專利名稱：包括修飾的導(dǎo)向部分的嵌合毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括修飾的導(dǎo)向部分的嵌合毒素，更具體地說，本發(fā)明涉及包括連接到假單胞菌外毒素蛋白質(zhì)上的表皮生長因子的嵌合毒素，其制備方法及經(jīng)修飾后提高了受體結(jié)合能力和細(xì)胞毒活性的嵌合毒素在腫瘤治療中的應(yīng)用。
可以將衍生于細(xì)菌或植物的蛋白質(zhì)毒素連接到生長因子、細(xì)胞因子、激素、抗體或其片段，以及其他細(xì)胞導(dǎo)向分子上，構(gòu)成具有尋靶能力和細(xì)胞毒活性的嵌合毒素，以殺傷攜帶特異性受體或抗原的有害細(xì)胞。一種很有開發(fā)前景的有效治療用毒素是由銅綠色假單菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的假單胞菌外毒素A(PE)單體蛋白質(zhì)(分子量66KD)。當(dāng)PE與其他導(dǎo)向因子組成的融合分子中的導(dǎo)向部分與細(xì)胞受體結(jié)合后，毒素-配體復(fù)合物通過胞吞作用經(jīng)膜凹陷進(jìn)入細(xì)胞膜囊泡，然后泡內(nèi)質(zhì)子泵迅速使膜囊泡內(nèi)環(huán)境酸化(pH值降低)。當(dāng)胞內(nèi)pH降低至足夠低時，延伸的毒素在胞內(nèi)蛋白酶(弗林蛋白酶，Purin)作用下，于Arg279和Gly280之間發(fā)生斷裂，同時聯(lián)系這個部分(Cys265-Cys287)的二硫橋鍵亦被還原并斷開，從而產(chǎn)生羧基末端37KD片段(Ogata et al．，J．Biol．Chem，26520678-20685，1990；Chiron et al．，J．Biol．Chem．27231707，1991)。然后37KD片段跨膜轉(zhuǎn)位到高爾基復(fù)合體上，并經(jīng)囊泡穿梭被帶入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)入胞漿內(nèi)。毒素分子借助其末端特異序列(REDLK)固著于肽鏈上。內(nèi)化后，該37KD片段催化氧化態(tài)NAD的ADP核糖基化部分向延伸因子2(EF-2)上轉(zhuǎn)移，使EF-2核糖基化而失活，從而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
從目前已知的假單胞菌外毒素融合蛋白質(zhì)殺傷有害細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的上述機(jī)理可以看出，決定毒素導(dǎo)向并進(jìn)而殺傷靶細(xì)胞的主要因素包括(1)融合蛋白質(zhì)分子導(dǎo)向部分與其相應(yīng)細(xì)胞受體的結(jié)合能力及穩(wěn)定性；(2)融合蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象及對其通過細(xì)胞膜向細(xì)胞溶膠內(nèi)轉(zhuǎn)位的能力；和(3)融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)折疊，及細(xì)胞內(nèi)弗林蛋白酶裂解PE分子以產(chǎn)生37KD片段的能力。因此，對PE-配體融合蛋白質(zhì)，特別是其中的毒素部分進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦揎検鞘直匾?。這些修飾包括分子中一個或多個半胱氨酸的取代、氨基和／或羧基末端一個或多個氨基酸的刪除、加入或取代等。迄今已有許多關(guān)于對毒素分子或其部分的修飾和功能分析的報導(dǎo)(參見美國專利5，705，163、5，821．238、5，621，078、5，705，156等)。
然而，當(dāng)毒素分子如PE66或PE40與導(dǎo)向分子融合后，必然導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)改變，包括分子折疊后個別氨基酸之間疏水相互作用甚至氫鍵形成所導(dǎo)致的對整個融合分子的受體結(jié)合能力及細(xì)胞毒活性的某些影響。為此，本發(fā)明人在充分考慮到這些影響的基礎(chǔ)上，試圖對融合蛋白質(zhì)的導(dǎo)向部分的分子結(jié)構(gòu)以及導(dǎo)向部分的連接方式進(jìn)行某些修飾和改動，以期改善嵌合分子的受體結(jié)合效率及靶細(xì)胞殺傷活性。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供包括連接到截短的毒素分子上的表皮生長因子序列的靶特異性嵌合毒素，特征在于其中作為導(dǎo)向部分的表皮生長因子序列以兩分子串聯(lián)方式連接到截短形式的毒素分子上。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的截短形式的毒素分子是缺失了Ia區(qū)的假單胞菌外毒素(PE40)。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的作為導(dǎo)向部分的兩分子串聯(lián)連接的表皮生長因子序列是缺失了羧基末端3個氨基酸殘基，并且以頭一尾串聯(lián)方式連接的表皮生長因子序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供含有如上文限定的嵌合毒素及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的再一個目的涉及上述藥物組合物在治療惡性增生性疾病中的應(yīng)用。


