專利名稱：抗Smad7的反義寡核苷酸(ODN)及其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗Smad7的反義寡核苷酸(ODN)及其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途。
本發(fā)明特別涉及適當(dāng)修飾的Smad7反義ODN序列，該序列顯示令人吃驚的特異性抑制Smad7表達(dá)的生物學(xué)活性，因此可作為生物治療劑用于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是用于治療慢性炎性腸病(IBD)。
克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是人的慢性炎性腸病的主要形式。兩種疾病均是復(fù)合臨床實(shí)體，其發(fā)病機(jī)理嚴(yán)格依賴于不同的遺傳、環(huán)境和免疫因子之間的相互作用。
盡管CD和UC在病理生理學(xué)和臨床水平上顯示明顯差異，對患者的治療方法卻共有許多共同的要素。即使藥理治療是首選方法，臨床表現(xiàn)、損害的類型和擴(kuò)展與并發(fā)癥類型的易變性影響治療方法的選擇。
水揚(yáng)酰偶氮磺胺吡啶和5-氨基水揚(yáng)酸是已證明在治療溫和型IBD和緩解維持療法中有效的藥物。
在具有中等到嚴(yán)重活性的階段和在與普遍狀態(tài)有關(guān)的情況下，需要使用皮質(zhì)類固醇。從主要的世界性病史的中長期分析可看出僅三分之二接受皮質(zhì)類固醇的患者可獲得臨床緩解，停藥后僅50％的患者未發(fā)生任何復(fù)發(fā)。
皮質(zhì)類固醇的連續(xù)給藥除誘導(dǎo)藥物依賴現(xiàn)象外，還會由于副作用的高危險性而使情況更糟。
同樣，經(jīng)常伴隨或取代皮質(zhì)類固醇治療的免疫抑制治療不能總是確保遏制炎癥和控制癥狀，并且還具有多種禁忌癥和嚴(yán)重副作用的缺點(diǎn)(Podolsky，2002)。
二十世紀(jì)九十年代可獲得的新一代藥物是生物制劑。更徹底的了解IBD的自然歷史和主要病理生理學(xué)機(jī)制有助于以具體方式控制醫(yī)學(xué)干預(yù)。從而產(chǎn)生了旨在控制特殊的炎癥“途徑”通過使用重組人蛋白質(zhì)、單克隆嵌合人源化抗體和融合蛋白的生物療法。文中，在治療CD中顯示出較好效力的藥物是直接阻斷TNF-α的單克隆嵌合抗體，TNF-α是在IBD過程中超量產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子(Seegers等，2002)。目前處于臨床試驗(yàn)IV期的該化合物在約60-70％的治療的患者中有效地遏制炎癥。然而，相當(dāng)大的發(fā)病率和可看出潛在微生物感染的復(fù)活、過敏現(xiàn)象和形成自身抗體已指出該化合物有一些副作用。后一個現(xiàn)象可能是基于抗TNF-α的化合物使得具有多種生物功能的細(xì)胞因子TNF-α失效的事實(shí)。
除了炎性作用，TNF-α也參與誘導(dǎo)和維持免疫耐受性的機(jī)制。因此，阻斷TNF-α活性反常地促進(jìn)過量的免疫反應(yīng)(Sandborn等，2002)。
所有這些評論說明需要在IBD的動物模型上進(jìn)行新的研究，通過這些研究可能鑒定用于更好且經(jīng)久的治療這種病癥的新的活性成分(Fiocchi，2001)。
就其它的生物療法而言，抗TNF-α治療，如施用抗炎性細(xì)胞因子(例如IL-10)代表目的在于控制炎性細(xì)胞分泌分子的生物效應(yīng)的治療性胞外方法。
對細(xì)胞因子與其受體相互作用激活的信號-轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究概括描述了使用能特異性和選擇性地調(diào)節(jié)重要的炎性和非炎性分子胞內(nèi)表達(dá)的新治療性策略的可能性。
在正常條件下，腸粘膜是“生理”炎性滲透的部位，其在促炎性和抗炎性分子之間維持脆弱的平衡。
能調(diào)節(jié)生長、分化和許多免疫和非免疫細(xì)胞活性的多功能細(xì)胞因子TGF-β1在與上述有關(guān)的情況中扮演了重要角色。
體外和體內(nèi)的研究證明TGF-β1是能控制腸粘膜發(fā)炎的強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)劑，并且抑制其活性導(dǎo)致發(fā)生與CD或UC免疫形態(tài)類似的結(jié)腸炎(Powrie F.等，1996；Neurath M.F.等，1996；Ludviksson B.R.等，1997)。
事實(shí)上，TGF-β1基因缺乏的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的多病灶炎性反應(yīng)(也包括腸)與由多種類型細(xì)胞(包括T細(xì)胞)產(chǎn)生過量的炎性細(xì)胞因子有關(guān)(Shull M.M.等，1992；Christ M.等，1994)。
類似地，通過表達(dá)TGF-β1受體RII的顯性負(fù)突變體形式抑制小鼠中TGF-β1信號提高了發(fā)生實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的敏感性(Hahm K.B.等，2001)。
最后，通過表達(dá)顯性負(fù)TGF-β受體II型特異性抑制T細(xì)胞中TGF-β1信號導(dǎo)致肺部和結(jié)腸中嚴(yán)重的炎性浸潤以及存在循環(huán)自身免疫抗體為特征的自身免疫疾病(Gorelik L.等，2000)。這些數(shù)據(jù)表明單個抗炎性分子活性的喪失足夠改變腸穩(wěn)態(tài)并發(fā)生能導(dǎo)致組織損傷的免疫應(yīng)答。
TGF-β1的抗炎性活性始于該分子與異源二聚體跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體復(fù)合物的相互作用，該復(fù)合物由兩個亞基組成，分別命名為TGF-β1 R1和TGF-β1 R2。TGF-β1結(jié)合時，受體在上述復(fù)合物內(nèi)相對旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致反式磷酸化過程，然后通過結(jié)構(gòu)活性的TGF-β1 R2激活TGF-β1 R1并能自磷酸化。
由屬于Smad族的蛋白介導(dǎo)TGF-β1激發(fā)的信號傳播至核。激活的TGF-β1 R1直接磷酸化Smad2和Smad3蛋白，使得這兩個蛋白可與Smad4相互作用，從而使Smad2-3/Smad4復(fù)合物移位至核，在那里復(fù)合物參與一些基因的轉(zhuǎn)錄控制(HeldinC-H.等，1997)。
動物模型的研究支持了Smad在TGF-β1抗炎性活性中的作用，這些研究表明Smad3編碼基因的缺失與細(xì)胞對TGF-β1應(yīng)答性降低和相關(guān)炎性疾病的發(fā)生有關(guān)，這些疾病的特征在于胃腸道水平大量浸潤T-細(xì)胞和形成化膿性膿腫(Yang X.等，1999)。
其它的胞內(nèi)蛋白，例如Smad7也屬于Smad蛋白族。這種占據(jù)TGF-β1R1的蛋白干擾Smad2/Smad3與受體的結(jié)合，從而阻止了磷酸化和激活。因此Smad7蛋白表達(dá)增加與TGF-β1介導(dǎo)的信號抑制有關(guān)(Hayashi H.等，1997)。
對IBD患者腸粘膜中的TGF-β1表達(dá)的評估顯示與普通患者腸中證實(shí)的相比所述分子的產(chǎn)量反而增加了(Lawrance IC.等，2001)。
