專利名稱：生產(chǎn)蛋白質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括將含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因，將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入該哺乳動物細胞的染色體中以獲得能夠表達目的蛋白質的哺乳動物細胞；和懸浮培養(yǎng)該哺乳動物細胞；和能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞。
背景技術：
利用重組DNA技術生產(chǎn)外源蛋白質被用于各種產(chǎn)業(yè)，如制藥業(yè)和食品業(yè)。在多數(shù)情況下，通過以下方法進行重組蛋白質的生產(chǎn)將含有編碼目的蛋白質的核苷酸序列的表達載體導入宿主，如大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母、昆蟲細胞、植物細胞、和動物細胞，選擇表達載體被整合入染色體的轉化體，并進一步在適當培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述細胞株。然而，為有效開發(fā)能夠生產(chǎn)外源蛋白質的宿主，必需選擇對每種目標蛋白質具有良好生產(chǎn)性的宿主細胞，因此在個體宿主的外源蛋白質生產(chǎn)技術方面要求進一步的技術創(chuàng)新。與動物細胞不同，在細菌系統(tǒng)、如大腸桿菌、和酵母系統(tǒng)中，很多情況下難以實現(xiàn)翻譯后修飾，如糖鏈修飾，并因此在生產(chǎn)具有活性的蛋白質方面產(chǎn)生了問題。由于在昆蟲系統(tǒng)中所生產(chǎn)的蛋白質受到翻譯后修飾，如磷酸化和加入糖鏈，該系統(tǒng)具有可以表達有原始生理活性的蛋白質的優(yōu)點。但是，由于分泌蛋白的糖鏈結構與哺乳動物源細胞的不同，當將該蛋白質應用于制藥用途時，抗原性等成為問題。此外，由于導入外源基因時在昆蟲細胞系統(tǒng)中使用重組病毒，存在從安全角度出發(fā)要求病毒滅活和隔離的問題。在動物細胞系統(tǒng)中，對于源自高等動物包括人類的蛋白質，可以用與活體內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質更相似的方式進行翻譯后修飾，如磷酸化、加入糖鏈、和折疊。這樣的精確翻譯后修飾對于蛋白質在其重組蛋白質中再現(xiàn)其所具有的原始生理活性是必需的，并且用哺乳動物細胞作為宿主的蛋白質生產(chǎn)系統(tǒng)通常應用于要求這樣的生理活性的藥品等。但是用哺乳動物細胞作為宿主的蛋白質表達系統(tǒng)通常生產(chǎn)性低，且在很多情況下導致導入的基因的穩(wěn)定性問題。改進用哺乳動物培養(yǎng)細胞作為宿主的蛋白質生產(chǎn)性不僅在生產(chǎn)治療藥物、診斷劑等中很重要，而且極大地促進了它們的研究和開發(fā)。因此，迫切需要開發(fā)一種基因表達系統(tǒng)，其易于使利用哺乳動物培養(yǎng)細胞、特別是中華倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)作為宿主獲得高生產(chǎn)性細胞株成為可能。轉座子是可以從染色體上的一個基因座轉移到其它基因座的可轉座基因元件。轉座子是用于分子生物和遺傳學研究的有力工具，并在昆蟲或線蟲(例如，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)或秀_隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans))和植物中用于諸如誘變、基因捕獲和制備轉基因個體的目的。但是，對于脊椎動物包括哺乳動物細胞，這樣的技術的開發(fā)已延遲。
然而，近年已報道了在脊椎動物中具有活性的轉座子，并且其中一些已顯示出在哺乳動物細胞、如源自小鼠和人類的細胞中具有活性。典型實例包括從青鏘(鏘魚)克隆的轉座子Toll (專利文獻I)和Tol2 (非專利文獻I)、從存在于鮭(Onchorhynchus)魚科基因組中的非自主轉座子再構建的Sleeping Beauty (非專利文獻2)、源自娃的人工轉座子Frog prince (非專利文獻3)和源自昆蟲的轉座子piggyBac (非專利文獻4)。這些DNA轉座子已經(jīng)作為基因轉移工具用于誘變、基因捕獲、轉基因個體的制備、抗藥蛋白質的表達等，以向哺乳動物細胞的基因組中引入新的表現(xiàn)型(非專利文獻5至12)。在昆蟲的情況下,研究了用源自鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲的轉座子piggyBac向蠶染色體中導入外源基因以表達由所述外源基因編碼的蛋白質的方法，并已公開了運用上述技術的蛋白質生產(chǎn)方法(專利文獻2)。但是，由于所表達的目的蛋白質的表達水平不充足并且在蠶的整個身體中產(chǎn)生，
導致了經(jīng)濟問題，因為需要先進的純化技術從含有大量污染蛋白質的體液中以高純度形式回收所表達的外源蛋白質。此外，用源自青鏘的轉座子Tol2在哺乳動物細胞中表達與G418抗性有關的蛋白質的實例是已知的(非專利文獻12)。引用列表專利文獻專利文獻1W02008/072540專利文獻2日本國特表2001-532188號公報非專利文獻非專利文獻INature 383,30(1996)非專利文獻2Cell 91,501-510(1997)非專利文獻3Nucleic Acids Res，31，6873-6881 (2003)非專利文獻4Insect Mol. Biol. 5，141-151 (1996)非專利文獻5Genetics. 166，895-899 (2004)非專利文獻6 PLoS Genet，2，el69 (2006)非專利文獻7 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，10769-10773 (1998)非專利文獻8 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :6759-6764 (2001)非專利文獻9 Nature 436，221-226 (2005)非專利文獻10 Nucleic Acids Res，31，6873-6881 (2003)非專利文獻11 Nucleic Acids Res. 35，e87 (2007)非專利文獻12 Proc Natl Acad Sci USA，103，15008-15013 (2006)
發(fā)明概要技術問題為了生產(chǎn)和分析目的蛋白質，需要用哺乳動物源培養(yǎng)細胞挑選穩(wěn)定并高水平表達目的蛋白質的細胞株，但制備和培養(yǎng)生產(chǎn)目的蛋白質的細胞要求相當多的勞動和時間。此外，雖然已經(jīng)了解目的蛋白質是利用轉座子序列在哺乳動物細胞中表達的，但是不了解用轉座子序列制備可以高水平表達目的蛋白質并因此可以用作蛋白質生產(chǎn)系統(tǒng)的細胞；用轉座子序列制備可以高水平生產(chǎn)目的蛋白質的哺乳動物細胞的方法；和用該細胞生產(chǎn)蛋白質的方法。如上所述，需要通過建立可以利用哺乳動物培養(yǎng)細胞有效并在短時間內(nèi)高水平生產(chǎn)目的蛋白質的蛋白質生產(chǎn)系統(tǒng)，來大量表達目的蛋白質。因此，本發(fā)明的目的是提供可以有效建立的能夠高水平表達目的蛋白質的細胞，和利用該細胞生產(chǎn)目的蛋白質的方法。問題的解決方案為解決上述問題，本發(fā)明人已經(jīng)進行了深入研究并由此發(fā)現(xiàn)可以通過以下方法有效制備能夠高水平表達目的蛋白質的哺乳動物細胞將含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；和將插入在一對(兩個)轉座子序列之間的基因片段整合入哺乳動物細胞的染色體。此外，發(fā)現(xiàn)可以用該細胞有效生產(chǎn)目的蛋白質，并從而完
