專利名稱：鑒定和/或定量靶化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過與固定在芯片上的捕獲分子結(jié)合，鑒定和/或定量從生物樣品中獲得的靶化合物的方法。
本發(fā)明還涉及基于所述方法進(jìn)行鑒定和/或定量的設(shè)備，該設(shè)備使得可以鑒定和/或定量在所述芯片上結(jié)合的靶化合物的陽性位置。
然而，由于所述微型化造成結(jié)合的靶化合物的量極少(幾個飛摩爾或甚至幾個阿摩爾)，所以對結(jié)合的靶化合物的檢測是困難的。因此，只有極為靈敏的方法才足以用于該檢測。
已經(jīng)提議用熒光分子對靶化合物例如DNA在其可能的遺傳擴(kuò)增之后進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)必須檢測RNA分子時，首先在其可能的擴(kuò)增之前，將其轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。如果直接標(biāo)記該靶化合物不可行，則可以采取雙反應(yīng)(夾心反應(yīng)(sandwich reaction))。然而，熒光分子的量極低，以致必須開發(fā)特定的陣列掃描儀用于檢測和/或定量該“雜交芯片”上結(jié)合的化合物。所述昂貴的特定掃描儀含有用于激發(fā)這些熒光分子的激光掃描器、用于減少熒光背景噪音的光孔、和用于增強(qiáng)檢測靈敏度的光電倍增器。
文件US-5,821,060和WO95/04160中描述了另一種具有高靈敏度的檢測方法，該方法基于采用昂貴裝置例如質(zhì)譜儀進(jìn)行的檢測。
還提出了以比色標(biāo)記(US5,270,167、US4,731,325，EP-A-0301141)或酶作用結(jié)果(EP-A-0393868、WO86/02733、EP-A-0063810)造成的特異產(chǎn)物沉淀為基礎(chǔ)的方法。然而，由于沉淀在離該結(jié)合反應(yīng)一定距離的位置發(fā)生，不能容易地將其位置與特異結(jié)合的靶化合物聯(lián)系起來，故所述這些方法或是靈敏度低或是不足以檢測到“雜交芯片”上的靶化合物。此外，這些酶反應(yīng)沉淀物的密度也不夠不透光，使得不能通過光吸收進(jìn)行檢測。
還提出，通過用金屬固定該酶反應(yīng)產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物，之后使其沉淀，以提高該檢測方法。然而，當(dāng)所述酶反應(yīng)的結(jié)果是可溶性產(chǎn)物時，沉淀物的位置和特異結(jié)合的靶化合物的檢測不相關(guān)。
發(fā)明目的本發(fā)明旨在提供一種鑒定和/或定量生物樣品中存在(可能同時存在)的一種或多種靶化合物的新方法，該方法不存在現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。
本發(fā)明旨在提供簡單而廉價的這樣一種方法，該方法通過采用固定在固相支持物表面陣列上的捕獲分子，使得可以對所述靶化合物進(jìn)行檢測。
本發(fā)明的最后一個目的是還提供基于所述方法的簡單而不昂貴的設(shè)備，該設(shè)備可以提高對“雜交芯片”上結(jié)合的靶化合物的鑒定和/或定量。
有利地，所述方法包括步驟-用捕獲分子接觸該靶化合物，以便使所述靶化合物可以和(相應(yīng))捕獲分子特異結(jié)合，所述捕獲分子按照密度為每cm2含有至少20個離散區(qū)域的陣列被固定在固相支持物表面，所述這些離散區(qū)域的每一個均固定有一種捕獲分子，-進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選(化學(xué)或生物化學(xué))催化反應(yīng)，以導(dǎo)致在所述結(jié)合的位置形成沉淀物，-優(yōu)選通過使用掃描儀，確定離散區(qū)域中沉淀物的可能存在，和-將離散區(qū)域中沉淀物的存在(沉淀模式)與該生物樣品中所述靶化合物的鑒定和/或定量相關(guān)聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明，“雜交芯片”是允許在其一或多個表面上形成捕獲分子陣列(特定模式)的任何類型固相支持物。所述固相支持物可以由玻璃、濾膜、電子器件、聚合或金屬材料等構(gòu)成。優(yōu)選地，所述陣列含有(有利地根據(jù)特定模式存在的)特定位置，每個位置通常僅含有一種捕獲分子。
