專利名稱：不依賴品種的植物轉(zhuǎn)化的快速方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將感興趣的遺傳物質(zhì)引入植物的方法，更具體說涉及已證明在基因水平上難以操縱的植物品種的轉(zhuǎn)化和品系轉(zhuǎn)變的方法。
背景技術(shù)：
在過去二十年中，方法學(xué)已進(jìn)步到基因工程改造植物。一般它們是基于直接將DNA引入植物細(xì)胞或用根瘤土壤桿菌(Agrabaterium tumefaciens)介導(dǎo)間接轉(zhuǎn)移。與直接轉(zhuǎn)移有關(guān)的方法包括對培養(yǎng)的植物組織顆粒轟擊和用聚乙二醇或電穿孔將DNA引入裸露植物細(xì)胞，即原生質(zhì)體。見例如，Sawahel & Cove，biotech.Adv.10394-412(1992)；Christou，Cur.OPinion Biotech.4135-141(1993)；Gelvin，Cur.Opinion Biotech.9227-232(1998)和Birch，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48297-326(1997)。大多數(shù)方法是品種專一性的，因為它們基于使用體外生長的可再生的植物系統(tǒng)，它是品種專一性的。除了一些經(jīng)濟(jì)上重要的作物如番茄、馬鈴薯和蕓苔(canola)以外，目前可行的轉(zhuǎn)化方法僅能用于少數(shù)幾種品種。
育種的傳統(tǒng)回交方法提供了將一種性狀從一品系(供體)轉(zhuǎn)移到另一品系(回歸親本)的機制。見例如Harlan和Pope，J.Heredity，13319-322(1922)。它對于玉米、大豆和棉花是特別有用的。成功的回交育種需要先前衍生的回歸親本；在選擇中保持感興趣的性狀；充分回交以重建回歸親本的基因組。Allard，Principle of Plant Breeding，Wiley and Sons(1960)。在回交程序中，雜交群落以下式描述的速率提高回歸親本基因的純合性純合比例＝1-0.5m其中m是回交代數(shù)。用該公式可計算出98％以上的雜交基因組在6代后將成為純合的回歸親本基因。然而該公式僅描述了不與待漸滲雜交的基因連接的基因組區(qū)域。連接區(qū)域達(dá)到純合的速率依賴于染色體重組頻率。在最詳細(xì)的評估傳統(tǒng)回交育種效力的一個研究中，在9個側(cè)接限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)基因座上檢測到8個Tm-2-轉(zhuǎn)換的同基因番茄品系。見Young和Tanksley，Theor.Appl.Genet.77353-359(1989)?；亟?0代后發(fā)現(xiàn)的，在下9代中保持尺寸不減小的最小供體染色體片段是4cM，11代后發(fā)現(xiàn)的最大尺寸是51cM(即比相應(yīng)染色體的一半大)。在根據(jù)單序列重復(fù)(SSR)或RFLP的標(biāo)記輔助選擇中，可更快更清楚的進(jìn)行重建，但需要用相對昂貴的方法篩選相當(dāng)大的子代群，并可能因轉(zhuǎn)基因隨機插入獨立的原代轉(zhuǎn)化子而復(fù)雜化。
顯然回交不是一種不重要的工作，因為對于大部分作物，同時需要數(shù)百種品系、雜交物或品種。例如在1998，美國大豆種子市場包括500種以上的品種，而美國玉米種子市場包括600種以上的雜交品種。回交方法的另一個主要缺點是非常耗時。通過回歸回交的品系轉(zhuǎn)變通常需要3-5次再回交，因此增加了至少2-4年的品種發(fā)育時間。
目前的轉(zhuǎn)化方法有許多缺點。例如品系轉(zhuǎn)變是一種將異源DNA從一種植物物種或品種通過不同的性(如授粉)或體(即細(xì)胞)雜交方法轉(zhuǎn)移到另一種植物的方法。由于目前的方法是物種和品種專一性的，它們商業(yè)上僅能與允許將轉(zhuǎn)基因從原代轉(zhuǎn)化物轉(zhuǎn)移到多種感興趣品種的品系轉(zhuǎn)變技術(shù)聯(lián)用。另外，它們導(dǎo)致隨機轉(zhuǎn)基因插入宿主基因組。因此需要廣泛篩選許多獨立的轉(zhuǎn)化物來鑒定穩(wěn)定、可遺傳，并能正確表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化物。隨后的轉(zhuǎn)基因插入不可能在同一位點，從而使育種復(fù)雜化。連鎖拖曳(即不良性狀的共同遺傳)和有限的操縱多個獨立轉(zhuǎn)基因性狀的能力提出了進(jìn)一步的困難。
發(fā)明簡述申請人發(fā)明了一種將核酸引入植物并產(chǎn)生基因工程改造的植物的方法。該方法可用于玉米和小麥等植物，它們很難用當(dāng)前的技術(shù)進(jìn)行基因修飾。另外，本方法對回交方法有顯著的改進(jìn)，因為它在短得多的時間內(nèi)達(dá)到了相同或更好的結(jié)果。
感興趣的核酸不直接引入感興趣的植物或稱作受體。而是首先送到另一與受體不同的植物，稱作供體或剪貼板物種。然后將核酸從供體移到受體。一種方法需要有性雜交或“雜交”兩種植物。用供體的花粉對受體植物授粉。另一種方法是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的，將供體和受體植物的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合。本發(fā)明的一個特征使核酸從供體移動到受體，而不移動供體的任何天然基因組DNA。這是通過選擇通常產(chǎn)生不穩(wěn)定雜交子的供體/受體對完成的。這意味著各自的基因組是不穩(wěn)定的，因此不能合并產(chǎn)生“雜交”植物。該現(xiàn)象在下文稱作“產(chǎn)生不穩(wěn)定子代或顯示優(yōu)先分離或分揀?！痹诠w和受體染色體臨時性共存過程中，感興趣基因的核酸移動到受體植物的基因組。本發(fā)明的另一個特征是通過用旁側(cè)序列包圍感興趣的核酸來實現(xiàn)隨機或位點專一性引入核酸，這些旁側(cè)序列使得核酸轉(zhuǎn)座到隨機位置或指導(dǎo)核酸插入受體基因組的特定位置。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種將遺傳物質(zhì)引入植物的方法，包括制備用具有5’和3’可切割旁側(cè)序列的異源核酸轉(zhuǎn)化的第一種植物，這些旁側(cè)序列使異源核酸從一個基因組移動到另一個基因組；使第二種植物和轉(zhuǎn)化的第一種植物雜交，其中第一和第二種植物在雜交后產(chǎn)生不穩(wěn)定子代或顯示優(yōu)先分離或分揀；和選擇含有異源核酸第二種植物的子代。
在優(yōu)選例中，5’和3’可切割旁側(cè)序列含有轉(zhuǎn)座因子，第一種植物、第二種植物或第一和第二種植物都產(chǎn)生對轉(zhuǎn)座因子專一性的轉(zhuǎn)座酶。在另一個優(yōu)選例中，5’和3’可切割旁側(cè)序列是重組位點，第一種植物、第二種植物或第一和第二兩種植物都產(chǎn)生對重組位點專一性的重組酶。