成了本發(fā)明。發(fā)明詳述具體地，本發(fā)明如下I.生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括將含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入該哺乳動物細胞的染色體以獲得能夠表達目的蛋白質的哺乳動物細胞；和懸浮培養(yǎng)該哺乳動物細胞。2.生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括下列步驟(A)至(C)(A)將下列表達載體(a)和(b)同時導入懸浮性哺乳動物細胞的步驟(a)含有包含編碼目的蛋白質的DNA的基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的表達載體，(b)含有編碼轉座酶的DNA的表達載體，其中所述轉座酶識別轉座子序列并具有將插入在一對轉座子序列之間的基因片段轉移入染色體中的活性，(B)從步驟(A)中所導入的表達載體瞬間表達轉座酶、以將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入哺乳動物細胞的染色體而獲得能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞的步驟，和(C)懸浮培養(yǎng)步驟(B)中獲得的能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞以生廣目的蛋白質的步驟；3.獲得能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞的方法，其包括將含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；和將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入該哺乳動物細胞的染色體；4.上述第I至3項中任一項所述的方法，其中懸浮性哺乳動物細胞是能夠在無血清培養(yǎng)基中存活和增殖的細胞；5.上述第I至4項中任一項所述的方法，其中懸浮性哺乳動物細胞是選自懸浮性CHO細胞、PER. C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 (或也稱為YB2/0)和適應于懸浮培養(yǎng)的懸浮性小鼠骨髓瘤細胞NSO的至少一種細胞，其中所述懸浮性CHO細胞中的CHO細胞適應于懸浮培養(yǎng)；6.上述第5項中所述的方法，其中CHO細胞是選自CH0-K1、CHO-KISV, DUKXBIUCH0/DG44、Pro-3和CHO-S的至少一種細胞；7.上述第I至6項中任一項所述的方法，其中選擇性標記基因是環(huán)己酰亞胺抗性基因;8.上述第7項所述的方法，其中環(huán)己酰亞胺抗性基因是編碼人核糖體蛋白質L36a的突變體的基因；9.上述第8項所述的方法，其中突變體是人核糖體蛋白質L36a的第54位脯氨酸被其它氨基酸取代的突變體；10.上述第9項所述的方法，其中其它氨基酸是谷氨酰胺；11.上述第I至10項中任一項所述的方法，其中一對轉座子序列是源自在哺乳動物細胞中發(fā)揮功能的一對DNA型轉座子的核苷酸序列；12.上述第11項所述的方法，其中源自一對DNA型轉座子的核苷酸序列是源自一對Toll轉座子的核苷酸序列或源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列；13.上述第12項所述的方法，其中源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列是含有SEQID NO :2所示核苷酸序列和SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的核苷酸序列；14.上述第12項所述的方法，其中源自一對Toll轉座子的核苷酸序列是SEQ IDNO 14所示核苷酸序列和SEQ ID NO 15所示核苷酸序列；15.能夠生產(chǎn)目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞，其中導入含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體，以將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入染色體，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；16.能夠生產(chǎn)目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞，其中同時導入含有基因片段及位于該基因片段兩端的轉座子序列的表達載體(a)和含有編碼轉座酶(轉移酶)的DNA的表達載體(b)，以將插入在一對轉座序列之間的基因片段整合入染色體，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因，而所述轉座酶識別轉座子序列并具有將插入在一對轉座子序列之間的基因片段轉移入染色體的活性；17.上述第15或16項所述的細胞，其中細胞是能夠在無血清培養(yǎng)基中存活和增殖的細胞；18.上述第15至17項中任一項所述的細胞，其中細胞是選自懸浮性CHO 細胞、PER. C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 (或也稱為YB2/0)和適應于懸浮培養(yǎng)的懸浮性小鼠骨髓瘤細胞NSO的至少一種懸浮性哺乳動物細胞，其中所述懸浮性CHO細胞中的CHO細胞適應于懸浮培養(yǎng)；19.上述第18項所述的細胞，其中CHO細胞是選自CH0-K1、CHO-KISV, DUKXBIUCH0/DG44、Pro-3和CHO-S的至少一種細胞；20.上述第15至19項中任一項所述的細胞，其中選擇性標記基因是環(huán)己酰亞胺抗性基因；21.上述第20項所述的細胞，其中環(huán)己酰亞胺抗性基因是編碼人核糖體蛋白質L36a的突變體的基因；22.上述第21項所述的細胞，其中突變體是人核糖體蛋白質L36a的第54位脯氨酸被其它氨基酸取代的突變體；23.上述第22項所述的細胞，其中其它氨基酸是谷氨酰胺；24.上述第15至23項中任一項所述的細胞，其中一對轉座子序列是源自在哺乳動物細胞中發(fā)揮功能的一對DNA型轉座子的核苷酸序列；25.上述第24項所述的細胞，其中源自一對DNA型轉座子的核苷酸序列是源自一對Toll轉座子的核苷酸序列或源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列；26.上述第25項所述的細胞，其中源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列是SEQ IDNO 2所示核苷酸序列和SEQ ID NO 3所示核苷酸序列；27.