專利名稱：激酶抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
p38激酶是促分裂原活化蛋白(MAP)激酶，其屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶總科。這種激酶通過胞外應(yīng)激反應(yīng)例如加熱、紫外線燈和滲透性的應(yīng)激反應(yīng)、以及通過炎癥性的刺激例如脂多糖來激活。當(dāng)激活時(shí)，p38激酶將調(diào)節(jié)前炎癥性的細(xì)胞素腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的生物合成的胞內(nèi)蛋白底物磷酸化。這些細(xì)胞活素涉及許多下列病癥的病理慢性的炎癥性病癥(Lee等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，696，149-170(1993)；Muller-Ladner，Curr.Opin.Rheumatol.，8，210-220(1996))，心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥(Salituro等人，Current Medicinal Chemistry，6，807-823(1999))，和自身免疫病癥(Pargellis等人，Nature Structural Biology，9(4)，268-272(2002))。
在吡啶基咪唑(WO9621452，WO9725045，US5656644，US5686455，US5717100，WO9712876，WO9821957，WO9847892，WO99903837，WO9901449，WO0061576，WO0172737)和嘧啶基-咪唑(WO9725048，WO9901452，WO9725046，WO9932121，WO9901131，WO9901130，WO9901136，WO9807452，WO9747618，WO9856788，WO9857996)結(jié)構(gòu)平臺(tái)內(nèi)的許多化合物，已經(jīng)確定為p38激酶的抑制劑或細(xì)胞素抑制劑。已知p38激酶的選擇性抑制劑可以抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)(McKenna等人...，J.Med.Chem.，45(11)，2173-2184(2002))。已經(jīng)報(bào)道了嘧啶基咪唑結(jié)構(gòu)平臺(tái)內(nèi)的化合物的抗炎活性(Lantos等人，J.Med. Chem.，27，72-75(1984))，并且也在探查許多p38激酶的抑制劑用于治療各種病癥的活性(Boehm和Adams，Exp.Opin.Ther.Patents，10(1)，25-37(2000))。作為細(xì)胞素抑制性藥物的化合物，即能夠抑制p38激酶的化合物，在該領(lǐng)域還有用于治療的需要。
本發(fā)明提供了新的p38激酶抑制劑，其可用于治療由過量細(xì)胞素產(chǎn)生引起的病癥。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了式I的化合物
其中 X是N，或C-R1；R是C1-C7烷基，C3-C7環(huán)烷基，(C1-C7亞烷基)-(C3-C7環(huán)烷基)，-SO2-(C1-C7烷基)，或-SO2-NR5R6；R1是氫，氨基，甲基，或-N＝CH(NMe)2；R2是任選被一或兩個(gè)獨(dú)立選自鹵素的取代基取代的苯基；R3是氫，C1-C7烷基，C3-C7環(huán)烷基，或任選被一或兩個(gè)獨(dú)立選自鹵素和三氟甲基的取代基取代的苯基；R4是氫或C1-C7烷基；R5和R6獨(dú)立地選自C1-C7烷基；或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動(dòng)物中的p-38激酶的方法，包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物治療有效量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明還提供了一種抑制哺乳動(dòng)物中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)產(chǎn)生的方法，該方法包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物有效量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明還提供了抑制哺乳動(dòng)物中的白介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生的方法，包含給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物有效量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療哺乳動(dòng)物中由過量細(xì)胞素產(chǎn)生引起的病癥的方法，包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物細(xì)胞素-抑制數(shù)量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明也提供了一種治療哺乳動(dòng)物中的敏感腫瘤的方法，該方法包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物治療有效量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明也提供了一種抑制哺乳動(dòng)物中的轉(zhuǎn)移病變的方法，該方法包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物治療有效量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明還提供了一種治療哺乳動(dòng)物中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物治療有效量的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合。
該發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備抑制p38激酶的藥物的用途。另外，該發(fā)明提供了用于抑制哺乳動(dòng)物中p38激酶的式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于抑制p38激酶的藥物組合物，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或其稀釋劑組合。本發(fā)明還提供了式I化合物用于制備一種藥物的用途，這種藥物用于治療通過抑制p-38激酶能夠改善或預(yù)防的疾病或病癥。
本發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)產(chǎn)生的藥物的用途。另外，本發(fā)明提供了用于抑制哺乳動(dòng)物中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生的式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)的藥物組合物，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑組合。本發(fā)明還提供了式I化合物用于制備一種藥物的用途，這種藥物用于治療通過抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生而能夠改善或預(yù)防的疾病或病癥。
本發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備抑制白介素-1β(IL-1β)產(chǎn)生的藥物的用途。另外，本發(fā)明提供了用于抑制哺乳動(dòng)物中的白介素β(IL-1β)的產(chǎn)生的式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于抑制白介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生的藥物組合物，包括式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑組合。本發(fā)明還提供了式I化合物用于制備一種藥物的用途，這種藥物用于治療通過抑制白介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生而能夠改善或預(yù)防的疾病或病癥。
本發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備一種藥物的用途，這種藥物用于治療由過量細(xì)胞素產(chǎn)生引起的病癥。另外，該發(fā)明提供了用于治療哺乳動(dòng)物中由過量細(xì)胞素產(chǎn)生引起的病癥的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于治療由過量細(xì)胞素產(chǎn)生引起的病癥的藥物組合物，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑組合。本發(fā)明還提供了式I化合物用于制備一種藥物的用途，這種藥物用于治療通過抑制過量細(xì)胞素產(chǎn)生而能夠改善或預(yù)防的疾病或病癥。
本發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備一種藥物的用途，這種藥物用于治療敏感腫瘤。另外，本發(fā)明提供了用于治療哺乳動(dòng)物中的敏感腫瘤的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于治療敏感腫瘤的藥物組合物，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑組合。
本發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備抑制轉(zhuǎn)移病變的藥物的用途。另外，本發(fā)明提供了用于抑制哺乳動(dòng)物中的轉(zhuǎn)移病變的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于抑制轉(zhuǎn)移病變的藥物組合物，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑組合。
本發(fā)明還提供了式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。另外，本發(fā)明提供了用于治療哺乳動(dòng)物中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明提供了一種適合于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，包括式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與一或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑組合。
發(fā)明的詳細(xì)說明上面化學(xué)式中所使用的一般化學(xué)術(shù)語具有它們常用的含義。例如，術(shù)語“C1-C7烷基”包括甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，己基和庚基部分。術(shù)語“C1-C7亞烷基”包括亞甲基，亞乙基，亞丙基，亞異丙基，亞丁基，亞異丁基，亞仲丁基，亞叔丁基，亞戊基，亞己基和亞庚基部分。術(shù)語“C3-C7環(huán)烷基”包括環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基和環(huán)庚基部分。術(shù)語“(C1-C7亞烷基)-(C3-C7環(huán)烷基)”是指通過C1-C7亞烷基連接基連接的C3-C7環(huán)烷基。術(shù)語“鹵素”包括氟，氯，溴，和碘。
術(shù)語“p-38激酶”是指p-38α和/或p38β激酶異構(gòu)型。
術(shù)語“抑制TNF-α(IL-1β，細(xì)胞素)的產(chǎn)生”是指將哺乳動(dòng)物中過量體內(nèi)水平的TNF-α、IL-1β、或另一種細(xì)胞素降低至正常的或亞正常水平。這可以通過下列方式實(shí)現(xiàn)抑制所有細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-1β、或另一種細(xì)胞素的體內(nèi)釋放；將哺乳動(dòng)物中的TNF-α、IL-1β或另一種細(xì)胞素的過量體內(nèi)水平的基因組水平下調(diào)至正常的或亞正常水平；抑制作為轉(zhuǎn)譯后現(xiàn)象的TNF-α、IL-1β或另一種細(xì)胞素的合成；或下調(diào)TNF-α、IL-1β或另一種細(xì)胞素至翻譯水平。
術(shù)語“最小有效劑量(MED)”是指可以產(chǎn)生效果的最小劑量，該效果統(tǒng)計(jì)上顯著地不同于在賦形劑對(duì)照組中觀察到的效果。
術(shù)語“閾有效劑量(TED)”是指要求得到指定活性閾值的劑量。例如，TED50是要求得到50％響應(yīng)的劑量。
術(shù)語“閾最小有效劑量(TMED)”是指保證統(tǒng)計(jì)上顯著效果的最低劑量，該效果也得到指定活性的閾水平。例如，TMED50是得到50％響應(yīng)的最低劑量，并且一定是統(tǒng)計(jì)上顯著地不同于賦形劑對(duì)照組。
術(shù)語“有效量”是指得到所需要藥理學(xué)效果的式I化合物的劑量。
熟練技術(shù)人員將會(huì)理解，某些式I的化合物含有至少一個(gè)手性中心。本發(fā)明包括所述化合物的所有單一對(duì)映體或非對(duì)映體、以及對(duì)映體和非對(duì)映體的混合物，包括消旋體。優(yōu)選，含有至少一個(gè)手性中心的式I化合物以單一對(duì)映體或非對(duì)映體的形態(tài)存在。單一對(duì)映體或非對(duì)映體可以從手性試劑開始制備，或通過立體選擇性的或立體特異性的合成技術(shù)制備?；蛘撸瑔我粚?duì)映體或非對(duì)映體可以通過標(biāo)準(zhǔn)手性色譜或結(jié)晶技術(shù)從混合物中分離。
技術(shù)熟練的技術(shù)人員將會(huì)理解，當(dāng)變量“W”是咪唑(i)、R4是氫時(shí)，咪唑環(huán)存在于下面的兩個(gè)互變異構(gòu)形式中
盡管互變異構(gòu)體I和II在結(jié)構(gòu)上是不同的，熟練的技術(shù)人員將會(huì)理解，它們處于平衡之中，并且在普通條件下可以容易和快速地互相轉(zhuǎn)換。(參見March，Advanced Organic Chemistry，Third Edition，Wiley Interscience，New York，New York(1985)，第66-70頁；和Allinger，Organic Chemistry，Second Edition，Worth Publishers，NewYork，New York，(1976)，第173頁)。因此，在互變異構(gòu)形式中，式I化合物的表述包括咪唑環(huán)的兩個(gè)互變異構(gòu)形式，其中變量“W”是咪唑(i)，且R4是氫。同樣地，其中“W”是咪唑(i)且R4是氫的式I化合物的命名，既可以是1H-咪唑也可以是3H-咪唑，其包括咪唑環(huán)的兩個(gè)互變異構(gòu)形式。具體地，名稱5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺包括1H-咪唑-4-基或3H-咪唑-4-基形式中的分子。類似地，當(dāng)變量“W”是三唑(iv)時(shí)，三唑部分存在三個(gè)互變異構(gòu)形式，并且一個(gè)互變異構(gòu)形式的表述或名稱包括三唑環(huán)的所有三個(gè)互變異構(gòu)形式。
