中。除了低劑量組(僅0.5g/kg飲食)外，治療和對照組之間的差異是明顯的，在1.0和2.0g/kg飲食組的情況下其差異為統(tǒng)計學上的顯著性。
表11化合物I對異常小囊轉(zhuǎn)移灶的抑制化合物劑量 n 平均ACF/結腸 ％對照 p(t-試驗)與(g/kg飲食)(+SE) 對照對照10 149±9- -0.57 149±14 1000.9921 10111±9 75 0.0081.510132±4 89 0.10120 10107±15 72 0.029
而且，化合物I可追溯性地滿足本發(fā)明的選擇標準，并為一種被用來確立該選擇標準的可行性的化合物。例如使用前面描述的方法，使用來自HT29細胞提取物的cGMP特異性PDE，化合物I具有0.68μM的cGMP特異性PDE IC50值。其COX I的抑制(為100μM)小于25％。
如對于前編程性細胞死亡，化合物I的DNA斷裂EC50為15μM。此外，在各種藥物濃度下化合物I在SW-480中的編程性細胞死亡的百分數(shù)示于表12中。
表12按形態(tài)學所確定的化合物I對SW-480結腸腺瘤細胞的HT-29細胞的編程性細胞死亡的誘導處理 劑量 ％編程性細胞死亡賦形劑(0.1％DMSO)- 1化合物I 0.35μM16化合物I 0.7μM 27化合物I 1.5μM 88化合物I的活性不局限于抗結腸癌細胞系活性或結腸癌的動物模型。它在各種腫瘤細胞系中具有廣范圍的抗腫瘤作用。在無菌條件下，在含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉的RPMI 1640培養(yǎng)基中讓各種類型的人癌癥細胞系增殖。為了確定化合物I的生長抑制作用，以1000細胞/孔將細胞接種在96孔板中。接種后經(jīng)過24小時，用各種濃度的溶解在DMSO中的化合物I的游離堿對細胞進行給藥(最終濃度為0.1％)。在五天的連續(xù)處理后，使用中性紅細胞毒性分析法確定藥物對腫瘤細胞生長的作用。中性紅為一種通過ATP依賴性轉(zhuǎn)運機理被活細胞選擇性攝取的染料。
如表13所總結的，當對一組來自各種組織器官的培養(yǎng)的人細胞系進行評價時，化合物I(游離堿)顯示有效的生長抑制活性。不管作為細胞系來源的腫瘤的組織發(fā)生如何，化合物I顯示可比較的生長抑制作用。對于所有細胞系計算的GI50值(相對于對照組生長抑制50％時的藥物濃度)為1-2μM。
除了下表中的數(shù)據(jù)以外，我們觀察到人白血病細胞系(CCRF-CEM，K562和Molt-4)、骨髓瘤細胞系(RPMI8226)、胰腺腫瘤(PAN-1)和卵巢癌細胞系(OVCAR-3)對化合物I(鹽酸鹽)具有可比較的敏感性。
表13化合物I對各種人腫瘤細胞系生長的抑制細胞系 腫瘤的來源GI50μM GI90μMColo 205 結腸 1.6 2.4HCT-15 結腸 1.7 3.0HT-29結腸 2.1 8.0SW-620 結腸 1.7 2.5DU145前列腺1.6 2.8PC-3 前列腺1.7 82.5NCI-H23 肺1.7 2.5NCI-H322M肺2.1 13.2NCI-H460 肺1.9 30.0NCI-H82 肺1.7 5.8MDA-MB-231 乳房 1.8 77.6MDA-MB-435 乳房 1.6 2.3UISO-BCA-1 乳房 1.5 4.7Molt-4*白血病1.6 NDCCRF-CEM*血病 1.4 NDK-562*白血病1.8 NDRPMI-8226*骨髓瘤1.2 NDOVCAR*卵巢 1.2 NDPANC-1*胰腺 2.2 ND*用化合物I的游離堿進行試驗，除非用星號另有說明(其中試驗使用鹽酸鹽來進行)。
在已知化合物I的動物和人安全性特征以及化合物I對動物和很多種細胞培養(yǎng)物功效的條件下，很明顯，滿足本發(fā)明的選擇標準的化合物(包括cGMP特異性PDE抑制)可用于抗腫瘤治療。
為了鑒定可治療有效性地作為抗腫瘤劑的并具有cGMP特異性PDE抑制活性的化合物，本領域普通技術人員具有許多公開的有用的模型化合物(以及其它的類似物，在此引入?yún)⒖?，它們可被用作具有相同構象、但不同化學性質(zhì)的其它化合物的計算機模擬的基礎。例如，如由Molecular Simulations公司出售的軟件，WebLabViewerProTM版本包括分子目測法和化學交換能力。該軟件包括官能度，包括已知化合物的3D目測以證實所勾勒出或輸入的化學結構的精確度。此外，該軟件允許根據(jù)用戶規(guī)定的特性添加結構，并且用戶可測定距離、角度或雙面。