圖1顯示用于表達(dá)以表皮生長因子(EGF)為導(dǎo)向部分的重組PE40嵌合蛋白質(zhì)的重組質(zhì)粒pEGF50×2-PE40的構(gòu)建策略。
圖2顯示本發(fā)明的EGF50×2-PE40(●)和按相似方法制備的EGF-PE40(△)對Hep2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性比較。
圖3顯示本發(fā)明的EGF50×2-PE40和按相似方法制備的EGF-PE40置換與A431細(xì)胞結(jié)合之125I-EGF的能力比較。
本發(fā)明涉及修飾的靶特異性嵌合毒素，特別是涉及由表皮生長因子(EGF)與PE40融合而成的融合毒素，其中作為導(dǎo)向部分的EGF分子是以其缺失了C末端3個氨基酸殘基的兩分子串聯(lián)形式連接到毒素部分上的。所說的導(dǎo)向部分與表面上帶有EGF受體(EGFR)的靶細(xì)胞結(jié)合，并且促使融合分子內(nèi)化到這些靶細(xì)胞中之后，融合分子的毒素部分即可有效地殺傷這些靶細(xì)胞腫瘤。
表皮生長因子(EGF)是由53個氨基酸組成的單鏈多肽。該因子廣泛存在于人和哺乳動物的體液、汗腺細(xì)胞及血小板中，并具有介導(dǎo)上皮細(xì)胞生長、促進(jìn)血管生成，以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的功能。在許多腫瘤，特別是鱗狀上皮癌及某些腺癌，如喉癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌及乳腺癌發(fā)生時，均表現(xiàn)有細(xì)胞表面EGF受體的過度表達(dá)(如參見Arteaga，CL．et al．，Cancer Res．54(17)4703-4709，1994)。有人發(fā)現(xiàn)鱗狀上皮癌的復(fù)發(fā)及鱗癌病人的存活期與細(xì)胞EGF受體的表達(dá)水平密切相關(guān)(如參見Scambia，G．et al．，Cancer 671347-1351，1991；Yang，D．et al．，Clin．Cancer Res．4993，1998)。另外還有人發(fā)現(xiàn)，鱗狀細(xì)胞癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)的mRNA水平較正常粘膜上皮細(xì)胞約高69倍。并且證明了抑制EGFR基因的表達(dá)可阻止頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖(Rubin，GA，et al．，Oncogene 15(4)409-416，1997)。早在八十年代末便有人使用EGF多肽作為導(dǎo)向分子，用于構(gòu)建具有腫瘤細(xì)胞靶特異性的細(xì)胞毒性劑。此后，許多研究者針對毒素部分對整體融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合活性和細(xì)胞毒活性進(jìn)行了許多深入研究。例如，Lee等人的研究表明，EGF與缺失Ia區(qū)的PE[PE(△Ia)，即PE40]結(jié)合所形成的融合分子EGF-PE40，較與天然PE66結(jié)合所形成的融合分子EGF-PE66具有更好的靶細(xì)胞特異性(Lee，CH，et al．，Protein Eng．6(4)433-440，1993)。
然而，考慮到EGF分子的結(jié)構(gòu)特征，EGF與PE分子融合后所導(dǎo)致的分子折疊和其對融合蛋白質(zhì)之三維結(jié)構(gòu)的影響，以及融合蛋白質(zhì)中作為導(dǎo)向部分的EGF與其細(xì)胞受體的結(jié)合幾率和穩(wěn)定性等因素，我們試圖在按照現(xiàn)有技術(shù)對融合蛋白質(zhì)的毒素部分進(jìn)行必要的修飾的同時，特別對導(dǎo)向部分即EGF分子進(jìn)行某些修飾。這些修飾包括刪除EGF分子羧基末端的3個氨基酸殘基、改變EGF與毒素分子特別是PE40分子間的連接方式。所說的改變導(dǎo)向部分與毒素部分間的連接方式則包括分別構(gòu)建EGF50-EGF50-PE66、EGF50-EGF50-PE40、EGF50-PE40-EGF50及EGF50-PE40等四種不同結(jié)構(gòu)形式的融合蛋白質(zhì)，并使用MTT細(xì)胞增殖檢測法(參見Mosman，T．，J．Immunol．Methods 6555-64，1983)比較了它們的靶細(xì)胞毒活性；使用膜受體結(jié)合置換試驗法(參見Riemen et al．，Peptide 8877-885，1987)比較了它們的特異性受體結(jié)合活性。這里使用的縮寫符號EGF50是指缺失C末端3個氨基酸殘基的表皮生長因子多肽。
我們的實驗研究發(fā)現(xiàn)，以兩分子頭-尾串聯(lián)方式連接的EGF50作為導(dǎo)向部分，所制得的融合蛋白質(zhì)具有更好的受體結(jié)合活性和細(xì)胞毒活性。
可使用天然PE分子(分子量為66KD)，作為靶特異性細(xì)胞毒性融合蛋白質(zhì)的毒素部分，以減少嵌合毒素的非特異性細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而改善毒素對攜帶EGFR的細(xì)胞的靶特異性毒性。另外，也可使用如美國專利5，621，078中所述的第265、287位半胱氨酸，或第265、287、372及379位半胱氨酸分別被丙氨酸取代的PE分子，或者如國際專利申請PCT／IL96／00151中所述的第57、546、247和249位上的一或幾個氨基酸被谷氨酸取代的PE分子。