上述第25項所述的細胞，其中源自一對Toll轉座子的核苷酸序列是SEQ IDNO 14所示核苷酸序列和SEQ ID NO 15所示核苷酸序列；28.蛋白質表達載體，其含有基因片段和位于該基因片段兩端的一對轉座子序列，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；29.上述第28項所述的蛋白質表達載體,其中一對轉座子序列是源自一對Toll轉座子的核苷酸序列或源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列；30.上述第29項所述的蛋白質表達載體，其中源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所示核苷酸序列和SEQ ID NO :3所示核苷酸序列；31.上述第29項所述的蛋白質表達載體，其中源自一對Toll轉座子的核苷酸序列是SEQ ID NO : 14所示核苷酸序列和SEQ ID NO : 15所示核苷酸序列。發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明的蛋白質生產(chǎn)方法，可以利用哺乳動物細胞有效生產(chǎn)目標蛋白質。此夕卜，本發(fā)明的細胞可以作為蛋白質生產(chǎn)細胞用于高效生產(chǎn)重組蛋白質。


圖I顯示用于表達抗人流感M2抗體的轉座子載體的示意圖。Tol2_L表示Tol2轉座子的左端(SEQ ID NO :2)，Tol2-R表示Tol2轉座子的右端(SEQ ID NO :3)，CMV表示CMV啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，He表示人類抗體H鏈cDNA, Lc表示人類抗體L鏈cDNA，和CHX-r表示環(huán)己酰亞胺抗性基因。圖2顯示抗人流感M2抗體表達載體的示意圖。CMV表示CMV啟動子,poly A表示多聚腺苷酸化位點，He表示人類抗體H鏈cDNA，Lc表示人類抗體L鏈cDNA和CHX_r表示環(huán)己酰亞胺抗性基因。圖3顯示Tol2轉座酶表達載體的示意圖。CAGGS表示CAGGS啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，和TPase cDNA表示Tol2轉座酶cDNA。圖4A顯示當使用表達抗人流感M2抗體的Tol2轉座子載體時，檢測懸浮性CH0-K1細胞中抗人流感M2抗體表達水平的結果?？v坐標表示抗體生產(chǎn)量O g/ml),和橫坐標表示懸浮性CH0-K1細胞的轉基因克隆數(shù)量。圖4B顯示當使用表達抗人流感M2抗體的Tol2轉座子載體時，檢測粘附性CH0-K1細胞中抗人流感M2抗體表達水平的結果。縱坐標表示抗體生產(chǎn)量O g/ml),和橫坐標表示粘附性CH0-K1細胞的轉基因克隆數(shù)量。圖5顯示表達抗人流感M2抗體的Toll轉座子載體的示意圖。Toll-L表示Toll轉座子的左端(SEQ ID NO 14), Toll-R表示Toll轉座子的右端(SEQ ID NO :15)，CMV表示CMV啟動子，poly A表示多聚腺苷酸化位點，He表示人類抗體H鏈cDNA, Lc表示人類抗體L鏈cDNA，和CHX-r表示環(huán)己酰亞胺抗性基因。圖6顯示Toll轉座酶表達載體的示意圖。CAGGS表示CAGGS啟動子，poIy A表示多聚腺苷酸化位點，和TPase cDNA表示Toll轉座酶cDNA。圖7顯示當使用表達抗人流感M2抗體的Toll轉座子載體時，檢測懸浮性CH0-K1細胞中抗人流感M2抗體表達水平的結果?？v坐標表示抗體生產(chǎn)量O g/ml),和橫坐標表示懸浮性CH0-K1細胞的轉基因克隆數(shù)量。
具體實施例方式本發(fā)明涉及生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括將含有基因片段和位于該基因片段兩
端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；將插入在一對(兩個)轉座子序列之間的基因片段整合入該哺乳動物細胞的染色體以獲得能夠表達目的蛋白質的哺乳動物細胞；和懸浮培養(yǎng)該哺乳動物細胞。本發(fā)明生產(chǎn)目的蛋白質的方法的實例包括包含下列步驟(A)至(C)的方法(A)將下列表達載體(a)和(b)同時導入懸浮性哺乳動物細胞的步驟(a)含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的表達載體，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA，(b)含有編碼轉座酶的DNA的表達載體，其中所述轉座酶識別轉座子序列并具有將插入在一對轉座子序列之間的基因片段轉移入染色體的活性，(B)從步驟(A)中所導入的表達載體瞬間表達轉座酶、以將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入該哺乳動物細胞的染色體而獲得能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞的步驟，和(C)懸浮培養(yǎng)步驟(B)中獲得的能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞以生廣目的蛋白質的步驟；此外，本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞，其中導入含有基因片段及位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體，以將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入染色體，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因。此外，本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞，所述細胞中同時導入含有基因片段和位于該基因片段兩端的轉座子序列的表達載體(a)以及含有編碼轉座酶(轉移酶)的DNA的表達載體(b)，以將插入一對轉座序列之間的基因片段整合入染色體，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因，而所述轉座酶識別轉座子序列并具有將插入在一對轉座子序列之間的基因片段轉移入染色體的活性。本說明書中的術語“轉座子”是可轉座的基因元件，是指在染色體上遷移或從一個染色體遷移到其它染色體(轉座)同時保持一定結構的基因單元。轉座子含有重復轉座子序列(也稱為反向重復序列(IR序列)或末端反向重復序列(TIR序列))的基因單元和編碼轉座酶的核苷酸序列，其中所述重復轉座子序列以相同方向或相反方向位于基因單元的兩端，其中所述轉座酶識別轉座子位點以將存在于轉座子序列之間的基因轉移。從轉座子翻譯的轉座酶可以通過識別轉座子兩端的轉座子序列、切掉插入在一對轉座子序列之間的DNA片段并將該片段插入待轉移的位點，從而轉移DNA。本說明書中的術語“轉座子序列”指被轉座酶識別的轉座子的核苷酸序列，其與IR序列或TIR序列的意思相同。含有該核苷酸序列的DNA可以含有不完全重復的部分，只要其可以通過轉座酶的活性被轉移(插入基因組中的其它位置)并含有對轉座酶特異的轉座子序列即可。如本發(fā)明所用的轉座子序列，優(yōu)選為源自DNA型轉座子的核苷酸序列，且更優(yōu)選為源自一對天然或人工DNA型轉座子的核苷酸序列，其可以被轉座酶識別并在哺乳動物細胞中轉座。源自DNA型轉座子的核苷酸序列的實例包括源自青鏘魚源Toll轉座子和Tol2轉