技術(shù)熟練的讀者將會(huì)了解，本發(fā)明的化合物能夠形成鹽。就一切情況而論，所有化合物的藥學(xué)可接受的鹽包括在它們的名稱內(nèi)。本發(fā)明的化合物是胺，并且相應(yīng)地與大量無機(jī)和有機(jī)酸的任一項(xiàng)起反應(yīng)，形成藥學(xué)可接受的加成鹽。優(yōu)選的藥學(xué)可接受的鹽是那些與馬來酸、富馬酸、琥珀酸、鹽酸和甲磺酸形成的鹽。特別優(yōu)選的是式I化合物的二-甲磺酸鹽。
某些類的式I化合物是p-38激酶的優(yōu)選抑制劑。下面的段落描述這種優(yōu)選類別
c)X是C-R1；d)X是C-NH2；e)R2是苯基，4-氟苯基，或2，4-二氟苯基；f)R2是苯基；g)R2是4-氟苯基；h)R2是2，4-二氟苯基；i)R4是氫；j)W是 X是C-R1，R2是苯基，4-氟苯基，或2，4-二氟苯基，和R4是氫；k)W是 X是C-NH2，R2是苯基，4-氟苯基或2，4-二氟苯基，和R4是氫；l)W是 X是C-R1，R是C1-C7烷基，R2是苯基，4-氟苯基，或2，4-二氟苯基，R3是C1-C7烷基或任選被一或兩個(gè)獨(dú)立選自鹵素和三氟甲基的取代基取代的苯基，R4是氫；
m)W是 X是C-NH2，R是C1-C7烷基，R2是苯基，4-氟苯基，或2，4-二氟苯基，R3是C1-C7烷基或任選被一或兩個(gè)獨(dú)立選自鹵素的取代基取代的苯基，R4是氫；n)式I的化合物是游離堿。
o)式I的化合物是鹽。
p)式I的化合物是甲磺酸鹽。
q)式I的化合物是二-甲磺酸鹽。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括段落a)-q)的所有組合。
在式I范圍內(nèi)的化合物的特別優(yōu)選的亞屬是式I’的化合物 其中R′是2，2-二甲基丙基或1，2，2-三甲基丙基；R2′是苯基，4-氟苯基，或2，4-二氟苯基；R3′是叔丁基，2-氯-6-氟苯基，2-氟-6-三氟甲基苯基，2，6-二氯苯基，或2，6-二氟苯基；或其藥學(xué)可接受的鹽。
最優(yōu)選的式I’化合物是那些符合下列條件的化合物1.R′是2，2-二甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是2-氟-6-三氟甲基苯基；2.R′是2，2-二甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是2，6-二氯苯基；3.R′是2，2-二甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是叔丁基；4.R′是2，2-二甲基丙基，R2′是苯基，和R3′是2-氯-6-氟苯基；5.R′是2，2-二甲基丙基，R2′是2，6-二氟苯基，和R3′是叔丁基；
6.R′是1，2，2-三甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是叔丁基；和7.R′是1，2，2-三甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是2，6-二氟苯基。
還優(yōu)選每個(gè)這些化合物以甲磺酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸氫鹽、二鹽酸鹽或二甲磺酸鹽的形式存在。特別優(yōu)選每個(gè)這些化合物以二甲磺酸鹽存在。
式I的化合物是p38激酶抑制劑。由此，本發(fā)明還提供了一種抑制哺乳動(dòng)物中的p38激酶的方法，該方法包括給予需要所述治療的哺乳動(dòng)物有效量的式I的化合物。優(yōu)選通過給予式I的化合物治療的哺乳動(dòng)物是人類。
作為p38激酶抑制劑，本發(fā)明的化合物可有效用于抑制前炎癥性細(xì)胞素腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的產(chǎn)生，因此可用于治療由產(chǎn)生過量細(xì)胞素引起的病癥。因此可認(rèn)為式I的化合物可有效用于治療炎癥性病癥，包括濕疹、特異性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和中毒性休克綜合癥。還認(rèn)為本發(fā)明的化合物可有效用于治療心血管病癥，例如急性心肌梗塞，慢性心力衰竭，動(dòng)脈粥樣硬化，病毒性心肌炎，心臟同種異體移植物的排斥，和與敗血癥-相關(guān)的心臟機(jī)能障礙。此外，還認(rèn)為本發(fā)明的化合物可有效用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥，例如腦膜炎雙球菌性腦膜炎，阿爾茨海墨病，帕金森病，和多發(fā)性腦硬化。
大部分實(shí)質(zhì)固態(tài)瘤通過惡性細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖而增加質(zhì)量。為了使腫瘤比2-3毫米直徑大，必須形成血管系統(tǒng)，一種被稱為血管生成的過程。已經(jīng)報(bào)道了通過血管抑素和血管內(nèi)皮抑素抑制腫瘤引起的血管生成，可以產(chǎn)生抗癌活性(O’Reilly等人，Cell，88，277-285(1997))。選擇性的p38激酶抑制劑SB22025已經(jīng)顯示其可以抑制血管生成(J.R.Jackson等人，J.Pharmacol.Exp.Therapeutics，284，687(1998))。因?yàn)檠苌墒谴蟛糠謱?shí)質(zhì)固態(tài)瘤的質(zhì)量擴(kuò)展的關(guān)鍵部分，用于抑制這種過程的新p38激酶抑制劑的開發(fā)代表了抗癌治療的有希望的方法。這種抗癌治療的方法可以沒有毒性的副作用或常規(guī)化療性能引起的耐藥性(Judah Folkman，Endogenous Inhibitors ofAngiogenesis，The Harvey Lectures，Series 92，第65-82頁，Wiley-LissInc.，(1998))。
作為p38激酶的抑制劑，本發(fā)明的化合物因此還用于抑制敏感腫瘤的增長(zhǎng)。Schultz，R.M.Potential of p38 MAP kinase inhibitors in thetreatment of cancer.InE.Jucker(ed.)，Progress in Drug Research，60，59-92，(2003)。將敏感腫瘤定義為其存活、增長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移病變?nèi)Q于p38激酶的腫瘤。敏感腫瘤包括腦、泌尿生殖道、淋巴系統(tǒng)、胃、喉和肺腫瘤(U.S.Patent#5,717,100)。優(yōu)選，本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“敏感腫瘤”包括人類的癌癥，這種癌癥包括非小細(xì)胞肺惡性腫瘤(A.Greenberg，等人Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，26，558(2002))，乳房惡性腫瘤(J.Chen，等人J.Biol.Chem.，276，47901(2001)；B.Salh，等人Int.J.Cancer，98，148(2002)；和S.Xiong，等人Cancer Res.，61，1727(2001))，胃惡性腫瘤(Y.D.Jung，等人Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，43，9(2002))，結(jié)腸癌(S.Xiong，等人Cancer Res.，61，1727(2001))，前列腺惡性腫瘤(J-I Park，等人Oncogene，22，4314-4332(2003)；L.Chen，等人Cancer Lett.，215，239-247(2004)；和A.R.Uzgara，等人Prostate，55，128-139(2003))，惡性黑色素瘤(C.Denkert，等人Clin.Exp.Metastasis，19，79(2002))，和多發(fā)性骨髓瘤(Hideshima，等人Oncogeneadvance online publication，1-11，(11 October 2004)；和Hideshima，等人Blood，101(2)，703(2003))。
通過抑制TNF-α來抑制血管生成，也已經(jīng)報(bào)道其可有效用于抑制或預(yù)防轉(zhuǎn)移病變(美國專利#6,414,150；U.S.Patent#6,335,336)。此外，抑制TNF-α，顯示其可用于治療和預(yù)防大約一半癌癥患者所感受的惡病體質(zhì)、消耗綜合征(T.Yoneda，等人，J.Clin.Invest.，87，977(1991))。此外，抑制p38激酶可以有效用于治療某些病毒病癥，例如流行性感冒(K.Kujime，等人J.Immunology.，164，3222-3228(2000))，鼻病毒(S.Griego，等人J.Immunology，165，5211-5220(2000))，和HIV(L.Shapiro，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，7422-7426，(1998))。
本發(fā)明的化合物可以通過各種方法制備，其中一些在下面的反應(yīng)路線中進(jìn)行了說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在下面反應(yīng)路線中的獨(dú)立步驟可以變化，以提供式I的化合物。生產(chǎn)式I的化合物所要求步驟的具體順序取決于要被合成的具體化合物、原料化合物和取代的部分的相對(duì)不穩(wěn)定性。在下面反應(yīng)路線中已經(jīng)排除了一些取代基，這是為了清楚而不是意欲以任何方式限制反應(yīng)路線的內(nèi)容。
其中W是咪唑(i)的式I化合物，可以按照下面反應(yīng)路線中說明的方法制備，其中R、R1、R2和R3如先前所定義。
反應(yīng)路線I 在合適的溶劑中，優(yōu)選乙酸，使二酮(a)與乙酸銨和合適的醛反應(yīng)，形成相應(yīng)的硝基吡啶基-咪唑(b)。在標(biāo)準(zhǔn)氫化或化學(xué)條件下，將硝基部分還原，形成該相應(yīng)的二胺(c)。然后使該二胺與溴化氰反應(yīng)，形成3-取代的-5-(咪唑-4-基)-2-氨基吡啶基-咪唑(Ia)，與合適的原甲酸酯反應(yīng)，形成3-取代的-5-(咪唑-4-基)吡啶基咪唑(Ib)，或與合適的亞硝酸酯反應(yīng)，形成3-取代的-5-(咪唑-4-基)吡啶基三唑(Ic)。
必要的二酮(a)可以如下面反應(yīng)路線所述來制備，其中R和R2如先前所定義。
反應(yīng)路線II
2，6-二氯硝基吡啶(d)與合適的胺或胺衍生物在合適的溶劑中一起加熱，形成相應(yīng)的2-氨基-6-氯-3-硝基吡啶(e)，然后其與適當(dāng)取代的乙炔偶合，形成相應(yīng)的1，2-二取代的乙炔(f)。將該乙炔氧化形成靶向二酮(a)。
其中W是吡唑(ii)或(iii)的式I的化合物是按照下面反應(yīng)路線所述制備的，其中X、R、R1和R2如先前所定義。
反應(yīng)路線III 在含水硫酸中用氧化汞處理乙炔(f)，形成酮(g)。在合適的溶劑中，典型地是二甲基甲酰胺，用二甲基甲酰胺二甲縮醛或三(二甲基-氨基)甲烷處理該酮，形成烯胺酮(enaminoketone)(h)。然后在合適的溶劑中，典型地是乙醇或甲醇，用肼處理該烯胺酮(enaminoketone)，形成苯基吡唑(j)。如先前所描述來制備咪唑并或三唑并吡啶部分，形成式Id的化合物。
其中W是[1，2，3]三唑(iv)的式I化合物，可以如下面反應(yīng)路線所述來制備，其中變量Y、R和R2如先前所定義。
反應(yīng)路線IV
使乙炔(f)與疊氮化物源(典型地是疊氮化鈉)在合適的溶劑例如二甲氧基乙烷中反應(yīng)，形成三唑(k)。如先前所描述來制備咪唑并或三唑并吡啶部分，形成式Ie的化合物。
其中W是噻唑(v)或_唑(vii)的式I的化合物可以如下面反應(yīng)路線中所述來制備，其中變量X、R、R2和R3如先前所定義，Y是O或S。
反應(yīng)路線V 在合適的溶劑中，使α-溴酮(l)與合適的酰胺(m，Y＝O)或硫代酰胺(m，Y＝S)反應(yīng)，形成相應(yīng)的_唑或噻唑(n)。然后在合適的溶劑中用溴處理_唑(n，Y＝O)，形成相應(yīng)的溴代雜環(huán)(o，Y＝O)。用正丁基鋰處理噻唑(n，Y＝S)，并且使得到的陰離子與三丁基氯化錫反應(yīng)，形成相應(yīng)的錫衍生物(o，Y＝S)。在先前所述的合適催化劑存在下，使適當(dāng)取代的雜環(huán)(o)與合適的硼酸(p)反應(yīng)，形成式If的化合物。
必要的α-溴酮可商業(yè)購買或可以通過標(biāo)準(zhǔn)條件由相應(yīng)的羰基化合物制備，例如House(H.O.House，Modern Synthetic Reactions，W.A.Benjamin，Inc.，Menlo Park，California(1972)，第459-478頁)和Laroek(R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers，Inc.，New York，New York(1989)，第369-471，755頁)所述。必要的酰胺和硫代酰胺是可商業(yè)購買的，或是可以通過技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備的。
其中W是咪唑(i)或異_唑(vi)的其它式I化合物，可以如下面反應(yīng)路線所述的標(biāo)準(zhǔn)鈀偶合條件下制備，其中W’是咪唑(i)或異_唑(vi)，X和R如先前所定義。
反應(yīng)路線VI 在鈀催化劑的存在下，典型地是雙(三苯基膦)鈀(II)氯化物，在合適的溶劑中，適當(dāng)取代的鹵代雜芳基(q)與適當(dāng)取代的硼酸(p)偶合，形成所需要的式Ie的化合物。必要的起始原料是可商業(yè)購買的，或是可以通過普通技術(shù)人員熟知的方法制備的。
本發(fā)明的許多化合物不只是用作p38激酶的抑制劑，也用于制備本發(fā)明其它化合物的中間體。例如，可以將伯和仲胺?；⑼榛蛟跇?biāo)準(zhǔn)肽偶合條件下與羧酸或氨基酸偶合。此外，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，可以將酯部分還原成相應(yīng)的醇或轉(zhuǎn)變?yōu)轷０?。利用大量親核試劑，可以將醇激活和置換，形成本發(fā)明的其它化合物。這種離去基團(tuán)包括但不局限于鹵化物，氧_離子，高氯酸烷基酯，銨基烷基磺酸酯，氟磺酸烷基酯，nonaflates，tresylates，三氟甲磺酸酯，和磺酸酯，優(yōu)選甲磺酸酯或甲苯磺酸酯。引入這些基團(tuán)的技術(shù)對(duì)于熟練技術(shù)人員也是熟知的，參見例如March，Advanced Organic Chemistry，5thEd.，John Wileyand Sons，New York，pg.445-449(2001)。另外，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，苯并咪唑核的2-氨基部分可以被重氮化和置換，形成本發(fā)明的其它化合物。
技術(shù)熟練的技術(shù)人員將會(huì)理解，不是所有式I化合物的取代基都能將耐受用于合成這些化合物的某些反應(yīng)條件。這些部分在合成中根據(jù)需要或要求在適宜的位置引入，或可以被保護(hù)，而后脫保護(hù)。熟練的技術(shù)人員將會(huì)理解可以在本發(fā)明的化合物合成中任何適宜的點(diǎn)除去保護(hù)基。引入和除去氮和氧保護(hù)基的方法在本領(lǐng)域是熟知的；見，例如，Greene and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rdEd.，JohnWiley and Sons，New York，Chapter 7(1999)。此外，技術(shù)熟練的技術(shù)人員將會(huì)理解，在許多情況下引入部分的順序不是關(guān)鍵的。生產(chǎn)式I的化合物所要求步驟的具體順序取決于要被合成的具體化合物、原料化合物和取代的部分的相對(duì)不穩(wěn)定性。