根據(jù)本發(fā)明，可以使作為導(dǎo)向因子的EGF直接或間接連接到毒素分子上。如果兩個部分是間接連接的，最好在兩個部分之間插入一個大約10～30個氨基酸的“接頭序列”或間隔臂。所說的接頭序列較好是由5～10個主鏈不超過4個碳原子并且不帶苯環(huán)側(cè)鏈的中性氨基酸(如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸)的2～3次重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)序列。但考慮到如上文所述的受體結(jié)合效率和結(jié)合穩(wěn)定性，以及融合蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)對受體結(jié)合和毒素分子內(nèi)化的影響因素，最好使用頭-尾串聯(lián)的兩分子EGF作為導(dǎo)向部分。在這種情況下，其中一個EGF分子將作為導(dǎo)向分子與細(xì)胞膜表面上的受體結(jié)合，而另一個分子則起到連接毒素分子的“間隔臂”的作用。
可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因融合技術(shù)或化學(xué)合成與偶聯(lián)技術(shù)制備本發(fā)明的嵌合毒素蛋白質(zhì)，但最好是使用基因融合技術(shù)。為此，例如可按照已知的DNA操作技術(shù)(如參見Sambrook et al．，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)克隆并擴(kuò)增編碼EGF50和編碼兩分子串聯(lián)之EGF50(EGF50×2)的核苷酸序列。然后將擴(kuò)增的2×EGF50基因按正確方向連接到已經(jīng)過或未經(jīng)修飾的PE40分子的5’末端，并將所得嵌合基因插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體系統(tǒng)中?；蛘?，亦可從攜帶PE40基因的起始質(zhì)粒(如pVC8)中切出所需的PE40基因，并將其連接到適當(dāng)?shù)闹虚g載體如pET17b中，然后將攜帶PE40基因的載體與PCR擴(kuò)增得到的EGF50或2×EGF50基因連接，環(huán)化后即得到攜帶EGF50-PE40或EGF2×50-PE40融合基因的重組表達(dá)載體。用如此得到表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，然后在適當(dāng)條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以產(chǎn)生所需的融合蛋白質(zhì)?？墒褂秒x子交換層析、大小排阻層析、疏水作用層析以及鹽析、超濾等方法從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中分離并純化蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物。產(chǎn)物的分離與純化步驟中，可使用SDS-PAGE法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或Western印跡法監(jiān)測純化產(chǎn)物的存在及其分子大小。
可使用文獻(xiàn)中已描述的各種檢測方法鑒定本發(fā)明的2×EGF50-PE40及EGF50-PE40融合蛋白質(zhì)的性質(zhì)。這些方法包括(1)ADP核糖基化試驗，該方法是根據(jù)EGF2×50-PE40或EGF50-PE40催化延伸因子2的ADP核糖基化的能力檢測其對哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制；(2)受體結(jié)合試驗，該方法根據(jù)2×EGF50-PE40或EGF50-PE40競爭性置換與A431細(xì)胞漿膜結(jié)合之125I-EGF的能力檢測其特異性受體的結(jié)合活性；(3)MTT細(xì)胞存活率試驗，該方法是根據(jù)活細(xì)胞將MTT轉(zhuǎn)化成蘭紫色甲瓚結(jié)晶體的能力檢測腫瘤細(xì)胞與2×EGF50-PE40或EGF50-PE40接觸后的存活性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有至少一種上述嵌合毒素和一種醫(yī)藥上可接受的惰性載體的藥物組合物?？砂凑罩扑幑I(yè)領(lǐng)域已知的基本原則制備適于胃腸道外途徑給藥的本發(fā)明的藥物組合物(例如參見Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed．，Mack Publishing Company，1980)?？赏ㄟ^各種給藥途徑，特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)及其他空腔器官內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物。
可使用本發(fā)明的嵌合毒素蛋白質(zhì)或含有該嵌合毒素蛋白質(zhì)的藥物組合物作治療藥物，用于治療由可依靠該蛋白質(zhì)的毒性作用緩解或消除的特定人體細(xì)胞引發(fā)的各種疾病。一種優(yōu)選的用途是用于治療其細(xì)胞表面上過量表達(dá)EGFR之細(xì)胞的惡性增生性疾病，如各種組織來源的鱗狀細(xì)胞癌。本發(fā)明的嵌合毒素或含該嵌合毒素的藥物組合物的治療有效劑量一般將根據(jù)疾病的性質(zhì)、嚴(yán)重程度、病人的一般狀況和對藥物的敏感性，以及給藥途徑等因素由臨床醫(yī)生確定。
