專利名稱：鑒定用于癌癥治療的化合物的體外方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定和評(píng)估用于癌癥治療，特別是用于肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌的治療的化合物功效的方法，目的是開發(fā)新型藥物產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及抑制膽堿激酶α 蛋白表達(dá)和/或活性的試劑，和/或抑制此表達(dá)的作用。
背景技術(shù)：
膽堿激酶(也已知為CK，CHK和ChoK)是kermedy或卵磷脂(PC)合成途徑中的起始酶，其在鎂離子(Mg+)存在下利用作為磷酸基團(tuán)供體的5’三磷酸腺苷(ATP)將膽堿磷酸化為磷酸膽堿(PCho)。由多種致癌基因介導(dǎo)的這一轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)高水平的膽堿激酶活性，從而引起其產(chǎn)物PCho的細(xì)胞內(nèi)水平異常升高，這些間接支持了膽堿激酶在形成人腫瘤的過程中的作用。然而，存在備選的不涉及激活膽堿激酶的PCho形成機(jī)制，并能夠解釋這種代謝物在腫瘤細(xì)胞中的高水平。盡管有證據(jù)顯示在腫瘤和轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞中出現(xiàn)了膽堿激酶活性的升高，但是由于并沒有在其活力的升高和腫瘤的轉(zhuǎn)化之間建立起明確的因果關(guān)系，因此它與致癌過程的關(guān)系沒有得到充分的論證。另一方面，也沒能鑒定出造成該結(jié)果的分子?，F(xiàn)已在人和其它哺乳類及嚙齒類動(dòng)物(大鼠、小鼠、牛、豚鼠、兔、猴)中鑒定了大約200個(gè)編碼具有同源于膽堿激酶的初級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽的基因序列，且這些序列被命名為膽堿激酶α a，膽堿激酶α b，膽堿激酶α 3，膽堿激酶β 1，膽堿激酶β 2，膽堿激酶CKB_1膽堿 /乙醇胺激酶，膽堿激酶樣乙醇胺激酶，Cots, Duff227，Cog3173CPTlB, SFl, SH0X2, FH0D2， FLJ12242, KRT5, FBL, ARL6IP4 等。(參見 http //www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/Blast. cRi#219541) 0實(shí)際上，從1982年以來，已有生化證據(jù)證明在從大鼠、小鼠和人中分離的不同組織中存在至少三種具有膽堿激酶活性和不同物化特征的同工酶。最近在人基因組中鑒定了至少三個(gè)編碼具有證實(shí)為膽堿激酶活性的蛋白質(zhì)的基因，且將它們命名為ck-alpha，ck-beta，和HCEKV(美國(guó)專利US2003186241)，并且許多基因所編碼的蛋白質(zhì)30-65 %的同源于ck基因編碼的蛋白質(zhì)，例如在(http://www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/Blast. cgi)中描述的基因 CAI16602，CHKL, CAI16600，CAI16599， CAH56371, CAI16603, BAA91793, CAI16598,以及在(http://www.ebi.ac.uk/cgi_bin/ sumtab ？ tool = asdblast&jobid = blast-20050412-18072127)中描述的基因 CPT1B， EKI2, SFl, SH0X2, FH0D2, FLJ12242, KRT5, FBL, ARI61pS, T0MM40, MLL。不同膽堿激酶同工酶的一個(gè)非常相關(guān)的特征就是它們具有不同的生化特性，在它們和膽堿基質(zhì)及ATP磷酸供體親和力和甚至在它們的活性形式上(即能以二聚體或四聚體的形式出現(xiàn))存在重要的改變。因此，確定在任意不同的已鑒定的膽堿激酶同工酶與由于它們?cè)谌四[瘤中過表達(dá)所引起的致癌能力之間是否存在著直接聯(lián)系是十分必要的。另一方面，已證明膽堿激酶的抑制作用在經(jīng)致癌基因轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞內(nèi)是一種新型
3有效的抗腫瘤方案，已將此方案在體內(nèi)外推到裸鼠中。膽堿激酶活性在幾個(gè)人乳腺癌瘤中的升高已于近期被發(fā)表，還看到膽堿激酶的變化是在一些人的腫瘤，如在肺部腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤及前列腺腫瘤中的頻繁事件。盡管一些參數(shù)與其它參數(shù)之間的相互關(guān)系，但是目前沒有證據(jù)肯定地證明膽堿激酶的過表達(dá)在人細(xì)胞中具有致癌和腫瘤的活性。有證據(jù)顯示膽堿激酶活性阻抑物，例如 hemicholinium-3[Cuadrado A. , Carnero Α. , Dolfi F. , Jimenez B.禾口 Lacal J. C. Oncogene 8,2959-2968(1993) Jimenez B.，del Peso L.，Montaner S.，Esteve P.禾口 Lacal J.C.J.CellBiochem. 57,141-149(1995) ；Hernandez-ΑΙcoceba, R. , Saniger, L., Campos, J. , Nunez, M. C. , Khaless, F. , Gallo, Μ. A. , Espinosa, A, Lacal, J. C. Oncogene, 15,2289-2301 (1997)]或西班牙專利申請(qǐng)ES200503^3中的低毒性亞甲基醌具有抗腫瘤活性。然而，在所提及的文獻(xiàn)或其他現(xiàn)有技術(shù)中都沒有結(jié)論性的證據(jù)證明具有所述膽堿激酶活性(ck-alpha，ck-beta，和HCEKV等)且在人組織中鑒定了的多種同工酶能夠?qū)z測(cè)到的酶活性負(fù)責(zé)，也沒有證據(jù)顯示哪一個(gè)同工酶對(duì)由具抗腫瘤活性的阻抑物引起的抑制作用敏感。該鑒定對(duì)建立其作為癌癥的治療目標(biāo)的潛在應(yīng)用十分必要。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是一種發(fā)現(xiàn)、鑒定和評(píng)估用于癌癥治療、特別是用于肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌治療的化合物功效的體外方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是基于來源于膽堿激酶α基因的核苷酸或肽序列在發(fā)現(xiàn)、 鑒定、開發(fā)和評(píng)估用于癌癥治療，優(yōu)選地用于肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌治療的化合物功效方法中的的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的由提供特征為在治療癌癥，優(yōu)選地，肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌中抑制膽堿激酶α蛋白的表達(dá)和/或活性的試劑組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的為一種藥物組合物，包括用于治療癌癥，優(yōu)選肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌的一個(gè)或幾個(gè)治療試劑和藥用賦形劑，。用于監(jiān)測(cè)對(duì)癌癥患者施用的治療的效果的體外方法也是本發(fā)明的一個(gè)目的，所述方法特征在于，評(píng)估從施用了抗腫瘤試劑的患者提取的組織樣品中膽堿激酶α蛋白表達(dá)水平，，以及比較由此獲得的數(shù)值和對(duì)應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)正常非癌癥組織樣品數(shù)值，其中所述抗腫瘤試劑優(yōu)選地為根據(jù)權(quán)利要求3-5的試劑，所述評(píng)估是通過確定所述樣品中的至少一個(gè)與膽堿激酶α蛋白相關(guān)的選自下列各項(xiàng)中的參數(shù)來實(shí)現(xiàn)的其信使RNA水平，所述蛋白質(zhì)的濃度或其酶活性。最后，本發(fā)明的另一個(gè)目的由實(shí)施本發(fā)明的診斷試劑盒組成。


