專利名稱：：谷氨酰胺?；凸劝彼岘h(huán)化酶效應(yīng)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(glutaminylcyclase)(QC，EC2.3.2.5)，其催化N-末端谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu*)同時(shí)釋放氨的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)和N-末端谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸同時(shí)釋放水分子的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)。本發(fā)明確認(rèn)了哺乳動(dòng)物的QC為金屬酶，提供了新型的哺乳動(dòng)物QC的生理底物和QC效應(yīng)物的應(yīng)用、用于治療可通過(guò)調(diào)節(jié)QC活性治療的疾病的包含QC效應(yīng)物的藥物組合物。此外，已發(fā)現(xiàn)金屬相互作用(metalinteraction)是開(kāi)發(fā)QC抑制劑的一種有效途徑。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將QC活性的效應(yīng)物與DPIV或DPIV樣酶(DPIV-likeenzyme)的抑制劑相聯(lián)合在治療或減輕可通過(guò)調(diào)節(jié)QC和/或DPIV活性治療的疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種鑒定和選擇QC活性的效應(yīng)物的篩選方法。
背景技術(shù)：
：谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC，EC2.3.2.5)催化N-末端谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸(pGlu*)同時(shí)釋放氨的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)。1963年，Messer首次由熱帶植物番木瓜(Caricapapaya)膠乳中分離得到QC(Messer，M.1963Nature4874，1299)。24年后，在動(dòng)物垂體中發(fā)現(xiàn)了一種相應(yīng)的酶活性(Busby，W.H.J.等，1987JBiolChem262，8532-8536；Fischer；W.H.和Spiess，J.1987ProcNatlAcadSciUSA84，3628-3632)。對(duì)于哺乳動(dòng)物的QC，通過(guò)QC的Gln至pGlu的轉(zhuǎn)化可見(jiàn)于TRH和GnRH前體(Busby，W.H.J.等，1987JBiolChem262，8532-8536；Fischer，W.H.和Spiess，J.1987ProcNatlAcadSciUSA84，3628-3632)。此外，最初的QC定位試驗(yàn)顯示其與催化作用的推斷(putative)產(chǎn)物共存于牛垂體中，進(jìn)一步提高所提出的于肽類激素合成中的功能(Bockers，T.M.等，1995JNeuroendocrinol7，445-453)。相反，植物QC的生理功能較不明顯。就來(lái)自番木瓜的酶而言，據(jù)認(rèn)為其在植物防御病原微生物具有一定作用(EIMoussaoui，A.等，2001CellMolLifeSci58，556-570)。最近通過(guò)序列對(duì)比確定了來(lái)自其它植物的推斷QC(Dahl，S.W.等，2000ProteinExprPurif20，27-36)。然而，這些酶的生理功能仍然不明確。來(lái)自植物和動(dòng)物的已知QC在底物的N-末端部位對(duì)L-谷氨酰胺有嚴(yán)格的特異性，并且發(fā)現(xiàn)它們的動(dòng)力學(xué)行為符合Michaelis-Menten方程(Pohl，T.等，1991ProcNatlAcadSciUSA88，10059-10063；Consalvo，A.P.等，1988AnalBiochem175，131-138；Gololobov，M.Y.等，1996BiolChemHoppeSeyler377，395-398)。然而，對(duì)比來(lái)自番木瓜的QC和哺乳動(dòng)物高度保守的(highlyconserved)QC的一級(jí)結(jié)構(gòu)卻并未發(fā)現(xiàn)任何序列同源性(Dahl，S.W.等，2000ProteinExprPurif20，27-36)。其中植物的QC似乎屬于一類新的酶家族(Dahl，S.W.等，2000ProteinExprPurif20，27-36)，而且發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的QC與細(xì)菌氨肽酶具有顯著的序列同源性(Bateman，R.C.等，2001Biochemistry40，11246-11250)，從而得出植物和動(dòng)物的QC具有不同的進(jìn)化起源的結(jié)論。EP02011349.4公開(kāi)編碼昆蟲(chóng)谷氨酰胺?；h(huán)化酶的多核苷酸，及其所編碼的多肽。該申請(qǐng)進(jìn)一步提供包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸。所分離的多肽和包含昆蟲(chóng)QC的宿主細(xì)胞可用于篩選降低谷氨酰胺?；h(huán)化酶活性的藥物的方法中。據(jù)記載，這種藥物可用作殺蟲(chóng)劑。阿爾茨海默癥(AD)是以與營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)元、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞緊密相關(guān)的細(xì)胞外淀粉樣斑塊(amyloidoticplaque)的異常堆積為特征(Terry，R.D.和Katzman，R.1983AnnNeurol14，497-506；Glenner，G.G.和Wong，C.W.1984BiochemBiophysResComm120，885-890；Intagaki，S.等，1989JNeuroimmunol24，173-182；Funato，H.等，1998AmJPathol152，983-992；Selkoe，D.J.2001PhysiolRev81，741-766)。β淀粉樣(Amyloid-β，Aβ)肽是老年斑的主要成分，并且被認(rèn)為與AD發(fā)病機(jī)理及進(jìn)展直接相關(guān)，該假設(shè)得到遺傳學(xué)研究的支持(Glenner，G.G.和Wong，C.W.1984BiochemBiophysResComm120，885-890；Borchelt，D.R.等，1996Neuron17，1005-1013；Lemere，C.A.等，1996NatMed2，1146-1150；Mann，D.M.和Iwatsubo，T.1996Neurodegeneration5，115-120；Citron，M.等，1997NatMed3，67-72；Selkoe，D.J.2001PhysiolRev81，741-766)。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白水解生成(Kang，J.等，1987Nature325，733-736；Selkoe，D.J.1998TrendsCellBiol8，447-453)，它通過(guò)Aβ的N-末端的β-分泌酶和C-末端的γ-分泌酶順序切割(Haass，C.和Selkoe，D.J.1993Cell75，1039-1042；Simons，M.等，1996JNeurosci16899-908)。除了在N-末端始于L-Asp的優(yōu)勢(shì)Aβ肽(Aβ-1-42/40)之外，老年斑中存在很多異質(zhì)性N-末端截短的形式。據(jù)報(bào)道這種被截短的肽在體外具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性并且比全長(zhǎng)的同工型更迅速聚集(Pike，C.J.等，1995JBiolChem27023895-23898)。已知N端截短的肽是在早期發(fā)作的家族性AD(FAD)患者中過(guò)度產(chǎn)生(Saido，T.C.等，1995Neuron14，457-466；Russo，C.等，2000Nature405，531-532)，并已知在唐氏綜合征(DS)患者的腦中于早期出現(xiàn)并且隨年齡增長(zhǎng)而增加(Russo，C.等，1997FEBSLett409，411-416，Russo，C.等，2001NeurobiolDis8，173-180；Tekirian，T.L.等，1998JNeuropatholExpNeurol57，76-94)。最后，其數(shù)量反映了疾病進(jìn)行性的嚴(yán)重程度(Russo，C.等，1997FEBSLett409，411-416)。額外的翻譯后過(guò)程可能通過(guò)1位與7位天冬氨酸的異構(gòu)化或外消旋化以及殘基3和11的谷氨酸的環(huán)化進(jìn)一步修飾N-末端。3位含焦谷氨酰胺的同工型[pGlu3]Aβ3-40/42]代表老年斑中N-端截短的物質(zhì)的顯著形式—大約占Aβ總量的50％(Mori，H.等，1992JBiolChem267，17082-17086，Saido，T.C.等，1995Neuron14，457-466；Russo，C.等，1997FEBSLett409，411-416；Tekirian，T.L.等，1998JNeuropatholExpNeurol57，76-94；Geddes，J.W.等，1999NeurobiolAging20，75-79；Harigaya，Y.等，2000BiochemBiophysResCommun276，422-427)，并且它們同樣存在于前淀粉樣病變(pre-amyloidlesion)中(Lalowski，M.等，1996JBiolChem271，33623-33631)。AβN3(pE)肽的堆積很可能是由于增強(qiáng)聚集和賦予對(duì)大多數(shù)氨肽酶的抵抗性的結(jié)構(gòu)修飾所致(Saido，T.C.等，1995Neuron14，457-466；Tekirian，T.L.等，1999JNeurochem73，1584-1589)。該證據(jù)為AD發(fā)病機(jī)理中AβN3(pE)肽的關(guān)鍵作用提供了線索。然而，關(guān)于其神經(jīng)毒性和聚集性方面卻了解得很少(He，W.和Barrow，C.J.1999Biochemistry38，10871-10877；Tekirian，T.L.等，1999JNeurochem73，1584-1589)。此外，盡管活性神經(jīng)膠質(zhì)確實(shí)與老年斑有關(guān)并且可能對(duì)淀粉樣沉積(amyloiddeposit)具有積極作用，但這些同工型對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用及神經(jīng)膠質(zhì)對(duì)這些肽的反應(yīng)完全未知。在最近的研究中，在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中研究了Aβ1-42、Aβ1-40、[pGlu3]Aβ3-42和[pGlu3]Aβ3-40肽的毒性、聚集性以及分解代謝，表明焦谷氨酸的修飾加劇了Aβ-肽的毒性，同時(shí)還抑制其被經(jīng)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞降解。Shirotani等人在體外研究了感染辛德畢斯病毒(SindbisVirus)的原代皮質(zhì)神經(jīng)元(primarycorticalneuron)中[pGlu3]Aβ肽的生成。它們構(gòu)建了通過(guò)氨基酸取代和缺失編碼[pGlu3]Aβ的潛在前體的淀粉樣前體蛋白互補(bǔ)DNA。對(duì)于始于N-末端谷氨酰胺殘基而不是天然前體中的谷氨酸的人工前體而言，提示存在通過(guò)谷氨酰胺酰基環(huán)化酶自發(fā)地轉(zhuǎn)化或酶促地轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸。尚未在體內(nèi)確定[pGlu3]Aβ天然前體的3位N-末端谷氨酸的環(huán)化機(jī)制(Shirotani，K.，Tsubuki，S.