本發(fā)明人在近期的文章中表明IBD患者的粘膜樣品以高水平的Smad7和降低水平的活性Smad3為特征，從而說明在IBD期間，TGF-β1介導(dǎo)的信號機(jī)制受到損害。本發(fā)明人還說明用特異性反義寡核苷酸5′-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3′(SEQ ID No 1)選擇性抵消Smad7可恢復(fù)固有層單核細(xì)胞(LPMC)對TGF-β1的應(yīng)答性，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子(例如TNF-α)的產(chǎn)量下調(diào)。
此外，在IBD患者的腸粘膜樣品中進(jìn)行的先體外后體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示施用Smad7反義ODN可恢復(fù)TGF-β1信號機(jī)制并降低細(xì)胞因子的產(chǎn)量(Monteleone.等，2001)。
在IBD期間，腸粘膜浸潤了大量的T-細(xì)胞。這些細(xì)胞被認(rèn)為是作用在這種疾病中的組織損傷的主要介體。
IBD患者的腸粘膜中T細(xì)胞數(shù)量的增加部分依賴于這種細(xì)胞抗誘導(dǎo)其死亡(細(xì)胞凋亡)的刺激的耐受性。
據(jù)信，阻斷T細(xì)胞凋亡在維持IBD的粘膜炎性應(yīng)答中起關(guān)鍵作用(Boirivant.等，1999)。實(shí)際上，T細(xì)胞死亡的增加與腸炎癥的消退有關(guān)。IBD期間T細(xì)胞抗細(xì)胞凋亡的耐受性的確切機(jī)制仍不清楚，即使似乎涉及局部釋放的細(xì)胞因子。
體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)表明TGF-β1可阻止或激活T細(xì)胞死亡并且該因子介導(dǎo)兩種應(yīng)答的能力是位點(diǎn)特異的(Han SH.等，1998；Arsura M.等，1996)。
Smad3敲除的小鼠在腸水平表現(xiàn)出炎性細(xì)胞數(shù)目大量增加，從而提示TGF-β1在腸水平控制腸T細(xì)胞凋亡中的作用(Yang等，1999)。
因此，使用合成的Smad7反義ODN抑制Smad7可代表一種新穎和可接受的“內(nèi)源性”生物治療慢性炎性疾病的方法，因?yàn)槿缟纤鏊謴?fù)了T細(xì)胞對TGF-β1的應(yīng)答性，所以該方法尤其針對IBD。
反義寡核苷酸(ODN)是與編碼特異和定向抑制的靶蛋白的信使RNA(mRNA)互補(bǔ)的短合成寡核苷酸序列。這種與mRNA雜交的序列產(chǎn)生了雙鏈雜交特性并激活普遍存在的催化酶，例如RNA酶H，這種酶降解實(shí)質(zhì)上產(chǎn)生激活DNA復(fù)制的DNA/RNA雜交鏈，從而阻止蛋白的翻譯。
即使與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域5’和剪接區(qū)域互補(bǔ)的ODN通常會導(dǎo)致更有效的結(jié)果，選擇與ODN雜交的最合適的mRNA區(qū)域和序列是需要經(jīng)驗(yàn)的。由于近來該領(lǐng)域?qū)ｉT化的公司擁有先進(jìn)的自動合成技術(shù)，在鑒定可能的靶部位后，設(shè)計大量的反義ODN不會產(chǎn)生困難。
相反，對可能的治療應(yīng)用而鑒定更具活性的ODN需要長期的篩選工作，該工作通過定量測試中測定效力。與上述相關(guān)的針對Smad7中的特定靶位的反義ODN序列是已知的(美國專利號6,159,697；受讓人ISIS制藥有限公司)。
由于這些分子的聚陰離子和親水性特征以及酶的快速降解作用，一些問題阻礙了使用反義ODN在體外和體內(nèi)進(jìn)行基因調(diào)控，例如難于穿過細(xì)胞膜。
為克服這些障礙，需要借助反義ODN的化學(xué)修飾，例如在上述Smad7特異序列的情況中磷酸硫代化(Monteleone.等，2001)，或磷酸酰胺化，即以硫或氮原子取代那些磷酸二酯鍵中非橋原子的氧原子。
與許多生物技術(shù)產(chǎn)品一樣，生物活性的證明指出了潛在的治療活性。
實(shí)際上，ODN可用在與不同疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)的基因和蛋白質(zhì)功能研究或用于治療性目的。盡管在前一個應(yīng)用領(lǐng)域中反義方法對于指導(dǎo)原則的容易是成功的，但由體外轉(zhuǎn)向體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更復(fù)雜，特別是關(guān)于這些新藥的藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)方面(Maggi A.等，1998)。
例如，本發(fā)明人以前進(jìn)行的體外生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)中使用的Smad7反義ODN(SEQ ID No 1)在體內(nèi)顯示出不期望效應(yīng)增加的危險。事實(shí)上，這種ODN含有兩個核苷酸CG對在磷酸硫代化后變?yōu)镃pG，這是提高ODN穩(wěn)定性的基本方法。后者是具有免疫系統(tǒng)強(qiáng)有力的刺激活性的序列，因此使用上述這種ODN會惡化任何免疫疾病的進(jìn)程，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。
不能假定類似的治療方法，特別是在克羅恩病的情況下，這是在白介素12刺激下由命名為Th1的特定類T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的病理學(xué)。實(shí)際上作為強(qiáng)有力的IL-12合成的誘導(dǎo)物，CpG分子能進(jìn)一步誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的發(fā)展。
此外，含有CpG二核苷酸的反義ODN體內(nèi)給藥與不含CpG的寡核苷酸相比副作用的危險增加了。特別是已證實(shí)脾、腎和肝的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)增生的危險增加，以及造血細(xì)胞增殖的增加(Agrawal S.等，2002)。
由于ODN的5’和3’端未保護(hù)頗易受核酶攻擊，使用ODN的另一個問題是來自該分子降解的代謝物的作用必然會導(dǎo)致副作用。
因此需要對硫代磷酸反義ODN骨架的CpG配對和5’與3’端進(jìn)行化學(xué)修飾。然而，修飾上述的ODN序列可能降低或喪失抑制Smad7合成的生物活性，并且有時甚至?xí)孓D(zhuǎn)體內(nèi)和體外的所需活性。
同樣，處理適合于體內(nèi)研究的實(shí)驗(yàn)性IBD模型是重要的，該模型可擴(kuò)大涉及免疫應(yīng)答調(diào)控喪失的機(jī)制和這些機(jī)制在IBD發(fā)作病理學(xué)中的作用的知識，以及調(diào)節(jié)或阻止這種應(yīng)答的可能性，從而限制在粘膜水平的炎癥進(jìn)程。與上述有關(guān)的TNBS介導(dǎo)的結(jié)腸炎代表了廣泛而有效的粘膜炎癥模型，該模型與人CD顯示出驚人的免疫形態(tài)學(xué)相似性(Neurath M.等，2000)。
由于上述原因，需要使用通過“內(nèi)源性”生物治療方法治療IBD的、在體內(nèi)外均有活性的新治療性生物制劑，如Smad7反義ODN。