圖1 :Α)在過表達(dá)膽堿激酶α和β后，人Hek293T細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞)提取物中的膽堿激酶活性(ChoK)(先體外后體內(nèi)膽堿激酶活性分析)。B)活細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)磷酸膽堿水平(體外膽堿激酶活性分析)。圖2 =A)在過表達(dá)膽堿激酶α和β后，人ChoI^93T細(xì)胞中ChoK的活性。B)形成的對(duì)抗在如A所示相同的提取物中的膽堿激酶α的單克隆抗體的特異性。圖3 通過NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)中的免疫組化技術(shù)確定的膽堿激酶α的過表達(dá)。圖4 通過乳腺癌中的免疫組合技術(shù)確定的膽堿激酶α過表達(dá)。圖5 通過結(jié)腸癌中的免疫組合技術(shù)確定的膽堿激酶α過表達(dá)。B)從腫瘤性轉(zhuǎn)化前的病變到腫瘤團(tuán)中觀察到漸進(jìn)染色的息肉。圖6:過表達(dá)人膽堿激酶α的細(xì)胞的附著依賴性生長(zhǎng)。如圖示，分析了兩個(gè)細(xì)胞品系Hek293和MDCK的形成的克隆數(shù)量和相對(duì)尺寸。圖7 膽堿激酶α在Nu/Nu小鼠中的體內(nèi)致癌活性。圖8 在體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤中膽堿激酶α的表達(dá)和酶活性。圖9 阻抑物MN58b對(duì)膽堿激酶α的特異性。在缺乏(0)或存在增高濃度的MN58b 的條件下，分析表達(dá)了重組人膽堿激酶α或膽堿激酶β蛋白的大腸桿菌提取物。圖10 阻抑物麗58b對(duì)由膽堿激酶α過表達(dá)誘導(dǎo)的腫瘤的抗腫瘤作用。圖11 在人Hek293T細(xì)胞中利用siRNA技術(shù)阻滯膽堿激酶α的表達(dá)。圖12 利用蛋白質(zhì)印跡法Α)和B)以及通過酶活性C)確定來源于人乳腺癌腫瘤細(xì)胞中由siRNA引起的對(duì)膽堿激酶α表達(dá)的阻滯。圖13 在人乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231中由膽堿激酶α的特異性干擾RNA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的死亡。Α)利用碘化丙錠進(jìn)行的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。B)與由細(xì)胞凋亡引起的死亡相關(guān)的PARP的消化。圖14 在人初級(jí)乳腺上皮細(xì)胞HMEC中膽堿激酶α的特異性干擾RNA。Α)相對(duì)于腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231，正常HMEC細(xì)胞中膽堿激酶α的基礎(chǔ)表達(dá)水平。B)在HMEC中與膽堿激酶α的干擾。C)對(duì)膽堿激酶α的干擾不會(huì)誘導(dǎo)初級(jí)人HMEC細(xì)胞的死亡。圖15 乳腺癌組織中膽堿激酶α的過表達(dá)。圖15a 在乳腺癌患者的組織中通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的膽堿激酶α信使RNA，用以10為底，由此測(cè)定的數(shù)量和正常組織樣品中數(shù)量的對(duì)數(shù)表示。圖15b 膽堿激酶α表達(dá)的平均值，在未轉(zhuǎn)移(第一個(gè)條形柱，標(biāo)記為 “否”)或轉(zhuǎn)移了(第二個(gè)條形柱，標(biāo)記為“是”)的個(gè)體中，以利用2_Δ Δ“方法從mRNA水平計(jì)算得到的所述基因的相對(duì)表達(dá)單位來表示。圖15c:有淋巴結(jié)瘤(下方的線，以灰色的+ 標(biāo)記)或無淋巴結(jié)瘤(上方的線，以黑色的+標(biāo)記)患者的無病存活率隨著流逝月份的個(gè)數(shù)的進(jìn)展。圖16 來源于肺癌細(xì)胞品系中膽堿激酶α的表達(dá)。圖16a 通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的來源于NSCLC(H1299和H460)型或SCLC(H510和H8》型癌癥細(xì)胞品系中的膽堿激酶 α信使RNA，用以10為底，由此測(cè)定的數(shù)量與正常初級(jí)支氣管上皮細(xì)胞(BEC)出現(xiàn)數(shù)量的比率的對(duì)數(shù)表示。圖16b 在正常初級(jí)支氣管上皮細(xì)胞(BEC)和來源于肺癌H460，H1299, H510及H82的細(xì)胞品系中，通過利用單克隆抗體的免疫測(cè)定檢測(cè)到的膽堿激酶α蛋白。在這些相同樣品中獲得的用于微管蛋白的信號(hào)顯示于其下方。圖16c 以30分鐘后在每微克蛋白質(zhì)中檢測(cè)到放射性標(biāo)記的PCho信號(hào)形式表示的膽堿激酶活性，該信號(hào)由每個(gè)顯示在相應(yīng)條形柱下的細(xì)胞品系中標(biāo)記的膽堿形成。圖17 通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定的早期提取自肺癌NSCLC患者的腫瘤組織中膽堿激酶α信使RNA的表達(dá)。用以10為底，由此測(cè)定的數(shù)量與正常組織樣品中數(shù)量的比率的對(duì)數(shù)表示。圖18 肺癌患者存活率隨時(shí)間的進(jìn)展，以月表示，并分為檢測(cè)到(斷線，"+")或未檢測(cè)到(連續(xù)線，+)膽堿激酶α表達(dá)兩種情況。在從階段I到IV的患者中的總存活率 (圖表位于左上方)，在從階段I到IV的患者中的無病存活率(時(shí)間從對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)開始，直到疾病復(fù)發(fā)為止)(圖表位于左下方)，階段IA到IIIA中的癌癥存活率(圖表位于右上方)，以及階段IA到IIIA中的無病存活率(圖表位于右下方)。圖19 來源于膀胱癌細(xì)胞品系中膽堿激酶α的表達(dá)。圖19a 通過實(shí)時(shí)定量PCR 測(cè)定的來源于膀胱癌細(xì)胞品系中膽堿激酶α信使RNA，用以10為底，由此測(cè)定的數(shù)量與正常無限增殖化膀胱tootsa細(xì)胞中數(shù)量的比率的對(duì)數(shù)表示；從左向右，條形柱相應(yīng)為品系 HT1376，J82，SW780, TCCSuP和UMVC3。圖19b 通過利用單克隆抗體的免疫測(cè)定，在正常無限增殖化膀胱細(xì)胞⑴rotsa)和來源于膀胱癌的細(xì)胞品系細(xì)胞TCCSuP，J82，UMVC3，SW789， 和HT1376中，以及陰性對(duì)照組(Hel^93T細(xì)胞)和陽性對(duì)照組(Hek-Chok細(xì)胞，經(jīng)過表達(dá)膽堿激酶α的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)中檢測(cè)到的膽堿激酶α蛋白；在相同樣品中獲得的用于微管蛋白的信號(hào)顯示于其下方。圖19c 以30分鐘后在每微克蛋白質(zhì)中檢測(cè)到放射性標(biāo)記的PCho信號(hào)形式表示的膽堿激酶活性，該信號(hào)由每個(gè)顯示在相應(yīng)條形柱下的細(xì)胞品系中標(biāo)記的膽堿形成。圖20 膀胱癌患者中膽堿激酶α的表達(dá)。圖20a 通過Affymetrix微點(diǎn)陣 U133Plus 2. 0，從90名患者的腫瘤組織中獲得的平均表達(dá)值，在根據(jù)誘導(dǎo)因數(shù)的數(shù)值分成的不同組中獲得1-3倍的誘導(dǎo)(條形柱1)，3-8倍的誘導(dǎo)(條形柱2)或8-M倍的誘導(dǎo)(條形柱3)。圖20b:通過實(shí)時(shí)定量PCR從20名膀胱癌患者中測(cè)定的膽堿激酶α信使RNA，用以10為底，由此測(cè)定的數(shù)量與正常無限增殖化膀胱tootsa細(xì)胞中數(shù)量的比率的對(duì)數(shù)表示； 水平線代表一種水平，且從這個(gè)水平開始就存在著與患者向更壞預(yù)后進(jìn)展的關(guān)系。圖21 膽堿激酶α表達(dá)與結(jié)瘤和/或轉(zhuǎn)移出現(xiàn)的關(guān)系。圖21a 與淋巴結(jié)瘤(數(shù)值由空方格□表示)或轉(zhuǎn)移(數(shù)值由實(shí)心圓 表示)的出現(xiàn)相關(guān)的陰性和陽性患者中膽堿激酶α的平均表達(dá)水平；直線相交在與被認(rèn)為能夠幫助觀察各組間水平區(qū)別的特征有關(guān)的陽性或陰性個(gè)體相對(duì)應(yīng)的平均值位置。圖21b:在根據(jù)膽堿激酶α表達(dá)水平劃分的患者的各組中進(jìn)行轉(zhuǎn)移的患者(連續(xù)黑色的條形柱，■)和未進(jìn)行轉(zhuǎn)移的患者(斜線標(biāo)記的條形柱，//)的比例；其中根據(jù)膽堿激酶α表達(dá)水平劃分的組包括低水平(位于左邊的一對(duì)條形柱)，中等水平(位于圖中間的一對(duì)條形柱)或高水平(位于圖右邊的一對(duì)條形柱)。圖22 建立在能夠合成干擾RNA基礎(chǔ)上的結(jié)構(gòu)的作用流程圖。