座子的核苷酸序列、從鮭魚科基因組中存在的非自主轉座子再構建的Sleeping Beauty、娃源人工轉座子Frog prince和昆蟲源轉座子PiggyBac。其中，特別優(yōu)選源自含有SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的青鏘魚源Tol2轉座子和含有SEQ ID NO :13所示核苷酸序列的青鏘魚源Toll轉座子的核苷酸序列。源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列的實例包括序列表SEQ IDNO 6所示Tol2轉座子核苷酸序列中第I至2299位核苷酸序列和第4148至4682位核苷酸序列。作為源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列，更優(yōu)選序列表SEQ IDNO :1所示Tol2轉座子核苷酸序列中第I至200位核苷酸序列(SEQ IDNO 2)(以下稱作“Tol2_L序列”)和第2285至2788位核苷酸序列(SEQID NO 3)(以下稱作“Tol2_R序列”)。源自一對Toll轉座子的核苷酸序列的實例包括含有序列表SEQID N0:13所示Toll轉座子核苷酸序列中第I至157位核苷酸序列和第1748至1855位核苷酸序列的核苷酸序列。作為源自一對Toll轉座子的核苷酸序列，更優(yōu)選序列表SEQ IDNO : 13所示Toll轉座子核苷酸序列中第I至200位核苷酸序列(SEQ瓜勵^幻丨以下稱作“^丨^序列”)和第1351至1855位核苷酸序列(SEQ ID NO 15)(以下稱作“Toll-R序列”)。本發(fā)明所用的轉座子序列的實例包括可以利用源自上述轉座子的轉座子序列的部分序列，通過調(diào)整該核苷酸序列的長度和通過由添加、缺失或取代修飾該核苷酸序列，從而控制其轉移反應。至于轉座子的轉移反應的控制，可以分別通過促進或抑制轉座酶對轉座子序列的識別而促進或抑制轉移反應。本說明書中的術語“轉座酶”指識別具有轉座子序列的核苷酸序列并將存在于核苷酸序列間的DNA轉移入染色體或從該染色體轉移到其它染色體的酶。轉座酶的實例包括源自青鏘魚的Toll和Tol2、從鮭魚科基因組中存在的非自主轉座子再構建的Sleeping Beauty、源自娃的人工轉座子Frog prince和源自昆蟲的轉座子PiggyBac。作為轉座酶，可以用天然酶，并可以用部分氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的任何轉座酶，只要其保持與轉座酶相同的轉移活性即可。通過控制轉座酶的酶活性，可以控制存在于轉座子序列間的DNA的轉移反應。為了分析它是否具有與轉座酶相同的轉移活性，可以用日本國特開2003-235575號公報中公開的2-成分分析系統(tǒng)測定。具體地，可以分別利用含有Tol2轉座酶缺失的Tol2轉座子(Tol2源非自主轉座子)的質粒和含有Tol2轉座酶的質粒，分析非自主Tol2元件是否可以通過轉座酶的活性被轉移并插入到哺乳動物細胞的染色體。本說明書中的術語“非自主轉座子”指缺失了存在于轉座子內(nèi)的轉座酶并因此不能進行其自主轉移的轉座子。通過允許轉座酶蛋白質、編碼轉座酶蛋白質的mRNA或編碼轉座酶蛋白質的DNA同時存在于宿主細胞內(nèi)，非自主轉座子可以將插入在非自主轉座子的轉座子序列間的DNA轉移到宿主細胞的染色體中。轉座酶基因指編碼轉座酶的基因。為了改進其在哺乳動物細胞中的表達效率，可
以將調(diào)整 Kozak 共有序列(Kozak M.，Nucleic Acids Res.，12，857-872 (1984))或核糖體結合序列、Shine-Dalgarno序列與起始密碼子之間的間隔調(diào)整到適當距離(如6至18個堿基)的序列連接到該基因的翻譯起始密碼子ATG的上游位點。根據(jù)本發(fā)明的方法，為了將表達載體中含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因的基因片段整合入宿主細胞的染色體，將含有基因片段及位于該基因片段兩端的轉座子序列的表達載體導入宿主細胞，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因，并允許轉座酶作用于導入細胞的表達載體中所包含的轉座子序列。為了允許轉座酶作用于導入細胞的表達載體中包含的轉座子序列，可以將轉座酶注射入細胞，或將含有編碼轉座酶的DNA的表達載體與含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因的表達載體一起導入宿主細胞。此外，通過將編碼轉座酶基因的RNA導入宿主細胞，可以在該細胞中表達轉座酶。不具體限定表達載體?？梢愿鶕?jù)導入含有轉座酶基因的表達載體的宿主細胞、用途等，通過從本領域技術人員已知的表達載體中任意選擇而使用任何表達載體。為了用本發(fā)明方法生產(chǎn)由兩個以上多肽構建的蛋白質，通過將編碼該兩個以上多肽的DNA整合入相同或不同表達載體，然后將表達載體導入宿主細胞，可以將DNA整合入細胞的染色體中。可以將轉座酶插入表達載體以與目的蛋白質一起表達，或可以將轉座酶插入與表達載體不同的載體?？梢栽试S轉座酶瞬時起作用或持續(xù)起作用，但為了制備穩(wěn)定生產(chǎn)的細胞，優(yōu)選允許轉座酶瞬時起作用。作為允許轉座酶瞬時起作用的方法，實例包括以下方法，其包括制備含有編碼轉座酶的DNA的表達載體和含有編碼目的蛋白質的DNA的表達載體，然后將兩個表達質粒同時導入宿主細胞。本說明書中的術語“表達載體”指用于導入哺乳動物細胞以表達目的蛋白質的表達載體。本發(fā)明所用的表達載體具有在表達盒兩側存在至少一對轉座子序列的結構。本說明書中術語“表達盒”指具有表達目的蛋白質所必須的基因表達控制區(qū)域和編碼目的蛋白質的序列的核苷酸序列?；虮磉_控制區(qū)域的實例包括增強子、啟動子和終止子。表達盒可以包含選擇性標記基因?？梢允褂萌魏螁幼?，只要其在動物細胞中發(fā)揮功能即可。實例包括巨細胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的啟動子、SV40早期啟動子、逆轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SR a啟動子、莫洛尼鼠白血病病毒、增強子等。并且，人CMV的IE基因的增強子可以與該啟動子一起使用?！斑x擇性標記基因”指可以用于區(qū)分導入質粒載體的細胞和缺乏該載體的細胞的任意其它基因。選擇性標記基因的實例包括抗藥基因(新霉素抗性基因、DHFR基因、嘌呤霉素抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、和環(huán)己酰亞胺抗性基因(日本國特開2002-2682879號公報))、熒光和生物發(fā)光標記基因(如綠色熒光蛋白GFP)等。本發(fā)明中，優(yōu)選的選擇性標記是抗藥基因，且特別優(yōu)選的選擇性標記為環(huán)己酰亞胺抗性基因。此外，通過對選擇性標記基因進行基因修飾，也可以改變選擇性標記蛋白質的抗藥性能和發(fā)光性能。環(huán)己酰亞胺(以下有時稱為CHX)是蛋白質合成抑制劑，作為用CHX抗性基因作為