文件US-5,561,071中描述了在蛋白質(zhì)上固定DNA鏈，之后與片基上位點特異性位置的特異附著。還已知，如文件GB-3319838中所述的，可以將捕獲化合物和微型管連接，然后對這些微型管進(jìn)行空間排列，以便產(chǎn)生陣列，或按文件EP-0476014、US-5,510,270、US-5,445,934、WO97/29212、US-5,605,662、US-5,632,957和WO94/22889中所述通過采用光刻技術(shù)在特定表面上獲得寡核苷酸的直接合成。
所有這些在固相支持物上固定捕獲分子以便獲得上述陣列的方法均與本發(fā)明相容。
根據(jù)本發(fā)明的生物靶化合物可以存在于生物(或可以是非生物)樣品例如從血液、尿、糞便、唾液、膿、血清、組織中提取的臨床樣品、發(fā)酵液或培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，必要時，在“雜交芯片”上檢測和/或定量所述靶化合物之前，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對其進(jìn)行分離、純化、切割、拷貝和/或擴(kuò)增。
優(yōu)選地，通過金屬化合物在所結(jié)合的靶化合物上的固定，或通過在酶存在時金屬的還原，在結(jié)合位置獲得沉淀物的形成。有利地，在膠體金存在時還原銀，這使得可以在結(jié)合的靶化合物和其捕獲分子之間不超過幾個微米的距離內(nèi)形成沉淀。
根據(jù)本發(fā)明，陣列上的這些特定位置在長度上小于1000μm。這些位置或點優(yōu)選具有10-500μm的直徑，并且相隔相似數(shù)量級的距離，以致固相支持物上的陣列在1cm2表面上含有100-250,000個點。然而，也可以制備1μm或更小的點，在其上固定捕獲分子。所述點或位置的形成可以通過已知的允許通過共價鍵合或非共價吸附將所述捕獲分子固定在固相支持物表面上的微電子或光刻工藝和裝置來實現(xiàn)。為了特異控制捕獲分子固定的位點，并避免可導(dǎo)致在孵育或洗滌步驟中能夠解吸附的若干捕獲分子(如核酸或抗體)的可能缺陷，優(yōu)選共價鍵合技術(shù)。
一個優(yōu)選實施方案是通過氨基鍵合在帶有醛基部分的活化玻璃上固定生物分子如蛋白質(zhì)、肽或核酸序列。采用氨基化核苷酸在核酸鏈的合成中可以容易地將氨基摻入其中?？梢园碨chena等(美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93，第10614-10619頁(1996))的所述方法，或按文件US-5,605,662和Krensky等(核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，15，第2891-2909頁(1987))的出版物中的所述方法，將氨基化氨基酸固定在帶有醛基的固相支持物如玻璃的表面上。按Joos等(Anal.Biochem.，247，第96-101頁(1997))的所述方法，通過采用偶聯(lián)劑如碳二亞胺化合物獲得氨基和羧基的鍵合。還可以采用巰基修飾的寡核苷酸在存在交聯(lián)分子時實現(xiàn)與固相支持物表面上氨基基團(tuán)的反應(yīng)(Thrisey等，核酸研究24，第3031-3039頁(1996))。類似地，按文件US-5,552,270和WO98/28444中所述的方法，可以將寡核苷酸固定在帶有羥基和醛基的凝膠例如聚丙烯酰胺上。
當(dāng)在最佳條件下進(jìn)行時，靶化合物對其相應(yīng)特異捕獲分子的結(jié)合(或識別)是一個自發(fā)非共價反應(yīng)。該反應(yīng)涉及非共價化學(xué)結(jié)合。介質(zhì)組成和其它物理和化學(xué)因素影響該結(jié)合的速率和強(qiáng)度。例如，對于核苷酸鏈的識別，低嚴(yán)緊性和高溫度降低兩條互補(bǔ)鏈之間結(jié)合的速率和強(qiáng)度。然而，也極大地降低了(并不是完全互補(bǔ)的)兩條鏈之間的非特異結(jié)合。當(dāng)幾個序列相似時，結(jié)合的特異性可以通過加入少量的非標(biāo)記分子來增強(qiáng)，這些分子將與它們互補(bǔ)序列競爭，但更多的是與其它的序列競爭，由此降低交叉反應(yīng)的水平。