在阻抑物存在下 (左側(cè)部分，“無表達(dá)”，與此結(jié)構(gòu)結(jié)合并抑制RNA的合成)；在誘導(dǎo)劑(強(qiáng)力霉素)存在下， 它與阻抑物結(jié)合，阻止阻抑物與此干擾結(jié)構(gòu)的結(jié)合，從而允許干擾RNA的合成(右側(cè)部分， “表達(dá)”)。圖23 在生長(zhǎng)允許條件下(“對(duì)照”欄)或膽堿激酶麗58b的化學(xué)阻抑物(中間欄)或RSM936 (右側(cè)欄)存在的條件下，MDA-MB-231細(xì)胞(上排噬斑)和Ch-ind-Ι細(xì)胞 (下排噬斑)的增殖。圖M :10 天(“10d”)或 20 天(“20d”)后，在缺乏(“-，，)或存在(“ +，，) 10 μ g/ ml的強(qiáng)力霉素的條件下，行為或MDA-MB-231細(xì)胞(標(biāo)為“MDA”的條形柱)和Ch-ind-Ι細(xì)胞(標(biāo)為“Chindl”的條形柱)。A 根據(jù)膽堿激酶α與GAPDH水平之間的比率的對(duì)膽堿激酶α遺傳抑制的作用。B:根據(jù)pCNA和GAPDH水平的比率對(duì)細(xì)胞增殖的作用。C 在吸收值為500nm時(shí)，Ch-ind-1細(xì)胞在缺乏(虛線)或存在(實(shí)線)誘導(dǎo)劑的條件下的不同時(shí)刻所觀察到的細(xì)胞生存能力。D 根據(jù)降解的PARP蛋白質(zhì)水平與總PARP蛋白質(zhì)水平的比率 (PARPdig/PARP總)的對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的作用。圖25 抗膽堿激酶β的多克隆抗體的特異性。A 免疫測(cè)定，其中多克隆抗膽堿激酶β抗血清與轉(zhuǎn)染了空載體(標(biāo)記為“空”的泳道)，膽堿激酶α表達(dá)載體(標(biāo)記為 “ChoKA”的泳道)，膽堿激酶β表達(dá)載體(標(biāo)記為“ChoKB”的泳道)和嵌合蛋白——膽堿激酶綠熒光蛋白表達(dá)載體(標(biāo)記為“ChoKB5’GFP”的泳道)的細(xì)胞樣品相互作用。箭頭表示膽堿激酶β和嵌合蛋白的條帶高度。B:免疫測(cè)定，其中多克隆抗膽堿激酶α抗體與轉(zhuǎn)染了空載體(標(biāo)記為“空”的泳道)，膽堿激酶α表達(dá)載體(標(biāo)記為“ChoKA”的泳道)， 膽堿激酶β表達(dá)載體(標(biāo)記為“ChoKB”的泳道)和嵌合蛋白——膽堿激酶β-綠熒光蛋白表達(dá)載體(標(biāo)記為“ChoKB5’GFP”的泳道)的細(xì)胞樣品相互作用。箭頭表示膽堿激酶α 的條帶高度。圖沈膽堿激酶α和β腫瘤發(fā)生能力的比較。從向小鼠進(jìn)行注射細(xì)胞開始，隨 X軸顯示的時(shí)間(周)，以平方厘米測(cè)量的腫瘤體積的進(jìn)展，其中所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 空載體 (數(shù)據(jù)由菱形塊表示“ ”)，膽堿激酶α表達(dá)載體(數(shù)據(jù)由方形塊表示“·”)，膽堿激酶β 表達(dá)載體(數(shù)據(jù)由三角塊表示“▲”)，以及膽堿激酶α表達(dá)載體+膽堿激酶β表達(dá)載體 (數(shù)據(jù)由X表示“X”)。圖27 通過實(shí)時(shí)定量PCR在肺癌患者組織中測(cè)定的膽堿激酶β信使RNA，用以10 為底，由此測(cè)定的數(shù)量與正常組織中數(shù)量的比率的對(duì)數(shù)表示。發(fā)明詳述為幫助理解本專利申請(qǐng)，將本發(fā)明上下文中一些術(shù)語和表述定義如下術(shù)語“受試者”或“個(gè)體”指哺乳動(dòng)物種類中的成員，包括但不限于馴養(yǎng)的動(dòng)物，靈長(zhǎng)類和人類；受試者優(yōu)選為任何年齡、任何種族的男性或女性人類。術(shù)語“癌癥”指這樣的疾病，其特征在于能侵襲相鄰組織和向遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散的細(xì)胞的異?；驘o控制生長(zhǎng)。術(shù)語“癌瘤”指由所述異常或無控制的細(xì)胞生長(zhǎng)導(dǎo)致生成的組織。術(shù)語“乳腺癌”或“乳腺癌瘤”指任何惡性增殖乳腺細(xì)胞紊亂。術(shù)語“結(jié)腸癌”或“結(jié)腸癌瘤”指任何惡性增殖結(jié)腸細(xì)胞紊亂。術(shù)語“直腸癌”或“直腸癌瘤”指任何惡性增殖直腸細(xì)胞紊亂。術(shù)語“腫瘤”指由良性(非癌的)或惡性(癌的)致瘤性過程產(chǎn)生的任意異常組織團(tuán)塊。術(shù)語“基因”指編碼蛋白質(zhì)的脫氧核糖核苷酸分子鏈。術(shù)語“DNA”指脫氧核糖核酸。DNA序列為脫氧核糖核苷酸序列。術(shù)語“ cDNA”指mRNA序列的互補(bǔ)核苷酸序列。術(shù)語“RNA”指核糖核酸。RNA序列為核糖核苷酸序列。術(shù)語“mRNA”指信使核糖核酸，它是總RNA中翻譯蛋白質(zhì)的部分。術(shù)語“從……轉(zhuǎn)錄的mRNA”指作為第一步基因(DNA)向mRNA中的轉(zhuǎn)錄，從而表達(dá)該基因和將其翻譯為蛋白質(zhì)。術(shù)語“核苷酸序列”或“nucleotidic序列”無明確區(qū)別地指核糖核苷酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸(DNA)序列。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”指由共價(jià)或非共價(jià)鍵連接的分子氨基酸鏈。該術(shù)語包括翻譯后修飾的全部形式，例如糖基化，磷酸化或乙?；?。術(shù)語“肽”和“多肽”指代表蛋白質(zhì)片段的分子氨基酸鏈。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“肽” 的使用無明確區(qū)別。術(shù)語“抗體”指對(duì)目標(biāo)分子表現(xiàn)出特異性結(jié)合活性的糖蛋白，該目標(biāo)分子指“抗原”。術(shù)語“抗體”包括單克隆抗體或多克隆抗體，及其整體或片段；它包括人抗體，人源化抗體，和非人源抗體?！皢慰寺】贵w”為定向?qū)箚我豢乖稽c(diǎn)或“決定子”的高特異性抗體的同源群體?！岸嗫寺】贵w”包括定向?qū)共煌乖瓫Q定子的抗體異源群體。術(shù)語“表位”，如在本發(fā)明中使用的，指蛋白質(zhì)的抗原決定子，該蛋白質(zhì)是為特異性抗體所識(shí)別的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。術(shù)語“治療目標(biāo)”指能夠針對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)并臨床使用藥物或治療化合物的核苷酸或肽序列。術(shù)語“拮抗物”指抑制被對(duì)抗分子生物活性的任何分子。拮抗分子的實(shí)例包括，其中，蛋白質(zhì)，肽，天然肽序列變異和小有機(jī)分子(具有低于500道爾頓的分子量)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“正常參考值”指健康個(gè)體中出現(xiàn)的某些蛋白質(zhì)，mRNA或其他身體代謝物的水平。本發(fā)明使用的術(shù)語正常組織指非癌癥組織，包括商業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明基于膽堿激酶α蛋白在腫瘤過程中表達(dá)增高的發(fā)現(xiàn)，特別是，肺癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌。本發(fā)明還基于過表達(dá)所述蛋白質(zhì)體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤且因此對(duì)該酶表達(dá)和/或活性的抑制是治療癌癥，特別是肺癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌的優(yōu)秀方法的驚人發(fā)現(xiàn)。因此膽堿激酶α在人類腫瘤發(fā)生中是優(yōu)秀的潛在治療目標(biāo)。在此意義上，本發(fā)明首先提供一種檢測(cè)個(gè)體中癌癥，優(yōu)選肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌的存在，確定所述個(gè)體中癌癥的階段和嚴(yán)重度，或監(jiān)測(cè)對(duì)患有所述癌癥的個(gè)體進(jìn)行治療的效果的體外方法，該方法包括a)檢測(cè)和/或定量所述個(gè)體樣品中膽堿激酶α蛋白，膽堿激酶α基因mRNA或相應(yīng)cDNA，和 b)將從所述個(gè)體樣品中檢測(cè)到膽堿激酶α蛋白的量，膽堿激酶α基因mRNA的量或相應(yīng)cDNA的量與從對(duì)照個(gè)體樣品，或從同一所述個(gè)體的早期樣品檢測(cè)到的膽堿激酶α 蛋白的量，膽堿激酶α基因mRNA的量或相應(yīng)cDNA的量，或與正常參考值進(jìn)行比較。