選擇性標記基因的實例，酵母(Kondo K. J. Bacteriol.，177，247171-7177 (1995))和動物細胞(日本國特開2002-262879號公報)的例子是公知的。在動物細胞的例子中，已發(fā)現(xiàn)對環(huán)己酰亞胺的抗性是由轉化體提供的，其中所述轉化體表達由序列表的SEQ ID NO :7所不核昔酸序列編碼的蛋白質,在該蛋白質中由序列表的SEQ ID NO :5所示核苷酸序列編碼的人核糖體蛋白質亞基L36a中的第54位脯氨酸被谷氨酰胺取代。沒有具體限定導入上述含有轉座子序列的蛋白質表達載體、轉座酶表達質粒載體和RNA的方法。實例包括磷酸鈣轉染、電穿孔、脂質體方法、基因槍方法、脂質體轉染等。直接以蛋白質形式導入轉座酶的方法的實例包括通過顯微注射或內(nèi)吞作用供入細胞?？梢允褂谩缎禄蚬こ淌謨浴分兴龇椒ㄟM行基因轉移，該手冊由村松正實和山本雅所著，由羊土社出版，ISBN9784897063737。宿主細胞可以是任何哺乳動物細胞，只要其可以傳代培養(yǎng)并穩(wěn)定表達目的蛋白質即可。宿主細胞的實例包括PER. C6細胞、人白血病細胞Namalwa細胞、猴細胞COS細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20(也稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Agl4、敘利亞倉鼠細胞BHK、HBT5637 (日本國特開昭63-000299號公報)、中華倉鼠卵巢細胞CHO細胞(Journal of Experimental Medicine, 108，945 (1958) ；Proc. Natl.Acad. Sci. USA,601275(1968) ;Genetics,55,513 (1968) ；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18，115 (1996) ；Radiation Research,148,260(1997) ；Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) ；Proc. Natl. Acad. Sci. ,60, 1275(1968) ；Cell,6,121 (1975) ；Molecular Cell Genetics, Appendix I，II(pp. 883-900))、CH0/DG44、CHO-Kl (ATCC CCL-61)、DUKXB11 (ATCC CCL-9096)、Pro-5 (ATCC CCL-1781)、CHO-S (LifeTechnologies,目錄號 11619)、Pro_3 和 CHO 細胞亞株。此外，通過改變上述宿主細胞以適合蛋白質生產(chǎn)、修飾染色體DNA、導入外源基因等，上述宿主細胞也可以用于本發(fā)明的蛋白質生產(chǎn)方法。此外，為了控制與所生產(chǎn)的目的蛋白質結合的糖鏈的結構，也可以使用獲得凝集素抗性的 Lecl3 [Somanc Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)]和缺失 a 1,6-巖藻糖基轉移酶基因的CHO細胞(W02005/35586，W02002/31140)作為宿主細胞。
目的蛋白質可以是任何蛋白質，只要其可以用本發(fā)明方法表達即可。具體的，實例包括人血清蛋白、肽激素、生長因子、細胞因子、凝血因子、纖溶系統(tǒng)蛋白質、抗體、和各種蛋白質的部分片段、等等。目的蛋白質的優(yōu)選實例包括單克隆抗體，如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，F(xiàn)e融合蛋白，和白蛋白結合蛋白，及其片段?？梢杂酶鞣N方法控制用本發(fā)明方法獲得的單克隆抗體的效應子活性。例如，已知方法是用于控制巖藻糖(以下也稱為核心巖藻糖)量的方法，，其中所述巖藻糖通過與抗體Fe區(qū)域第297位天冬酰胺(Asn)結合的復合型N-連接糖鏈的還原端的a _1，6鍵與N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)相連(W02005/035586，W02002/31140，和 W000/61739);通過改變抗體Fe區(qū)域的氨基酸基團來控制單克隆抗體的效應子活性的方法，等等?？梢杂蒙鲜鋈魏畏椒刂朴帽景l(fā)明方法生產(chǎn)的單克隆抗體的效應子活性。“效應子活性”指由抗體Fe區(qū)域引起的抗體依賴活性。作為效應子活性，已知的有抗體依賴性細胞毒(ADCC活性)、補體依賴性細胞毒(CDC活性)、吞噬細胞如巨噬細胞或樹突狀細胞的抗體依賴性胞吞作用(ADP活性)、等等。此外，通過控制單克隆抗體Fe區(qū)域的復合型N-連接糖鏈的核心巖藻糖含量，可以提高或降低抗體的效應子活性。作為降低與抗體的Fe相連的復合型N-連接糖鏈所連接的巖藻糖含量的方法，可以通過用缺乏編碼a 1，6_巖藻糖基轉移酶基因的CHO細胞表達抗體而獲得無巖藻糖連接的抗體，該無巖藻糖連接的抗體具有高度ADCC活性。另一方面，作為提高與抗體Fe相連的復合型N-連接糖鏈所連接的巖藻糖含量的方法，可以通過用導入編碼a 1，6_巖藻糖基轉移酶的基因的宿主細胞表達抗體而獲得巖藻糖連接的抗體，該巖藻糖連接的抗體具有的ADCC活性低于無巖藻糖連接的抗體。另外，通過改變抗體Fe區(qū)域的氨基酸殘基，可以提高或降低ADCC活性或⑶C活性。例如，可以用US2007/0148165所述的Fe區(qū)域的氨基酸序列提高抗體的⑶C活性。另外，通過如6737056或7297775或7317091號美國專利所述改變氨基酸，可以提高或降低抗體的ADCC活性或CDC活性。本發(fā)明中的術語“懸浮性哺乳動物細胞”指不與用于促進培養(yǎng)細胞粘附的涂覆型細胞培養(yǎng)支持體如微珠、用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)容器(也稱為組織培養(yǎng)或粘附培養(yǎng)容器等)等粘附、并可以通過懸浮于培養(yǎng)液中而存活和生長的細胞。當細胞不與細胞培養(yǎng)支持體粘附時，其可以在培養(yǎng)液中以單細胞狀態(tài)存活和生長或以兩個以上細胞凝集形成的細胞團狀態(tài)存活和生長。此外，作為本發(fā)明所用的懸浮性哺乳動物細胞，優(yōu)選在不含胎牛血清(以下稱為FCS)等的無血清培養(yǎng)基可以存活和生長中并同時懸浮于培養(yǎng)液中不與細胞培養(yǎng)支持體粘附的細胞，并更優(yōu)選懸浮于不含蛋白質的無蛋白質培養(yǎng)基中時可以存活和生長的哺乳動物細胞。作為組織培養(yǎng)的培養(yǎng)容器，其可以是任何培養(yǎng)容器，如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等，只要其施加了用于粘附培養(yǎng)的涂層即可。具體地，例如，可以用市售組織培養(yǎng)瓶(Greiner制造)、粘附培養(yǎng)瓶(Sumitomo Bakelite制造)等證實是否是懸浮性哺乳動物細胞。作為本發(fā)明所用的懸浮性哺乳動物細胞，其可以是通過使原本具有懸浮特性的細胞進一步適應于懸浮培養(yǎng)而制備的細胞，或者通過使粘附性哺乳動物細胞適應于懸浮培養(yǎng)條件制備的懸浮性哺乳動物細胞。原本具有懸浮特性的細胞的實例包括PER. C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2. Gil. 16Ag. 20(或也稱為 YB2/0)、CH0-S 細胞(Invitrogen 制造)等。上述“通過使粘附性哺乳動物細胞適應于懸浮培養(yǎng)條件制備的懸浮性哺乳動物細胞”可以用Mol. Biotechnol.，2000,15 (3)，249-57中所述的方法或以下所示方法制備，并可以通過建立表現(xiàn)出增殖特性和存活特性與懸浮培養(yǎng)適應前相似或優(yōu)于適應于懸浮培養(yǎng)前的細胞而制備(J. Biotechnol. 2007，130 (3)，282-90)。術語“與懸浮培養(yǎng)適應前相似”指適應于懸浮培養(yǎng)的細胞的存活率、增殖速率(倍增時間)等與適應懸浮培養(yǎng)前的細胞基本相同。根據(jù)本發(fā)明使粘附性哺乳動物細胞適應于懸浮培養(yǎng)條件的方法的實例包括下列