本發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)適當(dāng)修飾的反義ODN序列，與其體外抑制活性相比它們在IBD實(shí)驗(yàn)性模型中表現(xiàn)出較高的抑制Smad7表達(dá)的體內(nèi)生物活性，并且還高于其它已知的顯示相同修飾和在相同模型上測試的序列的活性。
特別是，體內(nèi)表現(xiàn)出較高生物活性的ODN序列是按照靶向人Smad7 RNA的位點(diǎn)403的硫代磷酸反義ODN序列(SEQ ID NO 1)設(shè)計的，這是在本發(fā)明人以前的實(shí)驗(yàn)過程中使用的。
由于這種Smad7硫代磷酸反義ODN在治療人類疾病中潛在和將來的用途，所述序列在其中含有的CpG二核苷酸處(因?yàn)樗鼈円咽黾暗闹旅庖咝?進(jìn)行修飾，以下稱為XY。
本發(fā)明人進(jìn)行的研究測試了各種已知和新穎的Smad7反義ODN的體內(nèi)與體外效力以及可能的毒性，并檢測了阻斷Smad7表達(dá)是否導(dǎo)致IBD實(shí)驗(yàn)性模型中粘膜炎癥的消退。
盡管在相同的研究過程中其它序列施用后動物中發(fā)生副作用，上述本發(fā)明的適當(dāng)修飾的反義ODN序列除了具有較高的體內(nèi)生物活性外，還表現(xiàn)出意外的無副作用。此外，本發(fā)明的ODN序列表現(xiàn)出限制淋巴細(xì)胞浸潤和以后的炎癥傳播的功效，這是其它反義ODN序列在本文測試中未發(fā)現(xiàn)的證據(jù)。
實(shí)驗(yàn)性模型中的這些研究和對其抑制的可能的療效可明顯看出Smad7作為生物靶的作用。
此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了Smad7在IBD過程中誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的作用。事實(shí)上，通過使用一些Smad7反義ODN已顯示TGF-β1調(diào)控腸T細(xì)胞凋亡并且缺損因子活性是導(dǎo)致細(xì)胞對凋亡刺激的耐受性的原因，這些刺激負(fù)責(zé)維持粘膜炎性應(yīng)答。
因此，本發(fā)明的目的是長度為21個核苷酸的Smad7硫代磷酸化的反義寡核苷酸，該寡核苷酸含有至少10個核苷酸的部分具有以下序列(SEQ ID No 2)5’-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’，其中X是含有選自胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2’-O-甲基胞嘧啶的含氮堿基的核苷酸并且Y是含有選自鳥嘌呤、5-甲基鳥嘌呤和2’-O-甲基鳥嘌呤的含氮堿基的核苷酸，只要核苷酸X或Y中至少一個含有甲基化的含氮堿基或其互補(bǔ)序列。
本發(fā)明其它的目的是各種反義寡核苷酸立體異構(gòu)體的寡核苷酸序列，例如非對映異構(gòu)體和對映異構(gòu)體，這些立體異構(gòu)體是對于序列中所包括的核苷酸間連鍵的磷原子而言的。實(shí)際上，核苷酸間連鍵可是硫代磷酸酯或甲基磷酸酯并且在兩種情況下與四個不同的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合的磷代表一個手性中心。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可在序列中具有至少一個甲基磷酸酯核苷酸，其位于，例如僅在5’或3’端之一或5’和3’端，或沿著寡核苷酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，甲基磷酸酯核苷酸可是X或Y，在這種方式中核苷酸間連鍵是在所述核苷酸之間的鍵。
在5’和3’端和/或沿著反義ODN的核苷酸序列可進(jìn)行其它的修飾以增加分子穩(wěn)定性從而阻止核酶的降解并減少從代謝物的作用產(chǎn)生不良效應(yīng)的危險。
本發(fā)明的反義寡核苷酸還可在序列中具有至少一個2’-O-甲基核糖核苷酸5’-單磷酸酯，例如其僅位于5’或3’端之一或5’和3’端，或沿著寡核苷酸序列。
本發(fā)明其它的目的是以上所述的反義寡核苷酸，其中2’-脫氧核糖核苷酸為核糖核苷酸所取代而2’-脫氧胸苷為尿苷所取代，以此方式將反義脫氧核糖核苷酸序列轉(zhuǎn)為對應(yīng)的反義核糖核苷酸序列。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是具有以下序列(SEQ ID No 3)的反義寡核苷酸5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’，其中X是5-甲基2’-脫氧胞苷5’-單磷酸酯。
另一個優(yōu)選的實(shí)施方案是具有以下序列(SEQ ID No 4)的反義寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’，其中X是5-甲基2’-脫氧胞苷5’-單磷酸酯，Z是2’-脫氧鳥苷甲基磷酸酯。
按照另一方面，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是具有以下序列(SEQ IDNo 15)的反義寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3’，其中X是5-甲基2’-脫氧胞苷5’-單磷酸酯，Z是2’-脫氧鳥苷甲基磷酸酯。
本發(fā)明的反義ODN可有利地用于醫(yī)藥領(lǐng)域；因此本發(fā)明的其它目的是含有至少一種上述的反義寡核苷酸作為活性成分以及一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及前述反義寡核苷酸序列在制備用于治療與Smad7表達(dá)相關(guān)疾病的藥物中的用途。特別與是這種Smad7表達(dá)相關(guān)疾病是IBD，例如CD和UC。
以下將按照優(yōu)選的實(shí)施方案，特別是參考附圖對本發(fā)明進(jìn)行闡述性而非限制性的說明，其中

圖1顯示了用Smad7 ODN反義和有義5′-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3′(SEQ ID No 4)處理CD患者的粘膜樣品40小時之后對腸T淋巴細(xì)胞數(shù)目的影響；圖2顯示了分析p-Smad2/Smad3復(fù)合物和總的Smad2/Smad3復(fù)合物在LPMC中的表達(dá)，LPMC分離自TNBS處理的小鼠(TNBS)、未處理的小鼠(Unt)和作為對照的乙醇處理的小鼠(EtOH)的腸；圖3顯示了分析Smad7在LPMC中的表達(dá)，LPMC分離自TNBS處理的小鼠(TNBS)、未處理的小鼠(Unnt)和作為對照的乙醇處理的小鼠(EtOH)的腸；圖4顯示了患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠的體重變化百分率，這些小鼠分別用Smad7反義寡核苷酸MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC(SEQ.IDNo 15)處理或不處理或用作為對照的(有義寡核苷酸)處理；該圖代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，其中每組研究了14只小鼠；圖5是從患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠和患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎并用Smad7反義寡核苷酸(SEQ.ID No 15)處理的小鼠中提取的結(jié)腸的肉眼可視圖；該圖代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，其中每組研究了14只小鼠；圖6是無結(jié)腸炎的小鼠和患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎并用Smad7反義寡核苷酸(SEQ.ID No 15)或用對照(有義寡核苷酸)處理的小鼠的結(jié)腸切片的組織學(xué)圖；該圖代表三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，其中每組研究了14只小鼠。放大率40×。
