專利名稱：含有熱穩(wěn)定防凍蛋白的冷凍食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分離防凍蛋白(AFP)的方法和涉及含有AFP的冷凍食品。
本發(fā)明背景長(zhǎng)期以來人們建議采用各種防凍蛋白(AFP)來改進(jìn)食品對(duì)冷凍的忍受能力。
出于本發(fā)明的原因，術(shù)語“AFP”具有本領(lǐng)域所熟知的含義，即那些表現(xiàn)出抑制冰晶體生長(zhǎng)的活性的蛋白質(zhì)。參見美國(guó)專利第5,118,792號(hào)。
WO90/13571公開了通過化學(xué)或重組DNA技術(shù)制得的防凍肽。這些AFP可適用于食物中。其實(shí)施例3B顯示，如果將水-冰混合物與0.01％(重量)的AFP一起冷凍進(jìn)薄膜(film)中便改變了冰晶體的形狀。
WO92/22581公開了來自植物的、可用來控制冰淇淋中冰晶體形狀的AFP。該文獻(xiàn)也描述了一種用于通過將植物葉子滲入萃取介質(zhì)中而無須使植物破碎從植物的細(xì)胞外空隙中萃取多肽組分的方法。
WO94/03617公開了從酵母中制備AFP及其在冰淇淋中的應(yīng)用。WO96/11586描述了通過微生物制備魚的AFP。
有一些文獻(xiàn)段落也提及用于低溫保護(hù)的植物蛋白的分離和/或用途。低溫保護(hù)蛋白在保護(hù)植物膜不受凍壞方面起了一定作用。然而這些蛋白沒有抑制再結(jié)晶的性能，因此不包括在術(shù)語AFP的范圍內(nèi)。
Hincha在Journal of Plant Physiology(1992年，140,236-240)中描述了從甘藍(lán)中分離出低溫保護(hù)蛋白。
Volger在《Biochimica et Biiophysica Acta》(412,1975年，335-349)中描述了從菠菜中分離出低溫保護(hù)葉蛋白。
Boothe在《PlantPhysiol》((1995年)，108:759-803)中描述了從蔓青中分離出蛋白。同樣，人們相信這些蛋白是低溫保護(hù)蛋白而不是AFP。
Neven在《Plant Molecular Biology》(21:291-305,1993)中描述了菠菜低溫保護(hù)蛋白的DNA特征。
Salzman在《Am.J.Enol.Vitic.》(第44卷，第4期，1993年)的“第18屆ASEV年會(huì)/東部的概括和回顧”中描述了在葡萄屬的芽中存在蒸煮穩(wěn)定的多肽。雖然該蛋白類同于魚的防凍肽，但它們是低溫保護(hù)蛋白而不是AFP。
Lin在《Biochemical and Biophysical Research Communication》，第183卷，第3期，1992年，第1103-1108頁)中以及Lin在《PlantPhysiology》((1992年)，99:519-525)中描述了來自Arabidopsis Hakaira的15kDa低溫保護(hù)多肽。
Houde在《The Plant Journal》((1995年)，8(4)，第583-593頁中)提及來自小麥的低溫保護(hù)蛋白。
此外-如實(shí)施例Ⅷ所示-加熱后甘藍(lán)、菠菜、蔓青和擬南芥屬的浸出液沒有再結(jié)晶抑制蛋白。
然而迄今AFP還未應(yīng)用于市售食品中。其一個(gè)原因是獲得AFP的成本高及過程復(fù)雜。另一個(gè)原因是直到現(xiàn)在才有人建議將其用于冷凍食品中的AFP不能結(jié)合進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)配方混合物中，因在處理過程中、尤其是在巴氏滅菌步驟過程中它們?nèi)菀资Х€(wěn)。這種失穩(wěn)相信是由于AFP的變性所引起，這是一個(gè)通?？蓮碾暮偷鞍字杏^察得到的眾所周知的結(jié)果。
本發(fā)明的目的在于提供這些問題的解決方法。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過一種新的較為簡(jiǎn)單的方法可將AFP從天然來源如冷凍馴化的植物中分離出來。該方法第一次使得可以鑒別在進(jìn)行巴氏滅菌之前可方便結(jié)合進(jìn)制備冷凍食品的混合物中的AFP。
因此，在第一方面本發(fā)明涉及從天然來源中回收AFP的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有AFP的汁液從天然來源中分離出來；b)將天然來源或含有AFP的汁液在至少為60℃的溫度下進(jìn)行熱處理；c)除去不溶的部分。