在這種情況下，由于上面公開了其它活性化合物的結構，可應用簇分析和該軟件的2D和3D類似性檢索技術來鑒定可能的新的其它化合物，對鑒定出的化合物可根據(jù)本發(fā)明的選擇標準接著進行篩選和選擇。這些軟件方法依賴于這一原理，即類似或具有類似特性的化合物最有可能具有類似的活性，其中這些化合物可使用本發(fā)明的選擇標準而得以證實。
同樣，當這些其它的化合物被計算機模擬時，可使用藥物工業(yè)領域普通技術人員通常使用的已知的結合化學方法來合成許多這些化合物和其變異體。一些可用的結合化學方法的實例包括由位于BothellWashington的New Chemical Entities公司，位于Palo Alto，California的Protogene Laboratories公司，位于South San Francisco，California的Axys公司，位于Tucson，Arizona的Nanosyn公司，位于San Diego，California的Trega公司和位于Natick，Mass的RBI公司提供的那些方法。有許多其它雇用公司。許多大的藥物公司具有雖然不是極好，卻也類似的實驗室能力。簡單地說，本領域普通技術人員可容易地制備許多用于從中選擇有效的化合物而用于治療腫瘤的具有本文公開的化合物特性的化合物。為了進一步有助于鑒定可使用本發(fā)明標準篩選和接著選擇的化合物，判斷所選擇的抗腫瘤化合物與PDE5蛋白的結合特性是有價值的。通過下面討論的方法，發(fā)現(xiàn)滿足本發(fā)明選擇標準的理想化合物可與PDE5的cGMP催化區(qū)結合。
為了確定它，使用不包括催化區(qū)的PDE5序列。制備該序列的一種方式是將優(yōu)選與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(“GST”)形成的融合蛋白的序列表達，其原因是顯而易見的。
使用按牛PDE5A cDNA序列設計的正向和反向引物和在PDE 1-10家族中的選擇，用RT-PCR法來獲得PDE5的cGB區(qū)(McAllister-Lucas L.M.等，生物化學雜志268，22863-22873，1993)。用于總RNA的5′-3′-公司試劑盒，接著用寡(dT)柱純化mRNA，與HT-29細胞一起使用。正向引物(GAA-TTC-TGT-TAG-AAA-AGC-CAC-CAG-AGA-AAT-G，203-227)和反向引物(CTC-GAG-CTC-TCT-TGT-TTC-TTC-CTC-TGC-TG，1664-1686)被用來合成編碼磷酸化位點和人PDE5A的低和高親和性cGMP結合位點的1484bp片段(203-1686bp，cGB-PDE5)。所合成的cGB-PDE5核苷酸片段編碼與牛PDE5A具有97％相似性的494個氨基酸。接著將它克隆至具有tac啟動子和EcoRI和XhoI切割位點的pGEX-5X-3谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合載體中(Pharmacia Biotech)。然后將融合載體轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)細菌中(Invitrogen)。將轉(zhuǎn)染的BL21細菌培養(yǎng)至對數(shù)期，接著加入作為誘導劑的IPTG。20℃下，將誘導進行24小時。收集細菌并裂解。將可溶性細胞溶解產(chǎn)物與GHS結合的Sepharose 4B(GSH-Sepharose 4B)一起保溫。GST-cGB-PDE5融合蛋白可與GSH-Sepharose珠結合，并用過量的冷PBS將其它蛋白從珠中洗脫下來。
所表達的GST-cGB-PDE5融合蛋白在7.5％ SDS-PAGE凝膠中以85Kd蛋白顯示。其特征在于其與cGMP結合和可被蛋白激酶G和A磷酸化。它顯示兩個cGMP結合位點，Kd為1.6±0.2μM，它接近于天然牛PDE5的Kd＝1.3μM。GSH結合的Sepharose珠上的GST-cGB-PDE5可在體外通過cGMP依賴性蛋白激酶和cAMP依賴性蛋白激酶A磷酸化。通過PKG磷酸化的GST-cGB-PDE5的Km為2.7μM，Vmax為2.8μM，而BPDEtide磷酸化的Km為68μM。由PKG的磷酸化表明磷酸分子以1∶1的比例摻入至GST-cGB-PDE5蛋白中。