在實(shí)施例和試驗(yàn)中所使用的縮寫、符號(hào)和術(shù)語具有下列含義AcOH＝乙酸；DMF＝N，N-二甲基甲酰胺；DMSO＝二甲亞砜；Et2O＝乙醚；EtOAc＝乙酸乙酯；EtOH＝乙醇；h＝小時(shí)(s)；MeOH＝甲醇；min＝分鐘；MTBE＝甲基叔丁基醚；Pd(OAc)2＝乙酸鈀；RT＝室溫；THF＝四氫呋喃；VO(acac)2＝乙酰丙酮氧釩(vanadylacetylacetonate)。
制備例1[6-(2-叔丁基-5-苯基-3H-咪唑-4-基)-3-硝基吡啶-2-基]-(2，2-二甲基丙基)胺(6-氯-3-硝基吡啶-2-基)-(2，2-二甲基-丙基)胺在室溫，將新戊基胺(18毫升，150mmol)加入到2，6-二氯-3-硝基吡啶(20克，103mmol)和Na2CO3(18.5克，175mmol)的EtOH(1.6毫升/mmol)懸浮液中，并攪拌過夜。濃縮，將得到的漿液用水(100mL)稀釋，并慢慢地用濃HCl(大約40mL)中和至pH值＝7。在0℃將懸浮液冷卻1小時(shí)，并通過真空過濾收集固體。用冰水(4×50mL)洗滌固體，空氣干燥過夜。用EtOAc和己烷再結(jié)晶物質(zhì)，得到標(biāo)題化合物黃色固體(21.23g，84％)。
MS(ES)m/z＝244[M+H](2，2-二甲基丙基-(3-硝基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)胺在烘干的圓底燒瓶中，該圓底燒瓶用氮?dú)庾M并排空三次，將(6-氯-3-硝基吡啶-2-基)-(2，2-二甲基丙基)胺(7.3克，30.0mmol)、苯乙炔(5.0毫升，45mmol)和三苯基膦(1.5mmol，0.39克)溶解在三乙胺(10毫升/克)中。加入Pd(OAc)2(0.10克，0.45mmol)，并重復(fù)吹氮/抽真空循環(huán)(3x)。在氮?dú)夥諊拢殡S著攪拌，在70-80℃加熱1-3小時(shí)，然后在RT下冷卻2小時(shí)。濃縮并在水(25mL)和EtOAc(150mL)之間分配。分離有機(jī)層，并用水(4×25mL)、飽和NaCl水溶液(25mL)洗滌，用MgSO4干燥，過濾并濃縮。將粗品固體通過用EtOAc/己烷重結(jié)晶純化，得到標(biāo)題產(chǎn)物鮮橙色固體(6.5g，21.2mmol，71％)。
MS(ES)m/z＝310[M+H]；mp90-92℃。
1-[6-(2，2-二甲基丙氨基)-5-硝基吡啶-2-基]-2-苯乙烷-1，2-二酮將(2，2-二甲基丙基)-(3-硝基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)胺(3.11克，10mmol)、NaHCO3(0.420克，5.0mmol)、MgSO4(2.40克，20mmol)在丙酮(85毫升)和水(25毫升)中的混合物冷卻，并冷卻至0℃。將KMnO4(3.16克，20.0mmol)加入到該冷卻混合物中，并在0℃劇烈攪拌該反應(yīng)混合物大約1-2小時(shí)。用Na2SO3(5.67g，45mmol)猝滅該混合物。除去冰浴并在RT攪拌混合物2小時(shí)。通過過濾劑的墊過濾固體。用水(2×50mL)和EtOAc(50mL)洗滌。將各相分離，并用EtOAc(3×50mL)提取水相。用飽和NaCl水溶液(25mL)洗滌合并的有機(jī)相，用MgSO4干燥，過濾并濃縮。純化粗品(硅膠色譜，用1∶1己烷∶CH2Cl2洗脫)，得到標(biāo)題化合物(1.586克，46％)。
MS(ES)m/z＝342[M+H]；mp88-90℃。-(2，2-二甲基丙基)胺在80℃，加熱1-[6-(2，2-二甲基丙氨基)-5-硝基吡啶-2-基]-2-苯乙烷-1，2-二酮(1.0241克，3.0mmol)、三甲基乙醛(0.66毫升，6.0mmol)、乙酸銨(3.47克，45mmol)在乙酸(5毫升/mmol)中的混合物，同時(shí)通過液相色譜-質(zhì)譜監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的出現(xiàn)。將反應(yīng)混合物冷卻到0℃，用5.0N NaOH中和至pH值7。用EtOAc(3×20mL)提取中和的水相，用20毫升飽和NaHCO3水溶液部分洗滌合并的有機(jī)相，直至沒有觀察到進(jìn)一步的中和。用MgSO4干燥有機(jī)相，過濾并濃縮。用EtOAc研磨橙色的粗品固體，獲得標(biāo)題化合物(0.7578g，62％)。
MS(ES)m/z＝408[M+H]；mp224-226℃。
基本上如制備例1所述，可以制備制備例2-21的化合物。
制備例226-[2-(2，6-二氯苯基)-5-苯基-1H-咪唑-4-基]-N2-異丁基吡啶-2，3-二胺向{6-[2-(2，6-二氯苯基)-5-苯基-1H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}異丁胺(1.43克，2.96mmol)在50毫升1∶1THF∶水混合物的溶液中加入連二亞硫酸鈉(2.58克，14.82mmol)，隨后加入32％NH4OH(9毫升)。將混合物在RT下攪拌2小時(shí)。用EtOAc稀釋。用飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)層，用Na2SO4干燥有機(jī)相。濃縮，得到標(biāo)題化合物(1.32克，98％)。
制備例232-異丁氨基-3-硝基-6-[3-(4-氟苯基)-1-嗎啉代乙基吡唑-4-基]吡啶2-異丁氨基-3-硝基-6-(4-氟苯基乙酮)吡啶將HgO(0.55克，2.54mmol)在100毫升4％H2SO4中的水懸浮液加入到2-異丁氨基-3-硝基-6-(4-氟苯基)乙炔基吡啶(3.99克，12.7mmol)的100毫升MeOH溶液中。在95℃攪拌17小時(shí)，冷卻至室溫。通過過濾劑過濾混合物，用EtOAc(5×100mL)溶解沉淀。濃縮并用10∶2∶1己烷∶乙醚∶MeOH(130mL)洗滌殘余物，形成標(biāo)題化合物(2.60克，62％)。
MS(ES)m/z＝332[M+H]。
2-異丁氨基-3-硝基-6-[3-(4-氟苯基)吡唑-4-基]吡啶。
將二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(4.50毫升，33.8mmol)加入到2-異丁氨基-3-硝基-6-(4-氟苯基-乙酮)-吡啶(5.63克，16.1mmol)在15毫升干燥DMF的攪拌溶液中。在80℃下加熱混合物6小時(shí)，冷卻至室溫，濃縮。將殘余物溶解在100mL EtOH中，加入8.30毫升肼(80％，在H2O中)，攪拌2小時(shí)，濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用己烷∶EtOAc1∶1洗脫)，得到標(biāo)題化合物(4.51g，75％)。
MS(ES)m/z＝356[M+H]。
2-異丁氨基-3-硝基-6-[3-(4-氟苯基)-1-嗎啉代乙基吡唑-4-基]吡啶在0℃，用95％NaH(0.36克，14.3mmol)處理2-異丁氨基-3-硝基-6-[3-(4-氟苯基)吡唑-4-基]吡啶(1.25克，3.52mmol)的干燥DMF(15毫升)溶液15分鐘。加入嗎啉代乙基氯鹽酸鹽(0.983克，5.28mmol)并慢慢地升溫至室溫。1小時(shí)之后，另外加入NaH(0.36克，14.3mmol)，并攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)。用MeOH(1mL)淬滅，并用水(30mL)稀釋。用EtOAc(100mL)提取，用MgSO4干燥，濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用己烷∶EtOAc1∶2洗脫)，得到標(biāo)題化合物(1.35g，81％)。
MS(ES)m/z＝469[M+H]。
制備例24(2，2-二甲基丙基)-[3-硝基-6-(5-苯基-3H-[1，2，3]三唑-4-基)-吡啶-2-基]胺將疊氮化鈉(0.065克)加入到2，2-二甲基丙基-(2-硝基-5-苯基乙炔基苯基)胺(0.153克)的DMSO(2.5毫升)溶液中。在80℃加熱2小時(shí)。冷卻到RT。加入10mL的1N HCl，用EtOAc(20mL)提取，用飽和NaCl水溶液(2×10mL)洗滌。用Na2SO4干燥剩下的有機(jī)相，濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用EtOAc∶己烷1∶2洗脫)，得到標(biāo)題化合物黃色固體(0.176g，100％)。
MS(ES)m/z＝353[M+H]。
制備例252-氨基-5-(2-氧代-2-苯乙?；?咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺N，N-二甲基-N’-(6-氯-3-硝基吡啶-2-基)磺酸將2，6-二氯-3-硝基吡啶(1克，2.60mmol)和N，N-二甲基磺酰胺(0.78克，3.12mmol)在干燥DMF(5毫升)中的混合物攪拌。加入氫化鋰(0.11g，6.76mmol)，并在RT下攪拌過夜。加入10mL水和3N HCl，直至pH值＝7。過濾該黃色固體，形成標(biāo)題化合物(85％)。
MS(ES)m/z＝279[M+H]。
N，N-二甲基-N’-(3-硝基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)磺酸將氮?dú)夤呐萃ㄟ^N，N-二甲基-N’-(6-氯-3-硝基吡啶-2-基)磺酸(3.86克，13.7mmol)、苯乙炔(2.3毫升，20.67mmol)、三苯基膦(0.09克，0.68mmol)和碘化銅(I)(0.06克，0.34mmol)在三乙胺(30毫升)和THF(60毫升)中的混合物3分鐘。將雙(三苯基膦)鈀(II)氯化物(0.24克，0.34mmol)加入到該混合物中，并在110℃加熱4小時(shí)。通過過濾劑墊過濾，濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用己烷∶EtOAc1∶1洗脫)，得到標(biāo)題化合物(80％)。
MS(ES)m/z＝346[M+H]。
N，N-二甲基-N’-(3-氨基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)磺酸在70℃，將N，N-二甲基-N’-(3-硝基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)磺酸(0.09克，0.26mmol)和氯化錫二水合物(0.35克，1.56mmol)在EtOAc(5毫升)和EtOH(2.5毫升)中的混合物攪拌2小時(shí)。濃縮并純化殘余物(硅膠色譜，用1∶1己烷∶EtOAc洗脫)，得到標(biāo)題化合物(65％)。
MS(ES)m/z＝317[M+H]。
2-氨基-5-苯基乙炔基咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺在80℃，將N，N-二甲基-N’-(3-氨基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)磺酸(0.20克，0.63mmol)、溴化氰(0.07克，0.69mmol)和甲醇鋰(0.04克，0.94mmol)在1，2二氯乙烷(20毫升)中的混合物攪拌過夜。濃縮并純化殘余物(硅膠色譜，用1∶1己烷∶EtOAc洗脫)，得到標(biāo)題化合物(45％)。
MS(ES)m/z＝342[M+H]。
2-氨基-5-(2-氧代-2-苯乙?；?咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺在0℃，將2-氨基-5-苯基乙炔基咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺(0.10克，0.31mmol)的丙酮(4毫升)溶液加入到機(jī)械攪拌的NaHCO3(0.01克，0.15mmol)和MgSO4(0.07克，0.62mmol)水溶液(4毫升)中。加入KMnO4(0.12克，0.748mmol)，并在0℃攪拌過夜。加入Na2SO3(0.13克)，攪拌1小時(shí)。加入EtOAc，用飽和NaCl水溶液洗滌，濃縮，得到標(biāo)題化合物橙色固體，其不用進(jìn)一步純化就可以使用(68％產(chǎn)率)。
MS(ES)m/z＝372[M+H]。
制備例26丙烷-2-磺酸{3-氨基-6-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]吡啶-2-基}酰胺丙烷-2-磺酸(3-硝基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)酰胺將丙烷-2-磺酸(5-氯-2-硝基苯基)酰胺(10克，35.7mmol)、苯乙炔(5.9毫升，53.6mmol)和三苯基膦(0.46克，1.78mmol)加入到三乙胺(25毫升，178.5mmol)的干燥THF(25毫升)溶液中，并用氮?dú)庾M系統(tǒng)。將二氯雙(三苯基膦)鈀(II)(0.625克，0.89mmol)和碘化銅(I)(0.17克，0.89mmol)加入到該攪拌混合物中。加熱反應(yīng)至回流4小時(shí)。冷卻到RT，濃縮至漿液。通過硅膠填料過濾粗品，使用EtOAc作為沖洗溶劑。濃縮濾液，用EtOAc-己烷結(jié)晶標(biāo)題化合物(7.9g，64％)。
MS(ES)m/z＝346[M+H]。
丙烷-2-磺酸[3-硝基-6-(2-氧代-2-苯乙?；?吡啶-2-基]酰胺在120℃，在氮?dú)夥諊?，將丙?2-磺酸(3-硝基-6-苯基乙炔基吡啶-2-基)酰胺(1.8克，5.26mmol)和氯化鈀(II)(0.93克，0.53mmol)在干燥DMSO(20毫升)中的混合物加熱12小時(shí)。冷卻至RT，濃縮至漿液，純化(硅膠色譜，用20∶80EtOAc∶己烷至30∶70EtOAc∶己烷的梯度洗脫)，得到標(biāo)題化合物(1.07克，54％)。
MS(ES)m/z＝346[M+H]。
丙烷-2-磺酸{6-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}酰胺在110℃，將丙烷-2-磺酸[3-硝基-6-(2-氧代-2-苯乙?；?吡啶-2-基]酰胺(0.25g，0.67mmol)、2，6-二氟苯甲醛(0.146毫升，1.35mmol)和乙酸銨(0.78克，10.05mmol)在乙酸(5毫升)中的混合物加熱2小時(shí)。冷卻到RT并濃縮。用EtOAc(30ml)稀釋，用飽和NaHCO3和飽和NaCl水溶液依次提取。用NaSO4干燥有機(jī)層，濃縮，純化(硅膠色譜，用30∶70EtOAc∶己烷洗脫)，得到標(biāo)題化合物(0.32克，95％)。
MS(ES)m/z＝500[M+H]。
丙烷-2-磺酸{3-氨基-6-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-吡啶-2-基}酰胺將10％Pd/C(0.033克)加入到丙烷-2-磺酸{6-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}酰胺(0.33g，0.66mmol)的MeOH(10毫升)攪拌溶液中。以幾部分加入硼氫化鈉(0.124克，3.3mmol)，同時(shí)在氮?dú)夥諊袛嚢?5分鐘。過濾催化劑并濃縮。用EtOAc(20ml)稀釋，用飽和NaHCO3和飽和NaCl水溶液依次提取。用Na2SO4干燥有機(jī)層，濃縮，得到標(biāo)題化合物(0.3g，98％)。
MS(ES)m/z＝470[M+H]。
制備例27丙烷-2-磺酸{3-氨基-6-[2-(2，6-二氯苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-吡啶-2-基}酰胺在100℃，將丙烷-2-磺酸{6-[2-(2，6-二氯苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}酰胺(0.262克，0.49mmol)和氯化錫(II)二水合物(0.55克，2.46mmol)在EtOH(10毫升)中的混合物加熱1小時(shí)。冷卻到RT，濃縮至漿液。將反應(yīng)混合物倒在飽和NaHCO3(20mL)中，并加入過濾劑。過濾并用EtOAc洗滌。分離各層，用飽和NaHCO3和飽和NaCl水溶液依次提取。用Na2SO4干燥有機(jī)層，濃縮，得到標(biāo)題化合物(0.21g，85％)。
MS(ES)m/z＝504[M+H]。
制備例281-芐基-2-甲基-4-溴-5-(2，4-二氟苯基)-1H-咪唑