結(jié)合條件的優(yōu)化對于抗原/抗體或配體/受體識別也是必需的，但它們通常是十分具體的。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案采用與其它金屬如金接觸時Ag+的催化還原所產(chǎn)生的放大。目前金納米顆粒(nanoparticules)是可獲得的，而且可以容易地將它們與分子如蛋白質(zhì)固定在一起。例如，鏈霉親和素包被的金顆粒可在市場上獲得。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，采用其后可通過配對物進(jìn)行識別的被標(biāo)記靶分子。該被標(biāo)記的分子(生物素、半抗原，...)可以被認(rèn)為是結(jié)合對的第一個成員。對于DNA，通過在其擴(kuò)增期間摻入生物素化的核苷酸，可以容易地進(jìn)行標(biāo)記。對于RNA，可以將生物素化的核苷酸用于其cDNA拷貝或之后的擴(kuò)增步驟中。由于這些靶分子通常以極低濃度存在，所以對這些核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增是常規(guī)慣例。蛋白質(zhì)可以采用NHS-生物素或其它反應(yīng)容易地進(jìn)行標(biāo)記。一旦這些生物素化分子被捕獲，則加入該結(jié)合對的第二個成員鏈霉親和素-金復(fù)合物，該鏈霉親和素特異地識別生物素，以致將該復(fù)合物固定在該靶標(biāo)被固定的位置上。如果采用半抗原作為標(biāo)記，則采用抗體-金復(fù)合物。然后將含有Ag+和還原劑的反應(yīng)混合物加在該表面上，之后Ag層將沉淀在這些金顆粒上，導(dǎo)致形成晶體顆粒。
可以通過采用金標(biāo)記的抗原、抗體或核苷酸，直接用金標(biāo)記這些靶分子。
另一種方法是避免對靶分子進(jìn)行任何標(biāo)記，并采用標(biāo)記的第二核苷酸序列。然后該靶標(biāo)和該標(biāo)記的核苷酸序列與固定它們的捕獲分子形成夾心雜交或夾心反應(yīng)，從而使檢測可以得以進(jìn)行。如上所述，該標(biāo)記的核苷酸序列本身能夠催化金屬的沉淀，或者是通過第二復(fù)合物來催化金屬的沉淀。
該Ag沉淀對應(yīng)于生物素化核苷酸序列的結(jié)合位置。由于所述位置十分明確，故可以鑒定所述沉淀物(陣列的具體點)的存在。
該沉淀物具有小晶體形狀，隨著時間增加該晶體可以達(dá)到約1μm直徑。由于這些小晶體起源于存在的直徑幾個納米的金顆粒，故它們的形成代表了信號的真實放大。
出乎意料地，在該表面上存在的標(biāo)記核苷酸序列的給定范圍內(nèi)，可以在該金標(biāo)記的核苷酸序列濃度和該表面上沉淀物的量之間獲得一個濃度曲線。該陣列的一個約束條件是必須將該檢測信號與其起始產(chǎn)生的位置聯(lián)系起來。
由于其顆粒形狀，沉淀物有利地改變了光的反射。它還導(dǎo)致光的強(qiáng)漫射(所檢測到的點)，這可以通過已知的檢測手段記錄下來。這些漫射測定典型地采用光電二極管從光線的反射來進(jìn)行檢測和記錄。一個出人意料的觀察結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)對于銀晶體存在的該測定出人意料地極為靈敏。
銀沉淀物顯示出黑色表面這一事實，使得可以采用掃描儀(通過陣列透明表面發(fā)生的光吸收)。不溶性沉淀的存在將對光產(chǎn)生吸收，然后對此進(jìn)行檢測和記錄。該掃描儀的優(yōu)點在于一個時間僅檢測該陣列的一小部分，以致可以獲得更好的分辨率。聚焦照明光束或檢測表面并記錄信號，以便能夠重構(gòu)該陣列圖像。該檢測工具(檢測器)可以是測量整個陣列的CCD或CMOS攝像機(jī)。該檢測的分辨率取決于該攝像機(jī)的像素數(shù)量。另一方面，該檢測器可以由排列成線的光電二極管構(gòu)成，通過在該線前面移動來掃描圖像?？梢灾圃炀哂幸粋€像素11μm的靈敏度的掃描儀，這足以分析直徑50μm或更大的點。
也可以將陣列的整體照明和透射光的記錄相結(jié)合(比所述掃描儀快，但似乎靈敏度較低)。
作為金屬，銀自身能夠反射光線。盡管該反射的效率低，但確實存在并且能夠用以定位銀沉淀物(點)。由于其金屬性質(zhì)，其它方法，如電磁場或電導(dǎo)的改變，也是可能的。
本發(fā)明的另一方面涉及對從樣品中獲得的一種或多種相同或不同的靶化合物進(jìn)行診斷和/或定量的設(shè)備，所述設(shè)備含有-對由于靶化合物與其相應(yīng)的上述捕獲分子的結(jié)合造成的固相支持物表面上的沉淀物(點)進(jìn)行檢測和/或定量的裝置，
-可能地，所述固相支持物上所記錄信息(例如條形碼)的讀取裝置，和-編程用于以下目的的計算機(jī)-可能地，識別帶有捕獲分子的離散區(qū)域，-收集從所述檢測裝置獲得的結(jié)果，可能地，將該結(jié)果與從所述讀取裝置獲得的信息相關(guān)聯(lián)，和-對所述靶化合物進(jìn)行診斷和/或定量。
