專利名稱：一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)c或活性蛋白質(zhì)c的方法以及由此所得的穩(wěn)定化組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定從血漿中得到或通過(guò)基團(tuán)重排技術(shù)制備的蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法。更為具體的是，本發(fā)明涉及一種在其被貯存或已經(jīng)過(guò)分離和純化、冷凍干燥、加熱等處理時(shí)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，本發(fā)明也涉及一種由此法穩(wěn)定的制劑。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)C(在下文中也稱為“PC”)是一種維生素K相關(guān)蛋白質(zhì)，即一種含有γ-羧基谷氨酸的蛋白質(zhì)，其可在存在于脈管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的thrombomodulin存在下，通過(guò)凝血酶被活化成活性蛋白質(zhì)C(在下文中也稱為“APC”)。
活性蛋白質(zhì)C是一種絲氨酸蛋白質(zhì)酶，有很強(qiáng)的抗凝聚活性，其是通過(guò)使血液凝聚的輔因子失活來(lái)完成的，這些輔因子如Va因子(FVa)和VIIIa因子(FVIIIa)。已知活性蛋白質(zhì)C從血管壁釋放一種血纖維蛋白溶酶原的活化物以加速血纖維蛋白溶解過(guò)程，而且，已知蛋白質(zhì)C的一個(gè)缺點(diǎn)是引起嚴(yán)重的凝血作用。因此，活性蛋白質(zhì)C是調(diào)節(jié)血血液凝聚和溶解作用的最重要因素。因此，希望開(kāi)發(fā)利用蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C作為一種新的抗凝血?jiǎng)┗蜓w維蛋白溶酶原試劑。
到目前為止，已知血漿中或通過(guò)人工組織培養(yǎng)得到的蛋白質(zhì)C的量是很低的。因此，為了更安全和更廣泛地把蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C作為一種抗凝血?jiǎng)┗蜓w維蛋白溶酶原試劑，分離和純化蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C是很重要的。另外，工業(yè)上大規(guī)模制備蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C，以溶液或冷凍的方式長(zhǎng)期貯存時(shí)，冷凍干燥或使感染性病毒失活如加熱等過(guò)程是必不可少的。然而，貯存放置、冷凍或冷凍干燥、或加熱處理高純蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C都很大程度地降低它的活性。也沒(méi)有見(jiàn)到關(guān)于經(jīng)高度提純蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C穩(wěn)定性的報(bào)導(dǎo)。在這些情況下，工業(yè)規(guī)模上穩(wěn)定和有效地提供高純度蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C是不可能的。
在這種情況下，本發(fā)明人認(rèn)真地研究了蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的穩(wěn)定性，結(jié)果表明蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的活性通過(guò)下述方法能夠保持住，即使是貯存放置相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間或經(jīng)過(guò)了分離和純化、冷凍干燥、加熱等過(guò)程。該方法是向蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C中添加至少一種氨基酸到一種含鈉離子的磷酸或檸檬酸的緩沖劑中，而后添加清蛋白和非離子型表面活性劑中的一種或兩者結(jié)合，這樣就完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其包括添加至少一種氨基酸到含有蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C及鈉離子的緩沖液中，而后加清蛋白和非離子型表面活性劑中的一種或兩者結(jié)合于前溶液中。