1-芐基-2-甲基-5-溴-1H-咪唑?qū)-溴代琥珀酰亞胺(7.85克，44mmol)加入到1-芐基-2-甲基-1H-咪唑(8.0克，46mmol)的氯仿(200毫升)溶液中，并攪拌6小時(shí)。用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌，用MgSO4干燥，通過硅膠墊過濾。濃縮濾液，并將殘余物懸浮在乙醚(600mL)中，加熱到回流，并熱過濾。濃縮醚濾液，得到標(biāo)題化合物褐色固體(9.3g)。
MS(ES)m/z＝252[M+H]。
1-芐基-2-甲基-5-(2，4-二氟苯基)-1H-咪唑?qū)?-芐基-2-甲基-5-溴-1H-咪唑(4.71克，18.7mmol)、2，4-二氟苯基硼酸(6.92克，43.8mmol)、雙(乙酰基(acetato))雙(三苯基膦)-鈀(II)(1.4克，1.875mmol)、2N Na2CO3(19毫升，38mmol)、MeOH(19毫升)和1，2-二甲氧基乙烷(120毫升)的混合物到加熱回流18小時(shí)。冷卻到RT。加入水和EtOAc并分離各層。用MgSO4干燥有機(jī)層，過濾并濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用EtOAc∶CH2Cl2混合物洗脫)，得到所要求的化合物(3.59克)。
MS(ES)m/z＝285[M+H]。
溴化在室溫，將1-芐基-2-甲基-5-(2，4-二氟苯基)-1H-咪唑(3.58克，12.6mmol)和N-溴代琥珀酰亞胺(2.24克，12.6mmol)在氯仿(100毫升)中的混合物攪拌18小時(shí)。將反應(yīng)混合物直接加入到硅膠上，并用CH2Cl2∶EtOAc混合物洗脫，得到標(biāo)題化合物(3.41g)。
MS(ES)m/z＝364[M+H]。
制備例292-叔丁基-4-(4-氟苯基)_唑?qū)⒖缮虡I(yè)購買的2-溴-4’-氟苯乙酮(100.00克，460mmol)、2，2-二甲基-丙酰胺(93.06克，20mmol)的1，4-二_烷(600毫升)溶液回流2天。過濾沉淀，濃縮濾液，純化(硅膠色譜，用己烷∶EtOAc 60∶1洗脫)，得到標(biāo)題化合物(55克，55％)。
MS(ES)m/z＝220[M+H]。
基本上如制備例29所述，可以制備制備例30-31的化合物。
制備例322-叔丁基-4-(4-氟苯基)-5-三甲基錫烷基_唑在-78℃，將2-叔丁基-4-(4-氟苯基)_唑(0.61克，2.77mmol)溶解在THF(15毫升)中，并加入叔丁基鋰(3.3毫升，1.7M)。將混合物攪拌45分鐘。加入三甲基錫烷基氯(0.58克，2.90mmol)并使溫度達(dá)到RT。攪拌2小時(shí)，加入氯化銨溶液(200μL，用氨調(diào)節(jié)pH值＝8)，濃縮。
1H NMR(CDCl3)δ7.46(m.2H)，6.95(m，2H)，1.32(s，9H)，0.24(s，9H)。
制備例334-(4-氟苯基)-2-甲基噻唑?qū)?-溴-4’-氟苯乙酮(10克，46mmol)和硫代乙酰胺(6.9克，92mmol)的1，4-二_烷(60毫升)溶液回流3小時(shí)。過濾沉淀，用EtOAc洗滌，得到標(biāo)題化合物(6.5g，73％)。
MS(ES)m/z＝194[M+H]。
基本上如制備例33所述，可以制備制備例34的化合物。
制備例352-氨基-5-溴咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺2，6-二溴-3-硝基吡啶在50℃，加熱2，6-二氯-3-硝基吡啶(9克)和氫溴酸(90毫升)在乙酸(30％)中的混合物過夜。冷卻到RT，投入水(600mL)中。過濾固體，形成標(biāo)題化合物(87％)。
1H NMR(CDCl3)δ7.93(d，J＝8.14Hz，1H)，7.55(d，J＝8.14Hz，1H)。
N，N-二甲基-N’-(6-溴-3-硝基吡啶-2-基)磺酸將2，6-二溴-3-硝基吡啶(11.3g，39.25mmol)和N，N-二甲基磺酰胺(0.006克，47.10mmol)在DMF(40毫升)中的混合物攪拌。加入氫化鋰(0.81g，102.05mmol)，并在RT下攪拌過夜。加入100mL水和3N HCl，直至pH值＝7。過濾黃色固體，形成標(biāo)題化合物(93％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ10.25(br s，1H)，8.41(d，J＝8.59Hz，1H)，7.50(d，J＝8.59Hz，1H)，2.95(2，6H)。
N，N-二甲基-N’-(3-氨基-6-溴-吡啶-2-基)-磺酸加熱N，N-二甲基-N’-(6-溴-3-硝基吡啶-2-基)磺酸(11.6克，35.69mmol)和氯化錫(40克，178mmol)在EtOAC∶EtOH 500∶250毫升中的混合物4小時(shí)。濃縮并純化殘余物(硅膠色譜，用1∶1己烷∶EtOAc洗脫)。用水研磨，形成標(biāo)題化合物(85％)。
MS(ES)m/z＝297[M+H]。
2-氨基-5-溴咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺攪拌N，N-二甲基-N’-(3-氨基-6-溴代吡定-2-基)磺酸(0.40克，1.35mmol)、溴化氰(0.08克，1.48mmol)和甲醇鋰(0.08克，2.02mmol)在1，2-二氯乙烷(400毫升)中的混合物。在80℃攪拌2小時(shí)。濃縮并純化殘余物(硅膠色譜，用1∶1己烷∶EtOAc洗脫)，得到標(biāo)題化合物(82％)。
MS(ES)m/z＝322[M+H]。
制備例361-[2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-基]-2-(2，4-二氟-苯基)-乙烷-1，2-二酮5-(2，4-二氟-苯基乙炔基)-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺將5-溴-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(30.00克，105.94mmol)、Et3N(60毫升)和Pd(OAc)2[P(Ph)3]2(3.97克，5.30mmol)在甲苯(150毫升)中混合，并將得到的混合物在氮?dú)夥諊屑訜岬健?5℃。將1-乙炔基-2，4-二氟代苯(21.95克，158.92mmol)的甲苯(30毫升)溶液逐滴加入到上述混合物中，而后將得到的反應(yīng)混合物在80℃加熱3小時(shí)。冷卻反應(yīng)至25℃，并用飽和NH4Cl水溶液(300mL)淬滅。在室溫下將得到的反應(yīng)混合物攪拌20分鐘，然后過濾，用H2O洗滌固體，在真空過濾下干燥30分鐘。使固體在MTBE(200mL)中形成漿液，然后過濾并用MTBE(50mL)沖洗。在真空過濾下干燥所回收的固體，形成14.47克標(biāo)題化合物淡黃色固體。
MS(ES+)m/z＝341(M+1)氧化用MgSO4(10.23克，85.00mmol)和NaHCO3(1.79克，21.30mmol)水溶液(200毫升)處理5-(2，4-二氟-苯基乙炔基)-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(14.47克，42.51mmol)的丙酮(350毫升)溶液。將得到的反應(yīng)混合物放置在水浴中。加入硅藻土(28.50克)，隨后經(jīng)10分鐘加入KMnO4(14.11克，89.28mmol)，反應(yīng)放熱至～30℃。在室溫下攪拌3小時(shí)，然后用10wt％Na2SO3水溶液(150mL)淬滅。攪拌30分鐘，然后用硅藻土墊過濾，用10％MeOH/EtOAc(2×700mL，每次)洗滌。分離濾液的各層，用EtOAc(2×500mL，每次)提取水溶液。用水(500mL)和飽和氯化鈉水溶液(500mL)洗滌合并的有機(jī)物，然后用Na2SO4干燥，過濾，減壓濃縮，得到固體。用10％MeOH/EtOAc洗滌硅藻土的濾墊，減壓濃縮濾液，獲得額外的固體。將固體合并，用柱色譜純化，用2％的2N NH4/MeOH-EtOAc洗脫，然后用5％的2N NH4/MeOH-EtOAc洗脫，得到13.08g(82％產(chǎn)率)的標(biāo)題化合物橙棕色固體。
MS(ES+)m/z＝373(M+1)制備例37{6-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-硝基-吡啶-2-基}-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-胺1-[6-(1(R)，2，2-三甲基丙氨基)-5-硝基吡啶-2-基]-2-((4-氟苯基)乙烷-1，2-二酮將[6-(4-氟-苯基乙炔基)-3-硝基-吡啶-2-基]-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-胺(2.73g，8.00mmol)溶解在丙酮(60毫升)中。加入水(20毫升)，然后加入NaHCO3(336毫克，4mmol，0.5當(dāng)量)和MgSO4(1.9g，16mmol，2.0當(dāng)量)，并將該反應(yīng)冷卻至大約3℃。伴隨著強(qiáng)烈攪拌，分批加入KMnO4(2.5g，16mmol，2.0當(dāng)量)，同時(shí)保持溫度低于3℃。1-2小時(shí)之后，通過加入水(20mL)和Na2SO3(4.5g，36mmol)猝滅反應(yīng)，在室溫?cái)嚢柙摶旌衔?小時(shí)。借助于600mL乙酸乙酯和大約300mL水，用Celite_過濾懸浮液。分離各層，用飽和NaHCO3水溶液洗滌有機(jī)層四次，用飽和NaCl水溶液洗滌兩次。用Na2SO4干燥有機(jī)層，濾出固體，減壓濃縮上清液。將殘余物進(jìn)行中壓的硅膠色譜純化，用CH2Cl2/己烷的50-70％梯度洗脫，得到所需要的化合物橙色油(1.82g，61％產(chǎn)率)。
MS(ESI)m/z＝374.1(M+H)+。
成環(huán)將1-[6-(1(R)，2，2-三甲基丙氨基)-5-硝基吡啶-2-基]-2-((4-氟苯基)乙烷-1，2-二酮(747mg，2.0mmol)溶解在冰醋酸(10毫升)中，加入乙酸銨(2.3g，30mmol，15當(dāng)量)，而后加入三甲基乙醛(344毫克，4.0mmol，2當(dāng)量)。加熱該反應(yīng)混合物至100℃，保持1小時(shí)，減壓濃縮。將得到的固體在乙酸乙酯和水之間分配。用飽和NaHCO3水溶液洗滌有機(jī)層5次，用飽和NaCl水溶液洗滌兩次。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并減壓濃縮。將殘余物進(jìn)行中壓的硅膠色譜純化，用等濃度的10％乙酸乙酯/己烷系統(tǒng)洗脫，得到標(biāo)題化合物橙色固體(589毫克，67％產(chǎn)率)。
MS(ESI)m/z＝440.2(M+H)+
基本上如制備例37所述，可以制備制備例38-40的化合物。
制備例41{6-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-硝基-吡啶-2-基}-(2，2-二甲基-丙基)-胺將1-(4-氟-苯基)-2-[5-硝基-6-(2，2-二甲基丙氨基)-吡啶-2-基]-乙烷-1，2-二酮(1.08g，3.0mmol)溶解在冰醋酸中，加入乙酸銨(3.47g，45mmol，15當(dāng)量)，而后加入三甲基乙醛(517毫克，6.0mmol，2當(dāng)量)。加熱該反應(yīng)混合物至100℃，保持1小時(shí)，減壓濃縮。將得到的固體在乙酸乙酯和水之間分配。加入NaHCO3，直至氣體逸出結(jié)束。用飽和NaHCO3水溶液洗滌有機(jī)層5次，用飽和NaCl水溶液洗滌一次。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并減壓濃縮，得到標(biāo)題化合物黃橙色的固體(1.25g，97％產(chǎn)率)。
Exact MS計(jì)算值m/z＝426.230(M+H)+；實(shí)測(cè)值m/z＝426.2313(M+H)+。
實(shí)施例15-(2-叔丁基-5-苯基-3H-咪唑-4-基)-3-(2，2-二甲基丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽在氫氣球條件下，攪拌6-(2-叔丁基-5-苯基-3H-咪唑-4-基)-3-硝基吡啶-2-基]-(2，2-二甲基丙基)胺(0.20克，0.5mmol)和10％鈀/碳(0.025克)在EtOH(10毫升)中的懸浮液過夜。將懸浮液通過過濾劑過濾，并用EtOH(2×5mL)洗滌。濃縮濾液至大約5毫升，在RT用溴化氰(1.3mmol)處理。用飽和碳酸氫鈉水溶液(2mL)淬滅，攪拌15-60分鐘。將混合物用水(50毫升)稀釋，并用CH2Cl2(2×10mL)提取。用飽和NaCl水溶液(5mL)洗滌合并的有機(jī)相，用MgSO4干燥，過濾，濃縮，并純化(硅膠色譜，用從100％CH2Cl2開始、至5∶95氨化的MeOH∶CH2Cl2的分級(jí)梯度洗脫)，得到所需要的化合物。將游離堿分離，而后通過用甲磺酸處理MeOH-水溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}，隨后冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物。
MS(ES)m/z＝402[M+H]。
基本上如實(shí)施例1所述，可以制備實(shí)施例2-14的化合物。
實(shí)施例153-環(huán)丙基甲基-5-[2-(2，6-二氯苯基)-5-(4-氟苯基)-3H-咪唑-4-基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽在氮?dú)夥諊?，用氯化亞錫二水合物(0.5641克，2.5mmol)處理(環(huán)丙基甲基{6-[2-(2，6-二氯苯基)-5-(4-氟苯基)-3H-咪唑-4-基[-3-硝基吡啶-2-基}胺(0.250克，0.5mmol)在EtOH(10毫升)中的懸浮液，并回流加熱2.5小時(shí)。冷卻至RT，慢慢地用飽和NaHCO3水溶液(5mL)和EtOAc(5mL)猝滅。將過濾劑加入到得到的懸浮液中，并進(jìn)一步用各自5mL的NaHCO3水溶液和EtOAc稀釋混合物。通過過濾劑的墊過濾混合物。用各自10mL的NaHCO3水溶液和EtOAc洗滌固體。將有機(jī)層分離，并用EtOAc(10mL)提取水相。用飽和NaCl水溶液(5mL)洗滌合并的有機(jī)相，用MgSO4干燥，過濾并濃縮。將粗品苯二胺溶解在EtOH(5mL)中，并用溴化氰(1.0mmol)處理。用飽和NaHCO3水溶液(2mL)淬滅，攪拌15-60分鐘。將混合物用水(5毫升)稀釋，并用CH2Cl2(2×10mL)提取。用飽和NaCl水溶液(5mL)洗滌合并的有機(jī)相，用MgSO4干燥，過濾，濃縮，并純化(硅膠色譜，用從100％CH2Cl2開始、至5∶95的5％氨/MeOH∶CH2Cl2的分級(jí)梯度洗脫)，得到所需要的化合物。將游離堿分離，而后通過用甲磺酸處理MeOH-水溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}，隨后冷凍干燥。
MS(ES)m/z＝495.1[M+H]。
基本上如實(shí)施例15所述，可以制備實(shí)施例16-35的化合物。
實(shí)施例365-[2-叔丁基-5-(4-氟苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基丙基)-2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶甲磺酸鹽按照實(shí)施例1，還原并分離{6-[2-叔丁基-5-(4-氟苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}-(2，2-二甲基丙基)胺(0.43克；1.0mmol)。使粗品二胺與純的原乙酸三乙酯在120℃反應(yīng)過夜。濃縮并用15mL 1N HCl稀釋。用飽和NaHCO3中和，并用CH2Cl2提取。用飽和NaCl洗滌有機(jī)層，用Na2SO4干燥，濃縮，純化(硅膠色譜，用EtOAc∶CH2Cl250∶50洗脫)，得到標(biāo)題化合物褐色固體(0.11克；53％產(chǎn)率)?；旧先鐚?shí)施例1所述，將游離堿產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}。
MS(ES)m/z＝420[M+H].