因此，檢測分辨率，更具體地，最終定量的可靠性，主要取決于該檢測裝置的特性。尤其是，當(dāng)檢測裝置包括CCD攝像機(jī)時，該可靠性取決于其像素的數(shù)量。因此像素的數(shù)量限制了該定量所容許的靈敏度。典型地，采用CCD可以獲得10μm一個像素的分辨率，這足以分析直徑100μm或更大的點。然而，像素的數(shù)量、每個像素的分辨率、以及靈敏度僅是由一個視點給出的這一事實，均限制了該定量。一個視點取決于以下三個模式記錄器件如CCD攝像機(jī)的位置，待檢測對象的位置和該對象的照明位置。
為了實現(xiàn)所述目的，本發(fā)明還涉及定量確定的固相支持物表面上沉淀物(優(yōu)選含有金屬晶體)的量的方法(優(yōu)選用于檢測和/或定量根據(jù)本發(fā)明的沉淀物，但不僅是該沉淀物)，所述確定的固相支持物表面被定義為每cm2有至少4個、至少10個、至少16個、至少20個或更多個離散區(qū)域的陣列，每個離散區(qū)域都可能含有沉淀物。根據(jù)本發(fā)明含有一或多個沉淀物的所述確定表面的圖像對應(yīng)不同的視野，所述圖像含有一個或多個攝像機(jī)在一個或多個光源照明時所攝取到的模擬信息，這些攝像機(jī)和光源根據(jù)預(yù)先確定的模式在空間上彼此相對排列；含有所述沉淀物的所述確定表面的相應(yīng)圖像模擬信息被變換和轉(zhuǎn)換成數(shù)字形式或數(shù)字形式組，并與第一和第二參比標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以確定待定量的沉淀物的量。
該第一參比標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)于從在無沉淀物的所述表面上攝取到的圖像包含的模擬信息中獲得的數(shù)字形式或數(shù)字形式組。
該第二參比標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)于從在含有已知量沉淀物的所述表面上攝取到的圖像包含的模擬信息中獲得的數(shù)字形式或數(shù)字形式組。
術(shù)語“量(Volume)”應(yīng)理解為是指期望獲得其空間型信息的量。在本發(fā)明中，所述量是由靶化合物與其相應(yīng)化合物相結(jié)合之后化學(xué)或生化反應(yīng)產(chǎn)生的。因此，所述獲得的量是靶化合物與其相應(yīng)捕獲化合物相結(jié)合之后化學(xué)或生化反應(yīng)的表示。
術(shù)語“圖像”應(yīng)理解為是指一組像素，其圖示了所述量的測量結(jié)果，并可以直接地被傳送給監(jiān)測器例如屏幕或打印機(jī)，并被記錄下來。
本發(fā)明還涉及含有用于實施所述方法的工具的設(shè)備，優(yōu)選含有配備有攝像機(jī)和一個和/或多個光源的一個或多個傳感器，這些攝影機(jī)和光源根據(jù)預(yù)先確定的模式在空間上彼此相對排列，并且與模擬信息捕獲系統(tǒng)相聯(lián)系，該信息通過采用所述傳感器來測量并通過處理器轉(zhuǎn)換為數(shù)字形式。
優(yōu)選地，該變換和轉(zhuǎn)換通過攝像機(jī)座上或計算機(jī)內(nèi)的處理器來完成。
該攝像機(jī)優(yōu)選是單色，紅外線，彩色的，具有特定鄰近范圍(specialadjacent range)的CCD或CMOS攝像機(jī)，或類似的記錄工藝。
該光源優(yōu)選是其波長與該沉淀物中所含金屬晶體的尺度相類似的紅外線，并有利地通過采用單個二極管或具有相同光譜分布的多個二極管產(chǎn)生。
這些光源有利地圍繞該固相支持物規(guī)則地相隔排列，所述光源的每一個對應(yīng)一個光點，并能夠自動地同時或相繼開關(guān)。
優(yōu)選通過透射、反射或兩者的組合獲得該圖像。
正如附圖
所示，該設(shè)備和方法可以包括使用一個攝像機(jī)和一個光源，放置在該固相支持物上方，所述攝像機(jī)和所述光源可以在空間三維上移動。
該設(shè)備和方法可以還包括使用在一個平面上相對排列的兩個或多個攝像機(jī)，放置在該固相支持物上方，并包括使用一個或多個光源，放置在該固相支持物下方。
該設(shè)備和方法可以還包括使用按照三角平面或另一規(guī)則或不規(guī)則圖形排列的三個或更多個攝像機(jī)，放置在該固相支持物上方，以及一個或多個光源，放置在該固相支持物下方。
該設(shè)備和方法可以包括使用一個放置在該固相支持物上方的攝像機(jī)、一個放置在該固相支持物上方和所述攝像機(jī)下方的第一光源，和一個放置在該固相支持物下方的第二光源，這兩個光源所放置的位置相對于該固相支持物幾乎是對稱的。
