專利名稱：蛋白激酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些化合物在蛋白激酶的抑制中的用途，該抑制劑具體是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的抑制劑，更詳細(xì)地講是絲氨酸/蘇氨酸激酶，促分裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶2(MAPKAP-K2)抑制劑。描述了它們?cè)卺t(yī)學(xué)上特別是在預(yù)防和/或治療炎癥和神經(jīng)疾病上的用途。
背景技術(shù)：
蛋白激酶是一族催化蛋白質(zhì)中的羥基磷酸化的酶。預(yù)計(jì)約2％的人類基因組編碼的基因編碼蛋白激酶。位于目標(biāo)蛋白質(zhì)上的特定的酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基的可逆磷酸化作用可以幾種方式顯著改變其功能，包括激活或抑制酶活性；創(chuàng)建或阻斷其他酶的結(jié)合位點(diǎn)；改變亞細(xì)胞定位或控制蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。因此蛋白激酶是多種細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)的樞紐，所述過(guò)程包括新陳代謝、細(xì)胞增殖、分化和存活。在已知需要蛋白激酶作用的許多不同的細(xì)胞功能中，一些代表用于治療某些疾病的靶。
已知幾種疾病可由異常的蛋白激酶活性導(dǎo)致或與其相關(guān)。已知人類的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶在許多疾病(包括糖尿病、癌癥)的發(fā)展中具有重要的作用且已牽涉到多種先天性綜合征。絲氨酸蘇氨酸激酶也代表一類酶，其抑制劑可能與癌癥、糖尿病和各種炎癥的治療有關(guān)。因此蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)代表新治療藥設(shè)計(jì)的有吸引力的領(lǐng)域。
迄今為止已經(jīng)鑒定了蛋白激酶抑制的三種可能的機(jī)理。這些包括假底物機(jī)理、腺嘌呤擬態(tài)機(jī)理和通過(guò)使用活性位點(diǎn)以外的表面將酶鎖定為無(wú)活性構(gòu)象。目前為止已經(jīng)鑒定/設(shè)計(jì)的大多數(shù)抑制劑作用于ATP結(jié)合位點(diǎn)。這類ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑已經(jīng)通過(guò)它們靶向作用更差的保守區(qū)域ATP結(jié)合位點(diǎn)的能力來(lái)證明其選擇性。
一種影響細(xì)胞調(diào)節(jié)的主要機(jī)理是通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)途徑。蛋白質(zhì)磷酸化作用代表通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)從分子傳播到分子并最終導(dǎo)致細(xì)胞響應(yīng)的過(guò)程。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)被高度調(diào)節(jié)且經(jīng)常重疊，如許多蛋白激酶以及磷酸酶的存在所證明。目前認(rèn)為許多疾病和/或病癥是激酶級(jí)聯(lián)的分子組分中異?；罨蚬δ芡蛔兊慕Y(jié)果。
MAPKAP-K2是在應(yīng)激誘導(dǎo)的MAPK途徑(

圖1)中的直接操縱p38的下游的絲氨酸/蘇氨酸激酶。
p38途徑參與轉(zhuǎn)導(dǎo)各種應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞外刺激如熱激、紫外光、細(xì)菌脂多糖和促炎細(xì)胞因子。該途徑的激活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和起始因子的磷酸化作用，并影響細(xì)胞分裂、凋亡、培養(yǎng)細(xì)胞的侵入力和炎癥反應(yīng)(Martin-Blanco，Bioessays 22，637-645(2000))。
p38本身激活許多除MAPKAP激酶以外的蛋白激酶，例如Mnkl/2、PRAK和MSK1(圖1)。大多數(shù)這些下游靶的特定和/或重疊功能還有待分辨。該途徑對(duì)新抗炎藥的發(fā)現(xiàn)具有特別的重要性。過(guò)去的干預(yù)該途徑的策略已包括開(kāi)發(fā)p38本身的選擇性抑制劑。這類抑制劑已經(jīng)在抑制細(xì)胞模型中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生方面證明有效，并在慢性炎癥的動(dòng)物模型中證明有效(Lee等發(fā)表于免疫藥理學(xué)第47卷第185-201頁(yè)(2000)的文獻(xiàn)(Lee et al.，Immuno pharmacology 47，185-201(2000))。然而，小鼠模型中p38表達(dá)的敲除導(dǎo)致胚胎死亡，此外得自這類胚胎的細(xì)胞已經(jīng)證明了一些對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞響應(yīng)的影響。這些觀察表明應(yīng)慎重對(duì)待涉及用p38抑制劑對(duì)人類長(zhǎng)期給藥的療法。
一種可供選擇的開(kāi)發(fā)抗炎藥的策略應(yīng)是在MAPKAP-K2水平上的抑制該途徑。人類MAPKAP-K2在其N-端具有兩個(gè)富脯氨酸片段，其后是激酶域和C-端調(diào)節(jié)域。該激酶與除MAPKAP-K3和4以外的其他絲氨酸/蘇氨酸激酶的同源性低。C端調(diào)節(jié)域包含二分核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)。已經(jīng)解析出無(wú)活性MAPKAP-K2的晶體結(jié)構(gòu)(Meng，W.等發(fā)表于生物化學(xué)雜志第277卷第37401-37405頁(yè)(2002)的文獻(xiàn)(Meng，W.et al.J.Biol.Chem.277，37401-37405(2002)))。MAPKAP-K2通過(guò)p38的激活是通過(guò)蘇氨酸殘基222和334的選擇性磷酸化作用而發(fā)生(Stokoe et al.，EMBO J.11，3985-3994(1992))。MAPKAP-K2具有位于其C端區(qū)域中的兩親性A螺旋基序，所述基序可能阻斷底物的結(jié)合。已經(jīng)提出通過(guò)p38的雙磷酸化作用來(lái)再定位該基序產(chǎn)生催化活性提高(You-Li等發(fā)表于生物化學(xué)雜志第270卷第202-206頁(yè)(1995)的文獻(xiàn)(You-Li et al.，J.Biol.Chem.270，202-206(1995)))。MPKAP-K2存在于未經(jīng)刺激的細(xì)胞的細(xì)胞核中并在細(xì)胞激活時(shí)移位到細(xì)胞質(zhì)中。已知這種激酶會(huì)磷酸化許多核轉(zhuǎn)錄因子以及胞質(zhì)蛋白質(zhì)例如熱激蛋白質(zhì)和5-脂加氧酶(Stokoe et al.，F(xiàn)EBS Lett.313，307-313(1992)，Werz，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，5261-5266(2000)，Heidenreich，et al.，J.Biol.Chem.274，14434-14443(1999)，Tan，et al.，EMBO J.15，4629-4642(1996)，Neufeld，J.Biol.Chem.275，20239-20242(2000))。所有的這類底物包含通過(guò)MAPKAP-K2有效磷酸化所需的獨(dú)特的氨基酸基序(XX-Hyd-XRXXSXX，其中Hyd為龐大的疏水殘基)(Stokoe et al.，Biochem.J.296，843-849(1993))。