基本上如實(shí)施例36所述，可以制備實(shí)施例37-38的化合物。
實(shí)施例395-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基丙基)-2-甲基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶甲磺酸鹽基本上如實(shí)施例16所述，將{6-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}-(2，2-二甲基丙基)胺還原，而后如所實(shí)施例36述，使二胺在原乙酸三甲酯反應(yīng)，得到游離堿褐色固體(0.11克；49％產(chǎn)率)?；旧先鐚?shí)施例1所述，將游離堿產(chǎn)物形成為甲磺酸鹽。
MS(ES)m/z＝458[M+H]。
基本上如實(shí)施例39所述，可以制備實(shí)施例40-45的化合物。
實(shí)施例465-[2-(2-氯-6-氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶甲磺酸鹽基本上如實(shí)施例15所述，將{6-[2-(2-氯-6-氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-硝基吡啶-2-基}-(2，2-二甲基丙基)胺還原。使二胺與純的原甲酸三乙酯回流24小時(shí)，并在RT另外回流24小時(shí)?；旧先鐚?shí)施例36所述，純化并分離游離堿(0.11克，49％產(chǎn)率)?；旧先鐚?shí)施例1所述，轉(zhuǎn)變成甲磺酸鹽。
MS(ES)m/z＝460[M+H]。
基本上如實(shí)施例46所述，可以制備實(shí)施例47-48的化合物。
實(shí)施例495-[3-(4-氟苯基)-1-異丙基吡唑-4-基]-3H-3-異丁基咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二-甲磺酸鹽在NH4OH(8.70毫升，32％，在水中)的存在下，將次硫酸鈉(2.55克，14.6mmol)加入到2-異丁胺基-3-硝基-6-[3-(4-氟苯基)-1-異丙基吡唑-4-基]吡啶(0.50克，1.27mmol)的25毫升1∶1 THF∶H2O溶液中。2小時(shí)之后，用水稀釋(25毫升)。用EtOAc(100mL)提取，用MgSO4干燥，濃縮。將殘余物溶解在1∶1 CH2Cl2∶EtOH(25毫升)中，加入溴化氰(0.16克，1.51mmol)，并攪拌大約48小時(shí)。濃縮并純化殘余物(硅膠色譜，用EtOAc∶MeOH 16∶1洗脫)。用乙醚己烷再結(jié)晶，形成游離堿(0.44克，88％)。基本上如實(shí)施例1所述，轉(zhuǎn)變成甲磺酸鹽(58％產(chǎn)率)。
MS(ES)m/z＝393[M+H]。
基本上如實(shí)施例49所述，可以制備實(shí)施例50-62的化合物。
實(shí)施例63N’-{5-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基}-N，N-二甲基甲脒將基本上如實(shí)施例1所述制備的N’-{5-[2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(0.10克，0.225mmol)、N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(0.05毫升，0.4mmol)在甲苯(1.5毫升)中回流2小時(shí)。冷卻到RT并濃縮。純化(硅膠色譜，用1∶1CH2Cl2∶乙腈洗脫)，得到標(biāo)題化合物(0.11g)。
MS(ES)m/z＝500[M+H]。
基本上如實(shí)施例63所述，可以制備實(shí)施例64的化合物。
實(shí)施例65N’-{5-[2-(2，6-二氯苯基)-3-甲基-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基}-N，N-二甲基甲脒在室溫，將基本上如實(shí)施例63所述制備的N’-{5-[2-(2，6-二氯苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基}-N，N-二甲基甲脒(0.10克，0.188mmol)、碘代甲烷(0.040克，0.282mmol)和Cs2CO3(0.09克，0.28mmol)在DMF(1.5毫升)中攪拌大約24小時(shí)。用EtOAc提取，用水(3x)、飽和NaCl水溶液洗滌，然后用Na2SO4干燥。過濾并濃縮，得到甲基異構(gòu)體的混合物。純化(硅膠色譜)，用1∶1∶0.4CH2Cl2∶乙腈∶己烷洗脫，得到標(biāo)題化合物(0.02克)。
MS(ES)m/z＝548[M+H]。
實(shí)施例665-[2-(2，6-二氟苯基)-3-甲基-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺在100℃，在1∶1冰醋酸∶濃HCl(0.6毫升)中加熱N’-{5-[2-(2，6-二氟苯基)-3-甲基-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基}-N，N-二甲基甲脒(0.02克，0.04摩爾)30分鐘。冷卻到RT。加入CH2Cl2和水，用5N NaOH中和到大約pH值＝7，同時(shí)快速攪拌。用CH2Cl2提取水相三次，合并有機(jī)層，用飽和NaCl水溶液洗滌，用Na2SO4干燥。過濾并濃縮，得到標(biāo)題化合物(0.02克)。
MS(ES)m/z＝459[M+H]
基本上如實(shí)施例66所述，可以制備實(shí)施例67的化合物。
實(shí)施例683-(2，2-二甲基丙基)-5-(5-苯基-3H-[1，2，3]三唑-4-基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將(2，2-二甲基-丙基)-[3-硝基-6-(5-苯基-3H-[1，2，3]三唑-4-基)吡啶-2-基]胺(0.180克，0.51mmol)和10％Pd/C(0.025克)懸浮在EtOH(10毫升)中，并在RT、在含有氫氣的氣球條件下攪拌5小時(shí)。使用過濾劑過濾反應(yīng)混合物，濃縮到大約反應(yīng)體積的一半。不用進(jìn)一步分離或純化就可以立刻使用該二胺(MS(ES)m/z323[M+H]，并在EtOH(5mL)中用溴化氰(0.09g)處理。在氮?dú)鈼l件下攪拌3.5小時(shí)，用飽和NaHCO3水溶液(2.0mL)淬滅，攪拌，用CH2Cl2(5mL)和H2O(5mL)稀釋，分離各相。用CH2Cl2(2×5mL)提取水相，用各自5毫升的H2O和飽和NaCl水溶液洗滌合并的有機(jī)相，用MgSO4干燥。過濾并濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用4∶96的2.0N氨/MeOH∶CH2Cl2洗脫)，得到游離堿。通過用甲磺酸處理MeOH-水溶液轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}，隨后冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(0.07g，39％)。
MS(ES)m/z＝348[M+H]。
基本上如實(shí)施例68所述，可以制備實(shí)施例69-71的化合物。
實(shí)施例725-[2-(2-氯-6-氟苯基)-5-苯基-1H-咪唑-4-基]-3-異丁基-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-b]吡啶甲磺酸鹽將6-[2-(2-氯-6-氟苯基)-5-苯基-1H-咪唑-4-基]-N2-異丁基吡啶-2，3-二胺(1.1克，2.52mmol)的CH2Cl2(9毫升)溶液和50％乙酸水溶液(9毫升)逐滴加入到亞硝酸鈉水溶液(0.1毫升)(0.184克，2.66mmol)中。攪拌該反應(yīng)混合物15分鐘，加入另外的CH2Cl2，并用飽和NaCl水溶液、NaHCO3水溶液(5％)洗滌有機(jī)層，用MgSO4干燥，濃縮。純化殘余物(硅膠色譜，用4∶1至1∶2的己烷∶EtOAc洗脫)，得到游離堿(70％)。MS(ES)m/z＝447[M+H]。將0.34毫升的1M甲磺酸的9∶1CH2Cl2∶MeOH溶液加入到該游離堿(0.15克，0.336mmol)的10毫升9∶1CH2Cl2∶MeOH溶液中。攪拌該溶液5分鐘，濃縮，并在乙醚中研磨該白色固體。過濾固體，形成標(biāo)題化合物(71％)。
MS(ES)m/z＝447[M+H]。
基本上如實(shí)施例72所述，可以制備實(shí)施例73-75的化合物。
實(shí)施例762-氨基-5-(2-叔丁基-5-苯基-3H-咪唑-4-基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺甲磺酸鹽在90℃，將2-氨基-5-(2-氧代-2-苯乙?；?咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺(0.07克，0.20mmol)、三甲基乙醛(65微升，0.6mmol)和乙酸銨(0.23克，3mmol)在乙酸(5毫升)中的混合物加熱4小時(shí)。冷卻到RT。用飽和NaHCO3水溶液稀釋，用EtOAc提取。濃縮有機(jī)相并純化(硅膠色譜，用15∶1 CH2Cl2∶MeOH洗脫)，得到游離堿(35％)。MS(ES)m/z＝438[M+H]。將5.4毫升1M甲磺酸的95∶5CH2Cl2∶MeOH溶液加入到該游離堿(0.02克，0.054mmol)的5毫升95∶5CH2Cl2∶MeOH溶液中。攪拌該溶液5分鐘，濃縮，并在乙醚中研磨該白色固體。過濾固體，得到標(biāo)題化合物(71％)。
MS(ES)m/z＝440[M+H]。
基本上如實(shí)施例76所述，可以制備實(shí)施例77-79的化合物。
實(shí)施例805-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-(丙烷-2-磺酰基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽在室溫，攪拌丙烷-2-磺酸{3-氨基-6-[2-(2，6-二氟苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-吡啶-2-基}酰胺(0.37克，0.79mmol)、溴化氰(0.104克，0.99mmol)和甲醇鋰(0.033克，0.87mmol)在二氯甲烷(10毫升)中的混合物12小時(shí)。加入飽和NaHCO3(10mL)，攪拌1小時(shí)。分離各層，用飽和NaCl水溶液提取。用NaSO4干燥有機(jī)層，濃縮，純化(硅膠色譜，用40∶60EtOAC∶己烷至80∶20EtOAc∶己烷的梯度洗脫)，得到游離堿(0.21g，54％)。MS(ES)m/z＝495[M+H]。將甲磺酸加入到該游離堿在1毫升5∶1甲醇∶二氯甲烷的混合物的溶液中。濃縮該溶液，加入乙醚。過濾固體，干燥，得到標(biāo)題化合物。
MS(ES)m/z＝495[M+H]。
基本上如實(shí)施例80所述，可以制備實(shí)施例81-91的化合物。
實(shí)施例925-[2-叔丁基-4-(4-氟苯基)_唑-5-基]-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺將氮?dú)夤娜?-叔丁基-4-(4-氟苯基)_唑(0.145克，0.66mmol)、5-溴-3-異丁基-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(0.355克，1.32mmol)、碳酸銫(6.06克，18.6mmol)、乙酸鈀(II)(0.201克，10％)和三苯基膦(0.14克，0.07mmol)在DMF(1.5毫升)的懸浮液中。在100℃加熱反應(yīng)過夜，冷卻到RT，并在EtOAc和飽和NaCl水溶液之間分配。用飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)層/用Na2SO4干燥，過濾，濃縮，純化(硅膠色譜，用2％的2M氨/MeOH-CH2Cl2洗脫)，得到標(biāo)題化合物(0.07g，34％)。
MS(ES)m/z＝408[M+H]。
基本上如實(shí)施例92所述，可以制備實(shí)施例93-96的化合物，同時(shí)基本上如實(shí)施例1所述，將游離堿轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}。
實(shí)施例972-氨基-5-(2-叔丁基-5-(4-氟苯基)_唑-5-基)咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺在密封管中，將2-氨基-5-溴咪唑并[4，5-b]吡啶-3-磺酸二甲基酰胺(0.05克，0,156mmol)溶解在甲苯(3毫升)中。加入2-叔丁基-4-(4-氟苯基)-5-三甲基錫烷基_唑(0.07克，0.17mmol)和四(三苯基膦)鈀(O)(0.02克，0.015mmol)。將混合物在110℃下加熱4小時(shí)。濃縮并純化(硅膠色譜，用20∶1 CH2Cl2∶MeOH洗脫)，得到標(biāo)題化合物(14％)。
MS(ES)m/z＝459[M+H]。
基本上如實(shí)施例97所述，可以制備實(shí)施例98的化合物，同時(shí)基本上如實(shí)施例1所述，將游離堿轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆撬猁}。
實(shí)施例995-[2-(2，6-二氯-苯基)-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將1-[2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-基]-2-(4-氟-苯基)-乙烷-1，2-二酮(19.58克，55.24mmol)、2，6-二氯-苯甲醛(15.47克，88.39mmol)和NH4OAc(42.58克，552.41mmol)在冰醋酸(200毫升)中混合，并在85℃、在氮?dú)夥諊袛嚢?小時(shí)。將得到的反應(yīng)混合物減壓濃縮。將殘余物溶解在乙酸乙酯(2,000毫升)中，并該得到的溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×1,000毫升，每次)、水(1,000毫升)和飽和氯化鈉水溶液(1,000毫升)洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾，而后減壓濃縮。用柱色譜純化，用乙酸乙酯-己烷(1∶1)、然后乙酸乙酯-己烷(2∶1)、然后純的乙酸乙酯、然后5％的2N NH3/MeOH-乙酸乙酯洗脫，得到11.70克(41.5％產(chǎn)率)的5-[2-(2，6-二氯-苯基)-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺類白色固體。MS(ES+)m/z＝509(M+1)。
將5-[2-(2，6-二氯-苯基)-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(11.20克，21.99mmol)在甲醇(150毫升)中混合，而后逐滴加入甲磺酸(2.11克，21.96mmol)的甲醇(10毫升)溶液。在室溫下攪拌20分鐘，而后減壓濃縮。加入乙酸乙酯(150毫升)，將得到的漿液過濾，用乙醚(200毫升)洗滌濾餅。將得到的固體在干燥箱中、在80℃、在真空條件下干燥2小時(shí)，得到12.765g(95％產(chǎn)率)的標(biāo)題化合物淺紫色固體。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)δ7.78-7.50(m，7H)，7.24-7.20(m，2H)，3.86(s，2H)，2.70(s，3H)，0.85(s，9H)TOF-MS[ES+，M+H]觀測(cè)值m/z 509.1412，計(jì)算值m/z509.1423。
實(shí)施例1003-(2，2-二甲基-丙基)-5-[5-(4-氟-苯基)-2-(2-氟-6-三氟甲基-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將1-[2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-基]-2-(4-氟-苯基)-乙烷-1，2-二酮(18.32克，51.69mmol)和2-氟-6-三氟甲基-苯甲醛(15.00克，78.08mmol)和NH4OAc(39.84克，516.90mmol)在冰醋酸(200毫升)中混合，并在85℃、在氮?dú)夥諊袛嚢?小時(shí)。將得到的反應(yīng)混合物減壓濃縮。將殘余物溶解在乙酸乙酯(2,000毫升)中，并該得到的溶液用飽和NaHCO3水溶液(2×1,000毫升，每次)、水(1,000毫升)和飽和氯化鈉水溶液(1,000毫升)洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾，而后減壓濃縮。用柱色譜純化，用純的乙酸乙酯、然后2％的2N氨/MeOH-乙酸乙酯、然后5％的2N氨/MeOH-乙酸乙酯洗脫，得到7.38克3-(2，2-二甲基-丙基)-5-[5-(4-氟-苯基)-2-(2-氟-6-三氟甲基-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺類白色固體。用柱色譜純化不純的餾份，用純的乙酸乙酯、然后1％的2N氨/MeOH-乙酸乙酯、然后2％的2N氨/MeOH-乙酸乙酯、然后3％的2N氨/MeOH-乙酸乙酯洗脫，得到額外的4.68克所需要的化合物。
MS(ES+)m/z＝527(M+1)將3-(2，2-二甲基-丙基)-5-[5-(4-氟-苯基)-2-(2-氟-6-三氟甲基-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(11.56克，21.95mmol)在甲醇(150毫升)中混合，而后逐滴加入甲磺酸(2.11克，21.96mmol)的MeOH(10毫升)溶液。將得到的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20分鐘，然后減壓濃縮。使殘余物在乙醚中形成漿液，過濾，并用新鮮乙醚洗滌。將得到的固體在干燥箱中、在室溫下、在真空條件下干燥48小時(shí)，得到12.015g(87.9％產(chǎn)率)的標(biāo)題化合物淺紫色固體。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)δ7.84-7.60(m，7H)，7.24-7.20(m，2H)，3.86(s，2H)，2.70(s，3H)，0.85(s，9H)TOF-MS[ES+，M+H]觀測(cè)值m/z527.1979，計(jì)算值m/z527.1982。
實(shí)施例1015-[2-叔丁基-5-(2，4-二氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將1-[2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-基]-2-(2，4-二氟-苯基)-乙烷-1，2-二酮(17.36克，46.62mmol)和三甲基乙醛(6.42克，74.53mmol)和NH4OAc(35.93克，466.20mmol)在冰醋酸(200毫升)中混合，并在85℃、在氮?dú)夥諊袛嚢?.5小時(shí)。冷卻到室溫過夜。在85℃加熱反應(yīng)5小時(shí)，然后在100℃加熱3小時(shí)，然后冷卻到室溫過夜。將得到的反應(yīng)混合物減壓濃縮。將殘余物溶解在EtOAc(2L)中，并將得到的溶液用飽和NaHCO3(2×1L)、H2O(1L)和飽和氯化鈉水溶液(1L)洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)物，過濾，而后減壓濃縮。用柱色譜純化，用純的EtOAc、然后1％的2N氨/MeOH-EtOAc、然后2％的2N氨/MeOH-EtOAc、然后3％的2N氨/MeOH-EtOAc洗脫，得到10.28克的5-[2-叔丁基-5-(2，4-二氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺類白色固體。
MS(ES+)m/z＝439(M+1)將5-[2-叔丁基-5-(2，4-二氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(11.55克，26.33mmol)在MeOH(150毫升)中混合，而后逐滴加入甲磺酸(2.53克，26.33mmol)的MeOH(10毫升溶液)。在室溫下將得到的反應(yīng)混合物攪拌20分鐘，然后減壓濃縮。使殘余物在Et2O中形成漿液，然后過濾，并用新鮮Et2O洗滌。將得到的固體在干燥箱中、在室溫下、在真空條件下干燥過夜，然后在80℃干燥1.5小時(shí)。在MeOH中將該鹽溶解，而后用NaHCO3處理，直至堿性。用EtOAc提取得到的溶液，用Na2SO4干燥合并的有機(jī)物，過濾，然后減壓濃縮。用柱色譜純化，用純的EtOAc、然后1％的2N氨/MeOH-EtOAc、然后2％的2N氨/MeOH-EtOAc洗脫，得到9.38克的5-[2-叔丁基-5-(2，4-二氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺。將5-[2-叔丁基-5-(2，4-二氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(9.38克，21.39mmol)在無水MeOH(150毫升)中混合，而后)逐滴加入甲磺酸(2.06克，21.43mmol)的MeOH(10毫升)溶液。將得到的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30分鐘，然后減壓濃縮。使殘余物在Et2O中形成漿液，然后過濾，并用新鮮Et2O洗滌。將得到的固體在干燥箱中、在室溫下、在真空條件下干燥48小時(shí)，得到10.695g(76％產(chǎn)率)的標(biāo)題化合物褐色固體。