實(shí)施例1本發(fā)明Smad7反義寡核苷酸對腸道T細(xì)胞凋亡作用的研究材料與方法反義ODN的合成所有Smad7反義ODN由MWG Biotech AG(MWG Biotech S.r.l.，F(xiàn)lorence)采用標(biāo)準(zhǔn)氨基磷酸鹽化學(xué)方案(Lesiak K.等，1993；Xiao W.等，1996)以標(biāo)準(zhǔn)自動技術(shù)使用自動DNA合成儀合成。
按照已知的合成方法(Sanghvi.等，1993)使用可市售的氨基磷酸鹽合成含有5-甲基-2’-脫氧胞苷(5-Me-dC)的寡核苷酸，而含有甲基磷酸酯基團(tuán)(MeP)的修飾的寡核苷酸用已知的方法合成(Maier MA.等，2002)。
用MWG Biotech開發(fā)的HPSF技術(shù)純化寡核苷酸分子。由于這種純化方法能去除標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)典純化方法不能去除的自動化學(xué)合成過程中的失誤序列(例如n-1、n-2和n-x序列)，所以具有高效率。
上述技術(shù)除了能得到100％的所需長度序列而無不需要的失效產(chǎn)物，還可避免下一個脫鹽操作，因?yàn)榧兓男蛄胁缓宣}和金屬離子。
假定不含任何鹽，寡核苷酸最終按標(biāo)準(zhǔn)方法(Guerlavais T.等，2002；Ragas JA.等，2000)用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析。然后寡核苷酸滅菌并用紫外/可見分光光度計將所得溶液定量為光密度(OD)。最后，在使用前這些分子重懸浮在無菌的PBS1×中。
所有使用的反義ODN以人和小鼠間具有100％同源性的Smad7mRNA為靶位。在下列所有寡核苷酸中，核苷酸間連鍵是硫代磷酸酯鍵。
用于本項(xiàng)研究的反義ODN序列按照以靶向人Smad7 mRNA的位點(diǎn)403的硫代磷酸酯反義ODN序列5’-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’(SEQ ID No 1)設(shè)計，該序列用于本發(fā)明人以前的實(shí)驗(yàn)過程中(Monteleone.等，2001)。
Smad7反義ODN序列5′-MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePG-3′(SEQ ID No 4)以人Smad7mRNA的位點(diǎn)403為靶位。這是一混合骨架的寡核苷酸，其中屬于SEQ ID NO 1的CpG對的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(文中用Me-dC表示)。此外，甲基磷酸酯鍵位于分子的兩端(文中以Mep表示)。
Smad7反義ODN序列5’-GTYTGGTCCTGAACATGC-3’(SEQ ID No 5)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)294為靶位。
粘膜樣品取自6位中等到嚴(yán)重的CD患者和4位嚴(yán)重的UC患者的切除標(biāo)本。此外，腸粘膜樣品取自10位因結(jié)腸癌進(jìn)行結(jié)腸切除術(shù)的未受影響的IBD患者(得到當(dāng)?shù)匚瘑T會的倫理批準(zhǔn))。LPMC用DTT-EDTA-膠原酶方法制備并重懸在補(bǔ)充有血清替換試劑HL-1(Biowhittaker，Wokingham，UK)的RPMI 1640(Sigma-AldrichS.r.l.，Milan)中。
在有和沒有TGF-β1(Sigma-Aldrich，終濃度約為1到5ng/ml)中培養(yǎng)細(xì)胞并在接種48小時后分析凋亡的水平。
在其它實(shí)驗(yàn)中，分離自IBD患者腸的LPMC重懸浮在補(bǔ)充有HL-1的RPMI1640中并在有和沒有上述Smad7反義ODN(SEQ ID No 4，SEQ ID No 5)以及有對照有義寡核苷酸(使用的濃度均是2μg/ml)中培養(yǎng)。24小時后，LPMC的等份用于抽提蛋白質(zhì)并評估Smad7的表達(dá)。剩余的細(xì)胞徹底洗滌并重懸浮在加了HL-1的RPMI 1640中并在有或沒有TGF-β1(5ng/ml)中培養(yǎng)48小時，然后分析細(xì)胞凋亡。
用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡用碘化丙錠(PI)染色然后用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。
洗滌細(xì)胞，于37℃在5μl核糖核酸酶A(0.6μg/ml，30-60 Kunitz單位，Sigma-Aldrich)中溫育15分鐘，然后在并冰浴上冷卻。在用流式細(xì)胞術(shù)分析之前加入碘化丙錠(100μg/ml)。
用特定的單克隆抗CD3抗體(DAKO Ltd.，Cambridgeshire，UK)鑒定T細(xì)胞。
蛋白質(zhì)抽提和Western印跡分析勻質(zhì)LPMC并在含有10mM Hepes(pH7.9)、10mM KCl、0.1mM EDTA和0.2mM EGTA的緩沖液A中抽提總蛋白。緩沖液補(bǔ)充有1mM二硫蘇糖醇(DTT)、10μg/ml抑肽酶、10μ/ml亮肽素和1mM苯甲磺酰氟(所有的試劑均來自Sigma-Aldrich)。
使用特定的兔抗人Smad7抗體(終稀釋度1∶400，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，CA；USA)分析Smad蛋白。偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體(Dako Ltd)以終稀釋度1∶20,000用于測定一抗結(jié)合，免疫反應(yīng)性用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce，Rockford，IL，USA)目測。
器官培養(yǎng)取自患者的外科標(biāo)本的粘膜移植物在有或沒有Smad7反義ODN(SEQ ID No4，SEQ ID No 5；以終濃度10μg/ml使用)培養(yǎng)40小時。
培養(yǎng)在有Smad7有義ODN中的粘膜移植物作為負(fù)對照。
在培養(yǎng)末期收集粘膜移植物并用于通過免疫組織化學(xué)分析固有層T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。
對于此目的，制備粘膜切片并用單克隆抗CD3抗體(DAKO)染色。偶聯(lián)于堿性磷酸酶的山羊抗鼠抗體(DAKO)用于測定一抗結(jié)合。
結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果顯示了TGF-β1如何以劑量依賴方式提高分離自正常受試者腸道的T淋巴細(xì)胞的凋亡。
表1顯示了培養(yǎng)48小時之后凋亡的T淋巴細(xì)胞的百分率。數(shù)字是4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中使用分離自4位正常受試者腸的T細(xì)胞。
表1