在包含5mM磷酸鈉緩沖液(pH＝6.8)，1mM EDTA，0.25mg/mlBSA，H3-cGMP(2μM，NEN)和GST-cGB-PDE5融合蛋白(30μg/分析)的100μl總體積中進行對感興趣化合物的cGMP結合分析(Francis S.H.等，生物化學雜志255，620-626，1980)。同時加入作為H3-cGMP底物的待測各種化合物，22℃下，將混合物保溫1小時。接著將混合物轉(zhuǎn)移至使用GF/B作為濾膜的Brandel MB-24細胞收集器中，接著用10ml冷的5mM磷酸鉀緩沖液(pH6.8)洗滌2次。切下膜另轉(zhuǎn)移至閃爍瓶中，接著將1ml H2O和6ml Ready SafeTM閃爍液體混合物加入至各瓶中。在Beckman LS 6500閃爍儀中進行計數(shù)。
為了計算，通過將結合蛋白煮沸5分鐘來制備空白樣品，當與未煮沸的蛋白比較時，結合讀數(shù)小于1％。還校正了濾膜或其它殘渣的猝滅。選用PDE5抑制劑、硫化物、exisulind、化合物B、化合物E、E4021和zaprinast和環(huán)核苷酸類似物、cAMP、環(huán)IMP、8-溴-cGMP、環(huán)UMP、環(huán)CMP、8-溴-cAMP、2′-O-丁基-cGMP和2′-O-丁基-cAMP，檢測它們是否競爭性地與GST-cGB-PDE5蛋白的cGMP結合位點結合。結果示于圖24中。cGMP特異性地與GST-cGB-PDE5蛋白結合。環(huán)AMP、cUMP、cCMP、8-溴-cAMP、2′-O-丁基-cAMP和2′-O-丁基-cGMP在結合中不與cGMP競爭。高濃度(100μM)的環(huán)IMP和8-溴-cGMP可部分地與cGMP(2μM)結合競爭。沒有任何一種PDE5抑制劑顯示出在與GST-cGB-PDE5的結合中與cGMP的競爭。因此，它們不與PDE5的cGMP結合位點結合。
然而，化合物E確實競爭性地(與cGMP)和PDE5結合(即峰A)。(化合物E還競爭性地(與cGMP)和PDE峰B結合)。在化合物E不與PDE5的cGMP結合位點結合的條件下，在化合物E與cGMP之間存在競爭性結合的事實完全意味著理想化合物，如化合物E與PDE5中的cGMP催化位點結合，這一信息可容易被本領域技術人員獲得(使用常規(guī)競爭性結合實驗)并有助于本領域技術人員更容易地模擬其它化合物。因此，借助于本文提供的理想化合物的化學結構和cGMP結合位點的信息，本領域技術人員可模擬、確定和選擇(使用本發(fā)明的選擇標準)其它可用作治療劑的其它化合物。
從術語“藥物組合物”即化合物(如上述的固體)和可藥用載體的一般含義可以熟知，根據(jù)本發(fā)明方法選擇的化合物可被配制成藥物組合物，可以通過固體或液體形式口服給藥，通過液體形式以IV或IP給藥，通過軟膏形式局部給藥，或通過栓劑形式直腸或局部給藥?？诜o藥的載體是最優(yōu)選的。
如本領域所熟知的，在藥物組合物中用于口服給藥的可藥用的載體包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑、錠劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，載體可包含至少一種惰性稀釋劑，如蔗糖、乳糖或淀粉。如在常規(guī)實踐中，這些載體還可包含除稀釋劑外的其它物質(zhì)，例如潤滑劑，如硬脂酸鎂。在膠囊劑、片劑、錠劑和丸劑的情況下，載體還可包含緩沖劑?？芍苽湓谄?、丸或顆粒的表面有腸衣的載體，如片、丸和顆粒。另外，可將腸衣包覆的化合物壓成片、丸或顆粒中，片劑、丸劑或顆粒劑用于對病人給藥。優(yōu)選的腸衣包括在結腸pH值下溶解或分解的那些，如紫膠或Eudraget S。
藥物組合物中的可藥用的載體包括用于口服給藥的液體劑型，例如包含本領域常用的惰性稀釋劑，如水的可藥用的乳劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿和馳劑。除這些惰性稀釋劑外，組合物還包含佐劑，如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑，增甜劑、增香劑和芳香劑。
用于IV或IP給藥的藥物組合物中的可藥用載體包括常用的藥物鹽溶液。
用于局部給藥的藥物組合物中的可藥用載體包括DMSO、醇或丙二醇等可與膜片和其它保持液體的物質(zhì)引起使用，以將藥物適當?shù)乇Ａ粼谄つw上以使藥物不蒸發(fā)掉。
用于直腸給藥的藥物組合物中的可藥用載體優(yōu)選為除本發(fā)明化合物外，可包含賦形劑，如可可油或栓劑蠟或凝膠的栓劑。