在其他優(yōu)選例中，也稱為供體或剪貼板物種的第一種植物是三囊草(Tripsacum)，也稱為受體的第二種植物是玉米、小麥、大麥或燕麥。在另一個優(yōu)選例中，供體是諸葛菜(Orychophragmus)，受體是十字花科植物如蕓苔。其他優(yōu)選供體/受體對是短絨野大豆(Glycine tomentella)/大豆、龍葵(Solanumphureja)/馬鈴薯、玉米/小麥、玉米/大麥、玉米/燕麥、狼尾草(Pennisetum)/小麥、狼尾草(Pennisetum)/大麥、鱗莖大麥(Hordeum bulbosum)/大麥、鱗莖大麥/小麥、Nicotiana digluta/煙草(Nicotiana tabacum)和小粒稻(Oryza minuta)/水稻。
在其他優(yōu)選例中，供體和/或受體植物攜帶Se半配子(semigamy)突變。在另一個優(yōu)選例中，供體和/或受體植物是攜帶導(dǎo)致多胚性的ms突變的大豆。
在本方法的其他優(yōu)選例中，轉(zhuǎn)基因通過靶向重組靶向進(jìn)入作為整合基因座位的專一性預(yù)定的基因組位點。
本發(fā)明的相關(guān)方面針對在體細(xì)胞水平進(jìn)行的將遺傳物質(zhì)引入植物的方法。該方法包括以下步驟
制備用異源核酸轉(zhuǎn)化的第一種植物的細(xì)胞或原生質(zhì)體，該異源核酸具有5’和3’可切割的旁側(cè)序列，它能使異源核酸從一個基因組移動到另一個基因組；將細(xì)胞或原生質(zhì)體與第二種植物的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合，產(chǎn)生融合細(xì)胞或融合原生質(zhì)體，其中第一和第二植物在雜交后產(chǎn)生不穩(wěn)定的子代或顯示優(yōu)先分離或分揀；從融合細(xì)胞或融合原生質(zhì)體再生出整株植物；和選擇含有異源核酸的再生植物的子代。還提供了融合細(xì)胞或原生質(zhì)體本身。另外，本發(fā)明的方法產(chǎn)生與用其他方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物具有不同基因組成的植物，因為該方法的最后結(jié)果是一種獨立的植物，它通常沒有原代轉(zhuǎn)化物(即供體)的任何固有DNA。還提供了該植物的子代、植物部分和種子以及植物的種子部分。
本發(fā)明的方法提供了基本上所有作物物種，尤其是經(jīng)濟(jì)學(xué)上重要的品種的轉(zhuǎn)基因操縱。該方法不僅一般用于幾乎全部作物物種，而且它們還是快速的(1-2次雜交)，沒有連鎖拖曳的，和無品種依賴性的。另外，描述的方法是唯一的轉(zhuǎn)化和品系轉(zhuǎn)變的品種獨立過程，可用于基因工程改造與其他品種雜交后不能回收的復(fù)合品系/雜交子。
附圖簡述


圖1是pIC156的線狀質(zhì)粒圖；圖2是pIC216的線狀質(zhì)粒圖；圖3是pIC312的線狀質(zhì)粒圖；圖4是pIC31A2的線狀質(zhì)粒圖；圖5是pIC401的線狀質(zhì)粒圖；和圖6是pIC411的線狀質(zhì)粒圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物，該方法如下用能切割/重新插入的構(gòu)建物(優(yōu)選通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的、或同源或非同源的重組機制)轉(zhuǎn)化供體物種或突變株；將供體與受體雜交，其中供體和受體生物選自物種/突變株組合，在有性/體細(xì)胞雜交后產(chǎn)生的雜交子是不穩(wěn)定的，并顯示基因組不穩(wěn)定性，和一種或兩種純親本基因型；誘導(dǎo)或選擇從受體上切下異源核酸并整合入供體親本染色體中；最后，選擇攜帶所述轉(zhuǎn)基因的基本上遺傳純的受體植物子代。在用受體和供體生物的物種或突變株組合進(jìn)行基因操縱時，異源遺傳物質(zhì)的流動是與固有基因流動完全分開的，這些生物在有性/體細(xì)胞雜交后產(chǎn)生雜交子，這些雜交子不顯示同源/同源染色體的重組，而且不穩(wěn)定，在有絲分裂或減數(shù)分裂后分揀出一種或兩種類型的純合親本基因組。
術(shù)語“植物”指所有開花植物和植物的所有形式、品系和品種。本文所用的“轉(zhuǎn)化的”意味著通過將異源DNA摻入細(xì)胞進(jìn)行基因修飾。術(shù)語“異源”意味著在受體植物中通常找不到的DNA。
種間/屬間雜交子中的物種專一性染色體消除(基因組分離)是公知的現(xiàn)象。然而許多情況下，對不穩(wěn)定雜交子的興趣有限，因為主要育種工作目的在于兩個親本基因組之間的染色體交換，作為外源染色體物質(zhì)的基因漸滲方法。在本發(fā)明產(chǎn)生之前，不穩(wěn)定雜交子分離性親本基因組僅在產(chǎn)生單倍體植物(種間、屬間雜交產(chǎn)生單倍體小麥、大麥、馬鈴薯)的系統(tǒng)方面，或在嘗試實現(xiàn)野生物種的染色體材料漸滲種植作物(如從三囊草到玉米或短絨野大豆到大豆)的負(fù)面結(jié)果方面有所描述。
通常對于每種作物物種(包括其全部品種和品系)有著野生性親屬或突變形式，雜交后形成不穩(wěn)定雜交子，并可能作為本文所定義的供體或剪貼板植物起作用。一種鑒定這類生物的經(jīng)驗方法包括將感興趣的作物物種與許多相關(guān)物種雜交，并測試所得子代的基因組成。初步鑒定主要是單親本子代的方法是文獻(xiàn)中已知的，根據(jù)基于差異選擇性性狀或非選擇性性狀。廣泛而可靠的測定子代基因型的方法有許多而且是簡單的，依賴于分析基因組DNA中的各種標(biāo)記。根據(jù)這種最初篩選和隨后的基因型分析，可迅速鑒定合適的剪貼板生物。該基本標(biāo)準(zhǔn)外，選擇供體/受體對，在原代雜交或其子代細(xì)胞中提供足夠持續(xù)的雜交狀態(tài)。雖然完全消除是所需的最終狀態(tài)，在同一細(xì)胞中兩種物種的染色體共存相當(dāng)時間是重要的，因為它提供了足夠時間從而能從“剪貼板”生物上切下轉(zhuǎn)基因座，并整合到受體染色體的染色體中。
可用許多不同方法排除或最大程度減小雜交子中親本基因組之間的物理性相互作用，尤其是染色體物質(zhì)交換。最熟知的方法是基于使用種間或?qū)匍g雜交-產(chǎn)生的雜交子幾乎不顯示任何同源染色體配對，因此限制了轉(zhuǎn)變。另外，許多這樣的雜交子或多或少是基因不穩(wěn)定的，并且顯示迅速消除一個親本基因組的傾向。結(jié)果用這樣的雜交，可將兩個關(guān)系甚遠(yuǎn)的親本生物的染色體置于一個雜交核中，產(chǎn)生在二親本之間定向交換轉(zhuǎn)基因材料的雜交狀態(tài)。然而，兩個親本的固有染色體物質(zhì)基本不相互作用，隨后染色體消除將在F0、F1或BC1子代消除一個親本。