更為具體的是，本發(fā)明涉及穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其中包括將蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C溶于如含鈉離子的磷酸或檸檬酸緩沖溶液中，而后加至少一種構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸于上述溶液中，這些氨基酸例如可以是甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等等，還要加入具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)活性作用的多肽如清蛋白、球蛋白等，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，也可加入任選的非離子型表面活性劑，一般為Tween80。本發(fā)明也涉及到由此法穩(wěn)定的制劑。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方案本文中使用的蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C包括各種有較大的APC活性的化合物及其衍生物，它們可以由已知的辦法制備。例如，從人體血漿中直接分離出蛋白質(zhì)C或利用基因重組技術(shù)制備得到蛋白質(zhì)C，然后使蛋白質(zhì)C活化；直接從人體血漿中分離出APC；或用基因重組技術(shù)制備APC等等?？梢杂靡阎霓k法把蛋白質(zhì)C活化為活性蛋白質(zhì)C，例如，可以用從人或牛的血液中分離出的凝血酶活化，或用同類的蛋白酶活化等等。
從血液中制備APC可采用例如下列方法通過(guò)親合色譜法，用抗蛋白質(zhì)C抗體從人的血漿中純化得到蛋白質(zhì)C，再用人體凝血酶活化，并且用陽(yáng)離子色譜法純化得到的活性蛋白質(zhì)C(Blood，63，P.115-121(1984))；或按照Kisiel描述的方法，激活從人體血漿中純化得到的蛋白質(zhì)C以產(chǎn)生APC(J.Clin.Invest.，64，p.761-769(1979))，其中采用檸檬酸鈉吸附和洗脫，用硫酸銨分餾，二乙基氨基乙醇-交聯(lián)葡萄糖(DEAE-Sephadex)的柱色譜法，葡聚糖硫酸瓊脂糖色譜法和聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法純化蛋白質(zhì)C，或按照Taylor等人所述的方法(J.Clin，Invest.，79，P.918-925(1987))激活一種商業(yè)上可得的含蛋白質(zhì)C的血液凝聚劑而得到活性蛋白質(zhì)C。
用基因重組技術(shù)得到APC產(chǎn)物可以如下列日本專利所描述的方法制備日本專利首次公布號(hào)(Kokai)NO.61-205487；(Kokai)NO.1-2338；(kokai)No 1-85084等等。本文所用的起始原料蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的制備過(guò)程，并不僅限于上文所提到的過(guò)程。
因此，制備的起始原料蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的純化和分離過(guò)程，是將生物化學(xué)上常用的各種分離和純化過(guò)程結(jié)合起來(lái)使用的，包括如用硫酸銨的鹽析法，用離子交換樹(shù)脂的離子交換色譜法、凝膠過(guò)濾、電泳等等。
當(dāng)用這些方法不斷提高蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的純度時(shí)，它必定變得不穩(wěn)定。當(dāng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)了貯存放置、冷凍、冷凍干燥、加熱等過(guò)程處理時(shí)，即使沒(méi)有很高的純度，它的活性也會(huì)降低。本發(fā)明的主要目的是研究如何穩(wěn)定這些由于純度不斷提高而變得不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C。由本發(fā)明得到的蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C可以是液體或者粉末狀。
本發(fā)明的穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法中，將含作為穩(wěn)定劑的濃度最好為50mM-200mM的鈉離子的鹽，至少一種氨基酸和一種有穩(wěn)定作用的多肽加到含有100-2500U/ml的蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的緩沖溶液中。鹽和氨基酸可單獨(dú)使用或兩種及多種結(jié)合使用。優(yōu)選的緩沖劑如檸檬酸鈉、磷酸鈉和硫酸鈉等。加入的氨基酸的最后濃度為0.005M-0.1M，最好為0.01M-0.05M。有穩(wěn)定作用的多肽如清蛋白或球蛋白的適當(dāng)濃度取決于一般常識(shí)或節(jié)約觀點(diǎn)，優(yōu)選濃度為0.5％(w/v)-10％(w/v)。單位“％(w/v)”此處表示一定量的溶質(zhì)溶解在1升溶液中，例如，當(dāng)10g溶質(zhì)溶在1升溶液里，濃度為1％(w/v)。在本發(fā)明的優(yōu)選方案里，加入任選的一種非離子型表面活性劑如Tween 80以提高穩(wěn)定效果，其濃度為0.0005％(w/v)-0.1％(w/v)。