可藥用載體和本發(fā)明化合物被配制成單劑形式的用于對病人給藥的藥物組合物。單劑中的活性成分(即根據(jù)本發(fā)明選擇的化合物)的劑量可以變化，以在根據(jù)所需給藥方法中(即口服或經(jīng)直腸)獲得消除致瘤作用活性的有效量的活性成分。因此，選擇的劑量取決于給藥的活性化合物的特性(例如其IC50，它可容易地確定)、給藥途徑、所需的治療期和其它因素。如果需要，單劑可為對活性化合物的每日需要量在一個劑量中，或分散在多個給藥劑量中，例如每天2至4次。對于IV給藥，可通過在平均成年男性的血漿內(nèi)含物(即約4升)中獲得IC50的劑量來確定用于給藥的起始劑量。根據(jù)本發(fā)明選擇的活性化合物的起始劑量的范圍可為0.5-600mg。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選被包裝在具有包括適應癥、使用說明等的適宜印刷物(例如包裝插頁)容器中(例如藥盒或藥瓶或兩者)。
顯然，根據(jù)上面的說明，本發(fā)明許多的修改和改變均是可能。因此，應理解在所附權利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不如本文具體描述的其它方式來進行。
權利要求
1.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，該化合物通過下列步驟進行選擇確定化合物的環(huán)加氧酶(COX)抑制活性；確定化合物的PDE抑制活性，其中PDE的特征在于(a)cGMP特異性高于cAMP；(b)在存在cGMP底物時為正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP具有亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感；和選擇具有比所述PDE活性低的COX抑制活性的化合物用于治療腫瘤。
2.權利要求1的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物在腫瘤細胞培養(yǎng)物中是否抑制腫瘤細胞的生長；和選擇出抑制腫瘤細胞生長的化合物用于治療腫瘤。
3.權利要求2的藥物組合物，其中通過評估化合物是否誘導編程性細胞死亡來確定對生長的抑制。
4.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，該化合物通過下列步驟進行選擇確定化合物的腫瘤細胞抑制活性；確定化合物的PDE抑制活性，其中PDE的特征在于(a)cGMP特異性高于cAMP；(b)在存在cGMP底物時為正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP具有亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感；和選擇具有比所述PDE活性低的COX抑制活性的化合物用于治療腫瘤。
5.權利要求4的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物是否在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡；和選擇出能誘導編程性細胞死亡的化合物。
6.權利要求5的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物是否具有COX抑制活性；和選擇出其COX抑制活性比對所述PDE的抑制活性低的化合物。
7.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種通過確定化合物的PDE抑制活性而選擇的化合物，其中PDE的特征在于(a)cGMP特異性高于cAMP(b)在存在cGMP底物時為正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP具有亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感；和(e)選擇具有該抑制活性的化合物。
8.權利要求7的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物是否在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡；和選擇具有誘導編程性細胞死亡活性的化合物。