上述方法的步驟c通常在步驟a和b之后進(jìn)行。步驟a和b可以以任何所需的順序進(jìn)行，如步驟a在前步驟b在后(在這種情況中將加熱富含AFP的汁液)或步驟b在前步驟a在后(在這種情況中將加熱天然來源)或步驟a和b同時(shí)進(jìn)行。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離方法具有許多優(yōu)點(diǎn)。
首先，通過使用此方法可以不必再如在根據(jù)WO92/22581的方法中所要求的那樣需要避免天然來源如植物的破碎。這就馬上顯著增加了本方法的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值(如與WO92/22581相比)，因?yàn)椴辉傩枰糜谔厥饧庸さ母叩耐顿Y費(fèi)用。
同時(shí)，通過使用高溫似乎可以從存在于天然來源的大量肽中提取出一種新的相當(dāng)活性的AFP(從天然材料中)，所述AFP包括相當(dāng)活性的w.r.t.冰再結(jié)晶抑制性能的肽。
第三，使用高溫出乎意料之外地不會(huì)使所有的蛋白質(zhì)的變性，但只是使一些蛋白質(zhì)變性，而剩下的AFP溫度穩(wěn)定性得到增加。這就使得在組合物中可以包括需要經(jīng)受較高溫度，如巴氏滅菌步驟的分離出來的AFP。這是特別令人驚奇的，因?yàn)槔鐏碜訵O92/22581的AFP在加熱條件下是不穩(wěn)定的(參見實(shí)施例Ⅵ)。
本發(fā)明的方法包括在步驟b中將天然來源或富含AFP的汁液加熱至高于60℃的溫度。優(yōu)選此溫度為60-110℃、最優(yōu)選為80-105℃。加熱步驟可在分離富含蛋白的汁液(步驟a)之后進(jìn)行或在分離富含蛋白的汁液之前進(jìn)行?？捎萌魏芜m宜的方法來加熱汁液，如常規(guī)加熱或微波加熱，任選添加提取介質(zhì)加熱、蒸汽等。
如果使用提取介質(zhì)，則最好其使用的體積較小以避免AFP組分發(fā)生不必要的稀釋。雖然特別優(yōu)選使用水，但可以使用任何適宜的提取介質(zhì)。如需要，可在水用作提取介質(zhì)之前將各種添加劑加入其中。然而最優(yōu)選的是使用基本上不含各種添加劑的水。
本發(fā)明方法可以應(yīng)用于任何熱穩(wěn)定的AFP的天然來源。包括在此范圍內(nèi)的是植物、魚、昆蟲和微生物。天然存在的種類或通過遺傳修飾獲得的種類都可以使用。例如可使微生物或植物經(jīng)基因修飾后表達(dá)AFP，然后根據(jù)本發(fā)明可將此AFP分離出來。因此可獲得與直接從天然來源中獲得的AFP至少80％、更優(yōu)選大于95％、最優(yōu)選100％同源的AFP。出于本發(fā)明的原因，擁有如此高同源水平的蛋白也包括在術(shù)語AFP的范圍內(nèi)。同時(shí)這些可以表達(dá)編碼AFP的基因轉(zhuǎn)化的微生物或植物也包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
可使用遺傳操作技術(shù)來生產(chǎn)述于本發(fā)明中的熱穩(wěn)定的AFP。通過用編碼所需熱穩(wěn)定多肽的基因構(gòu)成物可使合適的宿主細(xì)胞或有機(jī)體發(fā)生轉(zhuǎn)化?？蓪⒕幋a熱穩(wěn)定多肽的核苷酸順序插入到含有為轉(zhuǎn)錄作用和轉(zhuǎn)譯作用所需元件的適宜表達(dá)載體中，并且以一種在合適的條件下(如以適當(dāng)?shù)亩ㄏ蚣罢_的讀框且具有合適的目標(biāo)和表達(dá)序列)可將其表達(dá)出來的方式進(jìn)行。構(gòu)成這些表達(dá)載體所需的各種方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。
可以采用許多表達(dá)體系來表達(dá)熱穩(wěn)定多肽的編碼序列。這些體系包括(但不限于此)細(xì)菌、酵母昆蟲細(xì)胞體系、植物細(xì)胞培養(yǎng)體系和具有用合適表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物。
采用在熱穩(wěn)定提取液中分離出來的多肽核酸構(gòu)成物可以轉(zhuǎn)變很多種植物和植物細(xì)胞體系。優(yōu)選的實(shí)施方案包括(但不限于此)玉米、西紅柿、煙草、胡蘿卜、草莓、油菜籽和制糖甜菜。
優(yōu)選AFP衍生自植物(這指的是AFP直接從作為天然來源的植物中獲得，或與這些AFP具有高度同源的AFP在其它有機(jī)體中經(jīng)轉(zhuǎn)基因得到)。可采用任何含有熱穩(wěn)定AFP的植物，然而優(yōu)選在寒冷的條件下仍可生長(zhǎng)(因其含有AFP)的天然存在的植物(或其基因修飾的變種)。特別優(yōu)選使用冬黑麥、多年生牧草和苔草。其它適宜的植物可以是例如木質(zhì)植物、冬谷類等。