表2顯示了培養(yǎng)48小時后凋亡T淋巴細(xì)胞的百分率。相反，如表2的重復(fù)結(jié)果所示，分離自4位IBD患者的T淋巴細(xì)胞顯示出對TGF-β1誘導(dǎo)的凋亡信號的部分耐受性。
Table 2
特別是，當(dāng)IBD患者的T細(xì)胞在有0.2ng/ml或1ng/ml濃度的TGF-β1中培養(yǎng)時，表2的數(shù)據(jù)分析未見凋亡有意義的增加。相反，以5ng/ml的TGF-β1刺激IBD患者的T細(xì)胞導(dǎo)致凋亡少量增加。
如表3重復(fù)的T淋巴細(xì)胞百分率值所示，用Smad7反義ODN SEQ ID NO4處理分離自IBD患者的T淋巴細(xì)胞恢復(fù)了細(xì)胞對TGF-β1的應(yīng)答性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。數(shù)據(jù)涉及T細(xì)胞分離自4位IBD患者腸的4個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，T細(xì)胞單獨(dú)用培養(yǎng)基(未刺激)培養(yǎng)或用培養(yǎng)基和有義(對照)或反義寡核苷酸預(yù)處理過夜，然后用TGF-β1(1ng/ml)刺激。
Table 3
此外，如圖1的免疫組織化學(xué)所示，本發(fā)明人用先體外后體內(nèi)器官培養(yǎng)證明用本發(fā)明Smad7反義ODN處理IBD活組織檢查顯著降低了粘膜CD3+T細(xì)胞的數(shù)量。后者表現(xiàn)出用反義ODN處理降低了粘膜CD3+T細(xì)胞的數(shù)量。
結(jié)合這些觀察提示高Smad7水平在延長T細(xì)存活中起至關(guān)重要的作用，從而有助于IBD患者中局部炎癥的傳播。
因此，阻斷Smad7是控制這些疾病中粘膜炎癥的有希望的方法。
實(shí)施例2在TNBS-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)性模型中施用Smad7反義和有義寡核苷酸的體內(nèi)和體外作用的研究材料與方法采用前述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由MWG Biotech S.r.l.(Firenze)合成所有的Smad7反義和有義ODN。
使用的反義ODN以在人和鼠之間具有100％同源性的Smad7mRNA位點(diǎn)為靶位。在以下所有寡核苷酸中，核苷酸間連鍵是硫代磷酸酯鍵。以下所有序列用于實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
Smad7反義ODN SEQ ID No 1(5’-GTCGCCCCTTCTCCCCGCAGC-3’)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)403為靶位，本發(fā)明人在公布于以前文章的實(shí)驗(yàn)過程中已經(jīng)使用(Monteleone等，2001)。
以下反義寡核苷酸序列SEQ ID No 4和SEQ ID No 5用于進(jìn)一步研究Smad7在調(diào)節(jié)分離自IBD患者腸的LPMC中的T細(xì)胞凋亡中的作用。
Smad7反義ODN序列5′-MePGTMe-dCGCCCCTICTCCCMe-dCGCAMePG-3′(SEQ ID No 4)以人Smad7mRNA的位點(diǎn)403為靶位。這是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 1的3位和16位的CpG對的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶(以Me-dC表示)取代。此外，甲基膦酸酯鍵位于該分子的末端(以MeP表示)。
Smad7反義ODN序列5’-GTTTGGTCCTGAACATGC-3’(SEQ ID No 5)以人Smad7 mKNA的位點(diǎn)294為靶位。包括于其中的核苷酸間連鍵是硫代磷酸酯鍵。
Smad7反義ODN序列5’-GTTTGGTCCTGAACAT-3’(SEQ ID No 6)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)296為靶位。
Smad7反義ODN序列5’-GTITGGTCCTGAACATG-3’(SEQ ID No 7)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)295為靶位。
Smad7反義ODN序列5’-AGCACCGAGTGCGTGAGC-3’(SEQ ID No 8)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)577為靶位。
Smad7反義ODN序列5′-MePAGCACMedCGAGTGMedCGTGAGCMeP-3′(SEQ ID No 9)以人Smad7mRNA的位點(diǎn)577為靶位。這是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 86位和12位的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代。此外，甲基膦酸酯鍵位于該分子的末端。
Smad7反義ODN序列5’-CGAACATGACCTCCGCAC(SEQ ID No 10)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)233為靶位。
Smad7反義ODN序列5′-Me-d CGA ACA TGA CCT CMe-d CG CAC-3′(SEQID No 11)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)233為靶位。這是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 10的1位和14位的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代。
Smad7反義ODN序列5′-GTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAG-3′(SEQ IDNo 12)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)403為靶位。這是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 1的3位和16位的CpG對的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(以Me-dC表示)。
Smad7反義ODN序列5’-GATCGITTGGTCCTGAA-3’(SEQ ID No 13)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)299為靶位。
Smad7反義ODN序列5’-ATCGTITGGTCCTGAAC-3’(SEQ ID No 14)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)298為靶位。
Smad7反義ODN序列MePGTMe-dCGCCCCTTCTCCCMe-dCGCAMePGC(SEQ ID No 15)以人Smad7 mRNA的位點(diǎn)403為靶位。這是一混合骨架的寡核苷酸，其中在SEQ ID NO 1的3位和16位的CpG對的胞嘧啶被5-甲基胞嘧啶取代(以Me-dC表示)。此外，甲基膦酸酯鍵位于該寡核苷酸末端之一端和20位的鳥嘌呤殘基處。