除了在關(guān)系甚遠(yuǎn)的物種之間雜交作為允許實現(xiàn)臨時雜交狀態(tài)，然后迅速回復(fù)純親本基因組的一種方法以外，還有其他實現(xiàn)類似結(jié)果的方法。一種方法基于使用能減少或消除染色體交換，和/或在種間和種內(nèi)雜交中導(dǎo)致純親本基因組分離的突變株。一個例子是棉花中的半配子，一種突變導(dǎo)致精核進(jìn)入卵細(xì)胞但隨后大概未發(fā)生核融合；兩個核分別分裂，產(chǎn)生的F1植物是嵌合體，具有父本和母本型的單倍體組織區(qū)域。見Turcotte和Feaster，J.Hered.5855-57(1967)。另一種方法是熟知的月見草系統(tǒng)，其中所有染色體都參與轉(zhuǎn)位，這種轉(zhuǎn)位方式是F1與正常原種雜交將在減數(shù)分裂時形成含有染色體全部單倍體數(shù)目的一個環(huán)，從而排除了獨立的染色體分揀。另一種方法(Pandey，N.Z.J.Bot.，18203-207(1980)或其他)用化學(xué)/物理處理(如輻射)一個親本，導(dǎo)致?lián)p傷并隨后優(yōu)先消除損傷的基因組。這種方法是用γ照射的花粉授粉后產(chǎn)生單雌生殖洋蔥植物中的手段。見Dore&Marie，Plant Breeding 111142-147(1993)。
為了對任何給定的植物實施本發(fā)明，可找到野生的或遠(yuǎn)親植物來產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定的雜交子，其特征是迅速的基因組分離。下文總結(jié)了與經(jīng)濟(jì)學(xué)重要作物有關(guān)的熟知組合。
在所關(guān)注的雙子葉作物中，對于馬鈴薯研究的最深入的是商業(yè)品種的馬鈴薯(Solanum tuberosum)、和野生種Solanum phureja之間的雜交，導(dǎo)致高頻率的單倍體產(chǎn)物，因為在雜交種胚中phureja染色體早消失-Hougas等，Crop.Sci.4593-595(1964)；Clulow等，Theo.Appl.Genet.82545-551(1991)。關(guān)于Canola/油菜，Li，Z.，等，Theo.Appl.Gent.91131-136(1995)；Li，等，Herediatas12569-75(1996)；Li等，Theo.Appl.Genet.96251-265(1998)；Wu，J.，等，PlantBreeding 116251-257(1997)描述了歐洲油菜(Brassica napus)和諸葛菜(Orychophragmus violaceous)之間的雜交子中親本基因組的體細(xì)胞分離。雜交子是形態(tài)學(xué)上的中間體，但是自身不育的，在自花受粉后主要產(chǎn)生歐洲油菜子代。諸葛菜法還可用于芥菜(Brassica juncea)和(Brassica carinata)另兩種經(jīng)濟(jì)上重要的芥屬物種。還用于其他經(jīng)濟(jì)的十字花科如甘藍(lán)(B.oleracea)、油菜(B.campestris)、蘿卜(Raphanus sativus)。關(guān)于大豆，Shoemaker等，Theo.appl.Genet.8017-23(1990)中記載了大豆和短絨野大豆之間的雜交子代中，野生物種基因組的消除。偏母植物的其他例子可從野草莓(Fragaria vesca)和(Fragariachiloens)或(F.virginiana)之間的雜交獲得(Ichijima，Genetics，11590-604(1926))，從(Nicotiana digluta)和煙草之間的雜交獲得了偏父植株(Clausen和Lammerts，Amer.Nat.63279-322(1929))。
在所關(guān)注的單子葉作物中，Galinat，Ann.Rev.Genet.，5447-478(1971)和Galinat，Evolution，27644-655(1973)證明了在二倍體玉米和二倍體鴨茅狀摩擦禾(Tripsacum dactyloidees)之間的雜交中，F(xiàn)1雜交子具有預(yù)期的雙-單倍體染色體數(shù)。然而三囊草染色體在減數(shù)分裂中可能不配對，而且由于三囊草染色體在有絲分裂和減數(shù)分裂中傾向喪失，一旦BC1即可回收二倍體玉米。在全世界的許多育種實驗室中常規(guī)的重復(fù)產(chǎn)生這些結(jié)果。當(dāng)小麥或大麥與野生物種鱗莖大麥雜交時，由于受精和隨后鱗莖大麥基因組消除的結(jié)果，獲得了高頻率的單倍體(Kasha和Kao，Nature 225874-876(1970)；Barclay，Nature 256410-411(1975))。該方法廣泛用于這兩種作物的許多品種的單倍體產(chǎn)生。鱗莖大麥法已被遠(yuǎn)緣雜交所取代，其中小麥(普通小麥(Triticum estivum)和圓柱小麥(T.turgidum))、黑小麥或大麥植株用玉米、高粱、珍珠粟或三囊草的花粉授粉。得到的雜交子是高度不穩(wěn)定的，而且通常產(chǎn)生僅保留母本基因組的植株。該單倍體法用于數(shù)十種小麥品種，并基本上不依賴于品種。Laurie和Bennett，Theor.Appl.Genet.76393-397(1988)；Ohkawa等，Jap.J.Breed.42891-894(1992)；Ushiyama等，Jap.J.Breed.41353-357(1991)；Furusho等，Jap.Breed.41175-179(1991)；Laurie，Genome，321063-1067(1989)。相同方法也可用于燕麥的單倍體產(chǎn)生。見Rines和Dahleen，Crop.Sci.，30，1073(1990)。優(yōu)先基因組分離也在種間稻(Oryza)組合(如稻(O.sativa)和小粒稻(O.minuta))的子代中發(fā)生。見Mariam等，Theo.Appl.Genet.93664-671(1996)。
總的說，文獻(xiàn)提供了許多熟知的雜交組合的例子，這些組合當(dāng)用于本發(fā)明時，能產(chǎn)生臨時的雜交狀態(tài)，使得在該過程中可交換異源遺傳物質(zhì)。另外，可用許多野生物種作為轉(zhuǎn)基因供體，迅速和無連鎖拖曳的將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到多種重要作物的物種中。野生物種包括三囊草(如對于玉米、小麥、大麥和燕麥)；小粒稻(如對于稻)、諸葛菜(如對于蕓苔和其他經(jīng)濟(jì)上重要的十字花科植物)；(Solanumphureja)(如對于馬鈴薯)和短絨野大豆(如對于大豆)。出于相同目的也可使用突變株，如棉花的半配子突變株或在大豆中導(dǎo)致多胚性的ms突變。對于其他重要作物，包括甜菜、豌豆和西紅柿也不難鑒定出類似的物種組合或突變株。用含有遺傳信息的外源或異源構(gòu)建物轉(zhuǎn)化供體物種，該遺傳指令必然指導(dǎo)所述轉(zhuǎn)基因的切割及通過同源或非同源重組機制重整合到另一染色體上，以及感興趣的DNA中。為了有助于成功轉(zhuǎn)化子的選擇，該構(gòu)建物還含有編碼選擇性標(biāo)記(如監(jiān)測的性狀，例如抗生素或除草劑抗性或表型標(biāo)記，尤其是β-葡糖醛酸酶和/或綠色熒光蛋白質(zhì))的DNA。感興趣的DNA可含有一個或多個編碼不同蛋白質(zhì)的基因。受體植株子代的基因表達(dá)可導(dǎo)致對真菌、病毒和/或細(xì)菌性疾病、害蟲、殺蟲劑或環(huán)境壓力更強的抗性，或可導(dǎo)致改善的味道、儲藏或營養(yǎng)性質(zhì)。受體生物可以是未轉(zhuǎn)化的植株或轉(zhuǎn)化成在其基因組中含有特定位點的植株，該特定位點是與供體基因組中外源DNA插入物同源重組交換必須的。