9.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，該化合物通過下列步驟進行選擇確定化合物的環(huán)加氧酶(COX)抑制活性；確定化合物的PDE2抑制活性；和選擇具有比所述PDE活性低的COX抑制活性的化合物用于治療腫瘤。
10.權利要求9的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物在腫瘤細胞培養(yǎng)物中是否抑制腫瘤細胞的生長；和選擇其中抑制腫瘤細胞生長的化合物用于治療腫瘤。
11.權利要求10的藥物組合物，其中對生長的抑制通過確定化合物是否誘導編程性細胞死亡來確定。
12.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，該化合物通過下列步驟進行選擇確定化合物的腫瘤細胞生長抑制活性；確定化合物的PDE2抑制活性；和選擇顯示出腫瘤細胞生長抑制活性和所述PDE抑制活性的化合物。
13.權利要求12的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物是否在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡；和選擇能誘導編程性細胞死亡的化合物。
14.權利要求13的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物是否具有COX抑制活性；和選擇出其COX抑制活性比對所述PDE的抑制活性低的化合物。
15.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種通過確定化合物的PDE2抑制活性并選擇具有該抑制活性的化合物而選出的化合物。
16.權利要求15的藥物組合物，其中化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物是否在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡，并選擇具有編程性細胞死亡誘導活性的化合物。
17.用于治療腫瘤的化合物的選擇方法，包括確定化合物的環(huán)加氧酶(COX)抑制活性；確定化合物的PDE2抑制活性；和選擇具有比所述PDE活性低的COX抑制活性的化合物用于治療腫瘤。
18.權利要求17的方法，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的確定化合物在腫瘤細胞培養(yǎng)物中是否抑制腫瘤細胞的生長；和選擇其中抑制腫瘤細胞生長的化合物用于治療腫瘤。
19.權利要求18的方法，其中對生長的抑制通過確定化合物是否誘導編程性細胞死亡來確定。
20.用于治療腫瘤的化合物的篩選方法，包括確定化合物的腫瘤細胞生長抑制活性；確定化合物的PDE2抑制活性；和選擇顯示出腫瘤細胞生長抑制活性和所述PDE抑制活性的化合物。
21.權利要求20的方法，包括進一步確定化合物是否在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡；和選擇出能誘導編程性細胞死亡的化合物。
22.權利要求21的方法，進一步包括確定化合物是否具有COX抑制活性；和選擇出其COX抑制活性比對所述PDE的抑制活性低的化合物。
23.用于治療腫瘤的化合物的選擇方法，包括確定化合物的PDE2抑制活性并選擇具有該抑制活性的化合物。
24.權利要求23的方法，其中化合物通過如下步驟進一步選擇確定化合物是否在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡，并選擇具有編程性細胞死亡誘導活性的化合物。
25.用于治療腫瘤的化合物的鑒定方法，包括確定化合物的環(huán)加氧酶(COX)抑制活性；和確定化合物的PDE抑制活性，其中PDE的特征在于(a)cGMP特異性高于cAMP；(b)在存在cGMP底物時為正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP具有亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感；和選擇具有比所述PDE抑制活性低的COX抑制活性的化合物。
26.權利要求25的方法，進一步包括確定在培養(yǎng)物中化合物是否抑制腫瘤細胞生長；并選擇出能抑制腫瘤細胞生長的化合物用于治療腫瘤。