下列實施例旨在進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利要求的限制。
實施例12×EGF50-PE40嵌合毒素的制備A．分別用攜帶PE40基因的質(zhì)粒載體pVC8(Chaudhary et al．，PNAS USA 844538-4542，1987)和pET-17b(Novagen)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101。將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪涂于含氨芐青霉素(50μg／ml)的普通培養(yǎng)基上37℃保溫過夜。選擇氨芐青霉素抗性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，并用XbaI+EcoRI分別消化質(zhì)粒pVC8和pET-17b。用低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離得到PE40核苷酸編碼序列(1098bp)和較大的pET-17b載體DNA片段(3174bp)。然后在T4 DNA連接酶(Promega)存在下連接兩片段，并用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。挑取單菌落，并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，快速提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定，然后對酶切鑒定為陽性的中間質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析。將所得到的連接正確的中間質(zhì)粒定名為pET17b-PE40。
B．使用DNA合成儀(Applied Biosystems Inc．)合成寡核苷酸引物15’-CGCATATGAACTCCGACTCCGAATGTC-3’(SEQ ID NO1)和引物25’-GCCATATGCCACCACTTCAAGTCTCT-3’(SEQ ID NO2)及引物35’-GACTTGAAGTGGTGGAACTCCGACTCCGAA-3’(SEQ ID NO3)。在5％甲酰胺和各50pmol引物1及2存在下，使用5ng pVC8／EGF作為模板，并使用熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus Instruments)及提供的其他試劑進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)95℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃聚合1分鐘，30次循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。在1．5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上回收長度約160bp的擴(kuò)增產(chǎn)物EGF50。將5μg純化的EGF50片段加入含100pmol引物3的擴(kuò)增反應(yīng)體系中，進(jìn)行片段串聯(lián)連接反應(yīng)95℃變性1分鐘，63℃退火延伸5分鐘，5次循環(huán)后，分別加入50pmol的引物1和引物2，依前述條件擴(kuò)增并回收長約320bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，即EGF50×2。
C．用NdeI分別酶切擴(kuò)增的2×EGF50或EGF50片段，以及中間載體pET17b-PE40，并將NdeI酶切的EGF片段插入到用同樣核酸內(nèi)切酶切割的pET17b-PE40中。然后用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101。
在5％CO2環(huán)境下，37℃培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。培養(yǎng)后收集Ampr菌落并使用上述寡核苷酸引物，按上文B中所述的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR鑒定。從PCR鑒定陽性的菌落中提取質(zhì)粒DNA，再次用PCR方法和酶切方法鑒定重組體中EGF或2×EGF的存在和其連接方向。選擇連接方向正確的重組質(zhì)粒，分別定名為pETEGF50-PE40和pETEGF50×2-PE40。使用T7測序試劑盒(Pharmacia)進(jìn)行DNA序列測定，EGF核苷酸編碼序列和PE40基因的嵌合DNA序列如SEQ IDNO4所示。兩分子串聯(lián)的EGF核苷酸編碼序列和PE40基因的嵌合DNA序列如SEQ ID NO5所示。并根據(jù)SEQ ID NO5的DNA序列推導(dǎo)出EGF50×2-PE40的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