目前MAPKAP-K2是唯一的已經(jīng)鑒定特定功能的p38底物。已經(jīng)通過(guò)MAPKAP-K2缺陷小鼠(MAPKAP-K2-/-)表型有力地表明了MAPKAP-K2在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的具體作用(Kotlyarov，et al.，NatureCell Biol.1，94-97(1999))。這種小鼠能生存并且正常，只是炎癥反應(yīng)顯著減少。近來(lái)還表明MAPKAP-K2缺陷導(dǎo)致缺血性腦部損傷的顯著的神經(jīng)保護(hù)作用(Wang et al.，J.Biol Chem.277，43968-43972(2002))。MAPKAP-K2被認(rèn)為調(diào)節(jié)重要的促炎細(xì)胞因子mRNA的翻譯和/或穩(wěn)定性。人們認(rèn)為通過(guò)蛋白質(zhì)的磷酸化作用來(lái)執(zhí)行這項(xiàng)功能，所述蛋白質(zhì)結(jié)合到發(fā)現(xiàn)于這些細(xì)胞因子的未經(jīng)翻譯區(qū)域內(nèi)的富AU元件上。目前正在研究這些蛋白質(zhì)的性質(zhì)。
因此MAPKAP-K2代表了用于干擾炎癥反應(yīng)的應(yīng)激誘導(dǎo)的激酶級(jí)聯(lián)中的靶向作用點(diǎn)。
需要提供成為MAPKAP-K2激酶抑制劑的化合物。
發(fā)明公開(kāi)作為旨在取得上述目標(biāo)的大量勤奮研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由下式(I)表示的吡唑并[1，5-a]嘧啶衍生物和它們的藥學(xué)上可接受的鹽顯示出極好的激酶抑制活性，并在這一發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。
換句話說(shuō)，本發(fā)明提供以下(1)式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其他藥學(xué)上可接受的生物水解衍生物，包括其酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲、溶劑化物、水合物、親和試劑或前體藥物在制備用于抑制蛋白激酶的藥物中的用途 其中R1為氫R2為氫R3為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基、任選取代的雜芳烷基、任選取代的芳烯基、任選取代的雜芳烯基、任選取代的芳炔基或任選取代的雜芳炔基；R4為氫；R5為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基、任選取代的雜芳烷基、任選取代的芳烯基、任選取代的雜芳烯基、任選取代的芳炔基或任選取代的雜芳炔基、任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基；R6為氫、C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基或C3-C8任選取代的環(huán)烷基；或R5和R6一起與連接它們的氮原子共同形成各環(huán)均為5-7元環(huán)的單環(huán)或雙環(huán)雜環(huán)，并且除氮原子之外還任選含有一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的另外的雜原子，所述單環(huán)或雙環(huán)雜環(huán)可任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代；(2)(1)的用途，其中R3為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基或任選取代的雜芳烷基。
(3)(2)的用途，其中R3為C2-C8任選取代的烯基、任選取代的芳基或任選取代的芳烷基。
(4)(1)-(3)中任一項(xiàng)的用途，其中R5為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基。
(5)(4)的用途，其中R5為被NHR7取代的C3-C8環(huán)烷基，其中R7為任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基。
(6)(1)-(5)中任一項(xiàng)的用途，其中R6為氫或C1-C8任選取代的烷基。
(7)(6)的用途，其中R6為氫。
(8)(1)-(7)中任一項(xiàng)的用途，其中藥物用作MAPKAP-K2的抑制劑。
(9)(8)的用途，其中藥物用于預(yù)防或治療MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病。
(10)(9)的用途，其中MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病為神經(jīng)疾病(包括癡呆癥)、炎性疾病、調(diào)亡相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)元調(diào)亡、中風(fēng)、膿毒癥、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、增生性疾病、癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、局部缺血再灌注損傷、心臟病發(fā)作、血管原性疾病、器官低氧癥、血管增生癥、心臟肥大癥、凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。
(11)(10)的用途，其中疾病為神經(jīng)變性疾病。
(12)(11)的用途，其中神經(jīng)變性疾病為癡呆癥、阿耳茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、肌萎縮側(cè)索硬化、杭廷頓氏舞蹈病(Huntington′s disease)、老年性舞蹈病、西德納姆舞蹈病(Sydenham′s chorea)、低血糖、頭部和脊髓創(chuàng)傷包括創(chuàng)傷性頭部損傷、急性和慢性疼痛、癲癇癥和癲癇發(fā)作、橄欖體腦橋小腦癡呆癥、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、低氧癥相關(guān)的神經(jīng)變性、急性低氧癥、谷氨酸鹽毒性包括谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、腦局部缺血、與腦膜炎和/或神經(jīng)官能癥相關(guān)的癡呆癥、腦血管性癡呆癥或HIV感染患者的癡呆癥。
(13)(10)的用途，其中疾病由炎癥導(dǎo)致。
(14)(13)的用途，其中疾病為腸炎、支氣管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各種類型的變態(tài)反應(yīng)或阿耳茨海默氏病。
(15)(10)的用途，其中疾病為自身免疫性疾病。
(16)(15)的用途，其中自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、硬皮病、慢性甲狀腺炎、格雷夫斯病(Graefe′sdisease)、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血貧血癥、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、特異性皮炎、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病(Crohn′sdisease)、銀屑病或移植物抗宿主疾病。