本發(fā)明提供的方法具有高敏感性和特異性，且基于這樣的受試者或個(gè)體診斷為癌癥，優(yōu)選肺癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌，并與來源于無這些癌瘤病史受試者的樣品中的相應(yīng)水平相比，具有高膽堿激酶α基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平或高膽堿激酶α基因編碼的蛋白(膽堿激酶α蛋白)濃度。然而，膽堿激酶β基因在人體的表達(dá)與此前提到的任何癌癥類型不相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的方法包括從個(gè)體獲得樣品的步驟。能夠使用不同的液體樣品，例如尿液、 血液、血漿、血清、胸膜液、腹水、滑液、膽汁、胃液、腦脊液、糞便、唾液、支氣管鏡檢樣品液等。能夠利用任意常規(guī)方法獲得樣品，優(yōu)選地使用外科切除術(shù)。樣品能夠從預(yù)先診斷或未診斷有某種癌癥的受試者中獲得，或者還能夠從正在進(jìn)行治療的受試者，或曾經(jīng)對(duì)癌癥，特別是肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌，治療過的受試者中獲得。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括樣品提取步驟，用于從樣品獲得蛋白質(zhì)提取物或獲得總 RNA提取物。這兩種提取物之一代表了下一階段的工作物質(zhì)。提取總蛋白質(zhì)或總RNA的方案已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(ChornczynskiP. et al.，Anal. Biochem.，1987，162 :156 ； Chornczynski P. , Biotechniques, 1993, 15 :532 ；Molina, Μ. Α. , et al. , Cancer Res., 1999,59 :4356-4362)。能夠在本發(fā)明的框架中使用任何常規(guī)分析，以用于檢測(cè)癌癥，只要該方法能夠從待分析個(gè)體和對(duì)照個(gè)體收集的樣品中體外測(cè)量膽堿激酶α基因轉(zhuǎn)錄mRNA水平或其互補(bǔ) eDNA水平，以及膽堿激酶α蛋白濃度。因此，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)癌癥特別是肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌的存在，確定所述癌癥在個(gè)體中的階段或嚴(yán)重度，或監(jiān)測(cè)對(duì)患有所述癌癥的個(gè)體進(jìn)行治療的效果的方法，該方法基于對(duì)膽堿激酶α蛋白濃度的測(cè)量，或基于對(duì)膽堿激酶α基因表達(dá)水平的測(cè)量。在目的為檢測(cè)膽堿激酶α蛋白的情形，本發(fā)明的方法包括將從樣品獲得的蛋白提取物置于與對(duì)抗膽堿激酶α蛋白一個(gè)或多個(gè)表位的一種或多種特異性抗體組合物相接觸的第一步驟，以及量化由抗體和膽堿激酶α蛋白形成的復(fù)合物的第二步驟。存在著廣泛多樣的用于檢測(cè)并量化特意性抗原-抗體復(fù)合物形成的免疫學(xué)測(cè)定方法；此前已描述了大量的競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合測(cè)定方法，且其中大量可商業(yè)獲得。因此，能夠利用抗體來量化膽堿激酶α蛋白，所述抗體是例如單克隆抗體，多克隆抗體，它們是完整的或是其片段，特異性對(duì)抗膽堿激酶α蛋白的抗體的“combi-bodies” 和Fab或kFv片段；這些抗體是人，人源化或非人來源的抗體。這些測(cè)定方法中使用的抗體可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的；未標(biāo)記抗體可以用于凝集測(cè)定；標(biāo)記的抗體可以在廣泛多樣的測(cè)定中使用?？梢杂糜跇?biāo)記抗體的標(biāo)記分子包括放射性核苷酸、酶、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、 酶促底物或輔因子，酶促阻抑物、顆粒、染料和衍生物。存在著廣泛多樣的能夠在本發(fā)明中使用的，利用未標(biāo)記抗體(一抗)和標(biāo)記抗體(二抗)的已知測(cè)定方法；這些技術(shù)包括蛋白質(zhì)印跡法，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)， RIA (放射免疫測(cè)定)，競(jìng)爭(zhēng)性EIA (競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫測(cè)定)，DAS-ELISA (雙抗體夾心-ELISA)， 免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，基于使用包括特異性抗體的蛋白質(zhì)生物芯片或微點(diǎn)陣的技術(shù)，或基于如浸量尺(dipstick)形式膠狀沉淀的測(cè)定。檢測(cè)和量化蛋白EFNB2或蛋白 EDNRA的其它方法包括親和層析技術(shù)、配體結(jié)合試驗(yàn)或凝集素結(jié)合試驗(yàn)。本發(fā)明方法中優(yōu)選的免疫測(cè)定是雙抗體夾心-ELISA(DAS-ELISA)測(cè)定。任何特異性對(duì)抗膽堿激酶α蛋白一個(gè)或多個(gè)表位的抗體或抗體組合能夠用于該免疫測(cè)定。作為該測(cè)定的眾多可能形式之一的實(shí)例，將包被固相的單克隆或多克隆抗體，或該抗體的片段，或抗體的組合置于與待分析的樣品接觸，并在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，以形成抗原-抗體復(fù)合物。經(jīng)在適當(dāng)?shù)臈l件清洗以去除非特異性復(fù)合物后，將與信號(hào)產(chǎn)生化合物結(jié)合的指示劑在適當(dāng)?shù)臈l件下，與抗原-抗體復(fù)合物孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，所述指示劑包括單克隆或多克隆抗體或該抗體的片段，或這些抗體的組合。如果待分析樣品中存在膽堿激酶α 蛋白，通過測(cè)量產(chǎn)生的信號(hào)來檢測(cè)和量化待分析樣品中出現(xiàn)的膽堿激酶α蛋白。待分析樣品中存在的膽堿激酶α蛋白的量與該信號(hào)成比例。
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在目的為檢測(cè)相應(yīng)于膽堿激酶α基因的mRNA或cDNA，而非它們編碼的蛋白質(zhì)的情形中，本發(fā)明體外檢測(cè)癌瘤的方法有多種步驟。因此，一旦獲得了樣品并提取了總RNA，本發(fā)明檢測(cè)膽堿激酶α基因mRNA或相應(yīng)cDNA的方法包括第一步，擴(kuò)增總RNA提取物中存在的mRNA，或通過mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的相應(yīng)的cDNA ；第二步，量化膽堿激酶α基因mRNA或 cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增mRNA的一個(gè)實(shí)例由如下步驟組成反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA (RT)，隨后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) ；PCR是擴(kuò)增包含在核苷酸序列混合物中某特定核苷酸序列(目標(biāo))的技術(shù)。在PCR中使用過量的與目標(biāo)核苷酸序列互補(bǔ)鏈雜交的寡核苷酸引物對(duì)。然后具有聚合酶活性的酶(DNA Taq聚合酶)以目標(biāo)核苷酸序列作為模板延長(zhǎng)每個(gè)引物。再將延長(zhǎng)產(chǎn)物與起始目標(biāo)鏈解離后轉(zhuǎn)化為目標(biāo)序列。新引物分子雜交，且聚合酶對(duì)其進(jìn)行延長(zhǎng)；重復(fù)該循環(huán)，從而使目標(biāo)序列的數(shù)量呈指數(shù)增加。該技術(shù)在專利US4，683，195和US 4，683，202中有所描述。先前已經(jīng)描述了許多檢測(cè)和量化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，且本發(fā)明能夠使用其中任何方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方法中，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過轉(zhuǎn)移技術(shù)，例如RNA印跡法，將mRNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜來進(jìn)行 mRNA的檢測(cè)，以及利用膽堿激酶α基因mRNA或相應(yīng)cDNA的特異性探針進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，膽堿激酶α基因相應(yīng)的mRNA的擴(kuò)增和量化是利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR Ο -PCR)同時(shí)進(jìn)行的。