27.權利要求25的方法，進一步包括(a)確定化合物是否誘導腫瘤細胞的編程性細胞死亡；和(b)選擇能誘導編程性細胞死亡的化合物用于治療腫瘤。
28.用于治療腫瘤的化合物的選擇方法，包括確定化合物的生長抑制活性；確定化合物的PDE抑制活性，其中PDE的特征在于(a)cGMP特異性高于cAMP；(b)在存在cGMP底物時為正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP具有亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感；和選擇顯示出生長抑制活性和所述PDE抑制活性的化合物。
29.具有可用于治療腫瘤的潛能的化合物的篩選方法，包括確定受試化合物的PDE抑制活性，其中PDE的特征在于(a)cGMP特異性高于cAMP；(b)在存在cGMP底物時為正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP具有亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感；和選擇具有該抑制活性的化合物。
30.權利要求29的方法，進一步包括確定化合物在細胞中是否誘導編程性細胞死亡并進一步選擇具有編程性細胞死亡誘導活性的化合物。
31.權利要求29的方法，進一步包括確定選擇的化合物是否抑制前列腺素的合成并進一步選擇基本上不具有前列腺素抑制活性的化合物。
32.權利要求29的方法，其中所述PDE活性是通過如下步驟確定的從包含PDE5和所述新的PDE的腫瘤細胞系中分離cGMP特異性PDE活性部分，將所述混合的PDE分離物暴露于濃度為不抑制新的PDE的PDE5抑制劑中來抑制PDE5活性，并確定受試化合物對剩余cGMP活性的抑制活性，從而可確定受試化合物對所述新的PDE的抑制活性。
33.一種分離的磷酸二酯酶，其特征在于具有(a)高于cAMP的cGMP特異性；(b)在存在cGMP底物時的正協(xié)同動力學行為；(c)對于cGMP的亞微摩爾的親和性；和(d)對與純化的cGMP依賴性蛋白激酶的保溫不敏感。
34.權利要求33的分離的磷酸二酯酶，進一步特征在于對受zaprinast和E4021抑制的敏感性降低。
35.權利要求33的分離的磷酸二酯酶，進一步特征在于它可通過陰離子交換色譜與典型的PDE5活性分開。
36.權利要求35的分離的磷酸二酯酶，進一步特征在于它基本上不被鈣/鈣調(diào)蛋白活化。
37.權利要求36的分離的磷酸二酯酶，進一步特征在于它對咯利普蘭、長春西汀和引哚利旦不敏感。
38.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，其中化合物通過下列步驟進行選擇評價化合物對待治療腫瘤的抗腫瘤活性；評價在待治療的腫瘤中化合物是否增加PKG活性；和選擇在待治療的腫瘤中顯示抗腫瘤活性和具有能導致PKG活性增加的能力的化合物。
39.權利要求38的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的評價化合物是否抑制PDE5，并選擇能抑制PDE5的化合物。
40.權利要求38的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的評價在待治療的腫瘤中化合物是否降低β-連環(huán)蛋白，并選擇能降低β-連環(huán)蛋白的化合物。
41.權利要求38的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的評價化合物是否抑制cGMP特異性磷酸二酯酶(“PDE”)，并選擇能抑制所述PDE的化合物。
42.權利要求38的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的評價化合物是否增加PKG的表達，并選擇能增加PKG表達的化合物。
43.權利要求38的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的評價化合物是否增加PKG的活性，并選擇能增加PKG活性的化合物。
44.權利要求38的藥物組合物，其中所述化合物是通過如下步驟進一步選擇的評價化合物是否抑制PDE2，并選擇能抑制PDE2的化合物。