特別優(yōu)選熱穩(wěn)定AFP衍生自槭樹屬saccharoides(Acersaccharoides)、竹、醉魚草屬、園枝貓尾蘚、樹花屬farinaceae(Ramalinafarinacea)、松蘿屬subfloridana(Usnea subfloridana)、連翹屬、酢漿草屬、早熟禾屬Trivialis(Poa Trivialis)、毒麥屬Perenne(Loium Perenne)、絨毛草、雀麥屬Sterilis(Bromus Sterili)、Parodiochloa flabellata、發(fā)草屬antartica(Deschampsia antartica)、苔草屬aquatilis(Carex aquatilis)、Colobanthus quintensis和翦股穎屬tenuis(Agrostis tenuis)、羊茅屬contracta(Festuca contracta)和早熟禾。
通過任何方便的方法如壓濾、過濾、均化、萃取等可將富含AFP的汁液從其來源中分離出來。在通過例如過濾收集富含蛋白部分之前，優(yōu)選將AFP的天然來源如植物材料切成小塊或制成淤漿?？赏ㄟ^任何適宜的方法如在摻合機(jī)中進(jìn)行浸漬作用。將植物材料分成這種小塊的形式使得更容易收集富含AFP汁液將完全是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的事。
在蛋白部分收集和加熱(以所需的順序進(jìn)行)后，為了除去不溶部分并保留富含AFP液體部分，可通過方便的方法處理所得含有AFP的樣品。不溶部分可通過如過濾、沉淀等方法除去。然后最好進(jìn)一步處理富含AFP液體以濃縮或分離AFP，并將其做成適合于進(jìn)一步使用的形式。適宜方法的例子是干燥以獲得粉末或糊狀物，進(jìn)一步濃縮以獲得AFP濃縮液，色譜法將AFP從提取介質(zhì)中分離出來等。確定得到適當(dāng)分離的所需的適宜方法和條件同樣也是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的事。
對(duì)于一些天然來源而言，通過上述方法獲得的AFP可由兩種或多種不同的AFP的混合物所組成。如需要，通過任何常規(guī)方法如色譜法或其它基于物理/化學(xué)性質(zhì)如分子量的不同可分離這些AFP。
同樣如需要，可確定分離出來的AFP的氨基酸組成及其序列。可以采用任何適宜的確定方法。適宜方法的例子述于實(shí)施例中。同樣如需要，可確定為編碼AFP的核酸序列。含有能夠編碼氨基酸的核酸序列的載體也包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
基于以上資料，也可以對(duì)其它天然來源進(jìn)行基因修飾使得它們生產(chǎn)出如上所述的有利的AFP。適宜AFP的例子見述于實(shí)施例中。
我們發(fā)現(xiàn)，通過上述方法獲得的AFP承受熱處理的能力提高了。我們相信這些AFP以前從未被分離過。如上所述，這種增強(qiáng)了的耐熱性特別適用于必須經(jīng)受一個(gè)加熱步驟如巴氏滅菌的食品。
因此本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及由在80℃熱處理1小時(shí)、或在100℃熱處理10分鐘后，其再結(jié)晶抑制性能仍未有明顯減少證明了其熱穩(wěn)定性的AFP。一種適用于確定冰再結(jié)晶抑制性能的實(shí)驗(yàn)述于實(shí)施例中，它包括快速冷凍至-40℃，然后在-6℃下貯存1小時(shí)。優(yōu)選經(jīng)過熱處理后經(jīng)受此實(shí)驗(yàn)的AFP得到的冰晶體顆粒比起具有相同AFP但未經(jīng)熱處理的樣品的冰晶體顆粒來不大于5μm。優(yōu)選其差值不大于3μm、最優(yōu)選不大于1μm。
優(yōu)選選擇具有顯著冰晶體再結(jié)晶抑制性能的那些AFP。一種確定再結(jié)晶抑制性能的適宜實(shí)驗(yàn)示于實(shí)施例Ⅵ中。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的AFP能提供依據(jù)冰再結(jié)晶抑制測(cè)定(如示于實(shí)施例中)的冰顆粒大小為不大于15μm、更優(yōu)選為5-5μm。
可方便地將AFP用于食品中，優(yōu)選用于冷凍或即將冷凍的食品中。特別優(yōu)選的是AFP用于冷凍前需通過例如巴氏滅菌或消毒加熱的食品中。特別優(yōu)選用于冷凍糖食中。
這些食品的例子是冷凍糖食混合物如冷凍前需進(jìn)行巴氏滅菌的冰淇淋混合物和凍果子露混合物。這些混合物通常貯存于室溫下。適宜的食品形式是例如包裝于例如袋中或小香包中的粉末混合物。在添加水及任選的其它成分和進(jìn)行充氣(任選)后，所述混合物可以形成冷凍食品的基礎(chǔ)。