方法。將含血清培養(yǎng)基的血清含量降低到1/10，并以較高細胞濃度反復傳代培養(yǎng)。當哺乳動物細胞開始能夠存活和增殖時，進一步降低血清含量并反復傳代培養(yǎng)。通過該方法可以制備在無血清狀態(tài)下能夠存活和增殖的懸浮性哺乳動物細胞。此外，也可以通過以下方法制備懸浮性哺乳動物細胞，所述方法包括在培養(yǎng)液中添加適當?shù)姆请x子表面活性劑如Pluronic-F68等而培養(yǎng)。通過適應懸浮培養(yǎng)條件獲得懸浮特性的粘附性哺乳動物細胞的實例包括小鼠骨髓瘤細胞NSO、CHO細胞等。本發(fā)明中，作為懸浮性哺乳動物細胞所具有的特性，當懸浮培養(yǎng)2X IO5細胞/ml的細胞時，培養(yǎng)3或4天后的細胞濃度優(yōu)選為5 X IO5細胞/ml以上，更優(yōu)選為8 X IO5細胞/ml以上，特別優(yōu)選為I X IO6細胞/ml以上，最優(yōu)選為I. 5 X IO6細胞/ml以上。此外，本發(fā)明的懸浮性哺乳動物細胞的倍增時間優(yōu)選為48小時以下，更優(yōu)選為24小時以下，特別優(yōu)選為18小時以下，最優(yōu)選為11小時以下。用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基的實例包括市售培養(yǎng)基，如⑶-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen制造)，EX-CELL 325-PF 培養(yǎng)基(SAFC Biosciences 制造)、SFM4CH0 培養(yǎng)基(HyClone 制造)等。此外，也可以通過混合培養(yǎng)哺乳動物細胞所必需的糖、氨基酸等而獲得?？梢允褂迷谀軌驊腋∨囵B(yǎng)的培養(yǎng)條件下可以用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)容器來培養(yǎng)懸浮性哺乳動物細胞。培養(yǎng)容器的實例包括用于細胞培養(yǎng)的96孔板(Corning制造)、T-培養(yǎng)瓶(Becton Dickinson 制造)、Erlenmeyer 培養(yǎng)瓶(Corning 制造)等。至于培養(yǎng)條件，例如，其可以在5% CO2的氣氛中和37°C培養(yǎng)溫度下靜置培養(yǎng)。也可以使用振蕩培養(yǎng)設備，如專用于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)設備Wave Bioreactor (GE HealthcareBioscience 制造)。至于使用Wave Bioreactor設備時懸浮性哺乳動物細胞的懸浮培養(yǎng)條件,可以通過 GE Healthcare Bioscience 主頁 http://www. Relifesciences. co. ip/tech support/manual/pdf/cellcult/wave 0316. pdf 中所述的方法培養(yǎng)細胞。除振蕩培養(yǎng)外，也可以用旋轉攪拌設備如生物反應器培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^Cytotechnology (2006) 52 :199-207中所述方法等用生物反應器進行培養(yǎng)。本發(fā)明中，當用懸浮性哺乳動物細胞以外的細胞株時，可以用任何細胞株，只要其是通過上述方法適應于懸浮培養(yǎng)的哺乳動物細胞并是可以用于本發(fā)明的蛋白質生產(chǎn)方法的細胞株即可。通過在含有目的蛋白質的培養(yǎng)液或細胞勻漿中將目的蛋白質與目的蛋白質以外的雜質分離，來執(zhí)行純化懸浮性哺乳動物細胞生產(chǎn)的目的蛋白質。分離方法的實例包括離心、滲析、硫酸銨沉淀、柱層析、過濾等?？梢曰谀康牡鞍踪|與雜質的理化性質差異和它們對柱載體的親和性差異進行分離。純化目的蛋白質的方法可以，例如，通過《蛋白質實驗概述》(第一卷)_重組蛋白質的提取、分離和表達(日文版書籍的翻譯)(R田雅人和宮崎香編輯，羊土社出版，ISBN9784897069180)記載的方法實施。本文所引用的文獻、如科學論文、專利、專利申請的全部內(nèi)容分別通過在與所具體描述內(nèi)容同等的程度上進行參考納入本文。為易于理解，前文通過說明優(yōu)選實施方案介紹了本發(fā)明。以下，基于實施例進一步
具體介紹本發(fā)明，但提供上述闡述和以下實施例僅用于例示目的而不是出于限定本發(fā)明的目的。相應地，本發(fā)明的范圍不限于本文具體介紹的實施方案和實施例，而僅由權利要求限定。下文所述與基因重組有關的各種實驗技術，如克隆等，根據(jù)下列文獻記載的基因工程技術實施J. Sambrook,E. F. Frisch和T. Maniatis 所著的Molecular Cloning第二版，和 Current Protocols 出版的由 Frederick M. Ausubel 等所著的 Current Protocols inMolecular Biology 等。實施例[實施例I]表達抗人流感M2抗體的轉座子載體的制備用含有哺乳動物細胞基因表達盒的質粒作為蛋白質表達的質粒載體，該質粒含有插入在一對Tol2轉座子序列之間的任意人類抗體基因和抗藥標記基因。所用基因的各DNA是基于已知核苷酸序列人工化學合成，或通過制備其兩端序列的引物并然后用合適的DNA源作為模板進行PCR而獲得。為了進行后期基因操作，向引物末端加入限制性酶的限制性位點。在日本國特開2003-235575/號公報中所公開的非自主Tol2轉座子的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)中，用第1-200位核苷酸序列(Tol2_L序列)(SEQ ID NO 2)和第2285至2788位核苷酸序列(Tol2-R序列)(SEQ ID NO 3)作為轉座子序列。用下列方法制備含有一對轉座子序列(TAKARA BIO INC.制造)的各合成DNA片段。制備含有在Tol2-R序列的5’端和3’端都連接有限制性酶NruI識別序列的核苷酸序列的DNA片段。然后制備含有在Tol2-L序列5’端連接有FseI限制性酶識別序列并在其3’端連接有AscI限制性酶識別序列的核苷酸序列的DNA片段。接著，將由此制備的含有Tol2_R序列和Tol2_L序列的DNA片段插入表達載體N5LG1-M2-Z3載體(W02006/061723)，所述N5LG1-M2-Z3載體含有編碼抗人流感M2抗體Z3G1的氨基酸序列的核苷酸序列。