(17)一種治療或預(yù)防個(gè)體的MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予所述個(gè)體至少一種如(1)-(7)中任一項(xiàng)所定義的化合物或(8)或(9)所定義的組合物。
(18)(17)的方法，其中MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病為神經(jīng)疾病(包括癡呆癥)、炎性疾病、調(diào)亡相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)元調(diào)亡、中風(fēng)、膿毒癥、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、增生性疾病、癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、局部缺血再灌注損傷、心臟病發(fā)作、血管原性疾病、器官低氧癥、血管增生癥、心臟肥大癥、凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。
(19)(18)的方法，其中疾病為神經(jīng)變性疾病。
(20)(19)的方法，其中神經(jīng)變性疾病為癡呆癥、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、杭廷頓氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德納姆舞蹈病、低血糖、頭部和脊髓創(chuàng)傷包括創(chuàng)傷性頭部損傷、急性和慢性疼痛、癲癇癥和癲癇發(fā)作、橄欖體腦橋小腦癡呆癥、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、低氧癥相關(guān)的神經(jīng)變性、急性低氧癥、谷氨酸鹽毒性包括谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、腦局部缺血、與腦膜炎和/或神經(jīng)官能癥相關(guān)的癡呆癥、腦血管性癡呆癥或HIV感染患者的癡呆癥。
(21)(18)的方法，其中疾病由炎癥導(dǎo)致。
(22)(21)的方法，其中疾病為腸炎、支氣管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各種類型的變態(tài)反應(yīng)或阿耳茨海默氏病。
(23)(18)的方法，其中疾病為自身免疫性疾病。
(24)(23)的方法，其中自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、硬皮病、慢性甲狀腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血貧血癥、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、特異性皮炎、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、銀屑病或移植物抗宿主疾病。
(25)(18)-(24)中任一項(xiàng)的方法，其中一種或多種活性劑與該化合物同時(shí)、先后或序貫給予個(gè)體。
(26)確定(1)-(7)中任一項(xiàng)所定義的化合物的活性的方法，該方法包括提供分析活性和分析(1)-(7)中任一項(xiàng)所定義的化合物的活性的系統(tǒng)。
(27)(26)的方法，其中分析是化合物的蛋白激酶抑制活性分析。
(28)抑制蛋白激酶活性或功能的方法，該方法包括將蛋白激酶暴露于(1)-(7)中任一項(xiàng)所定義的化合物中。
(29)抑制MAPKAP-K2活性或功能的方法，該方法包括將MAPKAP-K2暴露于(1)-(7)中任一項(xiàng)所定義的化合物中。
(30)(29)的方法，該方法在研究模型中、體外、計(jì)算機(jī)芯片上或體內(nèi)例如動(dòng)物模型內(nèi)進(jìn)行。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示在應(yīng)激誘導(dǎo)的MAPK途徑中p38級(jí)聯(lián)。圖2顯示制備式I的化合物的常規(guī)反應(yīng)方案?，F(xiàn)在將通過(guò)以下非限定性實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式為了本發(fā)明的目的，烷基涉及具有1-8個(gè)碳原子的直鏈和支鏈烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基和正己基。該術(shù)語(yǔ)還包括C3-C8碳原子的環(huán)烷基，包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、CH2-環(huán)丙基、CH2-環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。
術(shù)語(yǔ)“烯基”是指2-8個(gè)碳原子且包含一個(gè)或多個(gè)碳碳雙鍵的直鏈或支鏈烯基，包括但不限于乙烯基、正丙烯1-基、正丙烯2-基、異丙烯基等。
術(shù)語(yǔ)“炔基”是指2-8個(gè)碳原子的且包含一個(gè)或多個(gè)碳碳三鍵的直鏈或支鏈炔基，包括但不限于乙炔基、2-甲基乙炔基等。
“芳族”是指包含一個(gè)環(huán)或稠合為一個(gè)或多個(gè)飽和或不飽和環(huán)的3-10元芳烴，包括但不限于苯基、萘基、蒽基(anthracenyl)或菲基(phenanthracenyl)。
“雜芳基”是指包含一個(gè)或多個(gè)選自N、O或S的雜原子且包含一個(gè)環(huán)或稠合為一個(gè)或多個(gè)飽和或不飽和環(huán)的3-10元芳基；且
“雜環(huán)基”是指包含一個(gè)或多個(gè)選自N、O或S的雜原子且包含雜芳基的3-10元環(huán)系統(tǒng)。雜環(huán)基系統(tǒng)可包含一個(gè)環(huán)或可稠合為一個(gè)或多個(gè)飽和或不飽和環(huán)；雜環(huán)基可完全飽和、部分飽和或不飽和，包括但不限于雜芳基和雜碳環(huán)基。碳環(huán)基或雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于環(huán)己基、苯基、吖啶、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并噻唑、咔唑、噌啉、二噁英、二氧六環(huán)、二氧戊環(huán)、二噻烷、二噻嗪、二噻唑、二硫雜環(huán)戊烷、呋喃、咪唑、咪唑啉、四氫咪唑、吲哚、二氫吲哚、吲嗪、吲唑、異吲哚、異喹啉、異噁唑、異噻唑、嗎啉、萘啶、噁唑、噁二唑、噁噻唑(oxathiazole)、噁噻唑烷(oxathiazolidine)、噁嗪、噁二嗪(oxadiazine)、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、酞嗪、哌嗪、哌啶、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、噠嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯烷、吡咯啉、喹啉、喹喔啉、喹唑啉、喹嗪、四氫呋喃、四嗪、四唑、噻吩、噻二嗪、噻二唑、噻三唑、噻嗪、噻唑、硫代嗎啉、硫萘(thianaphthalene)、噻喃、三嗪、三唑和三噻烷。
鹵素是指F、Cl、Br或I。