本發(fā)明另外的優(yōu)選實施方案是基于一或多個光源和一或多個攝像機(jī)的使用，它們可以按照本發(fā)明的方法聯(lián)合地或連續(xù)地使用，所述光源和/或所述攝像機(jī)可以在記錄(Lecture)過程中保持不動，或可以根據(jù)優(yōu)選的平動或轉(zhuǎn)動動作沿或繞含有特定量沉淀物的該固相支持物運動。
還可以通過采用一或多個光源和/或一或多個攝像機(jī)，使得含有特定量沉淀物的該固相支持物能夠進(jìn)行運動。
根據(jù)本發(fā)明可以使用的其它實施方案是如下設(shè)備，其含有(i)一個攝像機(jī)和幾個光源，這些不同的光源根據(jù)不同的對稱或非對稱模式彼此之間進(jìn)行排列，(ii)或者一個光源和幾個攝像機(jī)，所述攝像機(jī)根據(jù)不同的對稱或非對稱模式彼此之間進(jìn)行排列，(iii)或者它們的組合。該光源是其波長與沉淀物中所含晶體的尺寸相類似的的紅外線。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠提供用于實施本發(fā)明各個步驟的工具，尤其是可以通過采用已知工具或方法例如軟件和計算機(jī)技術(shù)中存在的那些工具和方法將該主要量變換和轉(zhuǎn)換為數(shù)字形式或數(shù)字形式組。
本發(fā)明還涉及計算機(jī)程序產(chǎn)品(軟件)，其含有用于當(dāng)所述程序在計算機(jī)上運行時實施本發(fā)明方法所有或部分步驟的程序代碼工具。
本發(fā)明涉及計算機(jī)程序產(chǎn)品，其含有儲存在計算機(jī)可讀介質(zhì)上，用于當(dāng)所述程序在計算機(jī)上運行時實施本發(fā)明方法的程序代碼工具。
所述工具能夠收集從所述檢測和/或定量裝置中獲得的結(jié)果，還可能收集從所述讀取裝置中獲得的信息，而且所述工具能夠由所述結(jié)果的分析，可能地，與所述讀取信息相關(guān)聯(lián)，對特定的靶化合物進(jìn)行診斷和/或定量。
該計算機(jī)程序產(chǎn)品的所述工具能夠區(qū)分樣點和可能檢測到的背景噪音，例如可以通過在將圖像歸為兩類用作訓(xùn)練組(training sets)之后鑒定圖像的均一部分來實現(xiàn)該區(qū)分。該區(qū)分可以通過后分類場景濾波技術(shù)(post-classification contextual filters techniques)增強(qiáng)。
所述工具還能夠鑒定樣點本身的輪廓，該輪廓將被疊加到最初圖像上，并使得可以測量在該點中鑒定到的計數(shù)像素的強(qiáng)度水平。
該定量工具使得可以將在該點中存在的所有像素的強(qiáng)度整合起來或記錄該點均一部分的整體強(qiáng)度水平。
而且，這些工具使得可以在每個樣品的點和對照或參比標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)靶化合物)之間，或在兩個或多個點之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較分析(優(yōu)選與所記錄的該固相支持物的信息相關(guān)聯(lián))。為了區(qū)分在一個測試中相對于另一測試統(tǒng)計學(xué)上具有差異的點，可以在該點圖像和所述標(biāo)準(zhǔn)靶化合物點的圖像之間進(jìn)行圖像的相互關(guān)聯(lián)。
可以讀取該檢測裝置和該讀取裝置所記錄的信號，并將其處理為電子計算機(jī)化數(shù)據(jù)，通過所述適合的計算機(jī)程序產(chǎn)品(軟件)進(jìn)行分析。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方案，該陣列帶有固定的寡核苷酸捕獲核苷酸序列，以致允許在同一固相支持物上對核酸序列進(jìn)行檢測、擴(kuò)增和可能的定量。在另一實施形式中，該陣列含有固定的PCR引物，以便按照Rasmussen等(Anal.Biochem.，198，第138-205頁(1991))的所述方法在該表面上產(chǎn)生并固定擴(kuò)增子，這就使得其后可以對它們進(jìn)行檢測。