1H-NMR(400MHz；CD3OD)δ7.74-7.66(m，2H)，7.60-7.54(m，1H)，7.15-7.08(m，2H)，3.70(s，2H)，2.70(s，3H)，1.51(s，9H)，0.81(s，9H)TOF-MS[ES+，M+H]觀測(cè)值m/z＝439.2398；計(jì)算值m/z＝439.2422實(shí)施例1025-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽在氫氣球條件下，將{6-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-硝基-吡啶-2-基}-(2，2-二甲基丙基)-胺(426毫克，1.0mmol)和10％鈀/碳(85毫克)在100％乙醇中的懸浮液攪拌過夜。通過0.2μm針筒式濾器過濾該懸浮液，減壓濃縮。將殘余物溶解在10％乙醇水溶液中，并在室溫下用溴化氰(80毫克，0.75mmol，1.5當(dāng)量)處理。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，用飽和NaHCO3水溶液猝滅反應(yīng)。加入乙酸乙酯和水，以溶解所有的固體。用飽和NaHCO3水溶液洗滌有機(jī)層一次，用飽和NaCl水溶液洗滌一次，用Na2SO4干燥，過濾并減壓濃縮。將殘余物進(jìn)行中壓硅膠色譜純化，用50％乙酸乙酯/CH2Cl2、然后用1.5-3.5％(2M氨/MeOH)/CH2Cl2洗脫，形成5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺褐色泡沫體(156毫克，74％產(chǎn)率)。
用甲磺酸處理5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺的甲醇-水溶液，隨后冷凍干燥，形成標(biāo)題化合物。
精確MS計(jì)算值m/z＝421.2516(M+H)+；實(shí)測(cè)值m/z＝421.2523(M+H)+。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.85(d，1H，J＝7.9Hz)，7.85(d，1H，J＝7.9Hz)，7.72(d，1H，J＝8.4Hz)，7.62(dd，2H，J＝8.8，4.8Hz)，7.27(t，2H，J＝8.8Hz)，3.90(s，2H)，2.70(s，3H)，1.62(s，9H)，0.89(s，9H)實(shí)施例1035-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺富馬酸鹽將126毫克(0.3mmol)5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺溶解在1.0毫升88％丙酮*中。伴隨著搖動(dòng)，逐漸地加入70mg富馬酸的溫?zé)?8％丙酮溶液。加入晶種，過濾得到的沉淀?？諝飧稍?，形成145mg(74％)的輕微紫色毛發(fā)似的晶體。
*(剩余部分是水，按體積)實(shí)施例104晶體5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽將126毫克(0.3mmol)5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺溶解在2.0毫升丙酮中。逐漸加入58mg甲磺酸。加入晶種，過濾得到的沉淀?？諝飧稍铮纬?14mg(62％)的類白色不規(guī)則晶體。
m.p.＞250℃實(shí)施例105非晶形5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽將5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽(300毫克)溶解在5毫升去離子水中。通過0.45μm濾過器將溶液過濾到預(yù)先冷卻的500mL容量瓶中。在燒瓶的底部和側(cè)面快速地冷凍溶液。凍干24小時(shí)，形成非晶形5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽。
實(shí)施例1065-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺琥珀酸鹽將126毫克(0.3mmol)5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺溶解在2.0毫升88％丙酮*中。逐漸地加入71mg琥珀酸/1mL溫?zé)?8％丙酮溶液。加入晶種，過濾得到的沉淀?？諝飧稍铮纬?23mg(63％)的非常淺的紫色晶體。
*(剩余部分是水，按體積)實(shí)施例1075-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺馬來酸氫鹽將126毫克(0.3mmol)5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺溶解在1.0毫升異丙醇中。逐漸地加入69.6mg馬來酸/1mL溫?zé)岙惐既芤?。加入晶種，過濾得到的沉淀?？諝飧稍?，形成120mg(63％)的非常淺的紫色晶體。
實(shí)施例1085-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二鹽酸鹽將126毫克(0.3mmol)5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺溶解在2.0毫升丙酮中。逐漸地加入120μL的5N鹽酸。將得到的沉淀過濾?？諝飧稍铮纬?40mg(93％)的非常淺的粉紅色晶體。
實(shí)施例1095-[2-(2-氯-6-氟-苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將{6-[2-(2-氯-6-氟-苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-硝基-吡啶-2-基}-(2，2-二甲基丙基)-胺(240mg，0.50mmol)溶解在100％乙醇(10毫升)中，并加入二氯化錫(II)二水合物(564mg，2.50mmol，5.0當(dāng)量)。加熱反應(yīng)混合物，直至原料耗盡。將反應(yīng)溶液冷卻到室溫，慢慢地用飽和NaHCO3水溶液猝滅。將Celite_加入到猝滅反應(yīng)中，并在Celite_墊上過濾該懸浮液，用水和乙酸乙酯洗滌。分離各層，將有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并減壓濃縮。將10％乙醇水溶液和溴化氰(106毫克，1.00mmol，2.0當(dāng)量)加入到得到的固體中，攪拌過夜。用飽和NaHCO3水溶液(20毫升)猝滅反應(yīng)。加入乙酸乙酯和水，以溶解所有的固體。用飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)層三次，用Na2SO4干燥，過濾并減壓濃縮。將殘余物進(jìn)行中壓硅膠色譜純化，用1.5-3％(2M氨/MeOH)/CH2Cl2的梯度洗脫，形成5-[2-(2-氯-6-氟-苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺黃綠色固體(196毫克，60％產(chǎn)率)。
用甲磺酸處理5-[2-(2-氯-6-氟-苯基)-5-苯基-3H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺的甲醇-水溶液，隨后冷凍干燥，形成標(biāo)題化合物。
MS(ESI)m/z＝475.2(M+H)+。
實(shí)施例1105-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將{6-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-硝基-吡啶-2-基}-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-胺(558mg，1.27mmol)在溶解100％乙醇(15毫升)中，并加入二氯化錫(II)二水合物(1.4g，6.3mmol，5當(dāng)量)。加熱反應(yīng)混合物，直至原料耗盡。將反應(yīng)溶液冷卻到室溫，慢慢地用飽和NaHCO3水溶液猝滅。加入Celite_，并在Celite_墊上過濾該懸浮液，用水和乙酸乙酯洗滌。分離各層，將有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并減壓濃縮。將10％乙醇水溶液(13毫升)和溴化氰(202毫克，1.99mmol，1.5當(dāng)量)加入到殘余物中，攪拌過夜。再加入1.5當(dāng)量的溴化氰，攪拌3小時(shí)，用飽和NaHCO3水溶液(20毫升)淬滅。加入乙酸乙酯和水，以溶解所有的固體。用飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)層三次，用Na2SO4干燥，過濾并減壓濃縮。將殘余物進(jìn)行中壓硅膠色譜純化，用1.5-4％(2M氨/MeOH)/CH2Cl2的梯度洗脫，形成5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-
3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺褐色玻璃體(158毫克，29％產(chǎn)率)。
用甲磺酸處理5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺的甲醇-水溶液，隨后冷凍干燥，形成標(biāo)題化合物。
MS(ESI)m/z＝435.2(M+H)+實(shí)施例1115-[2-(2，6-二氟-苯基)-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺甲磺酸鹽將{6-[2-(2，6-二氟-苯基)-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-硝基-吡啶-2-基}-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-胺(673mg，1.4mmol)溶解在100％乙醇(15毫升)中，并加入二氯化錫(II)二水合物(1.5g，6.8mmol，5當(dāng)量)。加熱反應(yīng)混合物，直至原料耗盡。將反應(yīng)溶液冷卻到室溫，慢慢地用飽和NaHCO3水溶液猝滅。將Celite_加入到猝滅的反應(yīng)中，并在Celite_墊上過濾該懸浮液，用水和乙酸乙酯洗滌。分離各層，將有機(jī)層用飽和NaCl水溶液洗滌。用Na2SO4干燥有機(jī)層，過濾并減壓濃縮。將10％乙醇水溶液(14毫升)和溴化氰(216毫克，2.04mmol，1.5當(dāng)量)加入到殘余物中，攪拌過夜。用飽和NaHCO3水溶液(20毫升)猝滅。加入乙酸乙酯和水，以溶解所有的固體。用飽和NaCl水溶液洗滌有機(jī)層，用Na2SO4干燥，過濾并減壓濃縮。將殘余物進(jìn)行中壓硅膠色譜純化，用1.5-3％(2M氨/MeOH)/CH2Cl2的梯度洗脫，形成5-[2-(2，6-二氟-苯基)-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺褐色玻璃體(289毫克，43％產(chǎn)率)。
用甲磺酸處理5-[2-(2，6-二氟-苯基)-5-(4-氟-苯基)-3H-咪唑-4-基]-3-(1(R)，2，2-三甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺的甲醇-水溶液，隨后冷凍干燥，形成標(biāo)題化合物。
MS(ESI)m/z＝491.2(M+H)+實(shí)施例1125-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽5-溴-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基-銨溴化物在H2O(20mL，0.4體積)中攪拌50wt％次磷酸水溶液(0.555g)和5％Pt/C(2.5g)的混合物10分鐘。加入固體VO(acac)2(0.420克，1.20mmol)，并額外攪拌該黑色漿液5分鐘。在一升高壓釜中，在室溫，將該漿液加入到2-(2，2-二甲基丙氨基)-3-硝基-6-溴吡啶(50.00克，173.61mmol)在甲苯(500.00毫升)的混合物中。在35psi(2.38大氣壓)H2的存在下，將高壓釜加熱到75℃，同時(shí)以100rpm攪拌。3小時(shí)之后，用HyfloSuper Cel_墊過濾該反應(yīng)混合物，并將濾液減壓濃縮至溶液全部質(zhì)量(273.0g)的一半。攪拌該溶液，加入溴化氰(18.4克，173.70mmol)，隨后加入MeOH(250毫升)。18小時(shí)之后，加熱至40℃，減壓濃縮，直至通過短路徑蒸餾收集350mL溶劑。用MTBE(350mL，7.0體積)稀釋所得到的漿液，冷卻至0℃，攪拌1小時(shí)。濾出固體，用MTBE(75mL，1.5體積)洗滌，在40℃減壓干燥24小時(shí)，形成48.06克(76％)所需要的化合物白色固體。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.96(9H，s)，3.91(2H，s)，7.45(1H，d，J＝8.1 Hz)，7.64(1H，d，J＝8.1Hz)，8.73(2H，bs)。
MS(ES-)m/z＝282.0；(M-1)-3-(2，2-二甲基-丙基)-5-(4-氟-苯基乙炔基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2- 基胺將三乙胺(27.10克，267.80mmol)加入到5-溴-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基-銨溴化物(25.00克，68.67mmol)在乙醇(25毫升)和甲苯(75毫升)的混合物中。加熱到70-75℃，而后加入Pd(OAc)2(0.15克，0.69mmol)、三苯基膦(0.72克，2.75mmol)和碘化銅(I)(0.13克，0.69mmol)。用15分鐘加入2/3的4-氟苯基乙炔(12.37克，103.00mmol)的甲苯(50毫升，2.0體積)溶液。1小時(shí)之后，加入剩下的4-氟乙炔溶液。3小時(shí)之后，加入額外的4-氟苯基乙炔(1.5g，12.86mmol)。額外的一小時(shí)之后，蒸餾除去EtOH。冷卻反應(yīng)混合物至＜40℃，加入水(25mL)。冷卻到室溫。過濾懸浮液，用水(25mL)和2×25mL甲苯洗滌。在45-50℃減壓干燥，形成19.3g(87％)的所需要的化合物。
純化步驟將甲醇(1,200毫升)加入到合并的全部3-(2，2-二甲基-丙基)-5-(4-氟-苯基乙炔基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(37.30克)中，并加熱至回流。加入活性炭(3.73克，10wt％)，并回流1小時(shí)。過濾，同時(shí)漿液是熱的，然后在室溫下將水(375mL)加入到濾液中，同時(shí)攪拌。濾出固體，用2×100毫升水洗滌，在45-50℃下減壓干燥，形成30.0g(80％)所需要的化合物。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.99(9H，s)，3.91(2H，s)，6.98(2H，s)，7.25-7.32(3H，m)，7.40(1H，d，J＝7.8Hz)，7.62-7.67(2H，m)。
1-[2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-基]-2-(4-氟 -苯基)-乙烷-1，2-二酮用5分鐘將MgSO4(82.7克，687.05mmol)和NaHCO3(14.4克，171.41mmol)的去離子水(1524毫升)溶液加入到3-(2，2-二甲基-丙基)-5-(4-氟-苯基乙炔基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(110.76g，343.57mmol)的丙酮(3665毫升)攪拌溶液中。加入Hyflo Super Cel_(171.1g)，隨后加入KMnO4(108.6克，687.21mmol)。在40-45℃加熱3小時(shí)，而后冷卻到室溫。加入飽和Na2SO3水溶液(1,800毫升)，隨后加入EtOAc(3,500毫升)和水(3,500毫升)。通過Hyflo Super Cel_床過濾，用9％MeOH/EtOAc(2,860mL)的混合物洗滌。分離濾液層，用2×2,750mL EtOAc反萃取水層。合并有機(jī)提取物，用2×2,380mL飽和氯化鈉水溶液(4760mL)洗滌，用Na2SO4干燥。過濾，然后減壓濃縮，形成暗紅色-褐色固體(185克)。加入丙酮(650毫升)，過濾懸浮液，將收集的固體用3×167毫升MTBE(501毫升)洗滌，在45℃減壓干燥，形成106.79克(88％)所需要的化合物淺黃色固體。
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ0.72(9H，s)，3.71(2H，s)，7.47(2H，dd，J1＝7.5Hz，J2＝8.5Hz)，7.56(2H，bs)，7.65(1H，d，8.0Hz)，7.97-7.99(2H，m)，8.02(1H，d，J＝8.0Hz)。
MS(ES+)m/z＝355.4；(M+1)+5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H- 咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺在氮?dú)夥諊校瑢?-[2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-基]-2-(4-氟-苯基)-乙烷-1，2-二酮(25.33克，71.48mmol)、NH4OAc(82.3克，1.04摩爾)和三甲基乙醛(13.0毫升，116mmol)在MeOH(650毫升)中的混合物加熱至回流，保持20小時(shí)。減壓濃縮。將殘余物溶解在EtOAc(2,000mL)、去離子水(500mL)和飽和NaHCO3水溶液(1000mL)中。分離各層，用1L飽和NaHCO3水溶液(1000mL)、去離子水(500mL)和飽和氯化鈉水溶液(500mL)洗滌有機(jī)層，然后用Na2SO4干燥。過濾并減壓濃縮，形成20.08克黑色固體/泡沫。加入MTBE(60mL)，并加熱至回流。用5分鐘加入己烷(290毫升)，然后將漿液冷卻至室溫。攪拌1.25小時(shí)，過濾，用己烷(80mL)洗滌所收集的固體，在45℃減壓干燥過夜，形成17.31g(58％)所需要的化合物淡褐色固體。
純化步驟將合并的全部5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(55.9克)在MTBE(165毫升)中的混合物加熱至回流。加入己烷(800毫升)，并冷卻漿液至室溫。過濾固體，用己烷(200毫升)洗滌，在45℃減壓干燥，形成54.35克(97％)所需要的化合物淡褐色固體。
1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ0.87(9H，s)，1.45(9H，s)，3.79(2H，s)，7.05(2H，dd，J1＝8.7Hz，J2＝9.0Hz)，7.30(1H，bs)，7.40-7.50(3H，m)。
MS(ES+)m/z＝421.4(M+1)+5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H- 咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽將5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(10.0853克，23.98mmol)的MeOH(24毫升)溶液加熱至40℃。除去熱源，并用3.5分鐘逐滴加入甲磺酸(3.14毫升，47.91mmol)/EtOAc(10毫升)。攪拌1小時(shí)，同時(shí)冷卻至室溫。加入EtOAc(20毫升)，并攪拌5分鐘。過濾，用2×50mL EtOAc洗滌固體，在45-50℃減壓干燥2.5小時(shí)，形成12.62克(86％)標(biāo)題化合物白色粉末固體。
1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ0.94(9H，s)，1.65(9H，s)，2.73(6H，s)，3.91(2H，s)，7.31-7.35(2H，m)，7.63-7.67(2H，m)，7.69(1H，d，J＝8.5Hz)，7.87(1H，d，J＝8.5Hz).MS(ES+)m/z＝421.5(M+1)+實(shí)施例1135-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-5-[2-(4-氟苯基)-2-氧代-乙?；鵠-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-1-_甲磺酸鹽在溫和的回流(105-107℃)下，用蒸餾裝置加熱3-(2，2-二甲基-丙基)-5-(4-氟-苯基乙炔基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺(184.7克，0.573摩爾)、甲酸(923.0毫升)、甲磺酸(110.0克，1.14摩爾)、DMSO(224.0克，2.87摩爾)和48％HBr(9.7克，0.057摩爾)的混合物過夜。減壓蒸餾出揮發(fā)物(550毫升)。冷卻至大約65℃，逐滴加入含有Na2S2O3(18.0克，0.114摩爾)的水(1.2L)，同時(shí)劇烈攪拌，保持溫度在大約65℃。冷卻反應(yīng)混合物至環(huán)境溫度(大約3小時(shí))，然后放在冰浴中(大約30分鐘)。過濾固體，用水(200mL)沖洗，在真空烘箱中、在大約50℃干燥，形成217.0g(84％)所需要的化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.08(s，2H)；8.18(d，J＝6.0Hz，2H)；7.92-7.98(m，3H)；7.40(t，J＝8.0Hz，2H)；3.67(s，2H)；2.40(s，2H)；0.66(s，9H)。
MS(ES+)m/z＝355.4(M+1)+.