合適的取代基包括烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、鹵素、羥基、NO2、CN、CO2R14、CONR14R15、NR14(CO)nR15、S(O)mR14；其中R14和R15可以相同或不同，為氫、烷基或芳基；n為0、1；m為0、1或2。
優(yōu)選R3為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基或任選取代的雜芳烷基。
更優(yōu)選R3為C1-C8任選取代的烯基、任選取代的芳基或任選取代的芳烷基。
優(yōu)選R5為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基。
更優(yōu)選R5為被NHR7取代的C3-C8環(huán)烷基，其中R7為任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基。
優(yōu)選R6為氫或C1-C8任選取代的烷基。更優(yōu)選R6為氫。
作為本發(fā)明式I中優(yōu)選的R1-R6的實(shí)例提及的基團(tuán)的優(yōu)選組合，可以提及的是以下組合1)和2)。
1)式I中，其中R1為氫，R2為氫，R3為C6-C14任選取代的芳基，R4為氫，R5為C3-C8任選取代的環(huán)烷基且R6為氫。
2)式I中，其中R1為氫，R2為氫，R3為C6-C14任選取代的芳基，R4為氫，R5為任選取代的雜環(huán)基且R6為氫。
用于第一方面的化合物可以鹽的形式提供，優(yōu)選式I的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例包括衍生自有機(jī)酸(例如乙酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、安息香酸、水楊酸、苯乙酸、扁桃酸、甲磺酸、苯磺酸和對(duì)甲苯磺酸)和無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸和硫酸等)，分別得到甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽等或衍生自堿(例如有機(jī)和無(wú)機(jī)堿)的鹽。用于形成本發(fā)明化合物的鹽的合適的無(wú)機(jī)堿的實(shí)例包括銨、鋰、鈉、鈣、鉀、鋁、鐵、鎂、鋅等的氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽。也可用合適的有機(jī)堿來(lái)形成鹽。這類適于與本發(fā)明化合物形成藥學(xué)上可接受的堿加成鹽的堿包括有機(jī)堿，所述有機(jī)堿無(wú)毒且到足以成鹽。這類有機(jī)堿為本領(lǐng)域所熟知并可包括氨基酸(例如精氨酸和賴氨酸)、一、二或三羥基烷基胺(例如一、二和三乙醇胺)、膽堿、一、二和三烷基胺(例如甲胺、二甲胺和三甲胺)、胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基哌嗪；嗎啉；乙二胺；N-苯甲基苯乙胺；三(羥甲基)氨基甲烷等。
可以采用本領(lǐng)域熟知的方法以常規(guī)方式制備鹽。所述堿性化合物的酸加成鹽可通過(guò)將本發(fā)明第一和第二方面的游離堿化合物溶解于水溶液或含水乙醇溶液或其他合適的包含所需酸的溶劑中而制得。當(dāng)本發(fā)明化合物包含酸性官能團(tuán)時(shí)，則所述化合物的堿鹽可通過(guò)將所述化合物與合適的堿反應(yīng)而制得。酸或堿鹽可直接分離或可通過(guò)濃縮溶液(例如蒸發(fā))而制得。本發(fā)明的化合物也可以溶劑化物或水合物形式存在。
本發(fā)明還延伸到上述化合物的前體藥物如上述化合物的酯或酰胺的用途。前體藥物為任何可在生理?xiàng)l件下或通過(guò)溶劑分解作用被轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物或本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的任何化合物。前體藥物在給予患者時(shí)可無(wú)活性但在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的活性化合物。
本發(fā)明使用的化合物可包含一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱碳原子并可以外消旋形式和光學(xué)活性形式存在。本發(fā)明化合物可以反式或順式形式存在。本發(fā)明的第一方面涵蓋了所有此類化合物的用途。
作為上述式I的化合物的具體實(shí)例，可以提及的化合物列于下表A。
其中“Me”和“Ph”分別是指“甲基”和“苯基”。
表A


















此處所定義的化合物相稱地為MAPKAP-K2的抑制劑。為了本發(fā)明的目的，抑制劑為任何降低或阻止MAPKAP-K2酶活性的化合物。
“MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病”為任何MAPKAP-K2起作用的疾病或病癥。實(shí)例包括神經(jīng)疾病(包括癡呆癥)、炎性疾病、調(diào)亡相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)元調(diào)亡、中風(fēng)、膿毒癥、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、增生性疾病、癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、局部缺血再灌注損傷、心臟病發(fā)作、血管原性疾病、器官低氧癥、血管增生癥、心臟肥大癥、凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。
此處所定義的化合物特別適用于預(yù)防或治療神經(jīng)變性疾病。特別是由調(diào)亡和/或炎癥導(dǎo)致的神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病的實(shí)例為癡呆癥、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、杭廷頓氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德納姆舞蹈病、低血糖、頭部和脊髓創(chuàng)傷包括創(chuàng)傷性頭部損傷、急性和慢性疼痛、癲癇癥和癲癇發(fā)作、橄欖體腦橋小腦癡呆癥、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、低氧癥相關(guān)的神經(jīng)變性、急性低氧癥、谷氨酸鹽毒性包括谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、腦局部缺血、與腦膜炎和/或神經(jīng)官能癥相關(guān)的癡呆癥、腦血管性癡呆癥或HIV感染患者的癡呆癥。
此處所定義的化合物也可用于預(yù)防或治療由炎癥導(dǎo)致的疾病。這些包括例如腸炎、支氣管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各種類型的變態(tài)反應(yīng)以及可能為阿耳茨海默氏病。也可用本發(fā)明化合物治療或預(yù)防的自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、硬皮病、慢性甲狀腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血貧血癥、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、特異性皮炎、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、銀屑病或移植物抗宿主疾病。