，Lee，H.J.，Maruyama，K.，和Saido，T.C.(2002)NeurosciLett327，25-28)。二肽基肽酶IV(DPIV)是在機(jī)體的多種組織包括腎臟、肝臟和腸中發(fā)現(xiàn)的脯氨酸后(在較小程度上為丙氨酸后、絲氨酸后或甘氨酸后)切割絲氨酸蛋白酶，并且可將N-末端的二肽從肽鏈上切割下來(lái)。最近已發(fā)現(xiàn)DPIV在神經(jīng)肽的新陳代謝、T細(xì)胞活化、癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的附著以及HIV進(jìn)入淋巴樣細(xì)胞方面起著重要的作用。參見(jiàn)WO02/34242、WO02/34243、WO03/002595以及WO03/002596。已知DPIV抑制劑可用于治療葡萄糖耐受性受損以及糖尿病(國(guó)際專利申請(qǐng)，公開(kāi)號(hào)WO99/61431，Pederson，R.A.等，1998Diabetes47，1253-1258和Pauly，R.P.等，1999Metabolism48，385-389)。特別是WO99/61431公開(kāi)了包含氨基酸殘基和噻唑烷或吡咯烷基團(tuán)的DPIV抑制劑及其鹽，尤其是L-蘇-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-蘇-異亮氨酰吡咯烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰吡咯烷及其鹽。低分子量的二肽基肽酶IV抑制劑的進(jìn)一步實(shí)例為以下物質(zhì)，如四氫異喹啉-3-甲酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯和2-氰基吡咯烷、N-(N′-取代的甘氨?；?-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨?；?-噻唑烷、N-(取代的甘氨?；?-4-氰基噻唑烷、氨基-酰基-二羥硼基-脯氨酰-抑制劑、環(huán)丙基稠合的吡咯烷和雜環(huán)化合物。二肽基肽酶IV抑制劑記載于US6,380,398、US6,011,155、US6,107,317、US6,110,949、US6,124,305、US6,172,081、WO95/15309、WO99/61431、WO99/67278、WO99/67279、DE19834591、WO97/40832、DE19616486C2、WO98/19998、WO00/07617、WO99/38501、WO99/46272、WO99/38501、WO01/68603、WO01/40180、WO01/81337、WO01/81304、WO01/55105、WO02/02560以及WO02/14271、WO02/04610、WO02/051836、WO02/068420、WO02/076450、WO02/083128、WO02/38541、WO03/000180、WO03/000181、WO03/000250、WO03/002530、WO03/002531、WO03/002553、WO03/002593、WO03/004496、WO03/024942以及WO03/024965，其教導(dǎo)，尤其是涉及這些抑制劑、其定義、應(yīng)用及其制備的教導(dǎo)全文并入此處作為參考。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物中新的QC生理底物Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]胃泌素、[Gln1]神經(jīng)降壓肽、[Gln1]FPP、[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18、[Gln1]分形素([Gln1]Fractalkine)、[Gln1]胖素A([Gln1]OrexinA)、[Gln3]胰高血糖素3-29及[Gln5]物質(zhì)P5-11，以及QC的效應(yīng)物的應(yīng)用及用于治療可通過(guò)調(diào)節(jié)QC活性治療的疾病的包含QC效應(yīng)物的藥物組合物。通過(guò)抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人QC是金屬依賴性轉(zhuǎn)移酶。QC脫輔基酶通過(guò)鋅離子可最有效地被再活化，并且鋅依賴性氨肽酶的金屬結(jié)合基序同樣存在于人QC中。與活性位點(diǎn)結(jié)合金屬相互作用的化合物為有效的抑制劑。出乎意料的是，研究表明重組人QC和源自大腦提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺?；沫h(huán)化作用以及谷氨酸的環(huán)化作用。更驚人的發(fā)現(xiàn)是，環(huán)化酶催化的Glu1轉(zhuǎn)化在pH6.0左右有利，而Gln1至pGlu-衍生物的轉(zhuǎn)化的最適pH在8.0左右。由于pGlu-Aβ相關(guān)肽的形成可通過(guò)抑制重組人QC及源自豬垂體提取物的QC活性而得以抑制，因此酶QC為研發(fā)阿爾茨海默癥治療藥物的目標(biāo)之一。通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥QC活性的效應(yīng)物，可能預(yù)防或減輕或治療如下疾病阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌(Heliobacterpylori)感染的潰瘍病和胃癌、病原性精神病(pathogenicpsychoticcondition)、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答(inflammatoryhostresponse)、癌癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘著和遷移過(guò)程、攝食障礙(impairedfoodintake)、失眠(sleep-wakefulness)、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙(impairedautonomicfunction)、激素平衡障礙以及體液調(diào)節(jié)障礙。此外，通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥QC活性效應(yīng)物，可能刺激胃腸道細(xì)胞優(yōu)選為胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖、急性酸分泌以及產(chǎn)酸性壁細(xì)胞及分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的分化。此外，通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥QC活性的效應(yīng)物，可能抑制髓祖細(xì)胞(myeloidprogenitorcell)的增殖。另外，給藥QC抑制劑能引起男性生殖力的抑制。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將QC活性的效應(yīng)物與DPIV或DPIV樣酶抑制劑相聯(lián)合在治療或減輕可通過(guò)調(diào)節(jié)QC和/或DPIV活性治療的疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供用于非胃腸道、腸道或口服給藥的藥物組合物，其包括至少一種任選地與常規(guī)載體和/或賦形劑相結(jié)合的QC效應(yīng)物；或包括至少一種任選地與常規(guī)載體和/或賦形劑相結(jié)合并與至少一種DPIV抑制劑相聯(lián)合的QC效應(yīng)物。本發(fā)明還提供了鑒定和選擇QC效應(yīng)物的篩選方法。通過(guò)參考下列各圖可進(jìn)一步理解本發(fā)明的這些方面及其它方面，其中圖1顯示人QC催化的H-Gln-Ala-OH環(huán)化的進(jìn)程曲線，其中于340nm處監(jiān)測(cè)吸光度的減小。各樣品包括0.3mMNADH/H+、14mMα-酮戊二酸、30U/ml谷氨酸脫氫酶以及1mMH-Gln-Ala-OH。從曲線A到D，應(yīng)用不同濃度的QCA，10mU/ml，B，5mU/ml，C，2.5mU/ml。在曲線D中，未加入QC。QC濃度與測(cè)得的活性之間呈線性關(guān)系(插圖)。圖2顯示在一級(jí)速率條件下使用Gln-βNA作為底物所確定的人和木瓜QC的pH依賴性(插圖)。就人QC而言，使用根據(jù)Ellis和Morrison的由25mMMES、25mM乙酸和50mMTris(Ellis，K.J.和Morrison，J.F.1982MethodsEnzymol.87，405-426)組成的提供恒定離子強(qiáng)度的緩沖系統(tǒng)。由于Tris的輕微抑制效應(yīng)，使用50mMMops緩沖液來(lái)研究木瓜QC。通過(guò)加入NaCl調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度為0.05M。通過(guò)以基于離解基團(tuán)(dissociatinggroup)的模型擬合對(duì)速率特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。就木瓜QC而言，通過(guò)以單一離解模型(singledissociationmodel)擬合數(shù)據(jù)得到pKa值為7.13±0.03。圖3顯示pH對(duì)人QC和源自木瓜膠乳的QC穩(wěn)定性的影響。在不同pH值的0.1M緩沖液(pH4-7的檸檬酸鈉、pH7-10的磷酸鈉)中將酶儲(chǔ)備溶液稀釋20倍。將酶溶液在30℃下溫育30分鐘后接著按照標(biāo)準(zhǔn)方案分析酶的活性。圖4顯示第2個(gè)氨基酸位置含谷氨酰胺的一組底物的專一性常數(shù)kcat/KM的對(duì)比。其中從二肽至四肽發(fā)現(xiàn)人QC的特異性有所提高，然而在木瓜QC中未觀察到任何變化。此處呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是表3所給參數(shù)的重制曲線(replot)。圖5顯示人QC催化的從H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2至pGlu-Lys(pGlu)-Arg-Leu-Ala-NH2的形成。通過(guò)因釋放氨引起的m/z比的時(shí)間依賴性變化監(jiān)測(cè)底物的轉(zhuǎn)化。樣品組成為0.5mM底物、38nMQC的40mMTris/HCl溶液，pH7.7。在所示的時(shí)間處，將樣品從試管中除去，與基質(zhì)溶液(1∶1v/v)混合并接著記錄質(zhì)譜。在木瓜QC中觀察到非常相似的依賴性。圖6顯示木瓜QC催化的源自H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2的pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2的形成。通過(guò)因釋放甲胺引起的m/z比的時(shí)間依賴性變化監(jiān)測(cè)底物的轉(zhuǎn)化。樣品組成為0.5mM底物、0.65μM木瓜QC的40mMTris/HCl溶液，pH7.7。在所示的時(shí)間處，將樣品從試管中除去，與基質(zhì)溶液(1∶1v/v)混合并接著記錄質(zhì)譜。在不含木瓜QC或向底物應(yīng)用低于1.5μM人QC的樣品中未觀察到底物的轉(zhuǎn)化(未顯示)。圖7顯示DPIV催化的從[Gln3]Aβ1-11到[Gln3]-Aβ3-11的形成。在所示的時(shí)間處，將樣品從試管中除去，與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)并接著記錄質(zhì)譜。圖8顯示DPIV抑制劑Val-吡咯烷酰胺(Val-Pyrrolidide，Val-Pyrr)對(duì)[Gln3]Aβ1-11的切割的阻礙作用。在所示的時(shí)間處，將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液(1∶1v/v)混合并接著記錄質(zhì)譜。圖9顯示QC催化的從[Gln3]Aβ3-11到[pGlu3]-Aβ3-11的形成。在所示的時(shí)間處，將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液(1∶1v/v)混合并接著記錄質(zhì)譜。