在優(yōu)選例中，異源DNA從供體移動到受體，通過基于以下的系統(tǒng)(1)轉(zhuǎn)座子-介導(dǎo)的非同源性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移或(2)利用同源重組機制的靶向轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)座子是可移動遺傳元件，它可含有一種植物基因組的基本部分，并產(chǎn)生巨大的表型多樣性。轉(zhuǎn)座元件是可移動的DNA片段，能切下并重新插入染色體上的另一個位置。植物轉(zhuǎn)座子是最先描述的可移動DNA元件之一，已克隆了許多植物轉(zhuǎn)座元件，如Ac/DS、Mu和En/Spm，優(yōu)選用于本發(fā)明。這些轉(zhuǎn)座元件目前用作植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)的遺傳工具。它們是植物發(fā)育研究、植物基因組分析和通過所謂的插入誘變和標(biāo)記進(jìn)行植物基因分離的無價工具。見例如，Walbot，Ann.Rev.Plant Mol.Biol.4349-82(1992)。Fedoroff，美國專利號4,732,856；Doonerk等，PCT申請WO91/156074；等，Yoder和Lassner，PCT申請WO92/01370，和Ebinuma等，PCT申請WO96/15252中描述了用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)座元件的其他例子。
對于本發(fā)明的目的，轉(zhuǎn)座子切割和轉(zhuǎn)基因的重新插入是一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)使雜交過程中轉(zhuǎn)基因移動與固有的植株基因移動相分離，同時提供額外重要優(yōu)點，即完全指令指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因切割和重新插入一個基因構(gòu)建物中，并通過一個轉(zhuǎn)化步驟。因此，該系統(tǒng)不需要受體生物中著陸位點的基因工程改造。
在另一個優(yōu)選例中，用重組酶和重組位點組合將異源DNA整合到受體基因組的特異性位點。噬菌體和酵母的位點專一性重組酶廣泛用作在試管和活生物體內(nèi)操縱DNA的工具。用于本發(fā)明的優(yōu)選重組酶/重組位點組合是Cre-Lox、FLR-FRT和R-RS，其中Cre、FLP和R是重組酶，Lox、FRT和RS是重組位點。其他合適的系統(tǒng)包括可使用內(nèi)含子編碼的酵母內(nèi)切核酸酶I-SceI。見Choulika等，Mol.Cell.Biol.151968-1973(1995)為了在植物中具有功能，這些位點需要7-8個堿基對(bp)的核心序列，位于12-13bp的反向重復(fù)之間；不對稱的核心位點確定3位點的取向，從而確定了重組產(chǎn)物的類型。不論將重組位點以正向或反向置于一DNA分子上或內(nèi)，或置于非連鎖的線性或環(huán)狀DNA分子上，對應(yīng)的重組酶可催化相互交換，產(chǎn)生缺失、倒置、轉(zhuǎn)位或共整合。見Bollag等，Ann.Rev.Genet.23199-225(1989)；Kilby等，Trnds Genet.9413-421(1993)；和Ow，curr.OpinionBiotech.7181-186(1996)。在本發(fā)明中，重組酶介導(dǎo)的位點專一性轉(zhuǎn)位發(fā)生在不同的，特別是非同源染色體之間。該內(nèi)-反式(in-trans)重組酶的作用主要是為了影響雜交子中屬于不同親本的兩條染色體之間轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)移。見Dale和Ow，Gene9179-85(1990)；Odell等，Mol.Gen.Genet.223369-378(1990)；Dale和Ow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810558-10562(1991)；Russell等，Mol.Gen.Genet.23449-59(1992)；Lyznik等，Plant J.8177-186(1995)；Albert等，PlantJ.7649-659(1995)；van Deuersen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927376-7380(1995)。
在文獻(xiàn)中描述了本發(fā)明中所用的合適的同源重組系統(tǒng)的例子，包括Cre-lox系統(tǒng)(Sauer，，美國專利4,959,317，Odell等，美國專利5,658,772；Odell等，PCT WO91/09957)和FLP-FRT系統(tǒng)(Hodge和Lyzinik，美國專利5,527,695)。植物中轉(zhuǎn)基因處理的已知重組系統(tǒng)的一個特定用途涉及從植物基因組上切割轉(zhuǎn)基因，一種用于消除商業(yè)品種不需要的異源遺傳物質(zhì)如抗生素選擇標(biāo)記的方法(Ow和Dale，PCT WO93/01283)。然而這些系統(tǒng)針對完全不同的應(yīng)用領(lǐng)域，即用于同源重組以消除異源DNA不需要的部分，而不是管理轉(zhuǎn)基因和固有植物基因流動的分離。Hooykaas和Mozo，美國專利5,635,381和Offringa等，美國專利5,501,967描述了另一種用途，針對用同源重組系統(tǒng)，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)DNA定點靶向整合入植物基因組。這些例子也限于細(xì)菌和植物細(xì)胞之間的靶向轉(zhuǎn)移，而不是兩種植物生物體之間。