本發(fā)明體外檢測(cè)來源于個(gè)體的樣品中的問題癌瘤方法的最后步驟包括將從個(gè)體中獲得樣品中的膽堿激酶α蛋白的量，膽堿激酶α基因mRNA量或相應(yīng)cDNA的量，與從對(duì)照受試者樣品，或從同一所述個(gè)體的早期樣品檢測(cè)到的膽堿激酶α蛋白的量，膽堿激酶α 基因mRNA的量或相應(yīng)cDNA的量進(jìn)行比較，或與正常參考值進(jìn)行比較。在第二個(gè)目的中，本發(fā)明還提供一種鑒定和評(píng)估用于癌癥治療，優(yōu)選地用于肺癌、 乳腺癌或結(jié)腸直腸癌治療的化合物的攻效的體外方法，該方法包括a)在適合條件下，使腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，優(yōu)選的肺腫瘤細(xì)胞、乳腺腫瘤細(xì)胞、結(jié)腸或直腸腫瘤細(xì)胞與候選化合物接觸適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，以允許它們相互作用，b)檢測(cè)和量化膽堿激酶α基因或膽堿激酶α蛋白的表達(dá)水平，和c)將所述表達(dá)水平和未經(jīng)候選化合物處理的對(duì)照腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中相應(yīng)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。以類似于本發(fā)明方法中所說明的體外檢測(cè)個(gè)體中存在的肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌的方法，進(jìn)行膽堿激酶α基因或膽堿激酶α蛋白的表達(dá)水平的量化。當(dāng)一種試劑降低膽堿激酶α基因的表達(dá)水平或逆轉(zhuǎn)所述基因的高表達(dá)作用，優(yōu)選地降低細(xì)胞增殖水平，該試劑成為癌癥治療的候選者。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及來源于膽堿激酶α基因的核苷酸或肽序列在尋找、鑒定、開發(fā)和評(píng)估用于癌癥治療，優(yōu)選地用于肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌治療的化合物的攻效的方法中的應(yīng)用。必需指出通過基于潛在藥物分子與治療目標(biāo)的競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的藥物篩選方法而獲知的重要性。本發(fā)明的另一個(gè)附加目標(biāo)涉及來源于膽堿激酶α基因的核苷酸或肽的應(yīng)用，以用于檢測(cè)癌癥存在，特別是肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌；用于決定個(gè)體中所述癌癥的階段或嚴(yán)重度，或用于監(jiān)測(cè)對(duì)患有所述這些任意癌癥的個(gè)體進(jìn)行治療的效果。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)由提供以抑制膽堿激酶α蛋白表達(dá)和/或活性為特征的試劑組成。能夠根據(jù)本發(fā)明鑒定和評(píng)估的這些試劑，所述試劑選自由下列各項(xiàng)組成的組a)特異性對(duì)抗膽堿激酶α蛋白中存在的一個(gè)或多個(gè)表位的抗體，或抗體的組合， 優(yōu)選地為人或人源化的單克隆抗體；還能是所述抗體的片段，單鏈抗體或抗獨(dú)特型抗體，b)抑制膽堿激酶α蛋白表達(dá)和/或活性的細(xì)胞毒性試劑，如毒素，具有放射活性原子的分子，或化學(xué)療法試劑，包括但不限于小有機(jī)和無機(jī)分子，肽，磷酸肽，反義分子，核糖核酸酶，siRNAs，三螺旋分子，等，和c)抑制膽堿激酶α蛋白一個(gè)或多個(gè)功能的膽堿激酶α蛋白的拮抗化合物。一種包含治療有效量的一種或多種上文所提及的試劑和一種或多種賦形劑和/ 或載體物質(zhì)的藥物組合物還構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)。另外，所述組合物可包含任意其他不抑制膽堿激酶α蛋白功能的活性成分。該賦形劑、載體物質(zhì)和輔助物質(zhì)必須是藥用的和藥理學(xué)允許的，它們從而能夠與劑型或制劑的其他化合物結(jié)合，且對(duì)被處理的生物體沒有不利影響。該藥物組合物或劑型包括適合口服或腸胃外施藥(包括皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))的化合物，盡管最佳施藥途徑依賴于患者的條件。該劑型可以是單劑量形式。該劑型可根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域的已知方法制備。 待施用的活性物質(zhì)的量可根據(jù)治療的特殊性而變化。本申請(qǐng)的另一個(gè)方面由一種實(shí)施本發(fā)明的診斷試劑盒組成。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種試劑盒，該試劑盒包括存于適當(dāng)容器中的特異性識(shí)別膽堿激酶 α蛋白的抗體和載體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該試劑盒用于檢測(cè)個(gè)體中癌癥的存在， 優(yōu)選地肺癌、乳腺癌或結(jié)腸直腸癌；用于決定該個(gè)體中所述癌癥的階段或嚴(yán)重度；或用于監(jiān)測(cè)對(duì)患有所述癌癥的個(gè)體進(jìn)行治療的效果。本發(fā)明的最后一個(gè)方面由診斷患有乳腺癌、肺癌或膀胱癌的患者的存活時(shí)間的體外方法組成，該方法包括通過確定所述樣品中與選自其信使RNA水平的膽堿激酶α蛋白， 所述蛋白質(zhì)的濃度或所述蛋白質(zhì)的酶活性有關(guān)的參數(shù)中的至少一個(gè)，對(duì)膽堿激酶α蛋白在從患者提取的癌組織樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估；以及對(duì)獲得的數(shù)值與相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)正常非癌組織樣品的數(shù)值進(jìn)行比較。以下實(shí)施例例證本發(fā)明。實(shí)施例1同種型的膽堿激酶活性如圖1所示，通過酶CKa 2 (52kDa，457個(gè)氨基酸)和CK β 1 (45kDa，395個(gè)氨基酸) 在ATP和鎂存在下，從膽堿生產(chǎn)磷酸膽堿的能力，確定其具有有效的膽堿激酶活性(圖1A)。 該活性在E. Coli中表達(dá)的重組形式和經(jīng)轉(zhuǎn)染的人HEK293細(xì)胞中都有所顯示。然而，且盡管兩種酶都具有膽堿激酶活性的事實(shí)，活細(xì)胞中磷酸膽堿的胞內(nèi)水平并不是等同變化的， 而是實(shí)際上在過表達(dá)膽堿激酶β的細(xì)胞中不能檢測(cè)到(圖1Β)。這些結(jié)果暗示了這兩種蛋白質(zhì)的生理學(xué)調(diào)節(jié)和生物學(xué)功能，并且因此，它們?cè)谀[瘤發(fā)生中的行為可能有差別。實(shí)施例2抗體的特異性開發(fā)了識(shí)別膽堿激酶α酶的多克隆和單克隆抗體，所述膽堿激酶α酶被半純化且表達(dá)為生成階段中的抗原和該過程的其他階段中的生產(chǎn)對(duì)照的蛋白質(zhì)。盡管已經(jīng)針對(duì)膽堿激酶α進(jìn)行了開發(fā)，但由于兩種酶(CKa和CKi3)的全序列中具有65%的全面的同源性，且在一些保守的區(qū)域，如膽堿結(jié)合和催化活性結(jié)構(gòu)域的同源性高達(dá)75%的事實(shí)，檢查哪一個(gè)同功酶能夠識(shí)別生成的多克隆和單克隆抗體是必要。我們已經(jīng)證明了使用的多克隆和單克隆抗體都對(duì)膽堿激酶α具有特異性，且它們不識(shí)別膽堿激酶β。為達(dá)到目標(biāo)， 在人ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中過表達(dá)膽堿激酶α和β蛋白，且在檢查到這兩種蛋白是存在并且有活性(圖2Α)以后，利用免疫檢測(cè)技術(shù)(蛋白質(zhì)印跡法)對(duì)經(jīng)先前研究過的多克隆抗體 (Ramirez de Molina, Α. , Gutierrez, R. , Ramos, Μ. Α. , Silva, J. Μ. , Silva, J. , Sanchez, J. J. ， Bonilla, F. ， Lacal, J. C. Oncogene 21,4317-4322(2002) ；Ramirez de Molina, Α.