適宜混合物的另一個(gè)例子可以是液體混合物(任選進(jìn)行充氣)，如需要，在添加其它成分及任選的進(jìn)一步充氣后可將其冷凍。
上述混合物很明顯的優(yōu)點(diǎn)是AFP成分的存在使得混合物可以在靜止的條件下如在商店或家用冷凍機(jī)中進(jìn)行冷凍而不會(huì)形成不可接受的冰晶體形狀，因此而獲得與通常經(jīng)靜止冷凍所得到的產(chǎn)品不一樣的結(jié)構(gòu)。
可以很方便地將這些混合物包裝于密閉容器中(如紙板箱、袋子、盒子、塑料容器等)。對(duì)于單份包裝的大小一般為10-1000克。對(duì)于多份包裝的大小可多至500千克。通常包裝大小為10-5000克。
如上所述，其中使用AFP的優(yōu)選食品是冷凍糖食如冰淇淋或凍果子露。基于最終食品的重量計(jì)，優(yōu)選AFP的含量為0.0001-0.5％(重量)。如果使用干混合物或濃縮物，則為了確保在最終冷凍食品中其含量能在上述范圍內(nèi)，其濃度可高些。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物可以含很低量的AFP，但其質(zhì)量仍然良好。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)AFP的含量可以低至0.1-50ppm而在冷凍的糖食中仍能提供足夠的再結(jié)晶性能和溫度忍受能力。雖然本申請(qǐng)人決不希望受縛于任何理論，但其原因可能是冷凍糖食固體與AFP之間的相互作用為抑制晶體生長(zhǎng)提供了一個(gè)極好的機(jī)制。AFP最常見的含量為1-40ppm、特別優(yōu)選為2-10ppm。
出于本發(fā)明的原因，術(shù)語“冷凍糖食”包括含有冷凍糖食如冰淇淋的牛奶、冷凍保加利亞奶酒、冷凍果汁水、果汁冰水、牛奶凍和冷凍乳蛋糕、凍果子露、粗粒冰糕(granitas)和冷凍水果泥。對(duì)于一些應(yīng)用則不太優(yōu)選AFP用在冷凍發(fā)酵食品中。
優(yōu)選固體在冷凍糖食(如糖、脂肪、香料等)中的含量大于4％(重量)，例如優(yōu)選大于30％(重量)、更優(yōu)選為40-70％(重量)。
根據(jù)本發(fā)明的冷凍糖食可以通過任何適用于生產(chǎn)冷凍糖食的方法進(jìn)行生產(chǎn)。然而特別優(yōu)選在巴氏滅菌及冷凍過程開始前使配方中的所有成分充分混合。冷凍過程可包括如在不大于華氏-30度的溫度下進(jìn)行的一個(gè)硬化步驟。
實(shí)施例Ⅰ首先通過收集汁液，然后進(jìn)行熱處理并分離AFP來分離AFP。
在一月份(該月份的平均溫度為3.5℃，確保植物得到適當(dāng)?shù)牡蜏伛Z化作用)收割冬黑麥(Halo變種)。將其組織迅速送至實(shí)驗(yàn)室以便進(jìn)一步處理，并用水徹底清洗以除去污垢。
在室溫下、于Waring摻合機(jī)中，用800克水將400克冬黑麥剪下物攪勻直至葉組織完全得到碎裂。通過4層軟棉布過濾來收集富含AFP的汁液。
然后通過將汁液煮沸10分鐘來使富含AFP的汁液經(jīng)歷溫度處理。這使得蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，而用于本發(fā)明中的AFP則保持在溶液中。通過在15,000g下離心20分鐘或通過進(jìn)一步經(jīng)軟棉布過濾使上清液從沉淀物中分離出來。
通過冷凍干燥可以使AFP從上清液中分離出來。
為了對(duì)照，可如下獲得冬黑麥的質(zhì)外體的浸出液(細(xì)胞外浸出液)將經(jīng)過30天冷馴化的黑麥植物葉切成3厘米長(zhǎng)，并在蒸餾水中徹底清洗以除去任何的細(xì)胞內(nèi)含物。將葉片在紙巾上拍干，然后全部浸入5mM EDTA、10mM抗壞血酸、2mM己酸、2mM芐脒和1mM苯基甲基磺酸氟(PMSF)的提取介質(zhì)中。在瓷燒瓶中將其進(jìn)行真空滲透60分鐘，然后取出葉子并完全拍干。將其排列。縱長(zhǎng)(lengthways)被截留于塑料注射針筒中，和緩地以2000Xg離心30分鐘。將質(zhì)外體的浸出液收集在注射器下面的微量離心管中。
實(shí)施例Ⅱ首先通過加熱天然來源的物質(zhì)，然后分離富含AFP的汁液并分離AFP來進(jìn)行AFP的分離。
在一月份(該月份的平均溫度為3.5℃，確保植物得到適當(dāng)?shù)牡蜏伛Z化作用)收割混合牧草組織(早熟禾屬Trivialis、毒麥屬Perenne、絨毛草、雀麥屬Sterilis)。將牧草組織迅速送至實(shí)驗(yàn)室以便進(jìn)一步處理，并用水徹底清洗以除去污垢。