圖10顯示QC抑制劑1，10-二氮雜菲對(duì)由[Gln3]Aβ3-11生成[pGlu3]-Aβ3-11的抑制作用。在所示的時(shí)間處，將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)并接著記錄質(zhì)譜。圖11顯示連續(xù)以DPIV和QC催化后，從[Gln3]Aβ1-11到[pGlu3]-Aβ3-11的形成。在所示的時(shí)間處將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)并接著記錄質(zhì)譜。圖12顯示在具有催化活性的DPIV和QC存在下，QC抑制劑1，10-二氮雜菲對(duì)由[Gln3]Aβ1-11生成[pGlu3]Aβ3-11的抑制作用。在所示的時(shí)間處將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)并接著記錄質(zhì)譜。圖13顯示在具有催化活性的DPIV和QC存在下，DPIV抑制劑Val-Pyrr對(duì)從[Gln3]Aβ1-11形成[pGlu3]Aβ3-11的還原作用。在所示的時(shí)間處將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)并接著記錄質(zhì)譜。圖14顯示在連續(xù)經(jīng)存在于豬垂體勻漿中的氨肽酶和QC催化后，由[Gln3]Aβ1-11到[pGlu3]Aβ肽3-11的形成。在所示的時(shí)間處將樣品從試管中移除，與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)并接著記錄質(zhì)譜。圖15A和B顯示與使用前煮沸10分鐘的重組人QC一同溫育的Aβ3-11a和Aβ3-21a的質(zhì)譜圖。C和D顯示當(dāng)存在導(dǎo)致分別形成[pGlu3]Aβ3-11a和[pGlu3]Aβ3-21a的活性人QC時(shí)Aβ3-11和Aβ3-21a的質(zhì)譜圖。E和F顯示當(dāng)存在活性QC及5mM抑制[pGlu3]形成的苯并咪唑時(shí)Aβ3-11a和Aβ3-21a的質(zhì)譜圖。圖16顯示對(duì)底物濃度作圖的木瓜QC催化的Glu-βNA-轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速率。在0.1M焦磷酸鹽緩沖液，pH6.1(正方形)、0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.5(圓形)以及0.1M硼酸鹽緩沖液，pH8.5(三角形)中測(cè)定初始速率。動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下KM＝1.13±0.07mM，kcat＝1.13±0.04min-1(pH6.1)；KM＝1.45±0.03mM，kcat＝0.92±0.01min-1(pH7.5)；KM＝1.76±0.06mM，kcat＝0.56±0.01min-1(pH8.5)。圖17顯示在一級(jí)速率定律條件(S＜＜KM)下確定的Gln-βNA(圓形)和Glu-βNA(正方形)轉(zhuǎn)化的pH依賴性。底物濃度分別為0.01mM和0.25mM。兩次測(cè)定均應(yīng)用由0.05M乙酸、0.05M焦磷酸和0.05M三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)組成的三元緩沖系統(tǒng)。為避免離子強(qiáng)度不同，所有緩沖液均通過(guò)加入NaCl調(diào)節(jié)至相同的電導(dǎo)率。這些數(shù)據(jù)用雙離解基團(tuán)方程擬合，揭示Gln-βNA的pKa值為6.91±0.02和9.5±0.1，Glu-βNA的pKa值為4.6±0.1和7.55±0.02。通過(guò)滴定法確定各底物中氨基的pKa值為6.97±0.01(Gln-βNA)和7.57±0.05(Glu-βNA)。所有測(cè)定均在30℃下進(jìn)行。圖18顯示當(dāng)存在咪唑、吡啶二羧酸且不含抑制性化合物時(shí)人QC催化的H-Gln-AMC環(huán)化的進(jìn)程曲線。在吡啶二羧酸存在下曲線的雙曲線形狀表明金屬離子從QC活性位點(diǎn)移除。圖19顯示雜環(huán)螯合劑1，10-二氮雜菲對(duì)QC滅活的時(shí)間依賴性。在不含底物時(shí)將QC酶與抑制劑一同溫育之后(連續(xù)曲線)，與未與抑制劑一同預(yù)溫育的樣品(點(diǎn)線)相比可觀察到酶活性降低，這表明金屬離子從QC活性位點(diǎn)移除。圖20表明單價(jià)和二價(jià)金屬離子對(duì)人QC的再活化作用。通過(guò)加入含2mM吡啶二羧酸的50mMBis-Tris溶液，pH6.8滅活QC。隨后，使該酶對(duì)包含1.0mMEDTA的50mMBis-Tris，pH6.8透析。通過(guò)將滅活的酶樣品與0.5mM濃度的金屬離子一同溫育可實(shí)現(xiàn)酶的再活化，同時(shí)在0.5mMEDTA存在下以避免緩沖液中痕量金屬離子引起的非特異性再活化。對(duì)照為未滅活，但同樣對(duì)EDTA溶液透析的酶樣品作為滅活酶(+EDTA)以及對(duì)未加入EDTA的緩沖液透析的酶樣品(-EDTA)。圖21人QC(hQC)和金屬肽酶ClanMH的其它M28家族成員的序列對(duì)比。使用于ch.EMBnet.Org中的ClustalW以默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行多重序列對(duì)比。在人QC(hQC；GenBankX71125)、源自灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus，SGAP；Swiss-ProtP80561)的鋅依賴性氨肽酶、以及在人谷氨酸羧肽酶II(hGCP11；Swiss-ProtQ04609)的N-乙?；?α-連接的酸性二肽酶(NAALADaseI)域(殘基274-587)中發(fā)現(xiàn)鋅離子連接殘基的保守。涉及金屬結(jié)合的氨基酸以粗體和下劃線形式打出。就人QC而言，這些殘基為肽酶的推斷對(duì)應(yīng)物(counterpart)。肽序列此處所述及使用的肽具有以下序列Aβ1-42Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaAβ1-40Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-ValAβ3-42Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaAβ3-40Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-ValAβ1-11aAsp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2Aβ3-11aGlu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2Aβ1-21aAsp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2Aβ3-21aGlu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2Gln3-Aβ3-40Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-ValGln3-Aβ3-21aGln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-NH2Gln3-Aβ1-11aAsp-Ala-Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2Gln3-Aβ3-11aGln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH具體實(shí)施方式本發(fā)明提供谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)的效應(yīng)物，其用于a)治療可通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)QC活性治療的哺乳動(dòng)物疾病和/或b)由QC活性調(diào)節(jié)引起的基于含pGlu的肽的作用的生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。此外，本發(fā)明提供抑制哺乳動(dòng)物中谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC，EC2.3.2.5)和/或QC樣酶的化合物，以及QC活性抑制劑在治療與QC活性相關(guān)的病理狀況中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種治療阿爾茨海默癥和唐氏綜合征的新方法。沉積在阿爾茨海默癥和唐氏綜合征大腦中的淀粉樣β-肽的N-端攜帶焦谷氨酸。由于修飾的淀粉樣β-肽對(duì)β-淀粉樣聚集及毒性呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，很可能會(huì)惡化疾病的發(fā)作和進(jìn)展，因此pGlu的生成在疾病的發(fā)展和進(jìn)展中是一重要事件(Russo，C.等2002JNeurochem82，1480-1489)。相反，在天然Aβ-肽(3-40/42)中，谷氨酸是作為N-末端氨基酸存在。到目前為止還未發(fā)現(xiàn)Glu到pGlu的酶促轉(zhuǎn)化。此外，至今尚未觀察到Glu肽到pGlu肽的自發(fā)性轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明一方面旨在確定QC在阿爾茨海默癥和唐氏綜合征中的作用。這一方面的研究包括合成在3位包含的氨基酸為谷氨酰胺而不是谷氨酸的Aβ3-11和Aβ1-11、這些修飾的淀粉樣β-肽對(duì)QC、DPIV和DPIV樣酶及氨肽酶的底物特征的確定、以及QC抑制劑在防止從淀粉樣β-衍生肽1-11和3-11的N-末端谷氨酰胺酰基殘基形成pGlu中的應(yīng)用。所得結(jié)果見(jiàn)實(shí)施例8。所應(yīng)用的方法記載于實(shí)施例3。至今，沒(méi)有跡象顯示QC與疾病進(jìn)展有關(guān)，因?yàn)樵贏β(3-40/42，或11-40/42)中谷氨酸為N-末端氨基酸。但是，QC是唯一已知的能在肽的N-末端形成pGlu的酶。本發(fā)明其它方面涉及以下結(jié)果和發(fā)現(xiàn)a)在副反應(yīng)中，QC催化谷氨酸以極低速率轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸的環(huán)化反應(yīng)，b)APP或其后形成的淀粉樣β-肽的谷氨酸通過(guò)未知的酶活性經(jīng)翻譯后加工轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，并且在另一步驟中，QC在淀粉樣β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺環(huán)化為焦谷氨酸，c)谷氨酸通過(guò)化學(xué)催化或自身催化經(jīng)翻譯后加工轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，隨后QC在淀粉樣β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺環(huán)化為焦谷氨酸，d)編碼淀粉樣β蛋白的APP基因中發(fā)生突變，導(dǎo)致在3位Gln代替Glu。在翻譯及N-末端加工后，QC催化谷氨酰胺環(huán)化為焦谷氨酸，e)由于未知酶活性障礙，谷氨酰胺被并入到APP的初生肽鏈中，隨后QC在淀粉樣β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺N-末端環(huán)化為焦谷氨酸。QC涉及上述所有五種情況下的關(guān)鍵步驟，即有利于淀粉樣β-肽聚集的焦谷氨酸的形成。因此，與環(huán)化反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制無(wú)關(guān)，對(duì)QC的抑制會(huì)防止導(dǎo)致阿爾茨海默癥和唐氏綜合征發(fā)作和進(jìn)展的斑塊形成性Aβ3-40/41/43或Aβ11-40/41/43的沉積。谷氨酸存在于淀粉樣β-肽的3、11和22位。