， Rodriguez-Gonzalez, Α. , Gutierrez, R. , Martinez-Pinero, L. , Sanchez, J. J. , Bonilla, F.，Rosell, R.，Lacal, J. C. Biochem. Biophys. Res. Common. 296,580-583(2002))和產(chǎn)生的抗膽堿激酶α的新單克隆抗體進(jìn)行了分析。如圖2Β所示，其顯示用這些抗體中的兩個(gè)的實(shí)施例，即使通過在使活性升高80倍的條件下過表達(dá)膽堿激酶β，也無抗體識(shí)別該同工型， 而在所有情形的相同條件和內(nèi)源控制水平中，均高度識(shí)別膽堿激酶α。這些結(jié)果顯示先前對(duì)使用多克隆抗體小組的研究定義膽堿激酶α為在來源于人腫瘤細(xì)胞品系和被分析的腫瘤自身過表達(dá)的同工酶。通過已給定義并沒有預(yù)期到這些結(jié)果，多克隆抗體識(shí)別分子中的不同表位，且膽堿激酶α和β序列65%同源，在一些區(qū)達(dá)到75%，特別是在催化區(qū)和底物和ATP結(jié)合區(qū)所在的共有結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例3腫瘤的特異性不同人腫瘤中膽堿激酶α的改變。具有證實(shí)了的對(duì)膽堿激酶α的特異性的抗體的可用性允許了在發(fā)達(dá)國(guó)家中一些目前最重要的腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中，研究膽堿激酶α表達(dá)的可能變化。為進(jìn)行該研究，對(duì)從38-50名不同的，患有以上癌癥中的一種的患者獲得的樣品進(jìn)行石蠟切片，并利用免疫組織化學(xué)法(IHQ)分析膽堿激酶α的表達(dá)，其中IHQ是一種允許檢測(cè)和確定“原位”生物分子成分，且在任何醫(yī)院的病理解剖能以自動(dòng)化的方式進(jìn)行的技術(shù)，其中“原位”生物分子成分是細(xì)胞和組織的整體部分。在這些患者的乳腺、結(jié)腸或肺樣品中，發(fā)現(xiàn)-所有情形中，用識(shí)別膽堿激酶α的抗體進(jìn)行的腫瘤染色是高度特異的，從而允許了腫瘤組織和正常鄰接組織間的明顯區(qū)別。-正常組織染色沒有在任何情形發(fā)生。-膽堿激酶α酶在該類型腫瘤中在62%-100%的范圍內(nèi)過表達(dá)，說明在人腫瘤發(fā)生過程中該同工型——膽堿激酶α的高參與性。圖3觀察由目前占肺癌80%的大細(xì)胞肺癌(NSCLS)獲得結(jié)果的實(shí)施例。如能觀察到的，出現(xiàn)了特異于腫瘤結(jié)且如上文所示特異性染色樣品62%的膽堿激酶α的細(xì)胞質(zhì)染色。根據(jù)該概念，對(duì)38名患有乳腺癌的患者進(jìn)行了相似的研究，再一次觀察到了占 97%的情形中膽堿激酶α特異于腫瘤組織的過表達(dá)(圖4)。最后，還對(duì)結(jié)腸癌中膽堿激酶α的表達(dá)進(jìn)行了研究，為了該目的，對(duì)從不同經(jīng)歷四年跟蹤的結(jié)腸癌患者所獲得的40個(gè)樣品進(jìn)行了石蠟切片分析。該分析開始于階段I，II， III和IV的原位癌瘤。與前一種情形類似，將每個(gè)切片上的與腫瘤組織鄰接的正常組織作為正常組織。沒有在這40個(gè)樣品中的任何一個(gè)及任何情形觀察到正常組織的陽性染色，從而證實(shí)了膽堿激酶α對(duì)腫瘤組織染色的高度特異性，在所有情形中再一次觀察到了該酶的過表達(dá)(圖5Α)。這些結(jié)果支持該酶的同工型在結(jié)腸癌中的高參與性。此外，該結(jié)果引導(dǎo)了對(duì)瘤前損傷，ACFs和不同程度發(fā)育異常的息肉的分析，其結(jié)果清楚地顯示膽堿激酶α的過表達(dá)是在與異常發(fā)育同時(shí)發(fā)生的結(jié)腸組織腫瘤過程中的早期事件，提示它在這些腫瘤中作為“守門者(gate-ke印er)”基因的潛在行為，以及由此其作為一種潛在的新的治療目標(biāo)的相關(guān)性。圖5B顯示了息肉，在其中能夠顯示出正常組織的染色幾乎無法檢測(cè)，隨著發(fā)育異常的開始發(fā)生(雙核細(xì)胞)染色增加了，在腫瘤團(tuán)塊中愈加強(qiáng)烈。實(shí)施例4腫瘤的特異件膽堿激酶α酶的致癌行為。已知在目前一些最重要的人類腫瘤中膽堿激酶α異常調(diào)控的高發(fā)生率，進(jìn)行研究以確定該蛋白是否單獨(dú)具有致癌能力，即膽堿激酶α是否具有致癌活性。為了進(jìn)行該研究，首先研究了該基因是否在附著不依賴性培養(yǎng)基中賦予生長(zhǎng)能力，這涉及到對(duì)其轉(zhuǎn)化能力的測(cè)定。利用作為對(duì)照的空載體，以及膽堿激酶α表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人ΗΕΚ293Τ細(xì)胞，并接種于軟瓊脂。如能在圖6中所看到的，該蛋白的過表達(dá)足以誘導(dǎo)人ΗΕΚ293Τ細(xì)胞和上皮狗 MDCK細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化。已知膽堿激酶α在人ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)化活性，對(duì)其致癌潛力進(jìn)行了體內(nèi)分析。為實(shí)現(xiàn)該目的，向免疫抑制小鼠(Nu/Nu)注射一百萬個(gè)過表達(dá)作為對(duì)照的空載體或膽堿激酶α表達(dá)載體的人ΗΕΚ293Τ細(xì)胞。注射后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行50天的至少每周兩次的監(jiān)測(cè)。對(duì)照細(xì)胞沒有在任何注射小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生任何腫瘤，而過表達(dá)膽堿激酶α的細(xì)胞在30 只注射小鼠中的8只( %)中誘導(dǎo)出現(xiàn)了腫瘤，45天后達(dá)到平均值為0.6cm3 (圖7)。這些結(jié)果顯示膽堿激酶α的過表達(dá)足以體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤，因此在人類腫瘤發(fā)生中是一個(gè)良好的潛在治療目標(biāo)。為了證實(shí)由膽堿激酶α產(chǎn)生的腫瘤保持其增高的表達(dá)和活性，手術(shù)提取、 溶解該腫瘤，并以它的雙親ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中相應(yīng)的水平作為對(duì)照確定該酶的活性和表達(dá)水平。如圖8所示，所有被分析的腫瘤以相似于接種前獲得的形式保持其高表達(dá)和酶活性水平，從而顯示膽堿激酶α的過表達(dá)誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤發(fā)生。實(shí)施例5藥理學(xué)特異性一旦證實(shí)了膽堿激酶α同工型的致癌活性，以及在人腫瘤中過表達(dá)的高發(fā)生率，又研究了阻抑物麗58b的抗腫瘤作用是否特異于該膽堿激酶α同工型 (Hernandez-Alcoceba, R. , Saniger, L. , Campos, J. , Nunez,Μ. C. , Khaless, F. , Gallo, Μ. Α. , Espinosa, Α. , Lacal, J. C. Oncogene,15,2289-2301 (1997) ；Hernandez-Alcoceba, R. , Fernandez, F. , Lacal J. C. Cancer Res. 59,3112-3118(1999) ；Ramirez de MolinaA., Banez -Coronel Μ. , Gutierrez R. , Rodriguez Gonzalez A. ,OlmedaD. ,Megias D. ,Lacal J. C. Cancer Res. 64 :6732-6739 Q004))，或者相反地，是否還能歸結(jié)于它與膽堿激酶β 同工型可能的相互作用。因?yàn)檫@兩個(gè)膽堿激酶α和膽堿激酶β同工型在底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化域中共享高達(dá)75%的同源性，所以該證明是必要的。為實(shí)現(xiàn)該目的，在缺乏膽堿激酶活性的Ε. Coli細(xì)菌菌株中表達(dá)這兩種膽堿激酶同工型(CK α和CK β )，因此觀察到的任何酶活性全部地歸功于該重組表達(dá)的膽堿激酶同工型。如圖9所示，膽堿激酶α的酶活性受麗58b處理的影響，該影響比同種阻抑物對(duì)該β同工型的影響更為明確。實(shí)際上，麗58b 對(duì)膽堿激酶α的活性的影響是對(duì)膽堿激酶β活性影響的20倍。