根據(jù)本發(fā)明的陣列可以在可能的預(yù)處理例如純化、切割、拷貝和/或遺傳擴(kuò)增之后，用于診斷試劑盒、及允許自動記錄的診斷和/或定量設(shè)備中。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的檢測和/或定量設(shè)備是一個如下系統(tǒng)，該系統(tǒng)將一個整合系統(tǒng)中的多個步驟或子步(這些步驟是樣品中核酸序列的純化、擴(kuò)增(通過已知的遺傳擴(kuò)增方法)、診斷和可能的定量)合并為一個自動核酸診斷系統(tǒng)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案將在以下非限制性實施方案中參考附圖進(jìn)行描述。
圖2-7表示在用于執(zhí)行本發(fā)明檢測和/或定量方法的設(shè)備的各種實施方案中一些器件的空間排列。
為了嫁接在玻璃上，首先將0.1M MES(pH6.5)中的0.2μm氨基化擴(kuò)增子溶液于100℃加熱5分鐘，然后通過機(jī)械手采用直徑250μm的針頭(Genetix，UK)點樣。20℃孵育1小時后，用0.1％SDS溶液進(jìn)行洗滌，然后用水洗滌兩次。之后與2.5mg/ml NaBH4溶液一起孵育5分鐘，再后用水進(jìn)行洗滌，并在95℃加熱3分鐘，然后干燥。與靶分子進(jìn)行雜交通過在有1mM生物素化dUTP時進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得該靶分子(Alexandre等，生物技術(shù)(Biotechniqnes)，25，第676-683頁(1998))。含有CMV病毒序列的質(zhì)粒被用于該PCR。擴(kuò)增后，采用高純度PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Boehringer，Mannheim，德國)純化該PCR產(chǎn)物，并通過在2％瓊脂糖凝膠上分離后溴化乙啶染色進(jìn)行定量。
為了進(jìn)行雜交，將5μl各種濃度(0.67、6.7和67fm)的生物素化靶DNA加入含有20μg鮭魚DNA的2×SSC Denhard溶液中。將一滴該溶液(5μl)加在該陣列上，并在濕潤的空氣中65℃孵育2小時。然后用含有15mM NaCl和0.1％Tween的10mM順丁烯二酸緩沖液(pH7.5)洗滌該陣列4次。銀沉淀后陣列上的銀沉淀物首先將該陣列與在含有100mM NaCl和0.1％干奶粉的15mM順丁烯二酸緩沖液(pH7.4)中稀釋1,000倍的0.8ml鏈霉親和素-膠體金(Sigma)一起孵育45分鐘。然后在含有15mM NaCl和0.1％Tween的10mM順丁烯二酸緩沖液(pH7.4)中洗滌該陣列5次。在該陣列上加上Sigma的“銀增強(qiáng)試劑”(40μl)，并在10分鐘后進(jìn)行更換，之后在5分鐘后進(jìn)行更換。在該順丁烯二酸緩沖液中洗滌后，干燥該陣列。陣列的檢測和分析掃描該陣列，并用圖形識別(form recognition)軟件處理該數(shù)字化圖像，以便給這些點定界并對其進(jìn)行鑒定。每個點的像素水平被整合在一起，然后對每個點給出一個值。采用在沒有固定捕獲核苷酸序列的三個位置中獲得的背景糾正這些值。
該設(shè)備也可以含有固相支持物1、在圓形支持物4上規(guī)則地彼此間隔的幾個光源2、和放置在所述固相支持物1上方的一個攝像機(jī)3，其中所述圓形支持物被放置在所述固相支持物1下方。
而且，該設(shè)備也可以含有固相支持物1。該設(shè)備還含有第一組光源2和第二組光源2’，每一組光源2和2’均規(guī)則地彼此間隔放置在一個平面上，優(yōu)選放置在圓形支持物4和4’上。該第一組光源2被放置在固相支持物1上方，而該第二組光源2’被放置在所述固相支持物1下方，所述第一組和所述第二組光源2和2’相對所述固相支持物1的位置是對稱放置的。該設(shè)備還含有置于所述固相支持物1上方和該第一組光源2上方的攝像機(jī)3。
而且，該設(shè)備也可以含有固相支持物1，以及含有或不含幾個光源2，這些光源被規(guī)則地彼此間隔放置在一個平面中，優(yōu)選圓形支持物4上，并置于該固相支持物1下方。該設(shè)備還含有放置在該固相支持物1上方的攝像機(jī)3。所述圓形支持物4和所述攝像機(jī)3相對該固相支持物1的位置對稱放置。
最后，該裝置也可以含有固相支持物1和幾個規(guī)則地彼此間隔排列在一個平面中，優(yōu)選在圓形支持物4上的光源2，以及3個攝像機(jī)3、3’和3”，所述圓形支持物被置于所述固相支持物1下方，所述攝像機(jī)被放置在所述固相支持物1上方并按三角排列在一個平面上。
權(quán)利要求