其中22位從谷氨酸(E)到谷氨酰胺(Q)的突變(對(duì)應(yīng)于淀粉樣前體蛋白APP693，SwissprotP05067)被記載為所謂的Dutch型腦動(dòng)脈淀粉樣病變突變(Dutchtypecerebroarterialamyloidosismutation)。在3、11和/或22位含焦谷氨酸殘基的β-淀粉樣肽被描述為比Aβ1-40/42/43更具細(xì)胞毒性和疏水性(SaidoT.C.2000MedicalHypotheses54(3)427-429)?？赏ㄟ^(guò)不同位點(diǎn)的β-分泌酶β-位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白切割酶(BACE)(HuseJ.T.等2002J.Biol.Chem.277(18)16278-16284)和/或通過(guò)氨肽酶加工產(chǎn)生多種N-末端變異。在所有情況下，環(huán)化反應(yīng)均可按照上述a)-e)發(fā)生。迄今為止，沒(méi)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持對(duì)應(yīng)于途徑a)的未知谷氨酰環(huán)化酶(EC)催化的Glu1-肽向pGlu-肽的酶促轉(zhuǎn)化(Garden，R.W.，Moroz，T.P，Gleeson，J.M.，F(xiàn)loyd，P.D.，Li，L.J.，Rubakhin，S.S.，和Sweedler，J.V.(1999)JNeurochem72，676-681，HosodaR.等，(1998)JNeuropatholExpNeurol.57，1089-1095)。到目前還未鑒定出這種能環(huán)化Glu1-肽的酶活性，所述Glu1-肽經(jīng)N-末端質(zhì)子化并在溫和的堿性pH條件下?lián)碛泻韶?fù)電的Glu1γ-羧基基團(tuán)。pH值低于7.0時(shí)對(duì)Gln1-底物的QC活性顯著降低。相反，似乎Glu1轉(zhuǎn)化可在酸性反應(yīng)條件下發(fā)生(Iwatsubo，T.，Saido，T.C.，Mann，D.M.，Lee，V.M.，和Trojanowski，J.Q.(1996)AmJPathol149，1823-1830；Russo，C.，Saido，T.C.，DeBusk，L.M.，Tabaton，M.，Gambetti，P.，和Teller，J.K.(1977)FEBSLett409，411-416；Russo，C.，Salis，S.，Dolcini，V.，Venezia，V.，Song，X.H.，Teller，J.K.，和Schettini，G.(2001)NeurobiolDis8，173-180；Tekirian，T.L.，Saido，T.C.，Markesbery，W.R.，Russell，M.J.，Wekstein，D.R.，Patel，E.，和Geddes，J.W.(1998)JNeuropatholExpNeurol.57，76-94；Russo，C.，Violani，E.，Salis，S.，Venezia，V.，Dolcini，V.，Damonte，G.，Benatti，U.，DArrigo，C.，Patrone，E.，Carlo，P.，和Schettini，G.(2002)JNeurochem82，1480-1489；Hosoda，R.，Saido，T.C.，Otvos，L.，Jr.，Arai，T.，Mann，D.M.，Lee，V.M.，Trojanowski，J.Q.，和Iwatsubo，T.(1998)JNeuropatholExpNeurol.57，1089-1095；Garden，R.W.，Moroz，T.P.，Gleeson，J.M.，F(xiàn)loyd，P.D.，Li，L.J.，Rubakhin，S.S.，和Sweedler，J.V.(1999)JNeurochem72，676-681)。按照本發(fā)明研究了QC能否在溫和的酸性條件下識(shí)別并轉(zhuǎn)化(turnover)淀粉樣β衍生肽。因此，合成并研究了作為酶潛在底物的肽[Gln3]Aβ1-11a、Aβ3-11a、[Gln3]Aβ3-11a、Aβ3-21a、[Gln3]Aβ3-21a以及[Gln3]Aβ3-40。選擇這些序列以模仿可能因翻譯后Glu酰胺化出現(xiàn)的天然的N-末端和C-末端截短的[Glu3]Aβ肽和[Gln3]Aβ肽。在本發(fā)明中已發(fā)現(xiàn)木瓜和人QC既催化谷氨酰胺?；h(huán)化也催化谷氨酰環(huán)化。顯然，QC的主要生理功能是在激素分泌過(guò)程之前或期間通過(guò)谷氨酰胺環(huán)化反應(yīng)完成內(nèi)分泌細(xì)胞中的激素成熟。已知這種分泌小泡的pH值呈酸性。因而，在5.0到7.0的窄pH范圍內(nèi)所述酶的副活性可能是其新發(fā)現(xiàn)的也轉(zhuǎn)化Glu-Aβ肽的谷氨?；h(huán)化酶活性。然而，由于Glu-環(huán)化遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于Gln-轉(zhuǎn)化，谷氨?；h(huán)化是否起到重要的生理作用值得懷疑。但是，在神經(jīng)退行性病變的病理學(xué)中，與谷氨?；h(huán)化有關(guān)。通過(guò)研究該酶促反應(yīng)的pH依賴性，我們發(fā)現(xiàn)未質(zhì)子化的N-末端對(duì)于Gln1肽的環(huán)化是必需的，并相應(yīng)地發(fā)現(xiàn)底物的pKa值與QC催化的pKa值一致(見(jiàn)圖17)。因此，QC可穩(wěn)定未質(zhì)子化α-氨基基團(tuán)對(duì)通過(guò)酰胺化親電地活化的γ-羰基碳的分子內(nèi)親核進(jìn)攻(路線1)。與含N-末端谷氨酰胺的肽上存在的單價(jià)電荷相比，含Glu的肽的N-末端Glu殘基在約中性pH條件下主要帶二價(jià)電荷。谷氨酸γ-羧基和α-氨基基團(tuán)的pKa值分別約為4.2和7.5。即，在中性及中性以上的pH條件下，盡管α-氨基氮部分或完全未質(zhì)子化且具有親核性，γ-羧基為未質(zhì)子化并因此不能發(fā)揮羰基的親電性。因此，不可能發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)。然而，在它們各自的pKa值之間大約5.2-6.5的pH范圍內(nèi)，含N-末端Glu的肽總濃度的大約1-10％(-NH2)或10-1％(-COOH)濃度的兩官能團(tuán)均呈現(xiàn)非離子化形式。結(jié)果，在溫和的酸性pH范圍內(nèi)，存在其所攜兩官能團(tuán)均未帶電荷的N-末端Glu-肽，從而QC可能穩(wěn)定分子內(nèi)環(huán)化為pGlu肽的中間體。即，如果γ-羧基被質(zhì)子化，則羰基碳有足夠的親電性以允許未質(zhì)子化的α-氨基進(jìn)行親核進(jìn)攻。在該pH值時(shí)，羥基離子作為離去基團(tuán)(路線3)。通過(guò)QC催化的Glu-βNA轉(zhuǎn)化所獲得的pH依賴性數(shù)據(jù)確證了這些假設(shè)(見(jiàn)實(shí)施例11)。與通過(guò)QC催化的Gln-βNA的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化相比，催化作用的最適pH值轉(zhuǎn)移至pH約6.0的酸性范圍，即該pH范圍內(nèi)底物分子同時(shí)富含質(zhì)子化的γ-羧基和未質(zhì)子化的α-氨基。此外，動(dòng)力學(xué)測(cè)定的pKa值7.55±0.02與通過(guò)滴定所測(cè)定的Glu-βNA的α-氨基的值(7.57±0.05)非常一致。從生理學(xué)上講，pH值6.0時(shí)QC催化的谷氨酸環(huán)化反應(yīng)的二級(jí)速率常數(shù)(或?qū)Ｒ恍猿?shù)，Kcat/KM)可能在比谷氨酰胺環(huán)化反應(yīng)的二級(jí)常數(shù)慢8,000倍的范圍內(nèi)(圖17)。然而，兩種模型底物Glu-βNA和Gln-βNA的非酶促轉(zhuǎn)化可以忽略不計(jì)，這與本發(fā)明所觀察到的pGlu肽的形成可忽略相吻合。因此，對(duì)于通過(guò)QC催化的pGlu生成，根據(jù)酶促與非酶促速率常數(shù)的比值可估計(jì)速率的增加至少為108(將酶催化反應(yīng)的二級(jí)速率常數(shù)與相應(yīng)的非酶促環(huán)化反應(yīng)一級(jí)速率常數(shù)進(jìn)行比較，Gln和Glu轉(zhuǎn)化的催化能力因子(catalyticproficiencyfactor)分別為109-1010M-1)。從這些數(shù)據(jù)得出的結(jié)論是，體內(nèi)很可能僅有一條酶促途徑導(dǎo)致pGlu生成。由于QC在腦內(nèi)非常豐富，并且考慮到最近發(fā)現(xiàn)的30μM(Gln-)TRH樣肽的突變的轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.9min-1(Prokai，L，Prokai-Tatrai，K.，Ouyang，X.，Kim，H.S.，Wu，W.M.，Zharikova，A.，和Bodor，N.(1999)JMedChem42，4563-4571)，可以預(yù)言對(duì)于適當(dāng)?shù)墓劝彼岬孜?，如果提供相似的反?yīng)條件，其環(huán)化反應(yīng)半衰期大約為100小時(shí)。此外，考慮到分泌途徑中腦部QC/EC的區(qū)室化和定位，實(shí)際上在體內(nèi)酶和底物的濃度及反應(yīng)條件可能更有利于完整細(xì)胞中的酶促環(huán)化作用。而且，如果N-末端Glu被轉(zhuǎn)化為Gln，則可預(yù)期QC介導(dǎo)的更加迅速的pGlu形成。在體外，兩種反應(yīng)均受應(yīng)用QC/EC活性抑制劑的抑制(圖9、10和15)?？偠灾?，本發(fā)明指出富含于大腦中的人QC很可能是從占存在于阿爾茨海默癥中的斑塊沉積的50％以上的由Glu-Aβ和Gln-Aβ前體生成淀粉樣病變形成性(amyloidogenic)pGlu-Aβ肽的催化劑。這些發(fā)現(xiàn)確定QC/EC參與了老年斑的形成并因此可作為治療阿爾茨海默癥的新型藥物靶標(biāo)。在本發(fā)明的第二個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)淀粉樣β衍生肽是二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV樣酶、優(yōu)選為二肽基肽酶II(DPII)的底物。DPIV、DPII或其它DPIV樣酶可從修飾的淀粉樣β-肽(1-11)的N-末端釋放二肽，生成以谷氨酰胺作為N-末端氨基酸殘基的淀粉樣β-肽(3-11)。結(jié)果如在實(shí)施例8中所示。如在文獻(xiàn)中所述，在被DPII、DPIV或其它DPIV樣酶切割之前，天冬氨酸(淀粉樣β-肽的殘基1)和丙氨酸(淀粉樣β-肽的殘基2)之間的肽鍵可異構(gòu)化產(chǎn)生異天冬氨酰殘基(Kuo，Y.-M，Emmerling，M.R.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.，Roher，A.E.(1997)BBRC237，188-191；Shimizu，T.，Watanabe，A.，Ogawara，M.，Mori，H.和Shirasawa，T.(2000)Arch.Biochem.Biophys.381，225-234)。這些異天冬氨酰殘基造成淀粉樣β-肽抵抗氨肽酶降解，從而使中心斑塊包含大量異Asp1-淀粉樣β-肽，表明N-末端轉(zhuǎn)化減少。然而，本發(fā)明首次證明了尤其在酸性條件下，N-末端二肽H-異Asp1-Ala2-OH可通過(guò)二肽基肽酶得以釋放。此外，已發(fā)現(xiàn)異構(gòu)化也可先于β-分泌酶切割，并且異構(gòu)化可加速蛋白水解進(jìn)程，從而導(dǎo)致隨后經(jīng)DPII、DPIV或DPIV樣酶轉(zhuǎn)化的異Asp1-淀粉樣β-肽N-末端異天冬氨酰鍵的釋放(Momand，J.和Clarke，S.(1987)Biochemistry26，7798-7805；Kuo，Y.-M.，Emmerling，M.R.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.，Roher，A.E.(1997)BBRC237，188-191)。因此，抑制異天冬氨酰形成可降低被β-分泌酶的切割，其又減少淀粉樣β-肽的形成。此外，通過(guò)抑制DPII、DPIV或DPIV樣酶阻斷異Asp1-淀粉樣β-肽的轉(zhuǎn)化可防止[Glu3]Aβ被QC/EC催化生成[pGlu3]Aβ。