D．用如上制備的重組表達(dá)載體pET-EGF50×2-PE40轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(λDE3)，并在含有氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600值約為0．6～0．8時加入IPTG至0．4mM以誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)3小時后離心收集細(xì)胞并懸浮于TE緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA)中，超聲破碎細(xì)胞并按Chaudhary等人(文獻(xiàn)出處同上)所述的方法制備周質(zhì)部分。收集所制得的細(xì)胞周質(zhì)部分，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測和Western印跡分析。在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離并染色后可見一條清晰的相當(dāng)于52KD的泳帶。Western印跡試驗結(jié)果可見與兔抗PE40抗血清和抗EGF抗血清特異性反應(yīng)的條帶，從而初步證實細(xì)胞周質(zhì)中2×EGF50-PE40嵌合毒素的存在及其分子大小。
依次使用連接到FPLC系統(tǒng)上的Mono Q(HR5／5)陰離子交換柱和SephacrylS-200柱(Pharmacia)純化2×EGF50(或EGF)-PE40。純化中使用0．2-0．3M的NaCl洗脫融合蛋白質(zhì)，并根據(jù)ADP核糖基化活性和細(xì)胞毒活性檢測和收集嵌合毒素的活性峰值部分。SDS-PAGE檢測表明，毒素的純度約為97％。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，用福林酚試劑測定蛋白質(zhì)濃度約為3mg／ml。對SDS-PAGE凝膠進(jìn)行薄層掃描，表明融合蛋白質(zhì)約占菌體總蛋白質(zhì)的35％。
實施例22×EGF50-PE40嵌合毒素的生物學(xué)活性分析細(xì)胞毒活性檢測-MTT細(xì)胞增殖試驗將人喉癌Hep-2細(xì)胞(維持在添加有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、50u／ml青霉素和50μg／ml鏈霉素的Eagle氏極限基本培養(yǎng)基(MEM)中，按2×104個細(xì)胞／孔的細(xì)胞密度加至40孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔內(nèi)。37℃保溫1小時后，在所有各孔內(nèi)加入溶于PBS溶液(5mg／ml)，并過濾除菌的MTT(3-(4，5-二甲苯-2-噻唑)2，5-二苯基溴化四唑(Sigma)，并加入2×EGF50-PE40或EGF50-PE40，然后將培養(yǎng)板37℃保溫4小時。保溫后向各孔內(nèi)加入100μl含10％SDS的10mMHCl溶液，并徹底混合均勻，待所有暗蘭色結(jié)晶溶解后(約12小時)，檢測570nm波長處吸光率(OD570)。試驗中以單純MEM培養(yǎng)基作為空白對照，并將其OD570設(shè)定為0。
圖2中顯示不同濃度(0．1-1000ng／ml)2×EGF50-PE40(●)和EGF50-PE40(△)對Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性。根據(jù)活細(xì)胞內(nèi)的隱酶(琥珀酸脫氫酶)將其攝入的MTT轉(zhuǎn)化成為蘭紫色結(jié)晶體甲瓚的能力，檢測嵌合毒素蛋白質(zhì)的細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果可見，以兩分子串聯(lián)的EGF50作為導(dǎo)向部分的嵌合毒素(2×EGF50-PE40)對Hep-2細(xì)胞的EC50值約為50pM，而作為陽性對照的EGF-PE40的EC50值則為大約80pM。而且，隨著毒素濃度的增加，前者的細(xì)胞毒活性仍有緩慢增加，而后者則基本上達(dá)到細(xì)胞毒活性平臺。
在另一項MTT細(xì)胞增殖試驗中，我們使用A431腫瘤細(xì)胞和正常哺乳動物CHO細(xì)胞進(jìn)一步比較了兩種不同結(jié)構(gòu)形式的融合蛋白質(zhì)對這些靶細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果顯示兩種形式的毒素蛋白均對表皮樣腫瘤A431細(xì)胞有明顯地殺傷活性，而對正常CHO細(xì)胞則基本上沒有可檢測的細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未示出)。EGF受體結(jié)合試驗簡單地說，為了檢測EGF肽與細(xì)胞膜表面EGF受體的結(jié)合，首先將A431細(xì)胞(約106個)懸浮于冰冷的檢測緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7．6，lmM DTT，0．1％牛血清白蛋白，1mM EDTA)中制備細(xì)胞勻漿，以2500×g4℃離心15分鐘后收集上清，并再次以22，000×g離心30分鐘(4℃)，然后收集細(xì)胞漿膜沉淀物并懸浮于上述緩沖液中4℃保存。
在有或沒有未標(biāo)記的EGF50或2×EGF50-PE40和EGF50-PE40存在下，將含有50μg漿膜蛋白質(zhì)的等分樣品(終體積100μl)與5mg放射性碘標(biāo)記的EGF(125I-EGF，New England Nuclear)4℃保溫2小時。保溫后用上述檢測緩沖液通過Whatman濾膜徹底洗樣品，并用λ計數(shù)器檢測漿膜結(jié)合的配體。在0．1mM未標(biāo)記的EGF存在下確定非特異性結(jié)合。實驗結(jié)果如圖3所示。