本發(fā)明所用化合物可按以下方法制備通過(guò)將式II、III或VI的化合物如下反應(yīng)，其中R1-R6如上所定義1)將式II的化合物 在不存在或存在金屬催化的情況下在例如Buchwald條件下與式R5R6NH的化合物反應(yīng)(J.Am.Chem.Soc.116，7901-7902(1994))，并用例如CF3CO2H來(lái)脫除保護(hù)基(例如見(jiàn)述于Protective Groups InOrganic Synthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基，第三版)，John Wiley & SonsInc)。
2)將式III的化合物 與式R5R6NH的化合物反應(yīng)。
3)將式III的化合物
與式((CH3)3COCO)2O的化合物反應(yīng)(例如見(jiàn)述于有機(jī)合成中的保護(hù)基，第三版，John Wiley & Sons Inc)。
4)將式IV的化合物 與式R3NH2或R3NHAc的化合物反應(yīng)。
式I的化合物可經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的反應(yīng)來(lái)提供不同的式I化合物。例如化合物可經(jīng)過(guò)還原、氧化、消除、取代和/或加成反應(yīng)。
式IV的化合物為已知或可通過(guò)類似于已知的制備類似的已知化合物的方法來(lái)制備。式II和III的化合物包括新的化合物且這類新的化合物形成本發(fā)明的另外的方面。
其他方法以及制備起始材料和中間體的方法對(duì)本領(lǐng)域化學(xué)家是顯而易見(jiàn)的。實(shí)例也闡明了各種制備本發(fā)明化合物以及起始材料和中間體的方法。
此處所定義的藥物也可包含一種或多種另外的活性劑，例如抗炎劑(例如p38抑制劑、谷氨酸鹽受體拮抗劑或鈣通道拮抗劑)、化療劑和/或抗增生劑。
合適的載體和/或稀釋劑為本領(lǐng)域所熟知，并包括藥品級(jí)淀粉、甘露糖醇、乳糖、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖(或其他糖)、碳酸鎂、明膠、油、醇、清潔劑、乳化劑或水(優(yōu)選無(wú)菌)。組合物可為一種組合物的混合制劑或可為同時(shí)、分別或按順序使用(包括給藥)的聯(lián)用制劑。
藥物可通過(guò)任何方便的方法給藥，例如通過(guò)口服(包括通過(guò)吸入)、胃腸外、粘膜(例如口腔、舌下、鼻)、直腸或透皮給藥且組合物相應(yīng)地調(diào)整。
對(duì)口服給藥，組合物可配制為液體或固體，例如溶液、糖漿、混懸劑或乳化液、片劑、膠囊和錠劑。
液體制劑一般由化合物或生理學(xué)上可接受的鹽在合適的水或非水的液體載體(例如水、乙醇、甘油、聚乙二醇或油)中的懸浮液或溶液組成。該制劑也可包含懸浮劑、防腐劑、調(diào)味劑或著色劑。
片劑形式的組合物可通過(guò)使用通常用于制備固體制劑的任何合適的藥物載體制得。這類載體的實(shí)例包括硬脂酸鎂、淀粉、乳糖、蔗糖和微晶纖維素。
膠囊形式的組合物可通過(guò)采用常規(guī)膠囊化方法來(lái)制備。例如包含活性成分的散劑、顆?；蛐⊥杩赏ㄟ^(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)載體并隨后填充到硬明膠膠囊中制得?；蛘撸稚┗蚧鞈覄┛赏ㄟ^(guò)使用任何合適的藥物載體(例如含水樹(shù)膠、纖維素、硅酸鹽或油)，且分散劑或混懸劑隨后填充到軟明膠膠囊中制得。
可以設(shè)計(jì)口服給藥組合物使其在通過(guò)消化道時(shí)保護(hù)活性成分不受降解，例如通過(guò)在片劑或膠囊制劑上外包衣。
典型的胃腸外組合物由化合物或生理學(xué)上可接受的鹽在無(wú)菌水或非水的載體或胃腸外可接受的油(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油)的溶液或懸浮液組成?；蛘撸芤嚎杀粌龈刹㈦S后在給藥前與合適的溶劑重新構(gòu)建。
鼻腔或口服給藥的組合物可方便地配制為氣霧劑、滴劑、凝膠劑和散劑。氣霧劑制劑通常包含活性物質(zhì)在生理學(xué)上可接受的水或非水溶劑中的溶液或穩(wěn)定懸浮液，且通常以密閉容器中單劑量或多劑量數(shù)量的無(wú)菌形式存在，所述密閉容器可為藥筒形式或用霧化器再填充使用?；蛘撸荛]容器可為單次撒布裝置，例如單劑量鼻吸入器或配備計(jì)量閥的氣霧劑分樣器，所述分樣器在容器的內(nèi)容物耗盡時(shí)丟棄。當(dāng)劑型包含氣霧劑分樣器時(shí)，它將包含藥學(xué)上可接受的拋射劑。氣霧劑劑型也可為泵霧化器形式。
適合口腔或舌下給藥的組合物包括片劑、錠劑和軟錠劑，其中活性成分用載體例如糖和阿拉伯膠、黃芪膠或明膠和甘油來(lái)配制。
直腸或陰道給藥的組合物可方便地以栓劑(包含常規(guī)的栓劑基質(zhì)例如可可脂)、陰道環(huán)、陰道片、泡沫或灌腸劑的形式。
適合透皮給藥的組合物包括軟膏劑、凝膠劑、貼劑和針劑(包括粉針劑)。
組合物方便地為單位劑量形式例如片劑、膠囊劑或安瓿劑。
藥物的制備可采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。組合物可為包括片劑、液體制劑、膠囊劑和散劑的任何形式或?yàn)槭称返男问?，例如功能食品。在后一種情況中，食品本身可用作藥學(xué)上可接受的載體。
此處所定義化合物可與一種或多種其他活性劑(例如抗炎劑(如p38抑制劑)、谷氨酸鹽受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑、化療劑或抗增殖劑)同時(shí)、先后或序貫給藥。例如對(duì)急性治療，可在給予患者本發(fā)明化合物之前給予p38抑制劑。
此處所定義化合物通常以日劑量方案(對(duì)成人患者而言)給藥，例如1mg-2000mg，優(yōu)選30mg-1000mg(例如10-250mg)的口服劑量，或0.1mg-100mg，優(yōu)選0.1mg-50mg(例如1-25mg)的式(I)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽(以游離堿形式計(jì)算)的靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)劑量，化合物每天給藥1-4次?；衔镞m當(dāng)?shù)匕催B續(xù)的治療周期給藥，例如一周或更長(zhǎng)。
第二方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個(gè)體的MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予所述個(gè)體此處所定義的化合物?；钚曰衔飪?yōu)選以累積的有效量給藥。個(gè)體可為需要治療或預(yù)防的。以上討論的任何MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病可為治療或預(yù)防的主體。一種或多種其他活性劑可與該化合物同時(shí)、先后或序貫給予個(gè)體。其他活性劑可為抗炎劑(例如p38抑制劑)、谷氨酸鹽受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑、化療劑或抗增生劑。