基于同源重組的轉(zhuǎn)基因改組(shuffling)具有明顯和強大的優(yōu)點。通過著重于同源性的DNA位點采用精確的靶向，可建立轉(zhuǎn)基因“著陸位點”，它是精心選擇并預(yù)先確定特征的。結(jié)果，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因行為，包括可繼承性、表達(dá)水平，無沉默等的更高水平的可預(yù)測性和可復(fù)制性。還可將轉(zhuǎn)基因盒的新版本安置到相同位點，用新的替換轉(zhuǎn)基因的舊版本。隨后培育具有預(yù)選和確定并作圖的整合位點的材料更容易而且更直接。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解僅當(dāng)所有受體“預(yù)先布線”而含有整合位點，才能使用該系統(tǒng)。用其他轉(zhuǎn)移機制，如轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或回交的經(jīng)典漸滲法可實現(xiàn)這樣的基因滲入。在更具體的情況下，除了重組位點，還可將重組酶基因引入受體物種。在這些情況下，重組酶基因?qū)⒃谌斯まD(zhuǎn)錄因子-介導(dǎo)的啟動子控制下，而轉(zhuǎn)錄因子由供體(剪貼板)植物中的基因組成型表達(dá)。重組酶僅在不穩(wěn)定雜交子的兩個基因組共存時產(chǎn)生。另外，重組酶可位于剪貼板植株中，但轉(zhuǎn)錄因子可在受體植物中組成型表達(dá)。
可將異源DNA用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入供體植物。雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的，包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)涉及原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。這些技術(shù)包括PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取，顆粒轟擊-介導(dǎo)的傳遞和顯微注射。Paszkowski等，EMBO J 32717-2722(1984)，Potrykis等Mol.Gen.Genet.199169-177(1985)，Reich等，Biotechnology 41001-1004(1986)和Klein等，Nature 32770-73(1987)描述了這些技術(shù)的例子。在每種情況下，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成整株植物。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是雙子葉植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)，因為其轉(zhuǎn)化效率高及其在許多不同物種中的廣泛應(yīng)用。常規(guī)可用土壤桿菌轉(zhuǎn)化的許多作物物種包括煙草、西紅柿、向日葵、棉花、油菜(oilseed rape)、馬鈴薯、大豆、苜蓿和楊(EP 0 317511(棉花)；EP 0 249 432(西紅柿)、WO 87/07299(芥菜)、美國專利4,795,855(楊))。土壤桿菌轉(zhuǎn)化通常涉及轉(zhuǎn)移攜帶感興趣的外源DNA的二元載體(如pCIB200或pCIB2001)到合適的土壤桿菌菌株，該轉(zhuǎn)化可能依賴于宿主土壤桿菌菌株攜帶的、在共存質(zhì)?；蛉旧w上的vir基因的互補(如菌株CIB542對于pCIB200)(Uknes等，Plant Cell 5159-169(1993))。重組二元載體轉(zhuǎn)移到土壤桿菌是通過用攜帶重組二元載體的大腸桿菌(一種輔助大腸桿菌菌株，攜帶pRK2013等質(zhì)粒，能將重組二元載體移動到靶土壤桿菌菌株)三親本交配法實現(xiàn)的。另外，通過DNA轉(zhuǎn)化將該重組二元載體轉(zhuǎn)移到土壤桿菌中(Hfgen&Willmitzer，Nucl.Acids.Res.16，9877(1988))。
用重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化靶植物常涉及共同培養(yǎng)土壤桿菌和植物的外植體，并按照本領(lǐng)域已知的方案。轉(zhuǎn)化組織在可選擇培養(yǎng)基上再生，其攜帶了存在于二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記。
單子葉植物的優(yōu)選轉(zhuǎn)化技術(shù)包括用PEG或電穿孔技術(shù)直接將基因轉(zhuǎn)移入原生質(zhì)體和顆粒轟擊入愈傷組織?？捎靡粏蜠NA物種或多個DNA物種(如共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，兩種技術(shù)都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化可具有避免復(fù)雜載體構(gòu)建和產(chǎn)生對感興趣的基因和選擇標(biāo)記具有不連鎖基因座的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點，使得選擇標(biāo)記在后代中被除去(如果認(rèn)為這是需要的)。然而，采用共轉(zhuǎn)染的缺點是分開的DNA整合入基因組的頻率小于100％(Schocher等，Biotechnology 41093-1096(1986))。
出版的專利申請EP 0 292 435，EP 0 392 225和WO93/07278描述了制備玉米愈傷組織和原生質(zhì)體的技術(shù)，用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，和從轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生玉米植株的技術(shù)。Gordeon-Kamm等。Plant Cell 2603-618(1990)和Fromm等，Biotechnology 11194-200(1993)，描述了用顆粒轟擊轉(zhuǎn)化杰出的近交純系玉米的技術(shù)。
稻轉(zhuǎn)化還可通過直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，利用原生質(zhì)體或顆粒轟擊進(jìn)行。已描述了日本型和印度型水稻的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Zhange等，Plant Cell Rep.7739-384(1988)；Shimamoto等，Nature 338274-277(1989)；Datta等，Biotechnology 8736-740(1990))。兩種類型都可用顆粒轟擊常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christou等，Biotechnology 9957-962(1991))。