圖3顯示部分純化(Mono Q離子交換層析后)的2×EGF50-PE40(○)或EGF50-PE40(△)對A431細(xì)胞膜結(jié)合的125I-EGF的置換作用。其中B代表在競爭物2×EGF-PE40或EGF以所指出的濃度存在下，與漿膜結(jié)合的125I-EGF的量(cpm)；Bo代表沒有競爭物存在時與細(xì)胞漿膜結(jié)合的125I-EGF的量(cpm)。
從圖3所示的數(shù)據(jù)可以看出，向膜表面上帶有EGF受體的腫瘤細(xì)胞配體-受體反應(yīng)體系中加入漸增濃度的本發(fā)明部分純化的2×EGF-PE40嵌合毒素后，隨著嵌合毒素濃度的增加而逐漸取代細(xì)胞膜結(jié)合的125I-EGF。而且，與以單分子EGF連接的毒素分子相比，本發(fā)明的以兩分子串聯(lián)的EGF(2×EGF)表現(xiàn)有更好受體結(jié)合能力。
序列表(1)一般信息(Ⅰ)申請人中國人民解放軍農(nóng)牧大學(xué)(Ⅱ)發(fā)明名稱包括修飾的導(dǎo)向部分的嵌合毒素(Ⅲ)序列數(shù)6(Ⅰ)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID No1CGCATATGAA CTCCGACTCC GAATGTC(2)SEQ ID No2的信息(Ⅰ)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO2GCCATATGCC ACCACTTCAA GTCTCT(2)SEQ ID No3的信息(Ⅰ)序列特征(E)長度30堿基對(F)類型核酸(G)鏈型單鏈(H)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO3
GACTTGAAGT GGTGGAACTC CGACTCCGAA(2)SEQ ID NO4的信息(Ⅰ)序列特征(A)長度1254堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO4ATGAACTCCG ACTCCGAATG TCCATTGTCC CACGACGGTT ACTGTTTGCA CGACGGTGTTTGTATGTACA TCGAAGCTTT GGACAAGTAC GCCTGTAACT GTGTTGTTGG TTACATCGGTGAAAGATGTC AATACAGAGA CTTGAAGTGG TGGCATATGG CCGAAGAGGG CGGCAGCCTGGCCGCGCTGA CCGCGCACCA GGCTTGCCAC CTGCCGCTGG AGACTTTCAC CCGTCATCGCCAGCCGCGCG GCTGGGAACA ACTGGAGCAG TGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCCCTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAAC CAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTGGCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGC GAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCCCGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAG AGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGCAACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGCCGAC GTGGTGAGCC TGACCTGCCC GGTCGCCGCCGGTGAATGCG CGGGCCCGGC GGACAGCGGC GACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACTGGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGAC GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAACTGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC CGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTCGTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCG GCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGCGCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGG CGCGGTTTCT ATATCGCCGG CGATCCGGCGCTGGCCTACG GCTACGCCCA GGACCAGGAA CCCGACGCAC GCGGCCGGAT CCGCAACGGTGCCCTGCTGC GGGTCTATGT GCCGCGCTCG AGCCTGCCGG GCTTCTACCG CACCAGCCTGACCCTGGCCG CGCCGGAGGC GGCGGGCGAG GTCGAACGGC TGATCGGCCA