本發(fā)明的一個(gè)典型實(shí)施方案是含有蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的緩沖水溶液，其含有100-2500U/ml的蛋白質(zhì)C和/或活性蛋白質(zhì)C，50-200mM的鈉離子，5-100mM的氨基酸，還含有0.5-10％(w/v)的清蛋白及0.0005-0.1％(w/v)的非離子型表面活性劑兩者之一或兩者的組合。
當(dāng)加入到蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的穩(wěn)定劑是粉末時(shí)，使用的量是當(dāng)粉末溶解時(shí)其濃度在上述提到的濃度范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明的另一典型方案是含有蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的組合物，其包括1×105-2.5×106U的蛋白質(zhì)C和/或活性蛋白質(zhì)C，50-200mg的鈉離子，5-100mM的一種氨基酸，還含5-100g的清蛋白及0.005-1g的非離子型表面活性劑兩者之一或兩者的組合。
加入這些成分的方法不是特定的，其包括各種方法。例如直接將本發(fā)明的粉末物質(zhì)加入到含有蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的緩沖劑中；或先將上述的粉末材料溶于水中或一適當(dāng)緩沖劑中，然后加溶液于含蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的緩沖溶液中；或?qū)⒑鞍踪|(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的粉末與上述粉末物質(zhì)混合。也可以在分離和純化蛋白質(zhì)的過(guò)程中或藥物制備過(guò)程中添加。
當(dāng)加有本發(fā)明穩(wěn)定劑的含蛋白質(zhì)C或活化蛋白質(zhì)C的溶液在貯存或經(jīng)例如分離和純化處理，或在溶液狀態(tài)下制備藥物制劑過(guò)程中，優(yōu)選在0-30℃條件下進(jìn)行，最好在0-10℃之間。當(dāng)所提的溶液以冷凍狀態(tài)貯存時(shí)，優(yōu)選在低于冰點(diǎn)溫度下貯存，最好低于-20℃，或當(dāng)冷凍干燥狀態(tài)下貯存時(shí)，最好在室溫或更低進(jìn)行。將本發(fā)明的穩(wěn)定劑加到含蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的溶液中時(shí)，即使它以溶液態(tài)或冷凍或冷凍干燥貯存放置，或?qū)λM(jìn)行例如分離和純化處理?；蛑苽渌幬镏苿┻^(guò)程中，蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的活性都能被穩(wěn)定保持。
APC的活性按照下列過(guò)程測(cè)定。
APC活性的單位被定義為使正常人體血漿中的促凝血酶原激酶激活時(shí)間(APTT，秒)延長(zhǎng)兩倍時(shí)所需的APC的量。因此，APC活性測(cè)定是將一稀釋樣品加到正常人體血漿中，測(cè)定血漿的APTT值(以秒為單位)，當(dāng)某一稀釋液所測(cè)得的APTT值是對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)(緩沖劑)值的兩倍時(shí)，這一稀釋液被認(rèn)為是樣品的APC的活性。
步驟用含1％人體血清清蛋白的二乙基巴比土酸將樣品稀釋到例如400、500、800、1000倍。取對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物(緩沖劑)及稀釋的樣品各100μl，將100μl的正常人體血漿(如Citrol IBaxterDiagnostics Inc.)和100μl的APTT試劑(如ActinBaxterDiagnostics Inc.)在37℃條件下，以15秒間隔加入，攪拌混合物，兩分鐘后，加入0.025M CaCl2100μl，測(cè)凝聚時(shí)間。
活性的計(jì)算由對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣和樣品在每一個(gè)稀釋值(x)的APTT值(Y)，可得103/x和y的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)如下T＝A(103/x)+Bx1值可由下列方程推出x1＝103{(Y1-B)/A}當(dāng)Y1值是對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣的APTT(秒)值的兩倍時(shí)，X1被認(rèn)為是樣品APC的活性(U/ml)。