用N5LG1-M2-Z3 載體(W02006/061723)作為抗體基因表達盒，所述 N5LG1-M2-Z3載體中在CMV增強子/啟動子的控制下被插入了編碼抗人流感M2抗體Z3G1 (ATCC保藏號PTA-5968 :2004年3月13日保藏，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)，Manassas，VA，美國)的H鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO 8)和編碼其L鏈(SEQID NO 9)的核苷酸序列(SEQ ID N0:10 和 SEQ IDNO :11)。將含有Tol2_R序列的DNA片段插入在N5LG1_M2_Z3載體中含有抗體基因表達盒和抗性標記基因的基因片段5’端側的限制性酶NruI位點中。然后，將含有Tol2-L序列的DNA片段插入到在3’端側的限制性酶FseI和AscI位點中。此外，在CMV增強子/啟動子的控制下，通過將環(huán)己酰亞胺抗性基因表達盒插入N5LG1-M2-Z3載體的FseI識別位點而構建表達抗人流感M2抗體的轉座子載體(圖I)，其中所述環(huán)己酰亞胺抗性基因表達盒與編碼環(huán)己酰亞胺抗性基因(人核糖體蛋白質L36a第54位脯氨酸被谷氨酰胺取代的基因)的核苷酸序列(SEQ ID N05)相連，其中所述FseI識別位點與Tol2轉座子序列相連。另一方面，將不包含轉座子序列的載體命名為抗人流感M2抗體表達載體并用作
對照載體(圖2)。[實施例2]轉座酶表達載體的制備用與目的抗體表達載體無關的表達載體來表達轉座酶。即，將編碼青鏘魚來源的Το12 轉座酶(SEQ ID NO 4)的基因插入 pCAGGS 載體(Gene, 108,193-200,1991)的 CAGGS啟動子下游，并用作表達載體(圖3)。[實施例3]懸浮性CHO細胞的制備將已用含10%血清(FCS)的a -MEM培養(yǎng)基(Invitrogen制造)培養(yǎng)的粘附性CHO細胞剝離并通過胰蛋白酶處理而回收，并用含10% FCS的新鮮a -MEM培養(yǎng)基在5% CO2培養(yǎng)器中37°C振蕩培養(yǎng)。若干天后，確認這些細胞的生長，然后以2 X IO5細胞/ml的濃度將它們接種到含有5% FCS的a -MEM培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)。再若干天后，用含有5 % FCS的a -MEM培養(yǎng)基同樣進行接種。最后，用下述方法制備適應于懸浮培養(yǎng)的細胞用無血清的a -MEM培養(yǎng)基反復傳代培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)，并確認細胞與血清存在下它們的培養(yǎng)情況具有相同的生長能力。(2)產(chǎn)抗體的CHO細胞的制備用實施例I和實施例2中所制備的表達抗人流感M2抗體的轉座子載體(以下稱為轉座子載體)和1'012轉座酶表達載體？04663-121 (圖3，1^￥31 111^ K. &Noda T. ,Genetics,166,895-899(2004))作為表達載體。此外，用無轉座子序列的抗人流感M2抗體表達載體作為對照。通過將上述表達載體導入適應懸浮培養(yǎng)的CHO-Kl細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，目錄號CCL-61)或HEK293細胞(FreeStyle 293F細胞，Invitrogen)比較獲得環(huán)己酰亞胺抗性克隆的頻次。將各細胞(4 X IO6細胞)懸浮于400 μ L PBS，用電穿孔法直接以環(huán)狀DNA形式共轉染表達抗人流感M2抗體的轉座子載體(10 μ g)和Tol2轉座酶表達載體(25 μ g)。在這一點上，為瞬時表達Tol2轉座酶，將Το12轉座酶表達載體直接以環(huán)狀DNA形式導入，以防止整合入宿主染色體。此外，作為對照，按照電穿孔法的標準基因轉移方法，用限制性酶使抗人流感M2抗體表達載體(IOyg)線性化，然后導入各細胞。在電壓為300V、靜電容量為500 μ F和室溫的條件下，使用電穿孔儀(Gene PulserXcell系統(tǒng)(Bio-Rad制造)),用間隙寬度為4mm的電擊杯(Bio-Rad制造)進行電穿孔。用電穿孔法轉染后，將各細胞接種到三個96孔板，并在CO2培養(yǎng)器中培養(yǎng)3天，其中對CHO細胞使用SAFC Biosciences制造的EX-CELL 325-PF培養(yǎng)基，對HEK293細胞使用FreeStyle-293 培養(yǎng)基(Invitrogen 制造)。接著，從轉染第4天培養(yǎng)基更換之日起，向培養(yǎng)基中加入3μ g/ml環(huán)己酰亞胺，使得在環(huán)己酰亞胺存在下培養(yǎng)細胞，隨后培養(yǎng)3周并每周進行培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)3周后，計數(shù)發(fā)現(xiàn)環(huán)己酰亞胺抗性克隆的孔數(shù)，結果顯示在表I和表2中。[表 I]表I環(huán)己酰亞胺抗性細胞(CH0細胞)的數(shù)量比較
權利要求
1.生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括將含有基因片段和位于所述基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入所述哺乳動物細胞的染色體以獲得能夠表達目的蛋白質的哺乳動物細胞；和懸浮培養(yǎng)所述哺乳動物細胞。
2.生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括下列步驟(A)至(C) (A)將下列表達載體(a)和(b)同時導入懸浮性哺乳動物細胞的步驟 (a)含有基因片段和位于所述基因片段兩端的轉座子序列的表達載體，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因， (b)含有編碼轉座酶的DNA的表達載體，所述轉座酶識別轉座子序列并具有將插入在一對轉座子序列之間的基因片段轉移入染色體的活性， (B)從步驟(A)中所導入的表達載體瞬間表達轉座酶、以將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入哺乳動物細胞的染色體而獲得能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞的步驟，和 (C)懸浮培養(yǎng)步驟(B)中獲得的能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞以生產(chǎn)目的蛋白質的步驟。
3.獲得能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞的方法，其包括將含有基因片段和位于所述基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；和將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入所述哺乳動物細胞的染色體。
4.根據(jù)權利要求I至3任一項的方法，其中懸浮性哺乳動物細胞是能夠在無血清培養(yǎng)基中存活和增殖的細胞。