在本發(fā)明的第三個(gè)具體實(shí)施方案中，DPIV活性抑制劑和QC抑制劑的組合可用于治療阿爾茨海默癥和唐氏綜合征。DPIV和/或DPIV樣酶與QC的組合效應(yīng)闡述如下a)DPIV和/或DPIV樣酶切割A(yù)β1-40/42，釋放出包含H-Asp-Ala-OH的二肽和Aβ3-40/42，b)在副反應(yīng)中，QC催化谷氨酸以極低速率環(huán)化為焦谷氨酸，c)通過(guò)未知的酶活性經(jīng)翻譯后加工于N-末端將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，并且隨后，QC在淀粉樣β-肽N-末端的加工后催化谷氨酰胺環(huán)化為焦谷氨酸，d)通過(guò)化學(xué)催化或自身催化經(jīng)翻譯后加工將谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，并且在另一步驟中，QC在淀粉樣β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺環(huán)化為焦谷氨酸，e)編碼淀粉樣β蛋白的APP基因存在突變，導(dǎo)致Aβ的3位由Gln代替Glu。在翻譯及N-末端加工后，QC催化谷氨酰胺環(huán)化為焦谷氨酸，f)由于未知酶活性障礙，谷氨酰胺被并入APP初生肽鏈，且隨后QC在淀粉樣β-肽N-末端加工后催化谷氨酰胺N-末端環(huán)化為焦谷氨酸。不同的肽酶活性也可觸發(fā)使N-末端Gln暴露于QC活性。氨肽酶能依次將Asp和Ala從Aβ1-40/41/43的N-末端除去，從而暴露易于環(huán)化的氨基酸三。二肽基肽酶如DPI、DPII、DPIV、DP8、DP9以及DP10可一步去除二肽Asp-Ala。因此，氨肽酶活性或二肽基肽酶活性的抑制可用于防止Aβ3-40/41/43的形成。DPIV和/或DPIV樣酶抑制劑以及QC下調(diào)效應(yīng)物(loweringeffector)活性的組合效應(yīng)闡述如下a)DPIV和/或DPIV樣酶抑制劑抑制Aβ1-40/42轉(zhuǎn)化為Aβ3-40/42。b)從而防止谷氨酸N-末端的暴露并且無(wú)論是通過(guò)酶促催化還是化學(xué)催化都不可能轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，從而導(dǎo)致焦谷氨酸的形成。c)另外QC抑制劑可防止APP基因突變產(chǎn)生的殘基修飾的Aβ3-40/42分子和那些修飾的Aβ3-40/42分子形成焦谷氨酸。本發(fā)明中，類似的DPIV或DPIV樣酶與QC的聯(lián)合作用已用其他肽類激素如胰高血糖素，CC趨化因子以及P物質(zhì)。胰高血糖素是通過(guò)刺激糖原分解和糖原異生起維持正常血糖(euglycemia)作用的自胰島α-細(xì)胞釋放的29個(gè)氨基酸的多肽。盡管胰高血糖素很重要，但關(guān)于體內(nèi)胰高血糖素的清除機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。Pospisilik等用靈敏的質(zhì)譜技術(shù)評(píng)估了胰高血糖素的酶促代謝以確定分子產(chǎn)物。將胰高血糖素以純化的豬二肽基肽酶IV(DPIV)溫育可順序生成胰高血糖素3-29和胰高血糖素5-29。在人血清中，胰高血糖素降解為胰高血糖素3-29之后迅速發(fā)生N-末端環(huán)化，從而防止DPIV介導(dǎo)的進(jìn)一步水解。與純化的DPIV或正常大鼠血清一起溫育后對(duì)胰高血糖素的生物測(cè)定顯示高血糖活性明顯喪失，而在缺少DPIV的小鼠血清中進(jìn)行類似的溫育未顯示胰高血糖素的生物活性有任何喪失。通過(guò)質(zhì)譜和生物測(cè)定監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，降解反應(yīng)被特異性DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷阻斷。這些結(jié)果確定DPIV是涉及胰高血糖素降解和失活的主要酶。這些發(fā)現(xiàn)為測(cè)定人血漿胰高血糖素水平提供了重要線索(Pospisilik等，RegulPept2001Jan12；96(3)133-41)。人單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-2最初從受激的骨肉瘤細(xì)胞中作為與MCP-1和MCP-3一同生成的趨化因子分離得到。VonCoillie等(VanCoillie，E.等，1998Biochemistry37，12672-12680)從人睪丸cDNA庫(kù)中克隆了5′-端延長(zhǎng)的MCP-2cDNA。它編碼76個(gè)殘基MCP-2蛋白，但與已報(bào)道的源自骨髓的MCP-2cDNA序列的密碼子46不同，其編碼Lys而非Gln。這一由單核苷多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)引起的MCP-2Lys46變異體(variant)在生物學(xué)上與MCP-2Gln46相當(dāng)。編碼區(qū)被亞克隆到細(xì)菌表達(dá)載體pHEN1上，并且在大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，將這兩個(gè)MCP-2蛋白變異體從周質(zhì)中回收。Edman降解顯示NH2端為Gln殘基而不是pGlu。在鈣動(dòng)員和趨化試驗(yàn)中于單核細(xì)胞上檢測(cè)rMCP-2Gln46和rMCP-2Lys46以及NH2-端的環(huán)狀對(duì)應(yīng)物。在rMCP-2Gln46和rMCP-2Lys46同工型之間未觀察到任何生物活性的顯著差別。然而，對(duì)于這兩種MCP-2變異體，NH2-末端的焦谷氨酸是趨化性而非鈣動(dòng)員所必需的。通過(guò)絲氨酸蛋白酶CD26/二肽基肽酶IV(CD26/DPPIV)NH2-端截短rMCP-2Lys46導(dǎo)致NH2-端Gln-Pro二肽的釋放，而含氨基端pGlu的合成MCP-2未受影響。CD26/DPPIV剪除的rMCP-2Lys46(3-76)在趨化性試驗(yàn)和信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)(signalingassay)中幾乎完全沒(méi)有活性。這些觀察結(jié)果表明MCP-2中NH2-端pGlu對(duì)趨化活性是必需的，并且它還保護(hù)該蛋白不受CD26/DPPIV的降解(vanCollie，E..等Biochemistry1998，37，12672-80)。本發(fā)明中，通過(guò)LC/MS分析確定，在胰高血糖素3-29(Pospisilik等，2001)和MCP-2同工型(vanCoillie等，1998)中測(cè)定的N-末端焦谷氨酰胺殘基的形成是由QC催化的。此外，通過(guò)LC/MS研究證明，在將兩個(gè)二肽Lys-Pro和Arg-Pr從P物質(zhì)經(jīng)N-末端DPIV催化除去后剩余的[Gln5]物質(zhì)P5-11被QC轉(zhuǎn)化為[pGlu5]物質(zhì)P5-11。DPIV抑制劑在WO99/61431中已公開(kāi)。具體而言，已公開(kāi)DPIV抑制劑包含氨基酸殘基和噻唑烷或吡咯烷基及其鹽，尤其是L-蘇-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-蘇-異亮氨酰吡咯烷、L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-別-異亮氨酰吡咯烷及其鹽。低分子量的二肽基肽酶IV抑制劑的更多實(shí)例為下列物質(zhì)，如四氫異喹啉-3-甲酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯及2-氰基-吡咯烷、N-(N′-取代的甘氨?；?-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨?；?噻唑烷、N-(取代的甘氨?；?-4-氰基噻唑烷、氨基-?；?二羥硼基-脯氨酰-抑制劑、環(huán)丙基稠合的吡咯烷以及雜環(huán)化合物。二肽基肽酶IV抑制劑記載于US6,380,398；US6,011,155；US6,107,317；US6,110,949；US6,124,305；US6,172,081；WO95/15309、WO99/61431、WO99/67278、WO99/67279、DE19834591、WO97/40832、DE19616486C2、WO98/19998、WO00/07617、WO99/38501、WO99/46272、WO99/38501、WO01/68603、WO01/40180、WO01/81337、WO01/81304、WO01/55105、WO02/02560和WO02/14271、WO02/04610、WO02/051836、WO02/068420、WO02/076450；WO02/083128、WO02/38541、WO03/000180、WO03/000181、WO03/000250、WO03/002530、WO03/002531、WO03/002553、WO03/002593、WO03/004496、WO03/024942和WO03/024965、其尤其是涉及這些抑制劑、其定義、用途及其產(chǎn)品的教導(dǎo)全文并入此處作為參考。優(yōu)選與QC效應(yīng)物聯(lián)合使用的為DPIV抑制劑如Hughes等在1999Biochemistry3811597-11603所公開(kāi)的NVP-DPP728A(1-[[[2-[{5-氰基吡啶-2-基}氨基]乙基]氨基]乙?；鵠-2-氰基-(S)-吡咯烷)(Novartis)；Hughes等在MeetingoftheAmericanDiabetesAssociation2002，Abstractno.272(Novartis)所公開(kāi)的LAF-237(1-[(3-羥基-金剛烷-1-基氨基)-乙?；鵠-吡咯烷-2(S)-腈)；Yamada等在1998BioorgMedChemLett8，1537-1540所公開(kāi)的TSL-225(色氨?；?1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸)；Asworth等在1996BioorgMedChemLett6，1163-1166及2745-2748所公開(kāi)的2-氰基吡咯烷酰胺和4-氰基吡咯烷酰胺；Sudre等在2002Diabetes51，1461-1469(Ferring)所公開(kāi)的FE-999011以及在WO01/34594(Guilford)中所公開(kāi)的化合物，并且所用劑量如以上參考文獻(xiàn)中所述。用于與QC效應(yīng)物聯(lián)合使用的更優(yōu)選的DPIV抑制劑為二肽化合物，其中氨基酸優(yōu)選為選自天然氨基酸如亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸。根據(jù)本發(fā)明使用的二肽樣化合物當(dāng)濃度(二肽化合物的濃度)為10μM時(shí)，血漿二肽基肽酶IV或DPIV樣酶的活性下降至少10％，尤其為至少40％。通常也期望體內(nèi)活性下降至少60％或至少70％。優(yōu)選的化合物也可表現(xiàn)為活性最多下降20％或30％。優(yōu)選的二肽化合物為N-纈氨酰-脯氨酰、O-苯甲酰羥胺、丙氨酰吡咯烷、異亮氨酰噻唑烷樣L-別-異亮氨酰噻唑烷、L-蘇-異亮氨酰吡咯烷及其鹽，尤其是反丁烯二酸鹽和L-別-異亮氨酰吡咯烷及其鹽。特別優(yōu)選的化合物為谷氨酰胺?；量┩楹凸劝滨０孵；邕蛲椤-Asn-吡咯烷、H-Asn-噻唑烷、H-Asp-吡咯烷、H-Asp-噻唑烷、H-Asp(NHOH)-吡咯烷、H-Asp(NHOH)-噻唑烷、H-Glu-吡咯烷、H-Glu-噻唑烷、H-Glu(NHOH)-吡咯烷、H-Glu(NHOH)-噻唑烷、H-His-吡咯烷、H-His-噻唑烷、H-Pro-吡咯烷、H-Pro-噻唑烷、H-Ile-azididine、H-Ile-吡咯烷、H-L-別-Ile-噻唑烷、H-Val-吡咯烷和H-Val-噻唑烷，及其藥物學(xué)可接受的鹽。這些化合物記載于WO99/61431及EP1304327中。此外，本發(fā)明提供QC效應(yīng)物與底物樣(substrate-like)肽類化合物聯(lián)合在競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)二肽基肽酶IV催化中的應(yīng)用。