專利申請EP 0 332 581描述了產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化和再生Pooideae原生質(zhì)體的技術(shù)。在Vasil等，Biotechnology 10667-674(1992)中還描述了用顆粒轟擊入C型長期可再生愈傷組織的轉(zhuǎn)化小麥。Vasil等，Biotechnology 111553-1558(1993)和Weeks等，Plant Physiol.1021077-1084(1993)描述了顆粒轟擊未成熟種胚和未成熟種胚衍生的愈傷組織。
使單子葉細(xì)胞與多個針狀體接觸，在針狀體上這些細(xì)胞可被穿刺，在細(xì)胞壁上形成裂縫，從而使轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)入細(xì)胞，實現(xiàn)單子葉細(xì)胞如玉蜀黍(Zea mays)的轉(zhuǎn)化。見美國專利5,302,523。還在下列美國專利中公開了可用于單子葉和雙子葉的轉(zhuǎn)化技術(shù)5,240,855(顆粒槍)；5,204,253(冷氣沖擊加速的微粒)；5,179,022(生物彈射裝置)；4,743,548和5,114,854(顯微注射)；和5,149,655、5,120,657(加速顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；5,066,587(氣體驅(qū)動的微粒加速器)；5,015,580(大豆植株的顆粒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；5,013,660(激光束-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；4,849,355和4,663,292。
然后使這樣轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物組織根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)長成完整植株。可按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從轉(zhuǎn)基因開花植物獲得轉(zhuǎn)基因種子。類似的，可用各種已知方法繁殖不開花植物如馬鈴薯和甜菜。見例如Newell等，Plant Cell Rep.1030-34(1991)(公開了莖培養(yǎng)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化)。
在本發(fā)明的另一個實施例中，通過融合體細(xì)胞或原生質(zhì)體將異源核酸從供體轉(zhuǎn)移到受體植物的基因組。該實施例的一個優(yōu)點是繞過了一些限制有性雜交的雜交屏障。然而該技術(shù)比有性雜交更復(fù)雜，而且僅能用于可從原生質(zhì)體再生的物種之間的雜交。因此優(yōu)選采用無關(guān)的供體和受體植物。這些配對的例子包括擬南芥(Arabidopsis)/棉花、擬南芥/大豆、擬南芥/稻和煙草/大豆。另一方面，雖然用原生質(zhì)體雜交建立了遠(yuǎn)緣物種(屬間、族間和科間)之間的雜交，但兩種種系遙遠(yuǎn)的基因組在雜交細(xì)胞中合作能力有限，雜交細(xì)胞常常是不穩(wěn)定的，并且很快喪失了親本物種之一的遺傳物質(zhì)。見Gleba&Sytnik，Monogr.Theor.Appl.Genet.81-220(1984)，Dudits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 848434-8438(1987)，和Babiychuck等，Mol.Gen.Genet.8487-91(1992)。因此，遠(yuǎn)緣供體和受體植物配對是更優(yōu)選的。
下文描述的實施例是在使用特定物種雜交組合和轉(zhuǎn)座子或同源重組轉(zhuǎn)基因切割/重插入的基礎(chǔ)上，成功轉(zhuǎn)化和品系轉(zhuǎn)變4種重要作物物種(蕓苔、馬鈴薯、玉米和小麥)的總結(jié)。提供這些例子僅用于說明本發(fā)明的具體實施例，而不意味著對本發(fā)明權(quán)利要求中未列出的提供限制。
實施例實施例1芥菜作物的轉(zhuǎn)化/品系轉(zhuǎn)變設(shè)計構(gòu)建物如下制備了在T-DNA邊界內(nèi)含有玉蜀黍轉(zhuǎn)座因子Spm成分的二元載體。
用Xho1和Sma1消化履粒pIC012，凝膠純化大片段，與Xho1和Cla1/Klenow處理產(chǎn)生的RS片段連接。得到的質(zhì)粒pIC013含有pUC118中的pNOS-RS-3’OCS，用Pst1和Bcl1消化，并與用相同酶消化的pIC017大片段連接。然后用HindIII/Klenow處理含有dSpm元件和pNOS-RS-3’OCS的質(zhì)粒pIC23，以除去HindIII和BamH1位點。將pIC23(-BamH1；-HindIII)的大Cla1片段克隆入pIC201的Cla1位點，得到側(cè)接p35S和GUS-3’NOS(pIC132)的dSpm元件。用EcoR1和HindIII消化質(zhì)粒pIC132。凝膠純化大片段，并克隆入基于pRK290的二元載體的EcoR1和HindIII位點，并攜帶作為植物轉(zhuǎn)化標(biāo)記的NPTII基因。用Ecl136II和HindIII消化得到的質(zhì)粒pIC141，與0.3kb pIC022的Xho1-BamH1片段和pIC023的7.7kb的Xho1-Sma1片段連接，以將在35S啟動子控制下的Spm轉(zhuǎn)座酶引入該二元載體。獲得質(zhì)粒pIC156并用于轉(zhuǎn)化實驗。用相似方法制備質(zhì)粒pIC216，但用pIC61的0.2kbXho1-BglII片段(pSpm)替換pIC022的Xho1-BamH1片段。
另4種載體的克隆步驟和上述的不同僅在于用pNOS-BAR-OCS3’或pNOS-BAR-OCS3’裝配dSpm元件的階段，其中BAR側(cè)接兩個RS位點。用Pst1、Bcl1消化質(zhì)粒pIC132，凝膠純化并與pIC016的1.5kbPst1、Bcl1片段連接，得到具有pNOSBAR-OCS3’的dSpm元件。
為了構(gòu)建pIC401和pIC411，將pIC01的大Xho1-Nco1片段與pIC018的BspH1-BamH1片段的小片段連接，兩個RS片段分別側(cè)接Nco1-BspH1和Bgl11-Xho1位點。得到的質(zhì)粒pIC138含有BAR基因側(cè)面為兩個RS位點。重新將pIC36的小Xho1片段克隆入pIC334的Xho1位點，得到具有pNOSRS-BAR-RS-OCS3’的質(zhì)粒pIC342。如上所述將最后的盒重新克隆入dSpm元件。