將500克的牧草剪下物放置于650瓦微波爐中，并以全功率加熱5分鐘，藉此溫度升高至85-100℃。然后將牧草剪下物冷卻至室溫。
或者將牧草剪下物與500克沸水混合，將此混合物重新加熱至100℃，在攪拌下煮沸10分鐘，然后冷卻至60℃。
加熱步驟后，通過過濾使富含AFP的汁液從剪下物中分離出來。在等體積水的存在下將其連續(xù)攪拌5分鐘，然后通過3層軟棉布進(jìn)行壓榨。
可將上清液進(jìn)行冷凍干燥以除去水，然后貯存?；蛘呖蓪⑸锨逡豪鋬鲑A存。
實(shí)施例Ⅲ通過混合以下成分得到用于制備冰淇淋的液體預(yù)混合物成分 ％(重量)脫脂奶粉 11.390蔗糖 3.410麥芽糖糊精(MD40) 4.000刺槐豆膠 0.072玉米糖漿63DE 20.705瓜爾豆膠 0.048Genulacta L100 0.020奶油 9.015微晶纖維素RC581 0.240明膠 0.140單酸甘油酯(棕櫚酸酯) 0.450香草醛 0.010AFP(實(shí)施例Ⅰ*) 0.100或0(對(duì)照)水余量*注AFP作為濃縮的AFP溶液(使用一些添加的水作為稀釋劑)添加，百分?jǐn)?shù)指的是AFP的量。
可方便地在85℃使該混合物進(jìn)行巴氏滅菌15秒，然后冷凍貯存在容器中。
通過采用常規(guī)家用混合器攪打至膨脹量約為100％，接著在家用冷凍機(jī)中進(jìn)行靜止冷凍，這些混合物可用于制備冰淇淋。根據(jù)本發(fā)明的組合物的結(jié)構(gòu)明顯好于對(duì)照樣品。
通過使用實(shí)施例Ⅱ的AFP代替實(shí)施例Ⅰ的AFP可獲得相當(dāng)好的結(jié)果。
實(shí)施例Ⅳ通過混合以下成分得到用于制備冰淇淋的液體預(yù)混合物成分％(重量)脫脂奶粉10.00蔗糖13.00麥芽糖糊精(MD40) 4.00刺槐豆膠 0.14熔融奶油 8.00單酸甘油酯(棕櫚酸酯) 0.30香草醛 0.01AFP(實(shí)施例Ⅰ*) 0.01或0(對(duì)照)水余量*注AFP作為在一些水中的濃縮AFP液添加，百分?jǐn)?shù)指的是AFP的量。
以上所有成分在室溫下混合，然后在89℃下進(jìn)行巴氏滅菌60秒。將混合物無菌裝入到500毫升的包裝袋中、密封并在室溫下貯存。
通過采用常規(guī)家用混合器攪打至膨脹量約為70％，接著在家用冷凍機(jī)中進(jìn)行靜止冷凍，以上混合物可用于制備冰淇淋。
貯存兩個(gè)月后，根據(jù)本發(fā)明的組合物的結(jié)構(gòu)明顯好于對(duì)照樣品。
通過使用實(shí)施例Ⅱ的AFP代替實(shí)施例Ⅰ的AFP可獲得相當(dāng)好的結(jié)果。
實(shí)施例Ⅴ重復(fù)實(shí)施例Ⅳ，不同的是在無菌包裝和密封之前將冰淇淋混合物預(yù)先充氣至70％的膨脹量。
所得產(chǎn)品可在室溫下貯存，通過將混合物放置到家用冷凍機(jī)中并在靜止條件下進(jìn)行冷凍可制得冰淇淋。
實(shí)施例Ⅵ可如下測(cè)定AFP的冰再結(jié)晶抑制性能將含有AFP的產(chǎn)品的樣品調(diào)節(jié)到蔗糖含量為30％(重量)(如果樣品的起始含量大于30％，則通過稀釋來調(diào)節(jié)，如果起始含量較低，則加入蔗糖至達(dá)到30％的含量)。
將3μL的一滴樣品置于22毫米寬的條狀蓋玻片上。然后將直徑為16毫米的蓋玻片放置于其上，在樣品上加上200克的重物以確保載玻片厚度均勻。蓋玻片的邊緣用純的指甲清漆密封。
將載玻片放置于Linkham THM 600的溫控顯微鏡載物臺(tái)上。使載物臺(tái)迅速冷卻(50℃/分)到-40℃以得到大量的小晶體。然后將載物臺(tái)的溫度迅速升高(50℃/分)到-6℃并保持在該溫度下。
使用Leica Aristoplan顯微鏡觀察在-6℃時(shí)的冰相。使用偏振光條件及λ板來增強(qiáng)冰晶體的對(duì)比度。通過35毫米的照相顯微鏡記錄冰相在T=0和T=1小時(shí)的狀態(tài)。
通常該實(shí)驗(yàn)可以適用于任何適宜的含有AFP和水的組合物。通常AFP在這種實(shí)驗(yàn)組合物中的含量不是很關(guān)鍵的，它可以為例如0.0001-0.5％(重量)、更優(yōu)選為0.0005-0.1％(重量)、最優(yōu)選為0.001-0.05％(重量)，例如為0.01％(重量)。
任何含有AFP和水的適宜組合物都可以用來進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。然而一般不需要得到純化的AFP。對(duì)實(shí)際應(yīng)用而言，通常制備液體浸出液或天然材料的汁液已經(jīng)足夠，其中可對(duì)此浸出液或汁液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