已知通過膽堿激酶α的過表達(dá)能體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤，且麗58b對(duì)該同工型具有特異性，還證實(shí)了由ChoKa誘導(dǎo)的腫瘤的生長(zhǎng)是否易受麗58b抑制的影響。為實(shí)現(xiàn)該目的，將一百萬個(gè)顯示出膽堿激酶α酶高度過表達(dá)的ck α基因轉(zhuǎn)染的人類ΗΕΚ293Τ細(xì)胞皮下注射到免疫抑制Nu/Nu小鼠中。當(dāng)腫瘤達(dá)到體積為0.1cm3時(shí)，開始用特異性膽堿激酶α阻抑物——MN58b進(jìn)行處理，該處理通過在無菌生理血清中腹膜施藥以5mg/Kg的劑量進(jìn)行了連續(xù)5天，并休息9天進(jìn)行。對(duì)照小鼠獲得相同的載體劑量，根據(jù)同樣的日程表，每周至少兩次地對(duì)腫瘤進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖10所示，膽堿激酶α的抑制導(dǎo)致對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的強(qiáng)烈抑制，達(dá)到 80%的腫瘤生長(zhǎng)的降低。這些結(jié)果顯示不僅膽堿激酶α過表達(dá)足以體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤，而且腫瘤細(xì)胞的增殖依賴于膽堿激酶α的活性。實(shí)施例6遺傳特異件所有這些結(jié)果支持膽堿激酶α在用于新的抗腫瘤方案的設(shè)計(jì)中作為一個(gè)新的治療目標(biāo)的潛力。然而，化學(xué)阻抑物能夠通過對(duì)研究人員而言隱藏的影響發(fā)揮其抗增殖作用， 即使將其設(shè)計(jì)為特異性對(duì)抗某種酶，如阻抑物MN58b的情形。文獻(xiàn)中存在著大量這樣的情形，其中顯示設(shè)計(jì)為特異性對(duì)抗一種激酶的阻抑物還影響其它相互間甚至不密切相關(guān)的激酶。在過去的幾年中新近開發(fā)了一種方法，該方法通過使用能夠準(zhǔn)確敏感地消除某一蛋白質(zhì)的mRNA而不影響其它細(xì)胞蛋白質(zhì)的siRNA(小干擾RNA)，允許了更準(zhǔn)確地建立特定酶的干擾作用。在這種情形，證明了通過使用特異于膽堿激酶α的阻抑物MN58b實(shí)現(xiàn)的藥理學(xué)干擾，通過利用SiRNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)的膽堿激酶α特異性抑制，在遺傳水平上具有確定性。該技術(shù)將允許明確地確認(rèn)ChoK α作為癌癥新的治療目標(biāo)。為了這個(gè)目的，生產(chǎn)了具有與膽堿激酶α信使RNA雜交能力且因此能夠特異性阻止該蛋白質(zhì)表達(dá)的寡核苷酸(稱為siCHKA)。 首先證明了該siRNA有效地阻止了膽堿激酶α在人ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中的表達(dá)，該內(nèi)源蛋白和 ChoKa熔合于GST，并轉(zhuǎn)染到相同細(xì)胞中(圖11)。一旦證明了該特異于膽堿激酶α的干擾RNA確實(shí)能夠有效地阻止該蛋白的表達(dá)， 就證明了它在從人乳腺癌瘤，MIDA-MI3-231獲得的腫瘤細(xì)胞中的作用，在其中已描述了利用MN58b對(duì)膽堿激酶的藥理學(xué)抑制誘導(dǎo)由細(xì)胞凋亡引起的強(qiáng)烈抗腫瘤作用。如圖12所示， 盡管在這些細(xì)胞中獲得了較低的轉(zhuǎn)染效率，但是觀察到MDA-MB-231中siCHKA的轉(zhuǎn)染暗示了對(duì)膽堿激酶α表達(dá)和其酶活性的抑制。為證明通過siRNA實(shí)現(xiàn)的膽堿激酶α的遺傳抑制作用相似于通過用MN58b的藥理學(xué)抑制獲得的作用，從而明確地證明對(duì)膽堿激酶α作用的特異性，確定了經(jīng)干擾siCHKA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生存能力。如在用MN58b處理腫瘤細(xì)胞后所發(fā)生的一樣，觀察到了細(xì)胞生存能力的降低，該降低與特異于經(jīng)膽堿激酶α干擾試劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡引起的死亡有關(guān)(圖13)。最后，如用RMN58b處理所發(fā)生的一樣，證明了特異于膽堿激酶α的干擾siCHKA 的表達(dá)，對(duì)正常初級(jí)人乳腺細(xì)胞HMEC(人乳腺上皮細(xì)胞)的生存能力沒有影響。在這些細(xì)胞中，該蛋白質(zhì)的基線表達(dá)水平非常低，說明如已描述的那樣，腫瘤細(xì)胞有組織地過表達(dá)膽堿激酶a。然而，盡管在初級(jí)細(xì)胞HMEC中膽堿激酶α的低基線表達(dá)，但是獲得了膽堿激酶α酶表達(dá)的明顯干擾，且能夠觀察到不同于在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的情況，這些細(xì)胞是如何
14不因?yàn)榧?xì)胞凋亡而死亡，而是周期性捕獲的(圖14)，與在經(jīng)阻抑物PAN58b處理的相同細(xì) IfiΦW^R^ffilB] (Rodriguez-Gonzalez Α. , Ramirez de Molina A, Fernandez F., Ramos Μ. A. , Nunez, M. del C. , Campos, J. M, Lacal T. C. Oncogene 22:8803-8812(2003)； Rodriguez-Gonzalez A, Ramirez de Molina A, Fernandez F. , Lacal. JC. 0ncoRene23 8247-8259(2004) ；Rodriguez-Gonzalez A. ,Ramirezde Molina A. , Banez "Coronel Μ., Megias D.，Nunez M. C.和 Lacal Τ. CInt. Τ. Oncol 26 :999-1008 (2005)) 實(shí)施例7_膽α &白廂舌·輔為了擁有證實(shí)膽堿激酶α在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的參與性的定量數(shù)據(jù)，進(jìn)行了額外測(cè)定以量化它們?cè)诨颊咧械谋磉_(dá)以及它們與所述患者發(fā)展的預(yù)后間可能的關(guān)系，所述患者患有看起來與膽堿激酶α特異性相關(guān)類型的癌癥(乳腺癌、肺癌和膀胱癌)。一方面通過從患者樣品中分離信使RNA進(jìn)行膽堿激酶α表達(dá)的定量分析。為了實(shí)現(xiàn)該目的，利用僅識(shí)別本研究中對(duì)應(yīng)于ChoK α的信使RNA的特異性Taqman探針，進(jìn)行自動(dòng)化實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。獲得的數(shù)據(jù)用以10為底的與正常組織的對(duì)照樣品的比例的對(duì)數(shù)來表不。在與乳腺癌相關(guān)的獲取數(shù)據(jù)的情形，獲得的結(jié)果如圖1 所示。能觀察到具有高于ChoK α中值活性水平的樣品對(duì)應(yīng)于具有更壞預(yù)后的患者(淋巴結(jié)瘤的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)移的發(fā)育，更低的存活率)。圖1 和15c的數(shù)據(jù)證實(shí)了這些數(shù)據(jù)。在圖15b中，由從63名乳腺癌患者獲得的數(shù)據(jù)制成，能夠觀察到出現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者中ChoK α表達(dá)的平均值是如何(以基因的相對(duì)表達(dá)單位來計(jì)算，利用2_“rt方法由mRNA水平計(jì)算而來(Livak，K. J. *khmitttgen， Τ. D. (2001)Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2 (Delta-Delta C (T))Method. Methods 25，402-408)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者。如果根據(jù)淋巴結(jié)瘤的出現(xiàn)來表示這些患者存活概率，其中淋巴結(jié)瘤的出現(xiàn)與相對(duì)于對(duì)照ChoKa表達(dá)的增高顯著相關(guān)(ρ < 0. 001)，則能夠在經(jīng)典的Kaplan Meier曲線 (Kaplan EL, Meier P, Nonparametric estimation from incompleteobservations. J. Am. Stat. Assoc. ,53 :457-481(1958))中觀察到隨著陽性淋巴結(jié)瘤增加的出現(xiàn)存活概率是如何顯著降低的(P = 0. 