總的說，獲得的構(gòu)建物含有轉(zhuǎn)化標(biāo)記(對卡那霉素抗性的NPTII基因)、在35S或其自身啟動子控制下的Spm轉(zhuǎn)座酶來源、插入在p35SGUS切割標(biāo)記中的非自主dSpm元件。制備了三種不同版本的dSpm元件a)dSpm含有被OCS基因轉(zhuǎn)錄終止子的RS位點(Z.rouxii的R重組酶識別的重組位點)分開的NOS啟動子。(見pIC156和pIC216，
圖1和2)。
b)dSpm含有pNOSBAR-OCS3’。(pIC312、pIC31A2，圖3和4)。
c)dSpm含有pNOSBAR-OCS3’，但BAR基因旁側(cè)是兩個單向RS位點(pIC401、pIC411，圖5和6)。
用植物內(nèi)轉(zhuǎn)化法在擬南芥中測試了構(gòu)建物。在用X-gluc染色植物組織后，可用GUS+區(qū)段的存在在原代轉(zhuǎn)化物中輕易監(jiān)測dSpm切割。全部構(gòu)建物在擬南芥中顯示高轉(zhuǎn)位活性，用于獲得幾種諸葛菜轉(zhuǎn)化物并確定其特征。
用諸葛菜進(jìn)行品系轉(zhuǎn)變消毒諸葛菜的種子并體外發(fā)芽。按芥菜物種所述進(jìn)行了該物種體外生長植株的轉(zhuǎn)化(De Block等，Plant Physiol.，91，694-701(1989))。所用的構(gòu)建物是基于擬南芥的、攜帶Spm轉(zhuǎn)座酶和不同版本的插入在35S CaMV啟動子和GUS基因之間的非自主dSpm元件(見
圖1)。用這些質(zhì)粒產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的諸葛菜植株。產(chǎn)生了幾種轉(zhuǎn)基因植株并確定特征。將兩種含有單拷貝插入物的獨立轉(zhuǎn)化株作為雄性親本與不同芥菜物種((B.nigra)、芥菜(B.juncea)、歐洲油菜(B.napus)、(B.carinata))，以及白芥(Sinapis alba)如前所述雜交。總計進(jìn)行了約600次雜交。將得到的雜交子自交，并選出存在dSpm元件的F1子代(PCR分析或磷化麥黃酮抗性)。進(jìn)一步篩選純芥菜表型和不存在GUS活性的那些存活的植株，然后測試是否不存在轉(zhuǎn)座酶序列，或物種專一性的諸葛菜重復(fù)。最后，通過分析F2子代建立了具有芥菜染色體特異性RFLP模式的dSpm共同分離。
用擬南芥品系轉(zhuǎn)變在下列實施例中，如上所述進(jìn)行了全部實驗，除了用諸葛菜和擬南芥植株作為雄性親本。擬南芥易于轉(zhuǎn)化，生命周期短。這些特征使擬南芥成為剪貼板物種的優(yōu)良候選。
實施例II歐洲油菜的轉(zhuǎn)化/品系轉(zhuǎn)變消毒歐洲油菜變種和諸葛菜的種子，體外發(fā)芽。如De Block等，Plant.Physiol.91694-701(1989)中所述進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。用基于土壤桿菌的載體pII2(含有R重組酶基因和無啟動子的潮霉素抗性基因，旁側(cè)有兩個rsx重組位點)轉(zhuǎn)化諸葛菜種子。用含有35S CaMV啟動子和RS重組位點的載體pII3轉(zhuǎn)化油菜種子，從而正確的重組將建立賦予潮霉素抗性的活性HPT基因。根據(jù)分子分析轉(zhuǎn)基因選出了各物種兩個獨立轉(zhuǎn)化的植株。如實施例II進(jìn)行了子代的雜交和分析。
實施例III馬鈴薯的轉(zhuǎn)化/品系轉(zhuǎn)變?nèi)缟?實施例I)進(jìn)行了實驗，除了用轉(zhuǎn)基因Solanum phureja作為花粉伴侶。如Hermsen等，Euphytica 22244-259(1973)中所述進(jìn)行了雜交，選出原代轉(zhuǎn)換的品系作為F0二倍化的雙單倍體。
實施例IV玉米的轉(zhuǎn)化/品系轉(zhuǎn)變在該實驗中用鴨茅狀摩擦禾品系作為轉(zhuǎn)基因供體。所用的構(gòu)建物基于土壤桿菌，如
圖1中所示，攜帶Spm轉(zhuǎn)座酶和非自主性dSpm元件，插入在35S CaMV啟動子和GUS基因之間，dSpm含有一個RS重組位點或一個選擇標(biāo)記(BAR)，具有(pIC401、pIC411)或不具有(pIC312、pIC31A2)RS位點。親本材料的轉(zhuǎn)化基本如Hiei等，Plant.Mol.Biol.35205-218(1997)中所述進(jìn)行。將轉(zhuǎn)基因植物與玉米變種雜交，得到的子代自交。從顯示磷化麥黃酮抗性或dSpm-專一性PCR信號的BC1中篩選出純玉米型分離株。進(jìn)一步篩選純玉米表型和不存在GUS活性的那些存活的植株，最后，測試是否不存在轉(zhuǎn)座酶序列或物種專一性的三囊草重復(fù)序列。最后，通過分析BC/F2子代，建立了磷化麥黃酮抗性或dSpm-專一性PCR信號與玉米染色體專一性RFLP模型的共同分離。
實施例V小麥的轉(zhuǎn)化/品系轉(zhuǎn)變?nèi)缦惹皩嵤├?實施例IV)中進(jìn)行了實驗，除了如Riera-Lizararu&Mujeeb-Kazi，Crop Sci.33973-976(1993)所述進(jìn)行雜交外。選出原代轉(zhuǎn)變品系作為雜交出現(xiàn)的F0二倍體化的單倍體。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明用于產(chǎn)生基因工程改造的植物，它們顯示廣泛的性能，可能包括對病毒、真菌、細(xì)菌性疾病、害蟲、殺蟲劑或環(huán)境壓力的增強抗性，和增強其他商業(yè)上理想的性能，如改善的味道、儲藏或營養(yǎng)性能。
本說明書中提到的所有出版物說明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有這些出版物在此引入以供參考，程度都相當(dāng)于各出版物專門和單獨指明那樣引入以供參考。
本文所述的本發(fā)明的各種修改本領(lǐng)域技術(shù)人員是明白的。這些修改都將在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種將遺傳物質(zhì)引入植物的方法，其特征在于，該方法包括制備用具有5′和3′可切割旁側(cè)序列的異源核酸轉(zhuǎn)化的第一種植物，該旁側(cè)序列使所述異源核酸從一個基因組移到另一個基因組；使用第二種植物與轉(zhuǎn)化的第一種植物雜交，其中所述第一和第二種植物在雜交后產(chǎn)生不穩(wěn)定的子代或顯示優(yōu)先分離或分揀；和選出含有所述異源核酸的所述第二種植物的子代。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁側(cè)序列含有轉(zhuǎn)座元件，其中所述第一種植物、所述第二種植物或所述第一種和第二種植物兩者能產(chǎn)生對所述轉(zhuǎn)座元件專一性的轉(zhuǎn)座酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁側(cè)序列是重組位點，和所述第一種植物、所述第二種植物、或所述第一種和第二種植物兩者能產(chǎn)生對所述重組位點專一性的重組酶。