第三方面，本發(fā)明提供了確定此處所定義化合物活性的分析，包括提供分析活性和分析化合物活性的系統(tǒng)。優(yōu)選分析化合物的MAPKAP-K2抑制活性。此處所定義的化合物可在體外、體內(nèi)、在計(jì)算機(jī)芯片上或在初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系進(jìn)行分析。活體外分析包括確定激活的MAPKAP-K2激酶活性的抑制作用的分析。或者，體外分析可定量化合物結(jié)合MAPKAP-K2的能力，并可通過(guò)在結(jié)合前放射性標(biāo)記化合物并隨后分離抑制劑/MAPKAP-K2復(fù)合體并確定所結(jié)合的放射性標(biāo)記的量來(lái)測(cè)定，或通過(guò)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定，其中新抑制劑用結(jié)合到已知的放射性配體的MAPKAP-K2孵育?？捎玫姆治龅膶?shí)例為閃爍親近測(cè)定法(SPA)，優(yōu)選使用放射性標(biāo)記的ATP。另一個(gè)實(shí)例為ELISA。在這些分析中可以使用任何類型或同工型的MAPKAP-K2。
第四方面，本發(fā)明提供了抑制MAPKAP-K2的活性或功能的方法，該方法包括將MAPKAP-K2暴露于本發(fā)明第一或第四方面的化合物或組合物中。該方法可在研究模型、體外、在計(jì)算機(jī)芯片上或體內(nèi)(例如動(dòng)物模型)中進(jìn)行。合適的動(dòng)物模型可為大鼠或小鼠的紅藻氨酸模型、大鼠的創(chuàng)傷性腦損傷模型或小鼠的MPTP模型。
每個(gè)方面的所有特性在細(xì)節(jié)上作必要的修改后可應(yīng)用到所有其他方面。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)以下實(shí)施例更為詳細(xì)地加以說(shuō)明，可以理解本發(fā)明的范疇不會(huì)在任何意義上限制于這些實(shí)施例中。
實(shí)施例1[合成通式(III)的吡唑并[1，5-a]嘧啶的常規(guī)方法]a)將胺R3NH2(1或1.1當(dāng)量)加入到5，7-二氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(IV)(2g)和三乙胺(2當(dāng)量)的2-丙醇(20ml)溶液中，將此混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將混合物在真空中濃縮并隨后將殘留物在水和二氯甲烷之間分配。有機(jī)相用水洗滌兩次，合并的水相用二氯甲烷反萃取。將合并的有機(jī)層合并用鹽水洗滌并用Na2SO4干燥。真空脫除溶劑得到前體(III)。(正常情況下產(chǎn)物不需要任何進(jìn)一步的純化，如果它們需要純化，則它們被重結(jié)晶。用NMR、HPLC和MS進(jìn)行分析。)如果上述室溫下的反應(yīng)未令人滿意地發(fā)生，則可以采用以下b)將胺R3NH2(1.2當(dāng)量)加入到5，7-二氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(IV)(2g)的包含N，N-二異丙基乙胺(2當(dāng)量)的2-丙醇(25ml)溶液中。反應(yīng)物在80℃下加熱過(guò)夜并用真空脫除溶劑。殘余物在水和二氯甲烷之間分配，有機(jī)相用水、鹽水洗滌兩次并用MgSO4干燥。真空脫除溶劑得到產(chǎn)物。
在R3NH2為受阻胺或弱親核的苯胺的情況下，可以采用以下方法c)在室溫下將氫化鈉(3mmol)加入2-甲基乙酰苯胺(2.2mmol)的甲苯(3ml)溶液中。加畢，將混合物加熱直到泡騰停止為止，溶液變得均勻。加入5，7-二氯吡唑并[1，5-a]嘧啶(IV)(1mmol)并將混合物加熱回流5h。(在此期間溶液變得不均勻)。冷卻后，謹(jǐn)慎地加入乙酸(1ml)和水(1ml)并將混合物攪拌15分鐘。真空脫除溶劑，殘余的乙酸用甲苯(3x)共沸蒸發(fā)而脫除。殘余物在水和乙酸乙酯之間分配。(用水和鹽水)洗滌有機(jī)相并干燥。真空脫除溶劑，殘余物用色譜法制得所需的化合物(III)。典型的未優(yōu)化產(chǎn)率為c)50-70％。起始材料(IV)和產(chǎn)物(III)的Rf在色譜上無(wú)法分辨，使得難以確定完全反應(yīng)?？雌饋?lái)似乎需要至少5h來(lái)出現(xiàn)顯著的反應(yīng)。

實(shí)施例2[合成通式(II)的吡唑并[1，5-a]嘧啶的常規(guī)方法]
將二碳酸二叔丁酯(2當(dāng)量)的1，4-二氧六環(huán)(10ml)溶液加入以上形成的前體(III)(2g)的1，4-二氧六環(huán)(10ml)溶液，隨后加入4-二甲基氨基吡啶(催化劑)。反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜，如果用TLC檢測(cè)到起始材料，則反應(yīng)進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間。混合物在真空中濃縮，隨后將殘余物在水和二氯甲烷之間分配。有機(jī)相用10％的檸檬酸、水和鹽水洗滌并用MgSO4干燥。真空脫除溶劑得到Boc保護(hù)的中間體(II)。(用過(guò)濾柱脫除任何殘留的4-二甲基氨基吡啶來(lái)進(jìn)行純化。用NMR、HPLC和MS進(jìn)行分析。)

實(shí)施例3[合成通式(I)的吡唑并[1，5-a]嘧啶的常規(guī)方法]a)將Boc保護(hù)中間體(II)(100mg)和反式-1，4-環(huán)己二胺(1.5g)充分混和的混合物在80-85℃下加熱90分鐘，然后冷卻。隨后將原料在二氯甲烷和飽和NaHCO3溶液之間分配。分離出有機(jī)相并用水洗滌。用MgSO4干燥并真空濃縮。將原料溶解于二氯甲烷(10ml)和三氟乙酸(5ml)。在室溫下攪拌1h，隨后真空蒸發(fā)。殘余物在飽和NaHCO3和二氯甲烷之間，分離有機(jī)相，用MgSO4干燥并隨后經(jīng)硅膠進(jìn)行柱色譜。洗脫液為二氯甲烷，隨后進(jìn)行梯度洗脫直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)。典型的純化產(chǎn)量為20mg。
b)將Boc保護(hù)中間體(II)(100mg)和反式-1，4-環(huán)己二胺(1.5g)充分混和的混合物在80-85℃下加熱18小時(shí)，然后冷卻。隨后將原料在二氯甲烷和飽和NaHCO3溶液之間分配。分離出有機(jī)相并用水洗滌。用MgSO4干燥并真空濃縮。將原料經(jīng)硅膠進(jìn)行柱色譜。洗脫液為二氯甲烷，隨后進(jìn)行梯度洗脫直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)。典型的純化產(chǎn)量為20mg。
c)將中間體(II)(0.1mmol)溶解于甲苯(1ml)中并加入胺(1.2當(dāng)量)。在氮?dú)獯嬖谙掳错樞蚣尤肴?二亞芐基丙酮)二鈀(0)(2mol％)、2，2′-雙(二苯膦基)-1，1′-聯(lián)萘(4mol％)和叔丁醇鈉(1.2當(dāng)量)。反應(yīng)物在80℃下加熱并攪拌過(guò)夜，然后反應(yīng)物通過(guò)0.45微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。真空脫除溶劑，將殘余物重懸于二氯甲烷(2ml)。加入三氟乙酸(0.8ml)，并使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。將混合物真空蒸發(fā)到干燥，將所得的殘余物溶解于N，N-二甲基甲酰胺(1ml)，過(guò)濾并用制備HPLC純化得到產(chǎn)物(I)。(用LC/MS進(jìn)行分析。)d)通式(I)的化合物進(jìn)一步精制i)用酰鹵、磺酰鹵、異氰酸酯和異硫氰酸酯酰化將三乙胺(1.1當(dāng)量)加入化合物2(50mg)的二氯甲烷(10ml)溶液中，隨后滴加酰鹵、磺酰鹵、異氰酸酯或異硫氰酸酯(1.05當(dāng)量)。將混合物攪拌1-2小時(shí)隨后用水洗滌，用MgSO4干燥，真空脫除溶劑隨后將殘余物經(jīng)硅膠進(jìn)行柱色譜。洗脫液為二氯甲烷，隨后進(jìn)行梯度洗脫直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)來(lái)得到化合物，例如