結(jié)腸炎的誘導(dǎo)5至6周齡的雄性SJL/J小鼠供養(yǎng)在特定無病原體的動物設(shè)施中。對于結(jié)腸炎的誘導(dǎo)，通過3.5F導(dǎo)尿管向輕微麻醉的小鼠施加每直腸2.5mgTNBS(pH1.5-2.0；Sigma Aldrich)的50％乙醇溶液。導(dǎo)尿管尖插入鄰近肛門邊緣約4cm，然后將100ml液體(TNBS/乙醇)緩慢注入結(jié)腸。
為保證TNBS分布于整個結(jié)腸和盲腸，小鼠在注射后保持直立姿勢30秒。用相同方法向一些小鼠單獨(dú)施加50％乙醇用作對照。
結(jié)腸炎的組織學(xué)評價在指定時間處死小鼠，分離出的組織固定于10％福爾馬林溶液(Sigma Aldrich)，埋植于石蠟中，切成組織切片并用蘇木精和曙紅染色。使用各種標(biāo)準(zhǔn)檢查染色切片的結(jié)腸炎證據(jù)，所用的標(biāo)準(zhǔn)例如存在淋巴細(xì)胞浸潤、腺管的伸長和/或畸變、腸壁的側(cè)翼潰瘍和增厚。
在結(jié)腸的顯微截面上炎癥的程度按以下0到4分級0無炎癥的證據(jù)；1在＜10％高倍視野(hp＝高倍視野)中觀察到低水平淋巴細(xì)胞浸潤，未觀察到結(jié)構(gòu)變化；2在＜10-25％hpf中觀察到中等淋巴細(xì)胞浸潤、腺管伸長和未伸出超過粘膜層的腸壁增厚；3在＜25-50％hpf中觀察到高水平淋巴細(xì)胞浸潤、伸出超過粘膜層的腸壁增厚；4在＜25-50％hpf中觀察到明顯程度的淋巴細(xì)胞浸潤、高脈管密度、腺管伸長和畸變與具有潰瘍的透壁性腸壁增厚。
分離固有層單核細(xì)胞(LPMC)和用Smad7反義ODN處理細(xì)胞固有層單核細(xì)胞(LPMC)分離自結(jié)腸樣本。樣本首先以無鈣鎂的HBSS(Hanks’平衡鹽溶液，Sigma-Aldrich)洗滌并切成0.5cm小片。這些小片于37℃在含有EDTA(0.37mg/ml)和二硫蘇糖醇(0.145mg/ml)的HBSS中孵育兩次各15分鐘。然后這些組織在含有膠原酶D(400U/ml，Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)和DNA酶I(0.01mg/ml，Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)的RPMI中消化，于37℃在振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
釋放自組織的LPMC重懸浮于100％Percoll，在40％Percoll梯度(PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden)下分層并以1,800rpm離心30分鐘得到富集淋巴細(xì)胞群。
為評價Smad7反義ODN的體外效力，分離自TNBS處理小鼠的LPMC以1×106/ml的終濃度在24孔板上重懸浮于補(bǔ)充有血清取代試劑HL-1(Biowhittaker)的RPMI 1640(Sigma-Aldrich)中。為轉(zhuǎn)染反義ODN，該步驟后每ml細(xì)胞培養(yǎng)基使用2μl的lipofectamine 2000試劑(LF，Invitrogen Italia SRL，San Giuliano Milanese)。然后，結(jié)合2μg/ml的反義ODN與LF并于室溫孵育20分鐘。然后將得到的混合物直接加入細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后，細(xì)胞從板上移去并用于以Western印跡分析Smad7。
用Smad7反義ODN處理小鼠用TNBS處理兩天后，按每直腸150μg將Smad7反義或有義寡核苷酸施用于小鼠。至少五只小鼠一組進(jìn)行檢查。在第五天處死小鼠，取出完整的腸粘膜樣品并用Western印跡分析Smad7和Smad3含量。此外評價了腸粘膜炎癥的程度。
蛋白質(zhì)抽提和Western印跡分析固有層單核細(xì)胞和完整的結(jié)腸樣本用上述方法勻漿化。然后用Western印跡展示Smad7表達(dá)。
最終，印跡用可市售溶液(Pierce)剝離并用抗肌動蛋白抗體(Sigma-Aldrich)檢測以證實(shí)在每孔中充滿有相同量的蛋白質(zhì)。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)進(jìn)行檢測。帶的強(qiáng)度用光密度計分析。
LPMC和完整的結(jié)腸樣品蛋白質(zhì)也用特異性的可市售抗體(Santa Cruz)以Western印跡分析了磷酸化蛋白質(zhì)和Smad3總蛋白質(zhì)的含量。
為分析磷酸化的Smad3，使用能識別作為抗原的磷酸化Smad2/3蛋白質(zhì)的特異性兔抗人抗體(1∶500終稀釋度)和偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體(1∶20000稀釋度)。免疫反應(yīng)性用化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)目測。
檢測之后，印跡用可市售溶液(Pierce)剝離并與特異性的山羊抗人Smad3抗體(1∶500終稀釋度)和偶聯(lián)于辣根過氧化物酶的兔抗山羊抗體(1∶20000稀釋度)孵育；然后用上述的化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)目測免疫反應(yīng)性。
FLISA測試活性TGF-β1的量在腸粘膜樣品中檢測。為此目的，抽提如上所述有或沒有TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠粘膜樣品的總蛋白質(zhì)。使用可市售的ELISA試劑盒(R&DSystems，Space Import-Export Srl，Milano)分析活性TGF-β1的水平。在DynatechMR 5000ELISA讀數(shù)器上測量490nm波長處的光密度。數(shù)據(jù)以pg/100g總蛋白質(zhì)表示。
結(jié)果在接受TNBS后，小鼠出現(xiàn)腹瀉和體重降低等誘導(dǎo)結(jié)腸炎的證據(jù)。肉眼可見結(jié)腸增大并且對其粘膜的組織學(xué)分析顯示中等到嚴(yán)重的炎性病變。
為檢測TNBS結(jié)腸炎的誘導(dǎo)是否與TGF-β1的產(chǎn)量變化有關(guān)，從有或沒有結(jié)腸炎的小鼠取得結(jié)腸樣本并用ELISA分析活性TGF-β1的含量。
因?yàn)樵谀c道水平存在幾種具有合成TGF-β1潛力的細(xì)胞類型，它可用于評價整個腸道粘膜而非僅評價LPMC。
在無結(jié)腸炎的情況中，檢測到低水平的活性TGF-β1(未刺激和對照小鼠各為85±12和94±26pg/g總蛋白質(zhì))。在患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的粘膜樣品中檢測到TGF-β1水平顯著(985±120pg/g總蛋白質(zhì))(p＜0.01)。即使該結(jié)果似乎提示在TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎期間可增加TGF-β1的活性，但對分離自患結(jié)腸炎小鼠的腸LPMC中活性Smad3的胞內(nèi)水平的分析令人吃驚地表現(xiàn)出降低的Smad3磷酸化作用，該磷酸化作用與Smad7的誘導(dǎo)量增加相關(guān)(圖2和3)。特別是圖2說明了在分離自未受影響腸而非患TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的LPMC中存在對應(yīng)于活性(磷酸化)Smad2/3的帶。圖3顯示僅在分離自患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的腸的LPMC樣本中存在兩條帶，較低的47Kda的帶對應(yīng)于游離Smad7而較高102Kda的帶對應(yīng)于TGF-β1 R1-Smad7復(fù)合物。這些數(shù)據(jù)說明局部炎癥刺激了TGF-β1的合成，但TGF-β1未能減弱粘膜炎癥。