該方法可應(yīng)用于例如由實(shí)施例Ⅰ或Ⅱ(有或沒有濃縮步驟)獲得的含AFP的浸出液。
測(cè)量了幾個(gè)樣品的再結(jié)晶抑制性能。這些樣品是由一年中不同時(shí)間收獲的黑麥所得。如上測(cè)量根據(jù)實(shí)施例Ⅰ經(jīng)浸漬和加熱后所得的AFP汁液的再結(jié)晶性能。作為對(duì)比，使用在溫室中(在通常不誘發(fā)AFP形成的溫度下)生長(zhǎng)的黑麥。
測(cè)量到以下冰晶體的大小。
樣品 1小時(shí)后的冰晶體大小(μm)對(duì)照 2512月樣品 171月樣品102月樣品153月樣品184月樣品185月樣品25這些測(cè)量結(jié)果表明，為了獲得良好的AFP活性，應(yīng)在冬季月份如12月-4月收割植物。特別優(yōu)選的是能提供冰晶體大小小于15μm或更小的樣品。在以上情況中可通過在1月或2月收割植物來達(dá)到這個(gè)目的。
對(duì)進(jìn)行過熱處理(在60℃下1小時(shí))的1月AFP樣品進(jìn)行相同的測(cè)量。在再結(jié)晶性能方面沒有觀察到顯著的減少。
作為對(duì)比，使用實(shí)施例Ⅰ的質(zhì)外體的浸出液。1小時(shí)后得到最終的冰晶體大小為11.1μm；經(jīng)熱處理后(在100℃下煮沸10分鐘)1小時(shí)后實(shí)驗(yàn)結(jié)果的冰晶體的大小為16.8μm。該實(shí)施例顯示來自冬黑麥的質(zhì)外體的浸出液不是熱穩(wěn)定性的。
實(shí)施例Ⅶ從Silsoe(UK)處獲得1月收割的牧草的未經(jīng)熱處理過的牧草浸出液。將浸出液離心1小時(shí)以除去污垢和不溶碎屑，離心機(jī)SorvallRC3C，轉(zhuǎn)子H6000A，溫度+5℃，轉(zhuǎn)速5000轉(zhuǎn)/分(7268g)。
將浸出液的樣品冷凍干燥以確定其總固含量。經(jīng)測(cè)定此值為11.48毫克/毫升。然后使干燥的浸出物用30％的蔗糖溶液再水化至其初始總固體濃度。按需要通過用30％的蔗糖溶液稀釋浸出液來制備幾種溶液。
采用實(shí)施例Ⅵ的測(cè)定方法來測(cè)量防凍活性。
在T=0和T=1小時(shí)處的再結(jié)晶抑制測(cè)定圖具有其通過Zeiss TGA10分析器所測(cè)量的平均冰晶體大小。所得結(jié)果示于下表中。<

>這些結(jié)果表明，對(duì)于牧草浸出液不同的稀釋濃度，在-6℃下1小時(shí)內(nèi)最終的晶體大小不同，冰晶體的大小也有變化?？梢钥闯鲈谀敛萁鲆褐械墓腆w含量可以有很大的變化，而仍可獲得良好的再結(jié)晶抑制性能。優(yōu)選選擇這些濃度使得1小時(shí)后冰晶體的大小不大于15微米。
用經(jīng)過熱處理后(在100℃下10分鐘)的牧草浸出液進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。看不到再結(jié)晶抑制性能的顯著變壞。
另外再采用相同的再結(jié)晶抑制實(shí)驗(yàn)來測(cè)試實(shí)施例Ⅱ的牧草浸出液。得到如下結(jié)果
熱處理晶體大小(μm)T=0 T=160℃,1小時(shí)9.6 11.1煮沸10分鐘9.8 11.3這些結(jié)果表明，即使是加熱后經(jīng)冷馴化的牧草的浸出液仍保持其抑制冰晶體生長(zhǎng)的能力。
實(shí)施例Ⅷ在1月收割幾種含有AFP的植物。通過在等體積保持于冰中的緩沖劑A(10mM EDTA、20mM抗壞血酸，用Tris緩沖至pH=7.4)中，用研杵和研缽(冷卻至4℃)研磨新鮮組織如根部、桿莖、芽或葉得到浸出液。將組織均漿通過一層或多層軟棉布過濾，在進(jìn)一步使用前將其保存于冰中。
使浸出液進(jìn)行實(shí)施例Ⅵ的再結(jié)晶抑制性能實(shí)驗(yàn)(在60℃下加熱1小時(shí)和煮沸10分鐘后)。
由于維持再結(jié)晶抑制性能而被證實(shí)含有熱穩(wěn)定AFP的有以下植物槭樹屬saccharoides、竹、醉魚草屬、園枝貓尾蘚、樹花屬farinaceae、松蘿屬subfloridana、連翹屬、酢漿草屬、早熟禾屬Trivialis、毒麥屬Perenne、絨毛草、雀麥屬Sterilis、Parodiochloaflabellata、發(fā)草屬antartica、苔草屬aquatilis、Colobanthus quintensis和翦股穎屬tenuis、羊茅屬contracta和早熟禾。
以下植物不合熱穩(wěn)定AFP甘藍(lán)、菠菜、蔓青和擬南芥屬。