ii)還原氨基化將環(huán)己酮(1.1當(dāng)量)加入化合物2(50mg)的四氫呋喃(5ml)溶液中，反應(yīng)在60℃加熱過(guò)夜。隨后將氰基硼氫化鈉(5當(dāng)量)加入冷卻的混合物中并在環(huán)境溫度下攪拌2小時(shí)。將混合物真空蒸發(fā)至干燥，將所得的殘余物溶解于水和乙酸乙酯中。分離有機(jī)相，用MgSO4干燥并隨后經(jīng)硅膠進(jìn)行柱色譜。洗脫液為二氯甲烷，隨后進(jìn)行梯度洗脫直到95％二氯甲烷+5％(10M NH3的甲醇溶液)，得到20mg熔點(diǎn)為85-87℃的化合物134。
用以上方法制備的通式(I)的化合物記錄于表B。表B中的每個(gè)化合物指定的數(shù)字對(duì)應(yīng)于上述表A中作為具體實(shí)例列出的化合物的編號(hào)。各化合物通過(guò)采用具有電噴霧離子源的單四極桿的質(zhì)譜來(lái)鑒定。M+H表示捕獲質(zhì)子(H)的化合物分子質(zhì)量(M)的值，M-H表示失去質(zhì)子(H)的化合物分子質(zhì)量(M)的值。熔點(diǎn)(mp)未經(jīng)修正。(d)表示在熔點(diǎn)或接近熔點(diǎn)時(shí)分解。不是固體的化合物為樹(shù)膠。
表B







MAPKAP-激酶2分析[化合物制備]將各化合物溶解于DMSO中，濃度為3Mm，并以等分試樣在-20℃下儲(chǔ)備。將這些儲(chǔ)備的等分試樣的化合物的DMSO溶液稀釋于30％的DMSO中得到1mM和3mM的初始工作儲(chǔ)備溶液。隨后將這兩種儲(chǔ)備溶液在30％DMSO中按1∶10連續(xù)稀釋來(lái)制備3000、1000、300、100、30、10、3、1、0.1、0.01μM儲(chǔ)備溶液。每50μl反應(yīng)使用5μl的每種儲(chǔ)備溶液來(lái)得到300、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.01、0.001μM的最終分析濃度。
激酶反應(yīng)在圓底聚丙烯96孔板中進(jìn)行。將MAPKAP-K2用稀釋緩沖液(50mM Tris/HCl。pH7.5，0.1mM EGTA，0.1％(體積/體積)β-巰基乙醇，1mg/ml BSA)稀釋到25mU/μl。在每個(gè)孔中加入5μl化合物或30％DMSO，隨后再加入25μl底物合劑(cocktail)(10μM ATP，30μM肽(KKLNRTLSVA)，0.5μCi33P-γ-ATP的50mM Tris pH7.5溶液，0.1mM EGTA，10mM乙酸鎂，0.1％BME)。通過(guò)加入20μl酶溶液/孔或20μl無(wú)酶稀釋溶液來(lái)起始反應(yīng)。將板振搖10秒并隨后在室溫下放置30分鐘。用50μl150mM的磷酸終止反應(yīng)。隨后將90μl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到96孔P81濾板(Millipore)并在室溫下培養(yǎng)5分鐘。隨后將濾板在板多頭抽真空裝置(Millipore)上用200μl 75mM的磷酸/孔洗滌4次并在烘箱中干燥2-3小時(shí)。隨后在每個(gè)孔加入PackardMicroScint′0′(30μl)，將板混合30分鐘并在Packard TopCount上進(jìn)行液體閃爍計(jì)數(shù)。
％對(duì)照＝(X-B)/(Tot-B)×100％抑制＝100-％對(duì)照X＝試驗(yàn)化合物孔的每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)B＝無(wú)酶孔的每分鐘計(jì)數(shù)Tot＝僅具有DMSO載體的孔的每分鐘計(jì)數(shù)表B中的化合物抗激酶的功效見(jiàn)表C。(根據(jù)在典型的1-100μM進(jìn)行的分析，將活性表示為+、++或+++，代表有活性、較高活性和非常高活性。)
表C






工業(yè)應(yīng)用性式I的吡唑并[1，5-a]嘧啶衍生物和它們的藥學(xué)上可接受的鹽顯示出極好的激酶抑制活性(特別是MAPKAP-K2抑制活性)。包含作為有效成分的化合物的藥物因此預(yù)期可用作蛋白激酶介導(dǎo)的疾病(其中涉及激酶)的治療劑或預(yù)防劑，例如炎性疾病、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、癌癥和/或腫瘤生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其他藥學(xué)上可接受的生物水解衍生物，包括其酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲、溶劑化物、水合物、親和試劑或前體藥物在制備用于抑制蛋白激酶的藥物中的用途 其中R1為氫R2為氫R3為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基、任選取代的雜芳烷基、任選取代的芳烯基、任選取代的雜芳烯基、任選取代的芳炔基或任選取代的雜芳炔基；R4為氫；R5為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基、任選取代的雜芳烷基、任選取代的芳烯基、任選取代的雜芳烯基、任選取代的芳炔基或任選取代的雜芳炔基、任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基；R6為氫、C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基或C3-C8任選取代的環(huán)烷基；或R5和R6一起與連接它們的氮原子共同形成各環(huán)均為5-7元環(huán)的單環(huán)或雙環(huán)雜環(huán)，并且除氮原子之外還任選含有一個(gè)或兩個(gè)選自N、O和S的另外的雜原子，所述單環(huán)或雙環(huán)雜環(huán)可任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代。
2.權(quán)利要求1的用途，其中R3為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的芳烷基或任選取代的雜芳烷基。
3.權(quán)利要求2的用途，其中R3為C2-C8任選取代的烯基、任選取代的芳基或任選取代的芳烷基。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中R5為C1-C8任選取代的烷基、C2-C8任選取代的烯基、C2-C8任選取代的炔基、C3-C8任選取代的環(huán)烷基、任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基。
5.權(quán)利要求4的用途，其中R5為被NHR7取代的C3-C8環(huán)烷基，其中R7為任選取代的雜環(huán)基或任選取代的雜環(huán)基烷基。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中R6為氫或C1-C8任選取代的烷基。