本發(fā)明評價了用Smad7反義ODN治療TNBS小鼠是否可恢復(fù)內(nèi)源性TGF-β1功能并限制正在進(jìn)行中的炎癥。
首先，測試上述Smad7反義ODN(SEQ ID No 1和SEQ ID No 4-15)在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中降低Smad7表達(dá)的效力。
關(guān)于體外實(shí)驗(yàn)，分離自患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠的腸的LPMC用各種Smad7反義ODN轉(zhuǎn)染并孵育過夜。用Western印跡分析Smad7。
關(guān)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，TNBS處理的小鼠施用Smad7反義ODN并在3天后處死小鼠，取出組織樣本并用Western印跡分析Smad7。
表4總結(jié)了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并顯示了各種Smad7反義寡核苷酸在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中所得的抑制百分率。數(shù)據(jù)表明4個獨(dú)立的體外實(shí)驗(yàn)的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM)和5個獨(dú)立的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的平均±SEM。
表4
(*)和(**)分別是ISIS的專利US6159697的第16條序列和第12條序列。
當(dāng)在分離自TNBS處理的鼠科模型的LPMC中體外轉(zhuǎn)染時，所有反義ODN有效地降低Smad7表達(dá)。分析表4所示的抑制百分率值可明顯發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸序列SEQ ID No 4、10、11、12和15顯示主要的效力。
然而，用寡核苷酸序列SEQ ID No10和11體內(nèi)處理得到的Smad7表達(dá)抑制百分率與體外實(shí)驗(yàn)所得的沒有明顯差別。
用反義ODNSEQ ID No4、12和15處理小鼠得到的Smad7抑制百分率明顯大于體外試驗(yàn)所得結(jié)果，即分別為55％對34％、42％對32％、56％對34％(P＜0.01)。
相反，用反義寡核苷酸SEQ ID No7處理小鼠導(dǎo)致體內(nèi)Smad7表達(dá)降低，其值低于體外反義寡核苷酸在LPMC中轉(zhuǎn)染所得值，即10％對17％，P＜0.01。
總體而言，這些結(jié)果表明只有在Smad7反義ODN序列中進(jìn)行特異性修飾能改善其藥代動力學(xué)、生物化學(xué)和生物物理圖譜。
在接受反義寡核苷酸(SEQ ID No 1和SEQ ID No 4-15)的小鼠中未證實(shí)有急性毒性跡象。1/5用TNBS處理的小鼠在3天后死亡(20％)。類似地，1/5接受Smad7有義寡核苷酸的小鼠在4天后死亡。
用Smad7反義ODN SEQ ID No1和SEQ ID No4-15處理的小鼠組中無死亡率。
反義序列SEQ ID No13和SEQ ID No14的用途與合理的體外抑制活性(分別為11％和9.5％)相關(guān)。然而，這種序列的體內(nèi)施用出人意料地伴隨著顯著的結(jié)腸炎惡化，直至導(dǎo)致小鼠在治療72小時后全部死亡。
肉眼分析取自這些小鼠的腸樣品發(fā)現(xiàn)存在嚴(yán)重的結(jié)腸炎并且這與腸中Smad7表達(dá)本質(zhì)上的增加相關(guān)。
如上所述，測試了Smad7反義ODN限制正在進(jìn)行中的炎癥的效力。對此目的，向誘導(dǎo)結(jié)腸炎后的小鼠施用反義寡核苷酸SEQ ID No1、4、5和15并將5只小鼠視為一組。
用Smad7反義ODN治療后，發(fā)現(xiàn)粘膜炎癥減輕。該結(jié)果在用反義寡核苷酸4和15治療的小鼠中尤其明顯。事實(shí)上，未接受反義寡核苷酸的患結(jié)腸炎小鼠在分別施用了反義寡核苷酸序列1或5后3-4級的結(jié)腸炎嚴(yán)重性達(dá)到2或3級，而用反義寡核苷酸序列4或15治療的小鼠的炎癥未超過1級。
未檢測Smad7口服是否也有效，TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后一天用Smad7反義寡核苷酸4、5或15或?qū)φ?有義寡核苷酸)治療。
對此目的，寡核苷酸重懸浮在碳酸氫鹽溶液中。施用于每只小鼠的溶液的終體積為3501μl并且含有劑量等于250、500或1000μg的寡核苷酸，這種溶液通過導(dǎo)管口服給藥。
在第5天處死小鼠，Smad7表達(dá)和炎癥程度的分析按前文所方法評價。所有用反義寡核苷酸而不是用對照有義寡核苷酸治療的小鼠表現(xiàn)出Smad7表達(dá)有意義的降低和Smad3磷酸化的增加，這些作用均不依賴于所使用的寡核苷酸劑量。
如圖4所示，抑制Smad7基本上與體重恢復(fù)相關(guān)。圖4顯示了用或不用Smad7反義寡核苷酸(SEQ.No.15)或用對照(有義)治療有TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的體重變化百分率。兩種寡核苷酸在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第二天用導(dǎo)管以250μg劑量口服給藥。第二天3組中每一組可證實(shí)體重減少表明TNBS處理誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)腸炎。此外證實(shí)了從第四天開始用Smad7反義寡核苷酸而不是用對照治療的小鼠表現(xiàn)出體重恢復(fù)。第五天患TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠體重明顯和輕微的恢復(fù)是因?yàn)?1.4％患結(jié)腸炎小鼠在第四天死亡，因此第五天評價體重時未計入。
如圖5和6所示，Smad7的抑制與組織炎癥的顯著抑制相關(guān)。圖5顯示了取自有TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠和用Smad7反義寡核苷酸(SEQ.ID.No.15)治療有TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸的圖像。寡核苷酸在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后的第二天以250μg劑量通過導(dǎo)管口服給藥。有TNBS結(jié)腸炎的小鼠的結(jié)腸顯示高度發(fā)炎、變短和增厚。相反，接受Smad7反義寡核苷酸的小鼠顯示結(jié)腸長度與厚度正常且無肉眼可見的炎癥跡象。圖6顯示沒有結(jié)腸炎的小鼠或用或不用Smad7反義寡核苷酸(SEQ.ID.No.15)或?qū)φ?有義)治療有TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠的結(jié)腸切片的組織學(xué)狀況。兩種寡核苷酸在誘導(dǎo)結(jié)腸炎后第二天通過導(dǎo)管以250μg劑量口服給藥。已顯示沒有結(jié)腸炎的小鼠中腺體顯現(xiàn)為直線且均勻，具有正常含量的含粘液的細(xì)胞和固有層的炎性成分。相反，在接受或未接受對照寡核苷酸的TNBS處理小鼠的結(jié)腸中，腺結(jié)構(gòu)遭到完全破壞，含粘液的和大量的炎性細(xì)胞浸潤在固有層中。證明在用TNBS處理并接受Smad7反義寡核苷酸的小鼠的結(jié)腸切片中存在正常的腺結(jié)構(gòu)且無炎癥。