046)(圖15c)，當(dāng)根據(jù)ChoK α的表達(dá)來表示患者的存活時(shí)，觀察到相同的趨勢(shì)(P = 0. 059)。實(shí)施例8膽堿激酶α在肺癌中的作用過表達(dá)水平和存活發(fā)生率為對(duì)膽堿激酶α在肺癌中的過表達(dá)重要性的研究進(jìn)行補(bǔ)充，進(jìn)行了一些測(cè)試。首先，又一次通過利用特異性Taqman探針的自動(dòng)化實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)了來源于肺癌患者細(xì)胞品系的相應(yīng)于所述酶的mRNA水平。該檢測(cè)在以下兩類細(xì)胞品系中進(jìn)行 相應(yīng)于最常見肺癌類型(75%-85%)——非小紅細(xì)胞或NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)的細(xì)胞品系，以品系Η460和Η1299為代表；和相應(yīng)于其它癌癥類型——小紅細(xì)胞或SCLC (小細(xì)胞肺癌)的品系，以品系Η510和Η82為代表。數(shù)據(jù)用以10為底的與正常初級(jí)人類支氣管上皮細(xì)胞——BEC的比的對(duì)數(shù)表示。結(jié)果如圖16a所示。該數(shù)據(jù)由通過利用單克隆抗體的免疫測(cè)定檢測(cè)到的在每個(gè)細(xì)胞品系中的蛋白質(zhì)水平的數(shù)據(jù)(圖16b)和通過測(cè)量標(biāo)記底物(Cho)30 分鐘后產(chǎn)生的具有放射活性的標(biāo)記產(chǎn)物(PCho)從而在相同品系中檢測(cè)到的可測(cè)酶活性的
15數(shù)據(jù)來補(bǔ)充(圖16c)。在所有情形都觀察到了一個(gè)與對(duì)照相比的增高，在SCLC品系特別是 H510的情形中尤為可觀。還檢查了在所述細(xì)胞品系中由添加麗58b所導(dǎo)致的ChoK抑制引起的抗增殖作用，獲得的結(jié)果顯示于下表中，其中圓括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示每個(gè)細(xì)胞與初級(jí)細(xì)胞相比的敏感度。在所有分析時(shí)期內(nèi)，初級(jí)細(xì)胞和這四個(gè)來源于腫瘤的細(xì)胞品系的差別是顯著的(P: < 0. 001)。表1，ChoK對(duì)來源于人肺腫瘤細(xì)胞品系的抑制的抗增殖作用。
細(xì)胞品系48小時(shí) IC50 (μΜ)72小時(shí) IC50 (μ Μ)114 小時(shí) IC50 (μ Μ)初級(jí)BEC40. 5±6· 218. 3±4· 84. 2±0. 8初級(jí)HMEC44. 7±4. 9520. 9±2. 73. 4±0. 13NSCLCH129910. 3±2· 5 (4)2.7±0·7 (8)0.9±0. 1 (4)NSCLCH4607. 03±2. 03 (6)2. 6±0. 8 (8)1. 1±0. 1 (3)SCLCH5101. 1±0. 1 (41)0. 4+0. 05 (53)0. 1+0. 03 (27)SCLCH821. 9±0· 2 (24)0, 8±0. 04 (27 V0.27±0.01 (12)這些結(jié)果由對(duì)來源于肺癌患者的人腫瘤樣品ChoKa過表達(dá)的研究來補(bǔ)充，特別是在從來源于NSCLC患者早期提取腫瘤的組織中。圖17顯示由對(duì)應(yīng)于進(jìn)行了所述的早期手術(shù)的患者中ChoK α的信使RNA的實(shí)時(shí)定量PCR分析獲得的結(jié)果，結(jié)果顯示在疾病的如此早期階段，與正常組織相比，ChoKa已經(jīng)在53%的情形中過表達(dá)了。再一次，當(dāng)分析ChoKa 表達(dá)與癌癥的嚴(yán)重程度(轉(zhuǎn)移的階段和存在或缺失)的相互關(guān)系時(shí)，觀察到了高ChoKa表達(dá)與高腫瘤惡性相關(guān)，如表2所示表2，根據(jù)肺癌嚴(yán)重程度的ChoK α的過表達(dá)
ChoKa具正常水平患者的數(shù)量和0/0過表達(dá)的患者的數(shù)量和％P階段I A-IIIAa18 (60%)12 (40%)0. 019IIIB-IVb0 (0%)6 (100%)轉(zhuǎn)移否18 (69.2%)8 (30. 8%)0. 0015是0 (0%)7 (100%) a腫瘤很小的階段，幾乎不存在或不存在結(jié)瘤且無轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)
b較大的涉及結(jié)瘤和轉(zhuǎn)移出現(xiàn)的腫瘤的階段在乳腺癌的情形中，肺癌中NSCLC初始階段中ChoKa的過表達(dá)與更壞的預(yù)后有關(guān)，如在圖18中顯示的曲線表中能觀察到的。能夠在該圖中看見在沒檢測(cè)出直接ChoKa 表達(dá)的那些患者中存活概率是如何隨時(shí)間維持在數(shù)值1的，而在檢測(cè)到ChoK α過表達(dá)那些患者中，概率降低，顯示出當(dāng)評(píng)估無疾病存活時(shí)的9個(gè)月份的中值，即從患者進(jìn)行手術(shù)到經(jīng)歷復(fù)發(fā)的時(shí)間。實(shí)施例9■堿膽α 胱痛Φ白句側(cè)擔(dān)拋·輔對(duì)膀胱癌患者也進(jìn)行了類似的研究。首先，檢測(cè)了來源于膀胱癌患者細(xì)胞品系中相應(yīng)于所述酶的mRNA水平，類似于實(shí)施例8中用于肺癌情形所描述的，該檢測(cè)同樣通過利用特異性Taqman探針的自動(dòng)化實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)進(jìn)行。使用了品系HT1376，J82，SW780， TCCSup和UMVC3，數(shù)據(jù)用以10為底的與正常無限增殖化膀胱細(xì)胞——Urotsa的比的對(duì)數(shù)表示。結(jié)果如圖19a所示。該數(shù)據(jù)由通過利用單克隆抗體的免疫測(cè)定檢測(cè)到的關(guān)于在每個(gè)細(xì)胞品系中的蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)數(shù)據(jù)(圖1%)和其中可檢測(cè)到的酶活性的估算值(圖 19c)來補(bǔ)充。能觀察到不同的細(xì)胞品系，與正常無限增殖tootsa細(xì)胞相比，顯示出增高的 ChoKa水平，并且觀察到來源于膀胱癌細(xì)胞品系中該蛋白質(zhì)表達(dá)也伴隨著相似的膽堿激酶活性的增高而增高。此外，還檢查了在這些細(xì)胞品系中由麗58b的添加導(dǎo)致的ChoK抑制引起的抗增殖作用，獲得的結(jié)果顯示于下表中，其中圓括號(hào)中的數(shù)字代表與具有較低ChoK水平的細(xì)胞品系——TCCSup有關(guān)的誘導(dǎo)因子，因?yàn)椴徽J(rèn)為用tootSA獲得的數(shù)據(jù)對(duì)進(jìn)行與其關(guān)系的比較時(shí)足夠可靠。表3，對(duì)來源于人膀胱癌細(xì)胞品系的ChoK抑制引起的抗增殖作用
權(quán)利要求
1.能夠誘導(dǎo)膽堿激酶β的藥劑在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述能夠誘導(dǎo)膽堿激酶β的藥劑是編碼膽堿激酶β 的多核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述癌癥是其中膽堿激酶α過量表達(dá)的癌癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述癌癥是肺癌、乳腺癌、膀胱癌或結(jié)腸直腸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外方法，該方法用于鑒定和評(píng)估用于治療不同類型癌癥，特別是肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和膀胱癌的化合物，目的是確定患者中所述癌癥的階段或嚴(yán)重程度，或用于監(jiān)測(cè)對(duì)所述癌癥患者中進(jìn)行所述癌癥的個(gè)體施用治療的效果。本發(fā)明還涉及為了開發(fā)新型藥物的目的而發(fā)現(xiàn)、鑒定、開發(fā)和評(píng)估癌癥治療化合物的功效；以及抑制膽堿激酶α蛋白表達(dá)和/或活性的試劑，和/或該表達(dá)引起的作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102228689SQ201110101088
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2006年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月13日
發(fā)明者安娜·拉米雷斯德莫利納, 戴維·加列戈奧爾特加, 胡安·卡洛斯·拉卡爾圣胡安, 莫妮卡·巴涅斯科羅內(nèi)爾 申請(qǐng)人:科學(xué)研究高等機(jī)關(guān)