5.根據(jù)權利要求I至4任一項的方法，其中懸浮性哺乳動物細胞是選自懸浮性CHO細胞、PER. C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 (或也稱為YB2/0)和適于懸浮培養(yǎng)的懸浮性小鼠骨髓瘤細胞NSO的至少一種細胞，所述懸浮性CHO細胞中的CHO細胞適于懸浮培養(yǎng)。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其中CHO細胞是選自CHO-Kl、CHO-KISV,DUKXBlI、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S的至少一種細胞。
7.根據(jù)權利要求I至6任一項的方法，其中選擇性標記基因是環(huán)己酰亞胺抗性基因。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其中環(huán)己酰亞胺抗性基因是編碼人核糖體蛋白質L36a的突變體的基因。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中突變體是人核糖體蛋白質L36a的第54位脯氨酸被其它氨基酸取代的突變體。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述其它氨基酸是谷氨酰胺。
11.根據(jù)權利要求I至10任一項的方法，其中一對轉座子序列是源自在哺乳動物細胞中發(fā)揮功能的一對DNA型轉座子的核苷酸序列。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中源自一對DNA型轉座子的核苷酸序列是源自一對Toll轉座子的核苷酸序列或源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其中源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列是含有SEQIDNO :2所示核苷酸序列和SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的核苷酸序列。
14.根據(jù)權利要求12的方法，其中源自一對Toll轉座子的核苷酸序列是SEQID NO 14所示核苷酸序列和SEQ ID NO 15所示核苷酸序列。
15.能夠生產(chǎn)目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞，其中導入含有基因片段和位于所述基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體，以將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入染色體，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因。
16.能夠生產(chǎn)目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞，其中同時導入含有基因片段和位于所述基因片段兩端的轉座子序列的表達載體(a)以及含有編碼轉座酶(轉移酶)的DNA的表達載體(b)，以將插入在一對轉座序列之間的基因片段整合入染色體，所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因，而所述轉座酶識別轉座子序列并具有將插入在一對轉座子序列之間的基因片段轉移入染色體的活性。
17.根據(jù)權利要求15或16的細胞，其中所述細胞是能夠在無血清培養(yǎng)基中存活和增殖的細胞。
18.根據(jù)權利要求15至17任一項的細胞，其中所述細胞是選自懸浮性CHO細胞、PER.C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL. P2.G11. 16Ag. 20 (或也稱為YB2/0)和適于懸浮培養(yǎng)的懸浮性小鼠骨髓瘤細胞NSO的至少一種懸浮性哺乳動物細胞，所述懸浮CHO細胞中的CHO細胞適于懸浮培養(yǎng)。
19.根據(jù)權利要求18的細胞，其中CHO細胞是選自CH0-K1、CHO-KISV,DUKXBIU CHO/DG44、Pro-3和CHO-S的至少一種細胞。
20.根據(jù)權利要求15至19任一項的細胞，其中選擇性標記基因是環(huán)己酰亞胺抗性基因。
21.根據(jù)權利要求20的細胞，其中環(huán)己酰亞胺抗性基因是編碼人核糖體蛋白質L36a的突變體的基因。
22.根據(jù)權利要求21的細胞，其中突變體是人核糖體蛋白質L36a的第54位脯氨酸被其它氨基酸取代的突變體。
23.根據(jù)權利要求22的細胞，其中其它氨基酸是谷氨酰胺。
24.根據(jù)權利要求15至23任一項的細胞，其中一對轉座子序列是源自在哺乳動物細胞中發(fā)揮功能的一對DNA型轉座子的核苷酸序列。
25.根據(jù)權利要求24的細胞，其中源自一對DNA型轉座子的核苷酸序列是源自一對Toll轉座子的核苷酸序列或源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列。
26.根據(jù)權利要求25的細胞，其中源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列是SEQID NO2所示核苷酸序列和SEQ ID NO :3所示核苷酸序列。
27.根據(jù)權利要求25的細胞，其中源自一對Toll轉座子的核苷酸序列是SEQID NO14所示核苷酸序列和SEQ ID NO :15所示核苷酸序列。
28.蛋白質表達載體，其含有包含編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因的基因片段及位于所述基因片段兩端的一對轉座子序列。
29.根據(jù)權利要求28的蛋白質表達載體，其中一對轉座子序列是源自一對Toll轉座子的核苷酸序列或源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列。
30.根據(jù)權利要求29的蛋白質表達載體，其中源自一對Tol2轉座子的核苷酸序列是SEQ ID NO :2所示核苷酸序列和SEQ ID NO :3所示核苷酸序列。
31.根據(jù)權利要求29的蛋白質表達載體，其中源自一對Toll轉座子的核苷酸序列是SEQ ID NO : 14所示核苷酸序列和SEQ ID NO :15所示核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)目的蛋白質的方法，其包括將含有基因片段及位于該基因片段兩端的轉座子序列的蛋白質表達載體導入懸浮性哺乳動物細胞，其中所述基因片段含有編碼目的蛋白質的DNA和選擇性標記基因；將插入在一對轉座子序列之間的基因片段整合入哺乳動物細胞的染色體以獲得能夠表達目的蛋白質的哺乳動物細胞；和懸浮培養(yǎng)該哺乳動物細胞；和能夠表達目的蛋白質的懸浮性哺乳動物細胞。
文檔編號C12N5/10GK102803484SQ201080026008
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月10日 優(yōu)先權日2009年6月11日
發(fā)明者川上浩一, 山口惠奈, 小川梨沙, 塚原正義 申請人:大學共同利用機關法人情報·系統(tǒng)研究機構, 協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社