反義ODN體內(nèi)給藥之后顯示較高Smad7抑制效力且無副作用，結(jié)合這些觀察提示，特別是如果將效力和毒性的這些性質(zhì)與使用在Smad7體外抑制中具有相同效力的其它反義ODN序列所得的結(jié)果比較，表明使用反義ODN序列可代表一種控制IBD期間粘膜炎癥的有希望的治療方法。
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序列表<110>吉利亞尼S.p.A.(Giuliani S.p.A.)<120>抗Smad7的反義寡核苷酸(ODN)及其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途<130>PCT 25572<140>RM2003A000149<141>2003-04-02<150>RM2003A000149<151>2003-04-02<160>15<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>靶向人Smad7 mRNA的位點(diǎn)403的反義硫代磷酸酯序列<220>
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<223>靶向人Smad7 mRNA的位點(diǎn)233的修飾的反義硫代磷酸酯寡核苷酸<220>
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<223>靶向人Smad7 mRNA的位點(diǎn)403的修飾的反義硫代磷酸酯寡核苷酸<220>
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<223>靶向人Smad7 mRNA的位點(diǎn)299的反義硫代磷酸酯寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(17)
<400>13gatcgtttgg tcctgaa 17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>靶向人Smad7 mRNA的位點(diǎn)298的反義硫代磷酸酯寡核苷酸<220>
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<221>modified_base<222>(20)..(20)<223>2’-脫氧鳥苷甲基膦酸酯<400>15ntngcccctt ctcccngcan c 2權(quán)利要求
1.抗Smad7的反義寡核苷酸硫代磷酸酯，其長度直至21個核苷酸并包含具有以下序列(SEQ.ID.No.2)或其互補(bǔ)序列的至少10個核苷酸的部分5’-GTXYCCCCTTCTCCCXYCAG-3’其中X是含有選自胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2’-O-甲基胞嘧啶的含氮堿基的核苷酸，并且其中Y是含有選自鳥嘌呤、5-甲基鳥嘌呤和2’-O-甲基鳥嘌呤的含氮堿基的核苷酸，條件是核苷酸X或Y中至少一個含有甲基化的含氮堿基。
2.如權(quán)利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于，該序列中至少一個核苷酸是甲基膦酸酯。
3.如權(quán)利要求2所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述至少一個甲基膦酸酯核苷酸僅位于3’或5’端之一或位于3’和5’端或沿著反義寡核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述甲基膦酸酯核苷酸是Y。
5.如權(quán)利要求2所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述甲基膦酸酯核苷酸是X。
6.如權(quán)利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于，該序列中至少一個核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸5’-單磷酸酯。
7.如權(quán)利要求6所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述至少一個2’-O-甲基核糖核苷酸5’-單磷酸酯僅位于3’或5’端之一或位于3’和5’端或沿著反義寡核苷酸序列。
8.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的反義寡核苷酸，其特征在于，2’-脫氧核糖核苷酸被對應(yīng)的核糖核苷酸取代。
9.如上述1到8項(xiàng)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的含有以下序列(SEQ.ID.No.4)的反義寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZ-3’其中，X是5-甲基2’-脫氧胞苷5’-單磷酸酯，并且Z是2’-脫氧鳥苷甲基磷酸酯。
10.如上述1到8項(xiàng)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的具有以下序列(SEQ.ID.No.15)的反義寡核苷酸5’-ZTXGCCCCTTCTCCCXGCAZC-3’其中，X是5-甲基2’-脫氧胞苷5’-單磷酸酯，并且Z是2’-脫氧鳥苷甲基磷酸酯。
11.如權(quán)利要求1所述的具有以下序列(SEQ.ID.No.3)的反義寡核苷酸5’-GTXGCCCCTTCTCCCXGCAG-3’其中，X是5-甲基2’-脫氧胞苷5’-單磷酸酯。
12.如權(quán)利要求1到11所定義的反義寡核苷酸用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
13.一種或多種藥學(xué)上可接受的佐劑和/或賦形劑的藥物組合物，其特征在于，含有作為活性成分的至少一種如權(quán)利要求1到11所定義的反義寡核苷酸。
14.權(quán)利要求1到11所定義的反義寡核苷酸在制備治療與Smad7的表達(dá)相關(guān)的病癥的藥物中的用途。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于，所述與Smad7表達(dá)相關(guān)的病癥是慢性炎性疾病。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，所述慢性炎性疾病是克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及適當(dāng)修飾的抗Smad7的反義寡核苷酸序列(ODN)及其作為治療性生物制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途，特別是用于治療慢性炎性腸病，例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。
文檔編號A61K48/00GK1788086SQ200480012344
公開日2006年6月14日 申請日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月2日
發(fā)明者G·蒙特里昂 申請人:吉利亞尼國際有限公司