蛋白質(zhì)C活性測(cè)定用的是由Boehlinger Mannheim生產(chǎn)的“Staclot proteinc”。
本發(fā)明由下列實(shí)例給予更詳細(xì)的解釋說(shuō)明，但不應(yīng)理解為僅限于此。
實(shí)例1各種抗衡離子對(duì)APC穩(wěn)定性影響
將2.5％的人體血清蛋白(本文以后也簡(jiǎn)稱為“HSA”)加到活性為500U/ml的活性蛋白質(zhì)C中。然后用含有0.7％NaCl和0.067M甘氨酸的由檸檬酸鈉、磷酸鈉和硫酸鈉各20mM組成的溶液滲析該溶液。滲析后，每個(gè)溶液在37℃放置24小時(shí)，之后測(cè)活性。結(jié)果列在表1中。檸檬酸鈉、磷酸鈉、硫酸鈉這些被測(cè)定的抗衡離子顯示了相似的令人滿意的穩(wěn)定性。
表1各種抗衡離子對(duì)APC穩(wěn)定性的影響抗衡離子活性保持比率(％)(37℃，24小時(shí))檸檬酸鈉20mM 97.4磷酸鈉20mM94.8硫酸鈉20mM92.2實(shí)例2氨基酸對(duì)APC活性的影響將2.5％的HSA加入到活性為500U/ml的活性蛋白質(zhì)C的溶液中。然后將溶液滲析，所用滲析液為含0.7％氯化鈉及甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸及谷氨酸各0.05M的檸檬酸鈉的緩沖劑。滲析后，每個(gè)溶液在37℃放置24小時(shí)，測(cè)定活性。結(jié)果列在表2。上述六種氨基酸均顯示很高的穩(wěn)定性，也沒(méi)有破壞APC的穩(wěn)定性。
表2各種氨基酸對(duì)APC穩(wěn)定性的影響氨基酸活性保持比率(％)(0.5％)(37℃，24小時(shí))
無(wú)氨基酸 86.1甘氨酸 97.7丙氨酸 97.7賴氨酸 107精氨酸 102天冬氨酸 108谷氨酸 106實(shí)例3加入HSA的影響制備兩種溶液，均含有人體活性蛋白質(zhì)C(1700U/ml)、20mM檸檬酸、0.7％的氯化鈉和0.067M甘氨酸，其中一種含2.5％HSA，另一種不含HSA。然后溶液在37℃和4℃條件下放置。用本文所述方法測(cè)定放置不同時(shí)間的活性，得到保持活性百分比。結(jié)果列在表3中。
表3在不同條件下保持活性百分比(％)在37℃時(shí)放置時(shí)間(小時(shí))0 1 3 6 8 24HSA(+) 100- 99.2- 101 97.4HSA(-) 100888 92.086.290.979.3在4℃時(shí)放置時(shí)間(小時(shí))0 13 5714HSA(+) 100-105--98.1HSA(-) 10011299.110498.985.2從表3所示結(jié)果可知，當(dāng)APC放置時(shí)，不含HSA的溶液不能阻止APC活性的降低。從這些結(jié)果得出，2.5％的HSA能十分有效地穩(wěn)定APC。
實(shí)例4HSA對(duì)APC穩(wěn)定性的影響表4的數(shù)據(jù)表明APC的活性取決于HSA的濃度。將0.5％到10％的HSA加到含活性蛋白質(zhì)C(500U/ml)的溶液中。該溶液被放入貯存容器中，在37℃條件下放置。24小時(shí)后，取樣并測(cè)量活性。在不含HSA的溶液中，活性以20％的比率降低，而在加入濃度為0.5到10.0％的HSA時(shí)，活性不降低且APC保持穩(wěn)定。
表4HSA對(duì)APC活性的穩(wěn)定性的影響HSA(％) 活性保持比率(％)(37℃，24小時(shí))0.0 79.00.5 96.02.5 97.45.0 98.010.0102實(shí)例5Tween80對(duì)APC穩(wěn)定性的影響將0.0005％到0.1％的非離子型表面活性劑Tween 80(商品名)加入到含人體活性蛋白質(zhì)C(500U/ml)、20mM檸檬酸，0.7％氯化鈉和0.067M甘氨酸的溶液中。將該溶液放于貯存容器中，在37℃條件下放置。24小時(shí)后取樣，測(cè)量活性。結(jié)果列在表5中。在Tween 80的情況中，活性以20％的比率降低，穩(wěn)定性被破壞，而在加入濃度為0.0005％到0.1％Tween 80的情況下，未發(fā)現(xiàn)活性變化，溶液保持高的穩(wěn)定性。
表5Tween 80(％) 活性保持比率(％)(37℃，24小時(shí))無(wú) 790.0005 1010.025 1040.1103實(shí)例6氯化鈉對(duì)經(jīng)冷凍干燥的固體檸檬酸鹽質(zhì)量的影響制備含有APC 500U/ml HSA 2.5％、甘氨酸0.067M和檸檬酸鈉20mM的經(jīng)冷凍干燥的APC產(chǎn)物，使其含有氯化鈉的濃度從1mM到500mM變化。每一冷凍干燥產(chǎn)物在60℃下放置一個(gè)月，各固體的外觀質(zhì)量列在表6中。
表6含有選定濃度氯化鈉的經(jīng)冷凍干燥處理制劑的質(zhì)量氯化鈉 固體質(zhì)量(mM)放置前在60℃放置一個(gè)月1 白色固體，皺縮非常易皺縮
10 白色固體，稍微皺縮與放置前相同50 白色多孔塊狀 與放置前相同100白色多孔塊狀 與放置前相同500透明皺縮塊狀 與放置前相同表6的結(jié)果表明，在添加氯化鈉的濃度很高或很低時(shí)，固體的APC制劑很難配制為藥物制劑。含有的氯化鈉濃度為50mM到200mM，被認(rèn)為是有利于冷凍干燥制劑的穩(wěn)定。