實(shí)施例Ⅸ可如下測(cè)試AFP的熱滯后活性將1毫升樣品放置在熱水浴中的微量離心管，并在60℃下加熱1小時(shí)。然后如下測(cè)量樣品的熱滯后性能將熔融的樣品放置于顯微載玻片(Camlab Cambridge，光程長(zhǎng)度為0.1毫米)。顯微載玻片的末端用礦脂密封。
使用氣溶膠冷凍噴涂將冰引入到樣品中。然后將載玻片浸入-0.1℃乙醇溫度調(diào)節(jié)浴中。平衡5分鐘后檢查樣品。如果冰完全熔化，則平衡后浴的溫度將以0.1℃逐步降低。重復(fù)這些步驟直至溫度達(dá)到少量冰晶體存在于樣品中的溫度為止。于此溫度平衡后，浴溫以0.01℃/分逐步降低。當(dāng)冰開始從平衡的晶體中蔓延時(shí)記錄此時(shí)樣品冰點(diǎn)的溫度。
然后通過使溫度從冰點(diǎn)開始以0.01℃/分逐步升高直至所有冰晶體熔化來測(cè)定樣品的熔融溫度。此溫度是樣品的熔融溫度。
樣品的熱滯后是熔融溫度與凝固溫度之差。
對(duì)第一樣品(熱處理之前)和第二樣品(熱處理之后)上進(jìn)行這個(gè)測(cè)試程序，然后進(jìn)行冷卻。
類似地，通過上述測(cè)試可以測(cè)定熱穩(wěn)定性(其中樣品在水中煮沸30秒)，然后測(cè)定熱滯后性能。測(cè)定幾個(gè)樣品的熱滯后性能。
樣品是由一年中從不同時(shí)間收獲的冬黑麥所得。如在實(shí)施例Ⅵ中測(cè)量根據(jù)實(shí)施例Ⅰ經(jīng)浸漬和加熱后所得的AFP汁液的熱滯后性能。作為對(duì)比，使用在溫室中(在通常不誘發(fā)AFP形成的溫度下)生長(zhǎng)的冬黑麥。
以下是所測(cè)得的熱滯后性能樣品 熱滯后(℃)對(duì)照0.0412月樣品0.181月樣品 0.212月樣品 0.173月樣品 0.154月樣品 0.125月樣品 0.05這些測(cè)量結(jié)果表明，為了獲得良好的AFP活性，應(yīng)在冬季月份如12月-3月收割植物。
對(duì)進(jìn)行過熱處理(在60℃下1小時(shí))的1月AFP樣品進(jìn)行相同的測(cè)量。在熱滯后性能方面沒有觀察到顯著的減少。
實(shí)施例Ⅹ測(cè)定AFP的氨基酸序列。
使用具有10kDa截留值膜的Amicon超濾室對(duì)實(shí)施例Ⅱ的熱穩(wěn)定牧草浸出液進(jìn)行約10次的濃縮。將所得的濃縮液上于一個(gè)MonoQ(Pharmacia)HR 5/5 FPLC陰離子交換柱中。結(jié)合到柱上的是在50mMTris/HCl緩沖液(pH=8.5)中，用NaCl至在相同pH=8.5 Tris緩沖液中0.5M的最終濃度線性梯度洗脫RI活性部分。以1毫升/分的流速進(jìn)行層析，收集1毫升部分并測(cè)定再結(jié)晶抑制活性(如實(shí)施例Ⅸ)。
將活性部分匯合在一起，并在Sorvall SS 34轉(zhuǎn)子(8×50毫升)將以10,000轉(zhuǎn)/分離心的centricon PM10離心濃縮器(Amicon)中離心10分鐘，濃縮至0.05毫升的體積。將濃縮液上于到以SMART微分離體系(Pharmacia)運(yùn)轉(zhuǎn)的Superdex 75 PC 3.2/30凝膠過濾柱上。該柱以0.05毫升/分的流速用50mM Tris/HCl緩沖液(pH=8.5)洗脫。上入總體積為3.5毫升的樣品后收集0.05毫升組分。用組分測(cè)定再結(jié)晶抑制活性(如實(shí)施例Ⅸ)，最具活性的組分在進(jìn)行N-末端測(cè)序前先在SDS PAGE凝膠上進(jìn)行分離及電印跡。
將活性的Superdex 75組分溶于凝膠上樣緩沖液(50mMTris/HCl,pH=6.8,10％甘油，10mM二硫蘇糖醇，2％SDS)中，然后根據(jù)Laemmli法在10％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離。電泳后，使凝膠夾緊一張甲醇潤(rùn)濕的蛋白印跡膜(Perkin Elmer)，并在含有10％甲醇的10mM的3(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)緩沖液(pH=11.0)中、在20伏下、進(jìn)行電印跡16小時(shí)。印跡后用甲醇、然后再用MilliQ(Millipore)水簡(jiǎn)單洗滌該膜，用考馬斯亮藍(lán)的0.1％(w/v)溶液進(jìn)行結(jié)合蛋白的顯色。
通過考馬斯染色可顯色出表觀分子量為25kDa和35kDa的兩條蛋白帶。35kDa蛋白似乎特別與最活性的RI組分密切相關(guān)。將這兩條譜帶用解剖刀片切下并進(jìn)行測(cè)序。對(duì)與表觀分子量為65-75kDa相對(duì)應(yīng)的膜的未染色部位也進(jìn)行測(cè)序，因最活性組分的凝膠銀染已經(jīng)表明在該分子量中有一個(gè)蛋白譜帶。