TCCGCTGCCGCTGCGCCTGG ACGCCATCAC CGGCCCCGAG GAGGAAGGCG GGCGCCTGGA GACCATTCTCGGCTGGCCGC TGGCCGAGCG CACCGTGGTG ATTCCCTCGG CGATCCCCAC CGACCCGCGCAACGTCGGCG GCGACCTCGA CCCGTCCAGC ATCCCCGACA AGGAACAGGC GATCAGCGCCCTGCCGGACT ACGCCAGCCA GCCCGGCAAA CCGCCGCGCG AGGACCTGAA GTAA(2)SEQ ID NO5的信息(Ⅰ)序列特征(A)長度1404堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO5ATGAACTCCG ACTCCGAATG TCCATTGTCC CACGACGGTT ACTGTTTGCA CGACGGTGTTTGTATGTACA TCGAAGCTTT GGACAAGTAC GCCTGTAACT GTGTTGTTGG TTACATCGGTGAAAGATGTC AATACAGAGA CTTGAAGTGG TGGAACTCCG ACTCCGAATG TCCATTGTCCCACGACGGTT ACTGTTTGCA CGACGGTGTT TGTATGTACA TCGAAGCTTT GGACAAGTACGCCTGTAACT GTGTTGTTGG TTACATCGGT GAAAGATGTC AATACAGAGA CTTGAAGTGGTGGCATATGG CCGAAGAGGG CGGCAGCCTG GCCGCGCTGA CCGCGCACCA GGCTTGCCACCTGCCGCTGG AGACTTTCAC CCGTCATCGC CAGCCGCGCG GCTGGGAACA ACTGGAGCAGTGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCC CTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAACCAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTG GCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGCGAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCC CGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAGAGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGC AACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGCCGACGTGGTGAGCC TGACCTGCCC GGTCGCCGCC GGTGAATGCG CGGGCCCGGC GGACAGCGGCGACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACT GGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGACGTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAAC TGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCACCGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTC GTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCGGCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGC GCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGGCGCGGTTTCT ATATCGCCGG CGATCCGGCG CTGGCCTACG GCTACGCCCA GGACCAGGAACCCGACGCAC GCGGCCGGAT CCGCAACGGT GCCCTGCTGC GGGTCTATGT GCCGCGCTCGAGCCTGCCGG GCTTCTACCG CACCAGCCTG ACCCTGGCCG CGCCGGAGGC GGCGGGCGAGGTCGAACGGC TGATCGGCCA TCCGCTGCCG CTGCGCCTGG ACGCCATCAC CGGCCCCGAGGAGGAAGGCG GGCGCCTGGA GACCATTCTC GGCTGGCCGC TGGCCGAGCG CACCGTGGTGATTCCCTCGG CGATCCCCAC CGACCCGCGC AACGTCGGCG GCGACCTCGA CCCGTCCAGCATCCCCGACA AGGAACAGGC GATCAGCGCC CTGCCGGACT ACGCCAGCCA GCCCGGCAAACCGCCGCGCG AGGACCTGAA GTAA(2)SEQ ID