成環(huán)在大約70℃，加熱2-氨基-3-(2，2-二甲基-丙基)-5-[2-(4-氟苯基)-2-氧代-乙酰基]-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-1-_甲磺酸鹽(0.62摩爾)、乙醇(2.5L)、乙酸銨(500.0克，6.2摩爾)和三甲基乙醛(84.0克，0.93摩爾)的混合物過夜。蒸發(fā)揮發(fā)物。在室溫下，加入乙酸乙酯(4.0L)和水(3.0L)，隨后加入1.0N NaOH(1.2L)，并攪拌20-30分鐘。分離各相，并用乙酸乙酯(2.0L)提取水相。合并乙酸乙酯相，用10體積的飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次，用Darco(30.0克，10％重量)處理。用硅藻土墊過濾，并濃縮濾液至大約1.0L。加入乙醇(2.50L)，并加熱至大約65℃，快速地滴加入甲磺酸(150.0g，1.55mol)/乙酸乙酯(500mL)，保持溫度在大約65℃，保持3小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，攪拌2小時(shí)以上。過濾懸浮液，用乙酸乙酯(500mL)沖洗固體，在真空烘箱中、在大約45℃干燥，形成226.0克標(biāo)題化合物。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.99(s，2H)，7.90(d，1H，J＝9.0Hz)；7.86(d，1H，J＝9.0Hz)；7.60(dd，2H，J＝9.0Hz)，7.34(dd，2H，J＝9.0Hz)；3.68(s，2H)；2.35(s，6H)；1.51(s，9H)；0.71(s，9H).
MS(ES+)m/z＝421.5(M+1)+.
實(shí)施例114制備晶種的一般方法將250μL在甲醇(0.1M)中的目標(biāo)化合物游離堿加入到設(shè)置為96孔格式的所有孔中，以此制備主平板。以一和兩個(gè)摩爾當(dāng)量將一系列酸分配至每個(gè)孔中。使用Genevac Series II蒸發(fā)器，由所有96孔中蒸發(fā)出溶劑，在靠模板中保留固體殘余物。通過一個(gè)蓋墊將一系列溶劑分配到每個(gè)孔中，而后加熱到55℃，同時(shí)攪拌，在大約55℃平衡60-90分鐘。然后熱過濾每個(gè)樣品，并轉(zhuǎn)入蒸發(fā)平皿、沉淀平皿和冷卻平皿的相應(yīng)孔中。使用55℃加熱的注射器，通過從主平板中轉(zhuǎn)移200μL濾液至開放孔滴定度平皿中來制備蒸發(fā)平皿，然后在室溫和環(huán)境濕度下蒸干過夜。使用55℃加熱的注射器，通過將100μL主平板中的濾液加入至封蓋的96孔滴定度平皿中來制備沉淀平皿，其中每個(gè)孔中含有200μL庚烷或異丙醇的反溶劑。在室溫下平衡九個(gè)小時(shí)之后，使用預(yù)先切片的Whatman濾紙來通過毛細(xì)作用除去過量溶液。使用55℃加熱的注射器，通過從主平板中轉(zhuǎn)移200μl濾液至封蓋的滴定度平皿中、并在8小時(shí)期間內(nèi)按指數(shù)律地從55℃冷卻至10℃，以此來制備冷卻平皿。使用具有2.5X物鏡的Zeiss Axiovert 200M反向入射-光學(xué)顯微鏡，在96孔平皿的每個(gè)孔的底部收集顯微照相。如果物質(zhì)是晶體，它顯示出雙折射，即針對(duì)黑暗背景顯示為白色。無定形固體以黑色或不透明的微滴或圓環(huán)呈現(xiàn)。
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p38激酶的抑制標(biāo)準(zhǔn)溶液制備通過將2.5mL 1M Tris-HCl(pH值7.5)、0.1mL 1M二硫蘇糖醇、1.0mL 1氯化鎂和300μL 1％Triton X-100混合、并用水稀釋至100mL來制備激酶緩沖溶液。將84毫升的這種激酶緩沖溶液與16毫升DMSO結(jié)合，制備16％DMSO溶液。
通過在5毫升激酶緩沖溶液中加入102.6μL 10mM含水ATP、25μL33P-ATP和163.5μL的4mM含水表皮生長(zhǎng)因子肽661-681(Biomol，Catalog #P-121)來制備200μM ATP溶液。
通過在1536μL激酶緩沖溶液中溶解9.5μL濃縮酶溶液(250ng p38酶/μL激酶緩沖溶液)來制備p38激酶溶液。
樣品制備在Costar 96孔微量滴定板中，將2μL在二甲亞砜中的10mM相應(yīng)化合物的儲(chǔ)備溶液溶解在248μL的16％DMSO溶液中，以此制備每個(gè)試驗(yàn)化合物和對(duì)照化合物的80μM溶液。將平皿放置到Tecan Genesis自動(dòng)液體處理器上，進(jìn)行1∶3的系列稀釋。
試驗(yàn)用Beckman Multimek 96孔自動(dòng)液體處理器將10μL連續(xù)稀釋的化合物放置到試驗(yàn)平皿中。用Titertek Multidrop 8-通道液體處理器加入20μL的200μM ATP溶液。使用Multimek將10μL的p38激酶溶液轉(zhuǎn)入試驗(yàn)平皿中。使混合物在30℃反應(yīng)40分鐘，然后通過用Multidrop加入60μL新制備的5％冰AcOH來中止反應(yīng)。使用Multimek將80μL的此溶液轉(zhuǎn)入“MAPH”平皿中。將平皿在室溫放置30分鐘，然后在Titertek MAP提取器上用新制備的0.5％冰AcOH(1×300μL，2×200μL)洗滌/吸出。將孔吸干，并用Multidrop加入100μL MicroScint-20閃爍液體(Packard Bioscience)。使平皿擱置30分鐘，并在PE/WallacMicrobeta Trilux閃爍計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)33P-同位素。
所有例示的化合物以10個(gè)濃度(20μM-1nM，使用1∶3系列稀釋)開始試驗(yàn)。對(duì)于IC50值小于25nM的化合物，以2μM至0.1nM(1∶3系列稀釋)的起始濃度重新試驗(yàn)。使用非線性回歸計(jì)算(IDBSActivityBase軟件)每種化合物的IC50值?；旧先缟纤鲈囼?yàn)所有的例示化合物，并且發(fā)現(xiàn)，抑制p38激酶具有IC50值＜5μM。具體地，基本上如上所述試驗(yàn)下列化合物，并且發(fā)現(xiàn)可以抑制p38激酶，如下面列表。
TNF-α的體外抑制小鼠腹膜巨噬細(xì)胞將1毫升硫羥乙酸鹽液體培養(yǎng)基(5.0克酵母抽提物，15.0克酪胨或胰酶解酪蛋白，5.0克葡萄糖，2.5克氯化鈉，0.75克L-胱氨酸，0.5克硫基乙醇酸鈉，1.0毫克刃天青，和0.75克瓊脂，在1.0L蒸餾水中)注入到Balb/C雌性小鼠的腹膜腔中。注射后的4或5天，將小鼠殺死，然后腹膜內(nèi)注入4mL RPMI-1640介質(zhì)(BioWhittaker)，并且用注射器抽出腹膜的巨噬細(xì)胞。
細(xì)胞素產(chǎn)物用血球計(jì)統(tǒng)計(jì)小鼠腹膜的小噬細(xì)胞，并且在96孔平皿中、在含有10％胎兒牛血清的RPMI-1640介質(zhì)中調(diào)節(jié)至5×105個(gè)細(xì)胞/孔。將200μL/孔涂覆在96孔平皿中，并且使細(xì)胞沉降并附著在孔的底部至少3小時(shí)。在37℃，使用一系列8個(gè)濃度預(yù)先處理試驗(yàn)化合物或標(biāo)準(zhǔn)p38激酶抑制劑1小時(shí)(20μL/孔)。在37℃，用50ng/mL脂多糖(LPS)和10U/mL干擾素-γ的混合物處理細(xì)胞18小時(shí)(20μL/孔)。采集條件培養(yǎng)基，并使用Luminex方法試驗(yàn)TNF-α產(chǎn)物。
TNF-α/Luminex檢測(cè)試驗(yàn)(Bio-Rad Bio-Plex試劑盒-目錄#171- G12221)將凍干的預(yù)混合TNF-α標(biāo)準(zhǔn)物(1標(biāo)準(zhǔn)管/兩個(gè)96孔平皿)與50μL無菌水(500,000pg/mL)重組。在使用以前，將樣品渦旋5秒鐘、在冰上培養(yǎng)30分鐘、并且渦旋5秒鐘。用#1-#12標(biāo)記一組十二個(gè)1.5mL管，然后將如下所示的細(xì)胞介質(zhì)的量加入到合適的管中(標(biāo)準(zhǔn)濃度如下50,000；25,000；12,500；6,250；3,125；1,562.5；781.3；390.6；195.3；97.7；48.8；和24.4pg/mL)。將預(yù)混合的抗細(xì)胞素共軛的小球大力渦旋(25X)30秒鐘。使用1X Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液將抗細(xì)胞素共軛小球稀釋至1X濃度。對(duì)于每個(gè)平皿，將240μL預(yù)先混合的小球加入到5760μL的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液中。將微孔96孔濾板用100μL/孔的封閉緩沖液進(jìn)行封閉。使用微孔過濾系統(tǒng)過濾封閉緩沖液，然后用毛巾擦干。在濾板上用100μl/孔的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液進(jìn)行2次洗滌，并用毛巾擦干。將1X抗細(xì)胞素共軛小球渦旋15秒鐘，并每個(gè)孔中加入50μL。將其濾過，并用毛巾擦干。在平皿上用100μl/孔的Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行2次洗滌。再次將其濾過，并用毛巾擦干。將50μL的樣品或標(biāo)準(zhǔn)物加入到每個(gè)樣品孔中。將其在RT、在設(shè)置為6的避光保存的振蕩器上培養(yǎng)60秒鐘，然后在設(shè)置為3的位置培養(yǎng)30分鐘，然后放入冰箱中過夜。用Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行3次洗滌。濾過，并用毛巾擦干。對(duì)于每個(gè)平皿，制備細(xì)胞素檢測(cè)抗體(在使用之前～10分鐘)，并且將60μL預(yù)混合的細(xì)胞素檢測(cè)抗體儲(chǔ)備加入到5940μL的Bio-Plex檢測(cè)抗體稀釋劑中。加入50的細(xì)胞素檢測(cè)抗體，并在RT、在設(shè)置為6的避光保存的振蕩器上培養(yǎng)60秒鐘，然后在設(shè)置為3的位置培養(yǎng)30分鐘。用Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行3次洗滌。將其濾過，并用毛巾擦干。對(duì)于每個(gè)平皿，制備Strept-PE(在使用之前～10分鐘)，并將60μL加入到5940μL的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液中。將50μL Streptavidin-PE加入到每個(gè)孔中，并在RT、在設(shè)置為6的避光保存的振蕩器上培養(yǎng)60秒鐘，然后在設(shè)置為3的位置培養(yǎng)10分鐘。用Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行3次洗滌。將其濾過。將小球重新懸浮在100μL/孔的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液中。在Luminex機(jī)器上讀出標(biāo)準(zhǔn)和樣品。然后基于12點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(使用四參數(shù)邏輯回歸法(Bio-Plex Manager 2.0，Bio-Rad)產(chǎn)生雙份)，將這些強(qiáng)度讀數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑽⒖?毫升單位，并計(jì)算IC50值。
基本上如上所述試驗(yàn)例示化合物的代表性成員，并且具有體外抑制TNF-α的IC50值＜100nM。具體地，基本上如上所述試驗(yàn)下列化合物，并且發(fā)現(xiàn)可以體外抑制TNF-α，如下面列表。
TNF-α的體內(nèi)抑制將化合物口服給予(100，30，10和3毫克/千克)雌性Balb/c小鼠(5個(gè)小鼠/劑量)。2小時(shí)之后，在每個(gè)小鼠的尾部靜脈，i.v.給予脂多糖(LPS，E.coli serotype 0111B4，5mg/kg)。一個(gè)小時(shí)之后，將給予LPS的小鼠通過吸入CO2進(jìn)行窒息，并通過心臟穿刺使血出。
TNF-α/Luminex檢測(cè)試驗(yàn)(Bio-Rad Bio-Plex試劑盒-目錄#171- G12221)將凍干的預(yù)混合TNF-α標(biāo)準(zhǔn)物(1標(biāo)準(zhǔn)管/兩個(gè)96孔平皿)與50(L無菌水(500,000pg/mL)重組。在使用以前，輕輕地渦旋5秒鐘、在冰上培養(yǎng)30分鐘、并且渦旋5秒鐘。用#1-#12標(biāo)記一組十二個(gè)1.5mL管，然后將如下所示的細(xì)胞介質(zhì)的量加入到合適的管中(標(biāo)準(zhǔn)濃度如下50,000；25,000；12,500；6,250；3,125；1,562.5；781.3；390.6；195.3；97.7；48.8；和24.4pg/mL)。將預(yù)混合的抗細(xì)胞素共軛小球大力渦旋(25X)30秒鐘。使用1X Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液將抗細(xì)胞素共軛小球稀釋至1X濃度。對(duì)于每個(gè)平皿，將240μL預(yù)先混合的小球加入到5760μL的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液中。將微孔96孔濾板用100μL/孔的封閉緩沖液進(jìn)行封閉。使用微孔過濾系統(tǒng)過濾封閉緩沖液。用毛巾擦干。在濾板上用100μl/孔的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液進(jìn)行2次洗滌，并用毛巾擦干。將1X抗細(xì)胞素共軛小球渦旋15秒鐘，并每個(gè)孔中加入50μL。濾過，并用毛巾擦干。在平皿上用100μl/孔的Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行2次洗滌。濾過，并用毛巾擦干。將25μL的血清樣品和25μL的稀釋劑(Bio-Rad)或50μL標(biāo)準(zhǔn)物加入到每個(gè)樣品孔中。將其在RT、在設(shè)置為6的避光保存的振蕩器上培養(yǎng)60秒鐘，然后在設(shè)置為3的位置培養(yǎng)30分鐘，然后放入冰箱中過夜。用Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行3次洗滌。濾過，并用毛巾擦干。對(duì)于每個(gè)平皿，制備細(xì)胞素檢測(cè)抗體(在使用之前～10分鐘)，并且將60μL預(yù)混合的細(xì)胞素檢測(cè)抗體儲(chǔ)備加入到5940μL的Bio-Plex檢測(cè)抗體稀釋劑中。加入50μL的細(xì)胞素檢測(cè)抗體，并在RT、在設(shè)置為6的避光保存的振蕩器上培養(yǎng)60秒鐘，然后在設(shè)置為3的位置培養(yǎng)30分鐘。用Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行3次洗滌。濾過，并用毛巾擦干。對(duì)于每個(gè)平皿，制備Strept-PE(在使用之前～10分鐘)，并將60μL加入到5940μL的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液中。每個(gè)孔加入50μL的抗生蛋白鏈菌素-PE，并在RT、在設(shè)置為6的避光保存的振蕩器上培養(yǎng)60秒鐘，然后在設(shè)置為3的位置培養(yǎng)10分鐘。用Bio-Plex洗滌緩沖液進(jìn)行3次洗滌。濾過。將小球重新懸浮在100μL/孔的Bio-Plex試驗(yàn)緩沖液中。在Luminex機(jī)器上讀出標(biāo)準(zhǔn)和樣品。然后基于12點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(使用四參數(shù)邏輯回歸法(Bio-Plex Manager 2.0，Bio-Rad)產(chǎn)生雙份)，將這些強(qiáng)度讀數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑽⒖?毫升單位，并計(jì)算IC50值。