1.用于鑒定和/或定量從樣品，優(yōu)選生物樣品中獲得的靶化合物的方法，包括步驟-用捕獲分子接觸該靶化合物以便允許所述靶化合物和捕獲分子之間可以特異結(jié)合，所述捕獲分子按照密度為每cm2含有至少20個離散區(qū)域的陣列被固定在固相支持物表面上，所述離散區(qū)域的每一個均固定有一種捕獲分子，-進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致在所述結(jié)合的位置形成沉淀物，-確定離散區(qū)域中沉淀物的可能存在，和-將此離散區(qū)域中沉淀物的存在與所述靶化合物的鑒定和/或定量相關(guān)聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于導(dǎo)致沉淀物形成的反應(yīng)是通過金屬化合物在該結(jié)合的靶化合物上的沉淀來實現(xiàn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述金屬化合物是磁性金屬化合物。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其特征在于導(dǎo)致沉淀物形成的反應(yīng)是在酶存在下的金屬還原反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于導(dǎo)致沉淀物形成的反應(yīng)是在與該結(jié)合的靶化合物偶聯(lián)的膠體金顆粒存在時銀的化學(xué)還原反應(yīng)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其特征在于該靶化合物與其相應(yīng)捕獲分子之間的特異結(jié)合是兩個核苷酸序列之間的雜交。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一項的方法，其特征在于該靶化合物與其相應(yīng)捕獲分子之間的結(jié)合是抗原結(jié)構(gòu)和其相應(yīng)抗體或它的高變部分之間的反應(yīng)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其特征在于該靶化合物與其相應(yīng)捕獲分子之間的結(jié)合是受體和其相應(yīng)配體之間的反應(yīng)。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其特征在于沉淀物的可能存在是通過光束，優(yōu)選激光束在所述沉淀物上的反射、吸收或漫射來得到的。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項的方法，其特征在于離散區(qū)域中沉淀物的存在是通過電磁場或電流傳導(dǎo)的改變得到的。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求1-10之任一項的方法，用于定量在該固相支持物的確定表面上一或多個沉淀物的量，其特征在于含有一或多個沉淀物且對應(yīng)于不同視野的所述確定表面的圖像是在一或多個光源的照明下通過一或多個攝像機(jī)攝取的，所述光源和攝像機(jī)按照預(yù)先確定的模式在空間上彼此相對排列，所述圖像含有模擬信息，并且其特征在于將含有所述沉淀物的所述確定表面的相應(yīng)圖像模擬信息變換和轉(zhuǎn)換成數(shù)字形式或數(shù)字形式組，并與第一和第二參比標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以確定待定量的沉淀物的量。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于該第一參比標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)于從在不含沉淀物的所述固相支持物(1)表面上攝取到的圖像所包含的模擬信息中獲得的數(shù)字形式或數(shù)字形式組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于該第二參比標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)于從在含有已知量沉淀物的所述固相支持物(1)表面上攝取到的圖像所包含的模擬信息中獲得的數(shù)字形式或數(shù)字形式組。