45.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，其中化合物通過下列步驟進行選擇評價在待治療腫瘤的完整腫瘤細胞中化合物是否增加PKG活性；評價在腫瘤細胞中化合物是否減少β-連環(huán)蛋白；和選擇在完整腫瘤細胞中導致PKG活性增加并在待治療腫瘤中導致β-連環(huán)蛋白減少的化合物。
46.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，其中化合物通過如下步驟進行選擇選擇在腫瘤中增加PKG活性的化合物，評價化合物的腫瘤生長抑制活性；其中能增加PKG活性并具有腫瘤生長抑制活性的化合物具有抑制腫瘤的能力，并基本上不抑制正常細胞的生長。
47.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，其中化合物通過如下步驟進行選擇確定化合物的環(huán)加氧酶(COX)抑制活性；并確定在腫瘤細胞中化合物是否增加PKG的活性；和選擇其COX抑制活性比其增加PKG活性的能力低的化合物用于治療腫瘤。
48.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，其中化合物通過如下步驟進行選擇確定化合物的腫瘤細胞生長抑制活性；并確定在腫瘤細胞中化合物是否增加PKG的活性；和選擇顯示出腫瘤細胞生長抑制活性并在腫瘤細胞中增加PKG活性的化合物。
49.用于治療腫瘤的藥物組合物，包含可藥用的載體和一種化合物，其中化合物通過如下步驟進行選擇評價在用化合物處理的腫瘤中PKG是否導致β-連環(huán)蛋白磷酸化，并選擇能導致PKG將β-連環(huán)蛋白磷酸化的化合物作為治療待治療腫瘤的化合物。
50.選擇可用于治療待治療腫瘤的化合物的方法，包括(a)評價化合物對待治療腫瘤的抗腫瘤活性；(b)評價在待治療腫瘤中化合物是否增加PKG活性；和(c)選擇顯示出抗腫瘤活性和具有在待治療腫瘤中導致PKG活性增加的能力的化合物。
51.權利要求50的方法，進一步包括評價化合物是否抑制PDE5，和選擇能抑制PDE5的化合物。
52.權利要求50的方法，進一步包括評價在待治療的腫瘤中化合物是否減少β-連環(huán)蛋白，并選擇能減少β-連環(huán)蛋白的化合物。
53.權利要求50的方法，進一步包括評價化合物是否抑制cGMP特異性磷酸二酯酶(“PDE”)并選擇能抑制所述PDE的化合物。
54.權利要求50的方法，進一步包括評價化合物是否增加PKG的表達并選擇能增加PKG表達的化合物。
55.權利要求50的方法，進一步包括評價化合物是否增加PKG的活化并選擇能增加PKG活化的化合物。
56.權利要求50的方法，進一步包括評價化合物是否抑制PDE2并選擇能抑制PDE2的化合物。
57.選擇用可用于治療待治療腫瘤的化合物的方法，包括(a)評價化合物在待治療腫瘤的完整腫瘤細胞中是否增加PKG活性；(b)評價在腫瘤細胞中化合物是否減少β-連環(huán)蛋白；和(c)選擇在完整腫瘤細胞中導致PKG活性增加并在待治療腫瘤中導致β-連環(huán)蛋白降低的化合物。
58.具有可用于治療腫瘤的潛能的化合物的鑒定方法，包括選擇在腫瘤中增加PKG活性的化合物，評價化合物的腫瘤生長抑制活性；其中增加PKG活性并具有腫瘤生長抑制活性的化合物具有抑制腫瘤的能力，并基本上不抑制正常細胞的生長。
59.具有可用于治療腫瘤的潛能的化合物的鑒定方法，包括確定化合物的環(huán)加氧酶(COX)抑制活性；和確定在腫瘤細胞中化合物是否增加PKG的活性；其中低的COX抑制活性和使PKG活性增加是化合物具有治療腫瘤能力的指征。
60.用于治療腫瘤的化合物的選擇方法，包括確定化合物的腫瘤細胞生長抑制活性；確定在腫瘤細胞中化合物是否增加PKG活性；和選擇顯示出腫瘤細胞生長抑制活性和在腫瘤細胞中使PKG活性增加的化合物。
61.一種用于治療待治療腫瘤的化合物的選擇方法，包括評價在用化合物處理的腫瘤中PKG是否導致β-連環(huán)蛋白磷酸化，并選擇導致PKG將β-連環(huán)蛋白磷酸化的化合物作為治療待治療腫瘤的化合物。
全文摘要
通過鑒定出能抑制cGMP磷酸二酯酶和在腫瘤細胞中增強PKG活性的化合物,可選擇出用于治療腫瘤的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK1255379SQ99121818
公開日2000年6月7日 申請日期1999年10月15日 優(yōu)先權日1998年10月15日
發(fā)明者劉莉, 朱冰, 李晗, W·約瑟夫·湯普森, 里佛特·帕穆克庫, 加里·A·皮亞扎 申請人:細胞途徑公司