優(yōu)選的肽類化合物為2-氨基辛酸-Pro-Ile、Abu-Pro-Ile、Aib-Pro-Ile、Aze-Pro-Ile、Cha-Pro-Ile、Ile-Hyp-Ile、Ile-Pro-別-Ile、Ile-Pro-叔丁基-Gly、Ile-Pro-Val、Nle-Pro-Ile、Nva-Pro-Ile、Orn-Pro-Ile、Phe-Pro-Ile、Phg-Pro-Ile、Pip-Pro-Ile、Ser(Bzl)-Pro-Ile、Ser(P)-Pro-Ile、Ser-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-D-Val、叔丁基-Gly-Pro-Gly、叔丁基-Gly-Pro-Ile、叔丁基-Gly-Pro-Ile-酰胺、叔丁基-Gly-Pro-叔丁基-Gly、叔丁基-Gly-Pro-Val、Thr-Pro-Ile、Tic-Pro-Ile、Trp-Pro-Ile、Tyr(P)-Pro-Ile、Tyr-Pro-別-lle、Val-Pro-別-Ile、Val-Pro-叔丁基-Gly、Val-Pro-Val及其藥物學(xué)可接受的鹽，其中叔丁基-Gly定義為而Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基絲氨酸和磷?；z氨酸。Tyr(P)定義為磷?；野彼?。這些化合物公開(kāi)于WO03/002593中。根據(jù)本發(fā)明可與QC效應(yīng)物聯(lián)合使用的其他優(yōu)選的DPIV抑制劑為肽基酮，例如2-甲基羰基-1-N-[(L)-丙氨酰-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-甲基羰基-1-N-[(L)-纈氨酰-(L)-丙氨酰-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-[(乙?；?氧-甲基)羰基]-1-N-[(L)-丙氨酰-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-[苯甲酰-氧-甲基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-{[(2，6-二氯芐基)硫甲基]羰基}-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷，2-[苯甲酰-氧-甲基)羰基]-1-N-[甘氨酰-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷氫溴酸鹽，2-[([1，3]-噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽，2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽，2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-1-N-[{(L)-丙氨酰}-甘氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽，2-[(吡啶-2-基)羰基]-1-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-纈氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸鹽以及它們的其它藥物學(xué)可接受的鹽。這些化合物于WO03/033524中已公開(kāi)。此外，根據(jù)本發(fā)明取代的氨基酮可與QC效應(yīng)物聯(lián)合使用。優(yōu)選的取代的氨基酮為1-環(huán)戊基-3-甲基-1-氧代-2-戊烷氯化銨，1-環(huán)戊基-3-甲基-1-氧代-2-丁烷氯化銨，1-環(huán)戊基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化銨，1-環(huán)己基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化銨，3-(環(huán)戊基羰基)-1，2，3，4-四氫異喹啉氯化物，N-(2-環(huán)戊基-2-氧乙基)環(huán)己烷氯化銨以及它們的其它藥物學(xué)可接受的鹽。在罕見(jiàn)的脯氨酸特異性蛋白酶中，DPIV最初被認(rèn)為是唯一的作為多肽鏈氨基末端倒數(shù)第二個(gè)殘基的脯氨酸特異性膜結(jié)合酶。然而，其它分子，甚至是那些結(jié)構(gòu)與DPIV非同源但有相應(yīng)活性的分子也已確定。迄今所確定的DPIV樣酶包括如Sedo和Malik(Sedo和Malik2001，BiochimBiophysActa，36506，1-10)及Abbott和Gorrell(Abbott，C.A.和Gorrell，M.D.2002InLangner&Ansorge(ed.)，Ectopeptidases.KluwerAcademic/PlenumPublishers，NewYork，171-195)在綜述文章中所記載的成纖維細(xì)胞激活蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨肽酶樣蛋白、N-乙?；摩?連接的酸性二肽酶、休眠細(xì)胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸引素(attractin)和二肽基肽酶IV相關(guān)蛋白(DPP8)、DPL1(DPX，DP6)、DPL2以及DPP9。最近報(bào)道了二肽基肽酶10(DPP10)的克隆及特性(Qi，S.Y.等，BiochemicalJournalImmediatePublication.Publishedon28Mar2003asmanuscriptBJ20021914)。此處所用的術(shù)語(yǔ)效應(yīng)物定義為與酶結(jié)合并提高或降低其體外和/或體內(nèi)活性的分子。某些酶具有影響其催化活性的小分子的結(jié)合位點(diǎn)；刺激分子(stimulatormolecule)被稱為激活劑。酶甚至具有識(shí)別多于一種激活劑或抑制劑的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。酶可探測(cè)(detect)多種分子的濃度并利用該信息改變其自身活性。由于酶既可呈現(xiàn)活性構(gòu)象也可呈現(xiàn)非活性構(gòu)象，因此效應(yīng)物可以調(diào)節(jié)酶活性激活劑是正效應(yīng)物，抑制劑是負(fù)效應(yīng)物。效應(yīng)物不僅在酶的活性位點(diǎn)起作用，而且還在調(diào)節(jié)位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)起作用，這些術(shù)語(yǔ)是用于強(qiáng)調(diào)調(diào)節(jié)位點(diǎn)是不同于催化位點(diǎn)的酶的要素，并用于區(qū)分這種調(diào)節(jié)形式與催化位點(diǎn)的底物和抑制劑間的競(jìng)爭(zhēng)(Darnell，J.，Lodish，H.和Baltimore，D.1990，MolecularCellBiology2ndEdition，ScientificAmericanBooks，NewYork，63頁(yè))。根據(jù)以下常規(guī)列表，本發(fā)明肽中的每個(gè)氨基酸殘基都用對(duì)應(yīng)于該氨基酸俗名的一個(gè)字母或三個(gè)字母名稱來(lái)表示此處所用的術(shù)語(yǔ)“QC”包括谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)和QC樣酶。QC和QC樣酶具有相同或相似的酶活性，進(jìn)一步定義為QC活性。在這一方面，QC樣酶在分子結(jié)構(gòu)上可根本不同于QC。此處所用的術(shù)語(yǔ)“QC活性”定義為N-末端谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸(pGlu*)或N-末端L-高谷氨酰胺或L-β-高谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為環(huán)狀焦-高-谷氨酰胺衍生物，同時(shí)釋放出氨的的分子內(nèi)環(huán)化作用。參見(jiàn)路線1和2。路線1QC對(duì)谷氨酰胺的環(huán)化路線2QC對(duì)L-高谷氨酰胺的環(huán)化此處所用術(shù)語(yǔ)“EC”包括QC和QC樣酶如谷氨酸環(huán)化酶(EC)的副活性，進(jìn)一步定義為EC活性。此處所用術(shù)語(yǔ)“EC活性”定義為N-末端谷氨酸殘基被QC轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸(pGlu*)的分子內(nèi)環(huán)化作用。參見(jiàn)路線3。此處所用術(shù)語(yǔ)“金屬依賴性酶”定義為需結(jié)合的金屬離子以實(shí)現(xiàn)其催化功能和/或需結(jié)合的金屬離子以形成催化活性結(jié)構(gòu)的酶。與酶結(jié)合并提高或降低其活性的分子被稱為“效應(yīng)物”。由于酶既可呈活性構(gòu)象又可呈非活性構(gòu)象，因此效應(yīng)物可改變酶活性激活劑是正效應(yīng)物，抑制劑是負(fù)效應(yīng)物。效應(yīng)物在調(diào)節(jié)位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)(來(lái)自希臘語(yǔ)“另一種形狀”)結(jié)合，這一術(shù)語(yǔ)是用于強(qiáng)調(diào)調(diào)節(jié)位點(diǎn)是不同于催化位點(diǎn)的酶的要素，并用于區(qū)分這種調(diào)節(jié)形式與催化位點(diǎn)的底物和抑制劑間的競(jìng)爭(zhēng)。根據(jù)本發(fā)明的個(gè)別具體實(shí)施方案，優(yōu)選為激活劑或抑制劑。路線3QC(EC)對(duì)不帶電荷的谷氨酰肽的N-末端環(huán)化本發(fā)明另一方面是鑒定新的QC生理底物。如實(shí)施例5所述，通過(guò)以哺乳動(dòng)物肽進(jìn)行的環(huán)化實(shí)驗(yàn)鑒定它們。如實(shí)施例1所述，之前已分離得到人QC和木瓜QC。所應(yīng)用的方法如實(shí)施例2中所述，而所應(yīng)用的肽合成如實(shí)施例6中所概述。研究結(jié)果見(jiàn)表1。表1谷氨酰胺?；h(huán)化酶的新生理底物(*，通過(guò)MALDI-TOF實(shí)驗(yàn)定性地測(cè)定)<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="709">底物人QC木瓜QCKM(μM)Kcat(s-1)Kcat/KM(mM-1s-1)KM(μM)Kcat(s-1)Kcat/KM(mM-1s-1)[Gln1]-胃泌素31±154.1±1.61745.2±36.934±225.8±0.5759±30[Gln1]-神經(jīng)降壓肽37±148.8±0.41318.9±24.840±335.7±0.9893±44[Gln1]-FPP87±269.6±0.3800.0±14.9232±932.5±0.4140±4[Gln1]-TRH90±482.8±1.2920.0±27.6n.d.n.d.n.d.[Gln1]-GnRH53±369.2±1.11305.7±53.2169±982.5±1.9488.2±114.8[Gln3]-胰高血糖素(3-29)**[Gln5-物質(zhì)P(5-11)**</table></tables>如實(shí)施例4所示，所有試驗(yàn)均在人或植物QC活性和穩(wěn)定性的最佳范圍內(nèi)進(jìn)行。具有N-末端谷氨酰胺殘基并因此為QC酶底物的生理學(xué)活性的肽的氨基酸序列列于表2表2具有N-末端谷氨酰胺殘基的生理學(xué)活性的肽的氨基酸序列在第四個(gè)具體實(shí)施方案中，肽[Gln1]胃泌素(17和34個(gè)氨基酸長(zhǎng)度)、[Gln1]神經(jīng)降壓肽以及[Gln1]FPP被確定為新的QC生理底物。胃泌素、神經(jīng)降壓肽以及FPP在它們的N-末端位置均含pGlu殘基。對(duì)所有的肽來(lái)說(shuō)，經(jīng)發(fā)現(xiàn)該N-末端pGlu殘基是通過(guò)QC催化由N-末端谷氨酰胺生成。結(jié)果，將N-末端谷氨酰胺殘基轉(zhuǎn)化為pGlu時(shí)，這些肽的生物學(xué)功能就被激活?？