14.診斷和/或定量從樣品中獲得的一或多種相同或不同靶化合物的設(shè)備，其特征在于它含有-用于檢測和/或定量在所述靶化合物和按照陣列置于固相支持物表面上的捕獲分子相結(jié)合處形成的沉淀物的裝置，該陣列每cm2含有至少20個離散區(qū)域，所述離散區(qū)域的每一個均固定有一種捕獲分子，-可能地，所述固相支持物上所記錄信息(例如條形碼)的讀取裝置，和-編程用于以下目的的計算機(jī)-可能地，識別帶有捕獲分子的離散區(qū)域，-收集從所述檢測裝置獲得的結(jié)果(沉淀物在特定位置的形成)，可能地，收集從所述讀取裝置獲得的信息，和-對所述靶化合物進(jìn)行診斷和/或定量。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的設(shè)備，含有配備有攝像機(jī)(3，3’，3”)及一或多個光源(2，2’)的一或多個傳感器，這些攝影機(jī)和光源根據(jù)預(yù)先確定的模式在空間上彼此相對排列，并與模擬信息獲取系統(tǒng)相聯(lián)系，所述信息通過采用傳感器來測量并通過處理器轉(zhuǎn)換為數(shù)字形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的設(shè)備，其特征在于該攝像機(jī)是CCD或CMOS攝像機(jī)(3，3’，3”)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的設(shè)備，其特征在于該光源(2，2’)是具有與該沉淀物中所含金屬晶體相似的波長的紅外線。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求15-17之任一項的設(shè)備，其特征在于它含有一組彼此規(guī)則間隔排列在一個平面上的光源(2，2’)，所述光源的每一個均對應(yīng)一個可自動地同時或相繼開關(guān)的光點。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求15-18之任一項的設(shè)備，其特征在于它含有一個攝像機(jī)(3)和一個光源(2)，放置在所述固相支持物之上方，所述攝像機(jī)和光源可以在空間三維上移動。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求15-18之任一項的設(shè)備，其特征在于它含有相對排列在一個平面上的兩個或更多個攝像機(jī)(3、3’)，放置在該固相支持物上方，該設(shè)備還含有一個或更多個光源(2，2’)，放置在該固相支持物(1)下方。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求15-18之任一項的設(shè)備，其特征在于它含有按照三角平面或另一規(guī)則或不規(guī)則模式排列的三個或更多個攝像機(jī)(3，3’，3”)，放置在該固相支持物(1)上方，并還含有一個或更多個光源(2，2’)，放置在該固相支持物(1)下方。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求15-18之任一項的設(shè)備，其特征在于它在該固相支持物上方(1)含有一個攝像機(jī)(3)和第一光源(2)，在所述攝像機(jī)(3)下方還含有放置在該固相支持物(1)下方的第二光源(2’)，這兩個光源(2、2’)的放置位置相對于該固相支持物(1)的位置是幾乎對稱的。
23.計算機(jī)程序，其含有用于當(dāng)所述程序在計算機(jī)上運行時實施以下步驟的程序代碼工具根據(jù)前述權(quán)利要求1-13之任一項的方法，確定離散區(qū)域中沉淀物的可能存在，和將這些離散區(qū)域中所述沉淀物的存在與靶化合物的鑒定和/或定量相關(guān)聯(lián)。
24.計算機(jī)程序產(chǎn)品，其含有儲存在計算機(jī)可讀介質(zhì)上的程序代碼工具，當(dāng)所述程序在計算機(jī)上運行時用于實施以下步驟根據(jù)前述權(quán)利要求1-13之任一項的方法，確定離散區(qū)域中沉淀物的可能存在，和將這些離散區(qū)域中所述沉淀物的存在與靶化合物的鑒定和/或定量相關(guān)聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定和/或定量從樣品,優(yōu)選生物樣品中獲得的靶化合物的方法,包括步驟:用捕獲分子與該靶化合物接觸,以便使所述靶化合物可以和捕獲分子特異結(jié)合,所述捕獲化合物根據(jù)密度為每cm
文檔編號C12N15/09GK1351712SQ00807744
公開日2002年5月29日 申請日期2000年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月19日
發(fā)明者J·利馬科爾, J·德馬特奧, N·贊瑪提歐, I·亞歷山大, S·海米爾斯, Y·胡比昂, F·德朗吉維勒 申請人:高級陣列技術(shù)股份有限公司