7.權(quán)利要求6的用途，其中R6為氫。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用作MAPKAP-K2的抑制劑。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病為包括癡呆癥的神經(jīng)疾病、炎性疾病、調(diào)亡相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)元調(diào)亡、中風(fēng)、膿毒癥、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、增生性疾病、癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、局部缺血再灌注損傷、心臟病發(fā)作、血管原性疾病、器官低氧癥、血管增生癥、心臟肥大癥、凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述疾病為神經(jīng)變性疾病。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述神經(jīng)變性疾病為癡呆癥、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、杭廷頓氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德納姆舞蹈病、低血糖、頭部和脊髓創(chuàng)傷包括創(chuàng)傷性頭部損傷、急性和慢性疼痛、癲癇癥和癲癇發(fā)作、橄欖體腦橋小腦癡呆癥、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、低氧癥相關(guān)的神經(jīng)變性、急性低氧癥、谷氨酸鹽毒性包括谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、腦局部缺血、與腦膜炎和/或神經(jīng)官能癥相關(guān)的癡呆癥、腦血管性癡呆癥或HIV感染患者的癡呆癥。
13.權(quán)利要求10的用途，其中所述疾病由炎癥導(dǎo)致。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述疾病為腸炎、支氣管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各種類型的變態(tài)反應(yīng)或阿耳茨海默氏病。
15.權(quán)利要求10的用途，其中所述疾病為自身免疫性疾病。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、硬皮病、慢性甲狀腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血貧血癥、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、特異性皮炎、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、銀屑病或移植物抗宿主疾病。
17.一種治療或預(yù)防MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予所述個(gè)體至少一種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所定義的化合物或權(quán)利要求8或9所定義的組合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述MAPKAP-K2介導(dǎo)的疾病為包括癡呆癥的神經(jīng)疾病、炎性疾病、調(diào)亡相關(guān)的疾病，特別是神經(jīng)元調(diào)亡、中風(fēng)、膿毒癥、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、增生性疾病、癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)、局部缺血再灌注損傷、心臟病發(fā)作、血管原性疾病、器官低氧癥、血管增生癥、心臟肥大癥、凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病為神經(jīng)變性疾病。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述神經(jīng)變性疾病為癡呆癥、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、杭廷頓氏舞蹈病、老年性舞蹈病、西德納姆舞蹈病、低血糖、頭部和脊髓創(chuàng)傷包括創(chuàng)傷性頭部損傷、急性和慢性疼痛、癲癇癥和癲癇發(fā)作、橄欖體腦橋小腦癡呆癥、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、低氧癥相關(guān)的神經(jīng)變性、急性低氧癥、谷氨酸鹽毒性包括谷氨酸鹽神經(jīng)毒性、腦局部缺血、與腦膜炎和/或神經(jīng)官能癥相關(guān)的癡呆癥、腦血管性癡呆癥或HIV感染患者的癡呆癥。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病由炎癥導(dǎo)致。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病為腸炎、支氣管炎、哮喘、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、各種類型的變態(tài)反應(yīng)或阿耳茨海默氏病。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述疾病為自身免疫性疾病。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、硬皮病、慢性甲狀腺炎、格雷夫斯病、自身免疫性胃炎、糖尿病、自身免疫性溶血貧血癥、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、特異性皮炎、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、銀屑病或移植物抗宿主疾病。
25.權(quán)利要求18-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種活性劑與該化合物同時(shí)、先后或序貫給予個(gè)體。
26.測(cè)定權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所定義的化合物的活性的方法，該方法包括提供分析活性和分析權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所定義的化合物的活性的系統(tǒng)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述分析是化合物的蛋白激酶抑制活性分析。
28.一種抑制蛋白激酶活性或功能的方法，該方法包括將蛋白激酶暴露于權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所定義的化合物中。
29.一種抑制MAPKAP-K2活性或功能的方法，該方法包括將MAPKAP-K2暴露于權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所定義的化合物中。
30.權(quán)利要求29的方法，該方法在研究模型中、體外、計(jì)算機(jī)芯片上或體內(nèi)進(jìn)行。
全文摘要
式I代表的吡唑并[1，5－a]嘧啶衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽顯示出極好的激酶抑制活性。因此，包含作為有效成分的化合物的藥物有望用作蛋白激酶介導(dǎo)的涉及激酶的疾病的治療劑或預(yù)防劑，所述疾病例如炎性疾病、自身免疫性疾病、破壞性骨骼疾病、癌癥和/或腫瘤生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1784410SQ20048001236
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月11日
發(fā)明者片岡健一郎, 小杉知巳, 今井穰, D·R·米切爾, D·J·辛普森, N·J·丘奇, 鈴木直貴, 山越優(yōu)子 申請(qǐng)人:帝人制藥株式會(huì)社