缟掀ば盘?hào)傳導(dǎo)細(xì)胞(transepithelialtransducingcell)，尤其是胃泌素(G)細(xì)胞在食物進(jìn)入胃后共同調(diào)節(jié)胃酸的分泌。最近的研究表明胃泌素前體產(chǎn)生多種活性產(chǎn)物，并且胃泌素的生物合成中有多個(gè)控制點(diǎn)。生物合成的前體和中間體(前胃泌素和Gly-胃泌素)是推斷的生長(zhǎng)因子；其產(chǎn)物，酰胺化的胃泌素調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖、產(chǎn)酸性(acid-producing)壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻細(xì)胞樣(ECL)細(xì)胞的分化、以及與ECL細(xì)胞內(nèi)的組胺合成及貯存有關(guān)的基因表達(dá)，以及劇烈刺激酸分泌。胃泌素還刺激表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族成員的生成，其又抑制壁細(xì)胞功能而刺激表面表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。血漿胃泌素濃度在具有幽門(mén)螺桿菌的患者中升高，已知這些患者有較高的患十二指腸潰瘍和胃癌的風(fēng)險(xiǎn)(Dockray，G.J.1999JPhysiol15315-324)。已知由胃竇G細(xì)胞釋放的肽激素胃泌素可以通過(guò)CCK-2受體刺激自泌酸粘膜中ECL細(xì)胞合成并釋放組胺。經(jīng)動(dòng)員的組胺通過(guò)結(jié)合位于壁細(xì)胞上的H(2)受體誘導(dǎo)酸分泌。最近的研究表明，胃泌素?zé)o論是完全酰胺化形式還是加工較少的形式(前胃泌素和甘氨酸延長(zhǎng)的胃泌素)，都是胃腸道的生長(zhǎng)因子。已經(jīng)確定酰胺化的胃泌素的主要營(yíng)養(yǎng)作用是針對(duì)胃泌酸粘膜，其中胃泌素引起胃干細(xì)胞和ECL細(xì)胞的增殖提高，結(jié)果導(dǎo)致壁細(xì)胞和ECL細(xì)胞質(zhì)量增加。另一方面，加工較少的胃泌素(例如，甘氨酸延長(zhǎng)的胃泌素)的主要營(yíng)養(yǎng)靶標(biāo)似乎是結(jié)腸粘膜(Koh，T.J.和Chen，D.2000RegulPept9337-44)。在第五個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供活性增強(qiáng)的QC效應(yīng)物在刺激胃腸道細(xì)胞尤其是胃粘膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞增殖、生酸壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻細(xì)胞樣(ECL)細(xì)胞的分化、與ECL細(xì)胞內(nèi)組胺合成及貯存有關(guān)的基因表達(dá)、以及在通過(guò)維持或提高活性[pGlu1]胃泌素的濃度刺激哺乳動(dòng)物劇烈分泌酸中的應(yīng)用。在第六個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供活性減弱的QC效應(yīng)物在通過(guò)降低無(wú)活性的[Gln1]胃泌素向活性[pGlu1]胃泌素的轉(zhuǎn)化率治療哺乳動(dòng)物中伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌的十二指腸潰瘍和胃癌中的應(yīng)用。神經(jīng)降壓肽(NT)是與精神分裂癥病理生理學(xué)相關(guān)的神經(jīng)肽，它能特異性調(diào)節(jié)以前已證明在該病癥中被誤調(diào)整的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。其中測(cè)定腦脊液(CSF)NT濃度的臨床研究表明CSFNT濃度降低的一亞類精神分裂癥患者通過(guò)有效的抗精神病藥物治療得以恢復(fù)。同樣存在大量證據(jù)表明在抗精神病藥物作用機(jī)制中涉及NT系統(tǒng)。中樞給藥NT與全身給藥抗精神病藥物在行為和生物化學(xué)效應(yīng)上非常相似，并且抗精神病藥物可提高NT神經(jīng)傳遞。這一連串的發(fā)現(xiàn)使得可假設(shè)NT起著內(nèi)源性抗精神病藥物的作用。此外，典型和非典型的抗精神病藥物能區(qū)別地改變黑質(zhì)紋狀區(qū)和中腦緣多巴胺末端區(qū)域中的NT神經(jīng)傳遞，并且這些作用分別是副反應(yīng)傾向及效力的先兆(Binder，E.B.等，2001BiolPsychiatry50856-872)。在第七個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供QC的活性增強(qiáng)效應(yīng)物在制備抗精神病藥物和/或在治療哺乳動(dòng)物的精神分裂癥中的應(yīng)用。QC效應(yīng)物維持或提高活性[pGlu1]神經(jīng)降壓肽的濃度。在精液漿中發(fā)現(xiàn)了一種與促甲狀腺素釋放激素(TRH)相關(guān)的三肽，受精促進(jìn)肽(FPP)。最近獲得的體外和體內(nèi)的證據(jù)表明FPP在調(diào)節(jié)精子生育力方面發(fā)揮重要作用。具體而言，F(xiàn)PP最初刺激無(wú)剩余力的(無(wú)能力的)精子“接通(switchon)”，使之更快地具有生育力，但之后獲得能育力致使精子不會(huì)自發(fā)產(chǎn)生頂體損失并因此不會(huì)失去受精能力。通過(guò)已知能調(diào)節(jié)腺苷?；h(huán)化酶(AC)/cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的腺苷可以模擬甚至事實(shí)上放大這些應(yīng)答。已發(fā)現(xiàn)FPP和腺苷兩者都能刺激無(wú)生育力的細(xì)胞中cAMP的生成但在有生育力的細(xì)胞中抑制其生成，而FPP受體可以某種方式與腺苷受體和G蛋白相互作用以實(shí)現(xiàn)對(duì)AC的調(diào)控。這些事件能影響各種蛋白的酪氨酸磷酸化狀況，其中某些在最初的“接通”中很重要，另一些可能與頂體反應(yīng)本身有關(guān)。在精液漿中還發(fā)現(xiàn)了降鈣素和血管緊張素II，它們?cè)隗w外對(duì)無(wú)生育能力的精子有相似的作用，并且可以放大對(duì)FPP的應(yīng)答。這些分子在體內(nèi)具有類似的作用，通過(guò)刺激然后維持生育能力從而影響生育力。是FPP、腺苷、降鈣素以及血管緊張素II的可用性降低或其受體的缺陷促成了男性不育癥(Fraser，L.R.和Adeoya-Osiguwa，S.A.2001VitamHorm63，1-28)。在第八個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供QC的活性降低效應(yīng)物在制備避孕藥物和/或在降低哺乳動(dòng)物的生育力中的應(yīng)用。QC的活性降低效應(yīng)物可降低活性[pGlu1]FPP的濃度，抑制精子的能育力以及導(dǎo)致精細(xì)胞失活。相反，已發(fā)現(xiàn)QC的活性增強(qiáng)效應(yīng)物能刺激男性生育力并治療不育癥。在第九個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明中鑒定了更多的QC生理底物。它們是[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18以及[Gln1]分形素。具體參見(jiàn)表2。這些多肽在諸如髓祖細(xì)胞增殖抑制、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附及遷移過(guò)程等病理生理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。最近的臨床試驗(yàn)研究了幾種抗肝炎B、人免疫缺陷病毒和黑素瘤的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞肽基疫苗。令人感興趣的一種可單獨(dú)使用或與其它腫瘤抗原聯(lián)合使用的黑素瘤候選疫苗為十肽ELA。該肽是具有N-末端谷氨酸的Melan-A/MART-1抗原免疫顯性肽類似物。已報(bào)道谷氨酸的氨基和γ-羧基以及谷氨酰胺的氨基和γ-羧酰胺基團(tuán)很容易縮合生成焦谷氨酸衍生物。為克服這一穩(wěn)定性問(wèn)題，已開(kāi)發(fā)若干用焦谷氨酸代替N-末端谷氨酰胺或谷氨酸而不損失藥理學(xué)性質(zhì)的有藥物學(xué)意義的多肽。不幸的是與ELA相比，焦谷氨酸衍生物(PyrELA)及N-末端乙?；舛说难苌?AcELA)不能引發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性。盡管在PyrELA和AcELA引入貌似很小的修飾，但這兩種衍生物很可能對(duì)特定的I類(specificclassI)主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex)比ELA具有更低的親和力。因此，為保存完整的ELA活性，必須避免生成PyrELA(BeckA.等2001，JPeptRes57(6)528-38)。最近已發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(QC)在黑素瘤中也過(guò)度表達(dá)(RossD.T等，2000，NatGenet24227-35)。在第十個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供QC效應(yīng)物在制備用于治療病理生理狀態(tài)如髓祖細(xì)胞增殖抑制、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、惡性轉(zhuǎn)移(malignmetastasis)、黑素瘤、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附及遷移過(guò)程的藥物中的應(yīng)用。在第十一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明確定[Gln1]胖素A為QC的生理底物。胖素A是一種可能通過(guò)協(xié)調(diào)這些互補(bǔ)的平衡功能(complementaryhomeostaticfunction)的復(fù)雜行為及生理反應(yīng)而在調(diào)節(jié)食物攝取和失眠中起重要作用的神經(jīng)肽。它還在能量代謝、自主功能、激素平衡和體液調(diào)節(jié)等平衡調(diào)節(jié)中起作用。在第十二個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供QC效應(yīng)物在制備用于治療食物攝取障礙及失眠、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙、激素平衡障礙和體液調(diào)節(jié)障礙的藥物中的應(yīng)用。若干蛋白中的多聚谷氨酰胺的擴(kuò)展導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病，如帕金森氏癥和肯尼迪癥。其機(jī)制在很大程度上仍然未知。多聚谷氨酰胺復(fù)制的生化性質(zhì)提出一種可能的解釋焦谷氨酸形成之前谷氨酰胺?；?谷氨酰胺?；I的內(nèi)分解斷裂可能通過(guò)增加多聚谷氨酰胺?；鞍椎姆纸獯x穩(wěn)定性、疏水性、淀粉樣變性生成(amyloidogenicity)和神經(jīng)毒性從而有助于發(fā)病機(jī)制的形成(Saido，T；MedHypotheses(2000)Mar，54(3)427-9)。因此在第十三個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供QC效應(yīng)物在制備治療帕金森氏癥和亨廷頓舞蹈癥(Huntingon’sdisease)的藥物中的應(yīng)用。在第十四個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種降低或抑制QC酶活性的一般方法。還提供抑制性化合物的實(shí)例。哺乳動(dòng)物QC的抑制作用最初僅在1，10-二氮雜菲和還原的6-甲基蝶呤中檢測(cè)到(Busby，W.H.J.等，1987JBiolChem262，8532-8536)。EDTA并不抑制QC，從而推斷QC不是金屬依賴性酶(Busby，W.H.J.