基本上如上所述試驗(yàn)例示化合物的代表性成員，并且具有體內(nèi)抑制TNF-α的IC50值＜100mg/kg。基本上如上所述試驗(yàn)實(shí)施例104的化合物，并且顯示出IC50值＜1mg/kg。
對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)的LPS引起的TNF-α的影響將LPS關(guān)節(jié)內(nèi)注射到大鼠踝中，引起TNF-α的合成，其可以按滑液洗出液體計(jì)量。高水平的TNF-α可在2小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)。由于關(guān)節(jié)是關(guān)節(jié)炎形成的位點(diǎn)，這種模型可以快速地確定，不論口服給予化合物是否對(duì)滑膜中的炎癥性響應(yīng)起作用。
將六個(gè)雌性Lewis大鼠(150-200克)置于每個(gè)試驗(yàn)組中。口服給予動(dòng)物賦形劑(1％羧甲基纖維素鈉-0.25％Tween80)或試驗(yàn)化合物(1mg/kg，3mg/kg，10mg/kg，和30mg/kg)。一個(gè)小時(shí)后，將10μl LPS(10μg)關(guān)節(jié)內(nèi)給予到每個(gè)大鼠的右踝中，同時(shí)剩下的踝接受10μL生理鹽水。兩個(gè)小時(shí)之后，用100μL生理鹽水灌洗每個(gè)踝。收集灌洗液，并在-80℃存儲(chǔ)。
#1組賦形劑(1％NaCMC-0.25％Tween80，1mL，PO)#2組試驗(yàn)化合物(1mg/kg，1mL，PO)#3組試驗(yàn)化合物(3mg/kg，1mL，PO)#4組試驗(yàn)化合物(10mg/kg，1mL，PO)#5組試驗(yàn)化合物(30mg/kg，1mL，PO)用可商業(yè)購買的ELISA試劑盒(R&D，RTA00)測(cè)定TNF-α。用實(shí)施例104的化合物處理，產(chǎn)生TNF-α合成的劑量依賴性抑制，具有0.54mg/kg的TMED50。
B16F10黑素瘤靶向(MAPKAP-K2磷酸化)B16F10黑素瘤細(xì)胞系是從American Type Culture Collection，Rockville，MD處獲得的。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI-1640介質(zhì)中培養(yǎng)。在其指數(shù)生長(zhǎng)期，將體外培育的細(xì)胞通過溫和的胰酶消化進(jìn)行采集，在介質(zhì)中洗滌兩次，并且再懸浮在無血清的RPMI-1640介質(zhì)中。使用血球計(jì)測(cè)定活細(xì)胞的數(shù)目，并調(diào)節(jié)至1×107個(gè)/mL。將腫瘤細(xì)胞皮下注入在正常的C57Bl6小鼠中。按小鼠的接種體積是0.2mL(2,000,000個(gè)細(xì)胞)。當(dāng)腫瘤達(dá)到300-500毫克時(shí)，既可以在p.o.化合物處理之后的固定時(shí)間(2.5小時(shí))將小鼠用于靶向抑制研究，也可以在p.o.化合物處理之后用于藥效研究(其中在許多時(shí)間點(diǎn)(例如3，6，9，12，15和18小時(shí))收集腫瘤)。
蛋白質(zhì)萃取和免疫印記分析將如上所述收集的腫瘤立刻急速在液氮中冷凍，并存儲(chǔ)在-80℃下。使用Daunce均化器、在冰上、在提取緩沖液中將腫瘤組織均勻化(25mM Tris，pH值7.5，含有下列蛋白酶抑制劑10μg/mL亮肽素，10μg/mL大豆tryp-胰凝乳蛋白酶抑制劑，10μg/mL N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮，10μg/mL抑肽酶，Nα-對(duì)甲苯磺?；?L-精氨酸甲酯，7mM苯甲脒，0.3mM苯甲基磺酰氟和兩個(gè)片劑的Roche完全蛋白酶抑制劑混合物；接著是磷酸酶抑制劑60mM beta-甘油磷酸鹽，1mM釩酸鈉，10mM氟化鈉，20mM對(duì)硝基苯磷酸，1μM岡田酸，1μM微囊藻素，2.5mM焦膦酸鈉；和1mM二硫蘇糖醇，15mM EDTA，5mMEGTA，1％Triton X100和150mM NaCl)。通過在冷凍微量離心機(jī)中、在14,000rpm和在1℃條件下，將組織溶解產(chǎn)物澄清20分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入在冰上預(yù)先冷卻的新微量離心管中，并在液氮或干冰中再次急速冷凍。在溫水中迅速解凍至大約80％之后，將樣品放置在冰上至完全解凍。在14,000rpm和在1℃下，將樣品再次離心15分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入預(yù)先冷卻的新微量離心管中，并且使用Bio-Rad蛋白試驗(yàn)試劑、使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物來測(cè)定蛋白濃度。
用提取緩沖液平衡蛋白提取物。將等體積的2X SDS樣品緩沖液加入到蛋白提取物中，并在水浴鍋中沸騰5分鐘。以4-20％梯度SDS-PAGE凝膠，將每種試樣的100mg蛋白質(zhì)提取物用于電泳，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維(NC)膜上。將NC膜在5％BSA/TBST(20mM Tris，pH值＝7.5，500mM NaCl，0.05％Tween20和0.02％疊氮化鈉)中封閉最少1小時(shí)。然后在4℃、在80rpm的振蕩器上，將該膜在1∶1,000的初級(jí)抗體與5％BSA/TBST中培養(yǎng)過夜。將膜用TBST洗滌4X，每次10分鐘。然后用以1∶10,000稀釋在3％無脂奶/TBST中的二級(jí)抗體HRP(辣根過氧化物酶)共軛物將膜培養(yǎng)40分鐘，并再次用TBST洗滌4次，每次10分鐘。然后按照制造商的說明書、通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham)來顯現(xiàn)免疫印記。所有的初級(jí)抗體是從Cell Signaling購買的，二級(jí)抗體HRP共軛物是從Amersham處獲得的。用于電泳和蛋白質(zhì)印跡法的凝膠劑、膜和裝置購買于Invitrogen。使用Kodak ImageStation 1000，從膠片來定量使人感興趣的蛋白頻帶。
基本上如上所述試驗(yàn)實(shí)施例104的化合物，并且顯示出TMED50＝3.59mg/kg。
大鼠膠原引起的關(guān)節(jié)炎功效模型將雌性Lewis大鼠((190g，Charles River Labs )用牛類型II膠原(2mg/mL)進(jìn)行免疫，該膠原用等體積的助劑(氫氧化鋁)乳化。在接近尾根的背部，將大鼠用大約0.3mg的乳狀液進(jìn)行皮內(nèi)免疫。按照相同方案，7天后將所有的動(dòng)物重新免疫。從第一次免疫之后的12至14天，大鼠開始形成關(guān)節(jié)炎(以腫脹和一或兩個(gè)踝充血為特征)。從出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的第一個(gè)標(biāo)志開始，將大鼠等量分布到5個(gè)試驗(yàn)組中，并對(duì)于每個(gè)大鼠開始劑量治療，bid 14天。
治療組1組 賦形劑(1％羧甲基纖維素鈉+0.25％Tween 80)1mL，PO，Bid×14天2組 試驗(yàn)化合物，5mg/kg，1mL，PO，Bid×143組 試驗(yàn)化合物，15mg/kg，1mL，PO，Bid×144組 試驗(yàn)化合物，30mg/kg，1mL，PO，Bid×145組 氫化潑尼松10mg/kg，1mL，PO，qd×14一周5天用卡鉗測(cè)定踝直徑，并記錄。用曲線(AUC)下的面積來表示數(shù)據(jù)，該曲線是由復(fù)合炎癥記錄和進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生的。基本上如上所述試驗(yàn)實(shí)施例104的化合物，并且顯示出TMED50＝1.5mg/kg(b.i.d.)。
口服本發(fā)明的化合物是優(yōu)選的。然而，口服不是唯一的途徑，或甚至不是唯一優(yōu)選的途徑。例如，透皮給予對(duì)于易忘或暴躁的患者比口服醫(yī)藥理想，為方便起見或避免與口服有關(guān)的潛在的并發(fā)癥，可以優(yōu)選靜脈內(nèi)途徑。在具體情況下，式I的化合物可以通過透皮膚、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或直腸內(nèi)途徑給予。給藥途徑可以以任何方式變化，這由藥物的物理性質(zhì)、患者和護(hù)理者的便利性、及其它相關(guān)的情況來限制(Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，Mack PublishingCo.(1990))。
藥物組合物可以按照藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的方式來制備。載體或賦形劑可以是固體、半固體或可以充當(dāng)活性組分的賦形劑或介質(zhì)的液體物質(zhì)。合適的載體或賦形劑在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘Ｋ幬锝M合物可以適合于口服、吸入、腸胃外、或局部使用，并且可以以片劑、膠囊、氣霧劑、吸入劑、栓劑、溶液、懸浮液等等的形式給予患者。
本發(fā)明的化合物可以口服給予，例如，利用惰性稀釋劑或膠囊，或壓縮成片劑。為了口服治療學(xué)給予的目的，該化合物可以與賦形劑混合，并且可以以片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、薄片、咀嚼膠等等的形式使用。這些制劑應(yīng)該含有至少4％的本發(fā)明化合物(活性組分)，但可以變化，這取決于具體形式，并且可以方便地在4％至大約70％的重量單位之間。存在于組合物中的化合物的量是所獲得的合適劑量。本發(fā)明的優(yōu)選組合物和制劑可以通過技術(shù)熟練的技術(shù)人員熟知的方法來確定。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等等也可以含有一或多種下列助劑粘合劑例如聚乙烯基吡咯烷酮，羥丙基纖維素，微晶纖維素，或明膠；賦形劑或稀釋劑例如淀粉，乳糖，微晶纖維素或磷酸二鈣，崩解劑例如交聯(lián)羧甲基纖維素，聚乙烯聚吡咯烷酮，淀粉羥基乙酸鈉，玉米淀粉等等；潤滑劑例如硬脂酸鎂，硬脂酸，滑石或氫化植物油；助流劑例如膠體二氧化硅；潤濕劑例如十二烷基硫酸鈉和聚山梨酸酯80；和甜味劑例如蔗糖，阿斯巴甜或鄰磺酰苯甲酰亞胺，可以加入增香劑例如胡椒薄荷，水楊酸甲酯或柑桔調(diào)味劑。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除了以上類型的物質(zhì)之外，它還可以含有液體載體例如聚乙二醇或脂肪油。其它劑量單位形式可以含有其它各種的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以改進(jìn)劑量單位的外形，例如包衣。由此，片劑或丸劑可以涂有糖、羥丙基甲基纖維素、聚甲基丙烯酸酯或其它包覆劑。除了本化合物之外，糖漿還可以含有蔗糖作為甜味劑、和某些防腐劑、染料和顏料和香料。用于制備這些不同組合物的物質(zhì)應(yīng)該是藥學(xué)純的，并且在使用數(shù)量中是無毒的。
式I的化合物通常在很廣的劑量范圍內(nèi)有效。例如，每日劑量正常地在大約0.0001至大約30mg/kg體重的范圍。在有些情況下，低于上述范圍的下限的劑量水平可以更合適，而在其它情況下，甚至可以更大劑量使用而不會(huì)導(dǎo)致任何有害的副作用，因此，以上劑量范圍無論如何不是限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)該理解，實(shí)際給予的化合物量將按照相關(guān)情況由醫(yī)師來確定，包括所治療病癥，選擇的給藥途徑，所給予的實(shí)際的一或多種化合物，個(gè)體患者的年齡、重量和應(yīng)答，和患者癥狀的嚴(yán)重度。
權(quán)利要求
1.式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽 其中 或 X是N，或C-R1；R是C1-C7烷基，C3-C7環(huán)烷基，(C1-C7亞烷基)-(C3-C7環(huán)烷基)，-SO2-(C1-C7烷基)，或-SO2-NR5R6；R1是氫，氨基，甲基，或-N＝CH(NMe)2；R2是任選被一或兩個(gè)獨(dú)立選自鹵素的取代基取代的苯基；R3是氫，C1-C7烷基，C3-C7環(huán)烷基，或任選被一或兩個(gè)獨(dú)立選自鹵素和三氟甲基的取代基取代的苯基；R4是氫或C1-C7烷基；R5和R6獨(dú)立地選自C1-C7烷基。
2.式I’的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽 其中R′是2，2-二甲基丙基或1，2，2-三甲基丙基；R2′是苯基，4-氟苯基，或2，4-二氟苯基；R3′是叔丁基，2-氯-6-氟苯基，2-氟-6-三氟甲基苯基，2，6-二氯苯基，或2，6-二氟苯基。
3.式I’的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽 其中a)R′是2，2-二甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是2-氟-6-三氟甲基苯基；b)R′是2，2-二甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是2，6-二氯苯基；c)R′是2，2-二甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是叔丁基；d)R′是2，2-二甲基丙基，R2′是苯基，和R3′是2-氯-6-氟苯基；e)R′是2，2-二甲基丙基，R2′是2，6-二氟苯基，和R3′是叔丁基；f)R′是1，2，2-三甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是叔丁基；或g)R′是1，2，2-三甲基丙基，R2′是4-氟苯基，和R3′是2，6-二氟苯基。
4.化合物5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺，或其藥學(xué)可接受的鹽。
5.化合物5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1 H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺，或其富馬酸鹽、二甲磺酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸氫鹽或二鹽酸鹽。
6.化合物5-[2-叔丁基-5-(4-氟-苯基)-1H-咪唑-4-基]-3-(2，2-二甲基-丙基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基胺二甲磺酸鹽。
7.一種藥物制劑，包括按照權(quán)利要求1至6的任一項(xiàng)的化合物與藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合。
8.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)化合物用于制備治療能夠通過抑制p-38激酶而改善或預(yù)防的疾病或病癥的藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)的化合物用于制備治療敏感腫瘤的藥物的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中敏感腫瘤是多發(fā)性骨髓瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了式I的激酶抑制劑。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1938302SQ200580010142
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月30日
發(fā)明者R·邦朱克里安, C·H·哈道奇, C·史, A·德迪奧斯, M·F·德普拉多, C·賈拉米洛阿古多, P·科蒂延, M·M·馬德, S·P·塞加斯, C·桑徹滋-馬蒂內(nèi)滋 申請(qǐng)人:伊萊利利公司