通過將膜的所有三個(gè)切下的部位放進(jìn)印跡測(cè)序筒(cartridge)進(jìn)行測(cè)序，按生產(chǎn)商(Perkin-E1mer)所述使用反應(yīng)和轉(zhuǎn)化周期確定其序列。以下給出N-末端序列表。
25kDa的AFP含有N-末端基本上與下述同源的序列ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR35kDa的AFP含有N-末端基本上與下述同源的序列ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO65-75kDa的AFP含有N-末端基本上與下述同源的序列X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR在每個(gè)次序中X指可以在植物蛋白中發(fā)現(xiàn)的任何氨基酸的未知氨基酸。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“基本上與…同源”意指在氨基酸中至少80％、更優(yōu)選大于90％、最優(yōu)選95-100％重疊。
權(quán)利要求
1．從天然來源中回收AFP的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有AFP的汁液從天然來源中分離出來；b)以至少60℃的溫度將天然來源或含AFP的汁液熱處理；c)除去不溶部分。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟a和b(順序可換)在步驟c之前進(jìn)行。
3．具有熱穩(wěn)定性的AFP，通過在60℃下熱處理1小時(shí)、在80℃下熱處理1小時(shí)或在100℃下熱處理10分鐘后，冰再結(jié)晶抑制性能沒有顯著的減少而得到證實(shí)。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的AFP，其中在水中經(jīng)熱處理過的AFP的組合物在快速冷凍至-40℃、然后在-6℃下貯存1小時(shí)后的冰晶體的大小比未經(jīng)熱處理過的相同AFP的冰晶體的大小不大于5μm。
5．根據(jù)權(quán)利要求3或4的AFP，其中在水中的AFP的組合物在快速冷凍至-40℃、然后在-6℃下貯存1小時(shí)后的冰晶體的大小為不大于15μm。
6．根據(jù)權(quán)利要求3或4的AFP，它含有一種或多種分子量為25kDa、35kDa和65-75kDa的蛋白。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的AFP，它具有與下述基本上同源的N-末端序列25kDa的AFPALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR35kDa的AFPALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO65-75kDa的AFPX-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR
8．含有可以編碼權(quán)利要求7的至少一種AFP的核酸序列的載體。
9．可以表達(dá)權(quán)利要求7的至少一種AFP的轉(zhuǎn)化有機(jī)體。
10．含有0.0001-0.5％(重量)根據(jù)權(quán)利要求3的AFP的冷凍糖食。
11．適用于生產(chǎn)含有權(quán)利要求3的AFP的根據(jù)權(quán)利要求10的冷凍糖食的預(yù)混合物。
12．用于制備冷凍糖食的方法，該方法包括制備含有0.0001-0.5％(重量)AFP的配方混合物，所述AFP具有熱穩(wěn)定性，這通過在60℃下熱處理1小時(shí)、在80℃下熱處理1小時(shí)或在100℃下熱處理10分鐘后冰再結(jié)晶抑制性能仍沒有顯著的減少而得到證實(shí)，然后在靜止條件下使混合物冷凍。
全文摘要
用于從天然來源中回收AFP的方法,所述方法包括以下步驟:a)將含有AFP的汁液從天然來源中分離出來;b)在溫度至少為60℃下將天然來源或含有AFP的汁液熱處理;c)將不溶部分除去。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1226284SQ97196682
公開日1999年8月18日 申請(qǐng)日期1997年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月26日
發(fā)明者P·J·利爾福特, A·J·麥克阿瑟, C·M·賽德博頓, P·維爾丁 申請(qǐng)人:尤尼利弗公司