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是三囊草，所述第二種植物是玉米。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是三囊草，所述第二種植物是小麥。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是三囊草，所述第二種植物是大麥。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是三囊草，所述第二種植物是燕麥。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是諸葛菜，所述第二種植物是十字花科植物。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是擬南芥，所述第二種植物是十字花科植物。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述十字花科植物是蕓苔。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是短絨野大豆，所述第二種植物是大豆。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是Solanumphreja，所述第二種植物是馬鈴薯。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是玉米，所述第二種植物是小麥。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是玉米，所述第二種植物是大麥。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是玉米，所述第二種植物是燕麥。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是狼尾草，所述第二種植物是小麥。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是狼尾草，所述第二種植物是大麥。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是鱗莖大麥，所述第二種植物是大麥。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是鱗莖大麥，所述第二種植物是小麥。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是小粒稻，所述第二種植物是稻。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是Nicotianadigluta，所述第二種植物是煙草。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一種和第二種植物之一或兩者是攜帶Se半配子突變的棉花。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一種和第二種植物之一或兩者是攜帶導(dǎo)致多胚的ms突變的大豆。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是擬南芥。
25.一種將遺傳物質(zhì)引入植物的方法，其特征在于，該方法包括(a)制備用具有5’和3’可切割旁側(cè)序列的異源核酸轉(zhuǎn)化的第一種植物的細(xì)胞或原生質(zhì)體，該旁側(cè)序列使所述異源核酸從一個基因組移到另一個基因組；(b)將所述細(xì)胞或原生質(zhì)體與第二種植物的細(xì)胞或原生質(zhì)體融合，產(chǎn)生融合的細(xì)胞或融合的原生質(zhì)體，其中所述第一種和第二種植物在雜交后產(chǎn)生不穩(wěn)定的子代或顯示分離優(yōu)勢或分揀；(c)從融合細(xì)胞或融合原生質(zhì)體再生整株植物；和(d)選出(c)中所述再生植物的含有所述異源核酸的子代。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁側(cè)序列含有重組位點。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述融合在含有對所述重組位點專一性的重組酶的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一種植物物種、所述第二種植物物種、或所述第一和第二種植物物種兩者能產(chǎn)生對所述重組位點專一性的重組酶。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述5’和3’可切割旁側(cè)序列含有轉(zhuǎn)座元件，其中所述第一種植物、所述第二種植物、或所述第一種和第二種植物兩者能產(chǎn)生對所述轉(zhuǎn)座元件專一性的轉(zhuǎn)座酶。
30.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是擬南芥，所述第二種植物是棉花。
31.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是擬南芥，所述第二種植物是大豆。
32.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一種植物是擬南芥，所述第二種植物是稻。
33.一種用權(quán)利要求1或權(quán)利要求24所述的方法制備的、含有異源核酸的完整植物。
34.權(quán)利要求33所述的完整植物的種子或種子部分。
35.權(quán)利要求33所述的植物的子代。
36.權(quán)利要求25(b)所述的方法產(chǎn)生的融合細(xì)胞或融合原生質(zhì)體。
全文摘要
公開了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。首先將異源DNA引入供體植物、植物細(xì)胞或?qū)⒃|(zhì)體引入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體,然后從供體移入到不帶任何供體天然基因組DNA的受體植物、植物細(xì)胞或原生質(zhì)體中。選擇產(chǎn)生不穩(wěn)定子代或顯示優(yōu)先分離或分揀的供體或受體?？蓪NA隨機插入或在特異性位點插入受體植物的基因組。還公開了用該方法產(chǎn)生的植物和植物子代、植物部分和種子以及植物的種子部分。
文檔編號C12N15/12GK1373634SQ00807611
公開日2002年10月9日 申請日期2000年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月17日
發(fā)明者N·V·屈奇克, V·克利米克 申請人:依康遺傳學(xué)股份有限公司