NO6的信息(Ⅰ)序列特征(A)長度468氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(Ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO6Met-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Asp-Gly-Val-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys-Asn-Cys-Val-Val-Gly-Tyr-Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Arg-Asp-Leu-Lys-Trp-Trp-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Asp-Gly-Val-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys-Asn-Cys-Val-Val-Gly-Tyr-Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Arg-Asp-Leu-Lys-Trp-Trp-His-Met-Ala-Giu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Gly-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asp-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Len-Len-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Len-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Gln-Gln-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Len-Gln-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Gln-Asp-Leu-Asp-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Len-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Gln-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asp-Gly-Ala-Len-Len-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Len-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Len-Thr-Len-Ala-Ala-Pro-Gln-Ala-Ala-Gly-Gln-Val-Gln-Arg-Len-Ile-Gly-His-Pro-Len-Pro-Len-Arg-Len-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Gln-Gln-Gly-Gly-Arg-Len-Gln-Thr-Ile-Len-Gly-Trp-Pro-Len-Ala-Gln-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Len-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Gln-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Len-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Arg-Gln-Asp-Len-Lys-end
權(quán)利要求
1．包括連接到截短的假單胞菌外毒素A蛋白質(zhì)上的EGF序列的嵌合毒素，特征在于其中作為嵌合分子導(dǎo)向部分的EGF是以兩分子串聯(lián)方式連接到截短的毒素分子上的。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合毒素，其中所說的以兩分子串聯(lián)連接的EGF是缺失了C末端3個氨基酸殘基的EGF50。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的嵌合毒素，其中所說的截短的假單胞菌毒素A是缺失了毒素分子中Ia區(qū)的PE40。
4．含有根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的2×EGF50-PE40嵌合毒素及一種或幾種醫(yī)藥上可接受的載體的藥物組合物。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物在治療惡性增生性疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾而提高了受體結(jié)合活性的靶特異性嵌合毒素,特別是包括與假單胞菌外毒素PE40連接之表皮生長因子序列的嵌合毒素,其特征在于其中作為導(dǎo)向部分的EGF是兩分子串聯(lián)的截短形式的EGF50。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所說的嵌合毒素的制備及其在治療惡性增生性疾病,特別是鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/104GK1293202SQ9912190
公開日2001年5月2日 申請日期1999年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月13日
發(fā)明者朱平, 張國利 申請人:中國人民解放軍農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所