實(shí)例7在經(jīng)冷凍干燥制劑中的APC活性制備含有本發(fā)明穩(wěn)定劑(0.7％氯化鈉，0.067M甘氯酸和2.5％HSA)的檸檬酸的緩沖溶液，使其含有APC的活性為100-2500U/管形瓶，且無(wú)菌情況下分別放入管形瓶中，而后冷凍干燥并密封。每一管形瓶放置在10℃、15℃和60℃條件下，測(cè)定活性的降低。結(jié)果列在表7中。數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的穩(wěn)定APC的辦法在冷凍干燥狀態(tài)下是有效的。
表7活性保持比率(％)APC時(shí)間 10℃15℃60(U/管形瓶)10030個(gè)月100 101 -50030個(gè)月97 99 -11天 991000 30個(gè)月99 97 -2500 30個(gè)月98 95 -11天 105
實(shí)例8重復(fù)的冷凍-熔化過(guò)程對(duì)APC穩(wěn)定性的影響將本發(fā)明的穩(wěn)定劑(0.7％氯化鈉，0.067M的甘氨酸和2.5％HSA)加入到含活性為500U/ml的活性蛋白質(zhì)C的檸檬酸的緩沖溶液中。得到的溶液重復(fù)(5次，10次，15次和20次)冷凍(-80℃)和熔化，之后測(cè)量活性。結(jié)果列在表8中。即使是重復(fù)冷凍-熔化20次，APC的活性也沒(méi)有明顯變化，且保持穩(wěn)定。
表8重復(fù)次數(shù) 活性保持比率(％)5 10210 95.115 10620 99.權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其包括添加至少一種氨基酸，及清蛋白和非離子型表面活性劑兩者之一或兩者的組分到含有蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C及鈉離子的鹽緩沖劑中。
2.權(quán)利要求1中穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)的方法，其中所述加入氨基酸的最終濃度是0.005M-0.1M。
3.權(quán)利要求1或2中的穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其中所述加入的氨基酸選自那些構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸。
4.權(quán)利要求3的穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其中所述構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸選自于下列幾種氨基酸甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸及谷氨酸。
5.權(quán)利要求1的穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其中所述清蛋白的最終濃度是0.5％(w/v)-10％(w/v)。
6.權(quán)利要求1的穩(wěn)定蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C的方法，其中所述非離子型表面活性劑的最終濃度是0.0005％(w/v)-0.1％(w/v)。
7.一種含有蛋白質(zhì)C和/或活性蛋白質(zhì)C的緩沖水溶液，其包括以下成分100-2500U/ml的蛋白質(zhì)C和/或活性蛋白質(zhì)C，50-200mM的鈉離子，5-100mM的氨基酸，及0.50-10％(w/v)的清蛋白和0.0005-0.1％(w/v)的非離子型表面活性劑兩者之一或兩者的組合。
8.一種含有蛋白質(zhì)C和/或活性蛋白質(zhì)C的組合物，其包括下列成分1×105-2.5×106U的蛋白質(zhì)C和/或活性蛋白質(zhì)C，50-200mg的鈉離子，5-100mM的氨基酸，及5-100g的清蛋白及0.005-1g的非離子表面活性劑中的一種或兩者的組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)C及活性蛋白質(zhì)C的方法及由此法得到的制劑，在分離和純化、冷凍干燥、加熱等過(guò)程中或貯存放置過(guò)程中此法及制劑均適用。將至少一種氨基酸，清蛋白和非離子表面活性劑中的一種或其組合加入到含蛋白質(zhì)C或活性蛋白質(zhì)C及鈉離子鹽的緩沖液中。
文檔編號(hào)C12N9/64GK1138297SQ94194600
公開(kāi)日1996年12月18日 申請(qǐng)日期1994年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月29日
發(fā)明者宮田和正, 秋本芳則, 緒方洋一, 中垣智弘 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所, 帝人株式會(huì)社