等，1987JBiolChem262，8532-8536，Bateman，R.C.J.等，2001Biochemistry40，11246-11250，Booth，R.E.等，2004BMCBiology2)。然而，正如通過(guò)1，10-二氮雜菲、吡啶二羧酸、8-羥基喹啉及其它螯合劑(圖18，19)對(duì)QC的抑制特性以及通過(guò)過(guò)渡金屬離子(圖20)使QC再活化所揭示，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人QC和其它動(dòng)物的QC為金屬依賴性酶。最后，通過(guò)與其它金屬依賴性酶的序列比較展示出金屬依賴性，表明人QC中也保存有螯合氨基酸殘基(圖21)?；衔锱c活性位點(diǎn)結(jié)合金屬離子的相互作用代表降低或抑制QC活性的一般方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)咪唑衍生物為強(qiáng)效的QC抑制劑。通過(guò)連續(xù)試驗(yàn)(詳情見(jiàn)實(shí)施例2)分析了許多咪唑衍生物抑制作為高度保守的哺乳動(dòng)物QC的一員的人QC的能力。因此，本發(fā)明提供咪唑衍生物和組氨酸及其衍生物作為QC的活性降低效應(yīng)物以及它們?cè)谝种祁愋秃托ЯΨ矫娴奶卣鳌Ｆ浣Y(jié)構(gòu)及Ki值見(jiàn)表3和4。結(jié)果詳細(xì)記載于實(shí)施例7中。表3人QC催化的反應(yīng)中咪唑衍生物的抑制常數(shù)。在30℃、pH8.0、含5mMEDTA的0.05MTris-HCl中進(jìn)行測(cè)定。其它表4L-組胺及其兩生物活性代謝物(也稱為tele-甲基組胺)對(duì)QC的抑制作用。出人意料的是，在酶活性表征期間發(fā)現(xiàn)除N-末端谷氨酰胺?；鶜埢?，N-末端β-高-谷氨酰胺酰基殘基也具有作為植物和動(dòng)物QC底物的性質(zhì)。該N-末端-高-谷氨酰胺酰基殘基分別被人和木瓜QC催化轉(zhuǎn)化為五元內(nèi)酰胺環(huán)。結(jié)果記載于實(shí)施例5中。所應(yīng)用的方法在實(shí)施例2中闡明而肽的合成按實(shí)施例6所述進(jìn)行。本發(fā)明另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案包括QC效應(yīng)物的篩選方法。從一組化合物中鑒別QC的活性修飾效應(yīng)物的優(yōu)選篩選方法包括以下步驟a)在允許它們相結(jié)合的條件下使QC接觸所述化合物；b)加入QC底物；c)監(jiān)測(cè)底物轉(zhuǎn)化或任選地測(cè)定殘余的QC活性；以及d)計(jì)算底物轉(zhuǎn)化率和/或QC酶活性的變化以鑒定活性修飾效應(yīng)物。另一優(yōu)選的篩選方法涉及一種鑒定及選擇直接或間接與QC活性位點(diǎn)結(jié)合的金屬離子相互作用的效應(yīng)物的方法，其包括以下步驟a)在允許它們相結(jié)合的條件下使QC接觸所述化合物；b)加入可被QC轉(zhuǎn)化的QC底物；c)監(jiān)測(cè)底物轉(zhuǎn)化或任選地測(cè)定殘余的QC活性；以及d)計(jì)算底物轉(zhuǎn)化率和/或QC酶活性的變化，其中所述變化可用于鑒定QC的活性修飾效應(yīng)物。哺乳動(dòng)物QC或木瓜QC優(yōu)選用于上述的篩選方法中。由于這些篩選方法所鑒定的效應(yīng)物將用于治療哺乳動(dòng)物尤其是人的疾病，所以哺乳動(dòng)物QC尤其優(yōu)選。上述篩選方法所選擇的藥物可通過(guò)降低至少一種QC底物的轉(zhuǎn)化(負(fù)效應(yīng)物，抑制劑)，或通過(guò)提高至少一種QC底物的轉(zhuǎn)化(正效應(yīng)物，激活劑)而起作用。本發(fā)明的化合物可被轉(zhuǎn)化為酸加成鹽，尤其是藥物學(xué)可接受的酸加成鹽。本發(fā)明化合物的鹽可采用無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽的形式。本發(fā)明化合物可被轉(zhuǎn)化為及用作酸加成鹽，尤其是藥物學(xué)可接受的酸加成鹽。藥物學(xué)可接受的酸加成鹽一般為其中將堿性側(cè)鏈以無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸質(zhì)子化的形式。代表性的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、羥乙基磺酸、苯磺酸、草酸、哌酸(pamoicacid)、2-萘磺酸、對(duì)-甲苯磺酸、環(huán)己磺酸、水楊酸、糖精酸或三氟乙酸。本發(fā)明化合物的所有藥物學(xué)可接受的酸加成鹽形式均已包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。鑒于游離化合物及其鹽形式化合物間的緊密聯(lián)系，只要是本文所涉及的化合物，若在這種情況下可能或適宜，其相應(yīng)的鹽也同樣涵蓋在內(nèi)。如果本發(fā)明的化合物具有至少一個(gè)手性中心，它們就可以對(duì)映異構(gòu)體的形式存在。如果化合物具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心，則它們可能額外以非對(duì)映異構(gòu)體形式存在。應(yīng)理解所有這種異構(gòu)體及其混合物均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，化合物的某些晶體形式可能以多晶型形式存在，因此同樣包含在本發(fā)明中。另外，某些化合物可能與水(即水合物)或常規(guī)有機(jī)溶劑形成溶劑化物，而這種溶劑化物同樣也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。包括其鹽的化合物還可以其水合物的形式獲得或包括用于其結(jié)晶的其它溶劑。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療通過(guò)調(diào)節(jié)有此需要的患者的QC酶活性介導(dǎo)的疾病的方法，其包括以治療該疾病治療有效的量和給藥方案給藥本發(fā)明的任意化合物或其藥物組合物。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物、及其藥物學(xué)可接受的酸加成鹽形式在制備用于預(yù)防或治療由患者QC活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。所述化合物可通過(guò)任意常規(guī)給藥途徑向患者給藥，包括但不限于靜脈內(nèi)、口服、皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、非胃腸道及其聯(lián)合方式。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及藥物組合物，即藥物，其包括至少一種本發(fā)明的化合物或其鹽，任選地與一種或更多種藥物學(xué)可接受的載體和/或溶劑相結(jié)合。藥物組合物可采用，如非胃腸道或腸道劑型的形式并包含適當(dāng)?shù)妮d體，或它們可采用包含適于口服給藥的載體的口服劑型的形式。它們優(yōu)選為采用口服劑型的形式。按照本發(fā)明給藥的QC活性效應(yīng)物可在藥物學(xué)可給藥的劑型或復(fù)合劑型(formulationcomplex)中用作抑制劑或與抑制劑、底物、偽底物(pseudosubstrate)、QC表達(dá)抑制劑、結(jié)合蛋白或那些降低哺乳動(dòng)物QC蛋白濃度的酶蛋白抗體聯(lián)合使用。本發(fā)明化合物使根據(jù)患者及疾病單獨(dú)地調(diào)整治療成為可能，尤其是使避免個(gè)體不耐受性、過(guò)敏和副作用成為可能。所述化合物還表現(xiàn)出活性程度隨時(shí)間變化。從而使提供治療的醫(yī)生有機(jī)會(huì)對(duì)患者的個(gè)別情況作出不同的反應(yīng)他能精確調(diào)整一方面作用起效速率以及另一方面作用持續(xù)時(shí)間尤其是作用強(qiáng)度。按照本發(fā)明優(yōu)選的治療方法代表預(yù)防或治療由哺乳動(dòng)物QC酶活性的調(diào)整介導(dǎo)的疾病的新方法。它非常簡(jiǎn)單，易于商業(yè)應(yīng)用并適于尤其用于治療哺乳動(dòng)物特別是人類醫(yī)學(xué)中基于生理活性QC底物濃度不平衡的疾病中，如表1和2所列。該化合物有利地例如采用包含活性成分與常用添加劑如現(xiàn)有技術(shù)已知的稀釋劑、賦形劑和/或載體相結(jié)合的藥物制劑的形式給藥。例如，它們可通過(guò)非胃腸道(例如，i.v.生理鹽水溶液)或腸道(例如口服給藥，以常規(guī)載體配制)給藥。根據(jù)其內(nèi)源穩(wěn)定性和生物利用度，為達(dá)到所期望的血糖正常值標(biāo)準(zhǔn)，每天可給藥單劑量或多劑量的所述化合物。例如，在人體中這種劑量范圍可在每天大約0.01mg至250.0mg范圍內(nèi)，優(yōu)選為在每千克體重約0.01至100mg化合物的范圍內(nèi)。通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥QC活性效應(yīng)物可預(yù)防或減輕或治療選自下列的疾病阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌感染的潰瘍和胃癌、致病性精神病、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附和遷移、食物攝取障礙、失眠、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙、激素平衡障礙以及體液調(diào)節(jié)障礙。此外，通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥QC活性效應(yīng)物可刺激胃腸道細(xì)胞優(yōu)選為胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖、急性酸分泌以及產(chǎn)酸性壁細(xì)胞及分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的分化。另外，向哺乳動(dòng)物給藥QC抑制劑可導(dǎo)致精細(xì)胞功能喪失從而抑制生育力。因此，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)和控制男性生育力的方法以及QC的活性降低效應(yīng)物在制備男性避孕藥中的應(yīng)用。此外，通過(guò)向哺乳動(dòng)物給藥QC活性效應(yīng)物可抑制髓祖細(xì)胞增殖。因此按照本發(fā)明使用的化合物能以本身已知的方式利用惰性、無(wú)毒、藥物學(xué)適當(dāng)?shù)妮d體和添加劑或溶劑轉(zhuǎn)化為常規(guī)制劑，如片劑、膠囊、錠劑、丸劑、栓劑、顆粒劑、氣霧劑、糖漿，液體、固體和膏狀乳劑(cream-likeemulsion)以及混懸劑和溶液劑。在每種劑型中，治療有效的化合物優(yōu)選在總混合物中為大約0.1到80重量％的濃度，更優(yōu)選為1到50重量％的濃度，也就是說(shuō)，采用足夠獲得上述劑量范圍的量。這些物質(zhì)可作為錠劑、膠囊、可咀嚼膠囊(bitablecapsule)、片劑、滴劑、糖漿形式的藥物使用，或作為栓劑或鼻噴霧劑使用。該劑型可便于制備，例如通過(guò)以溶劑和/或載體，任選地使用乳化劑和/或分散劑分散活性成分，可例如在將水用作稀釋劑的情況下任選地使用有機(jī)溶劑作為輔助溶劑(auxiliarysolvent)。與本發(fā)明有關(guān)的有用的賦形劑的實(shí)例包括水，無(wú)毒有機(jī)溶劑如石蠟(例如天然石油餾分)、植物油(例如油菜籽油、花生油、芝麻油)、醇(例如乙醇、甘油)、二醇(例如丙二醇、聚乙二醇)；固相載體如粉碎的天然礦物質(zhì)(例如高分散硅石、硅酸鹽)、糖(例如原糖、乳糖和葡萄糖)；乳化劑如非離子型和陰離子型乳化劑(例如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸酯以及芳基磺酸酯)、分散劑(例如木素、亞硫酸鹽溶液、甲基纖維素、淀粉以及聚乙烯吡咯烷酮)以及潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、硬脂酸及月桂基硫酸鈉)以及任選的調(diào)味劑。可通過(guò)常規(guī)方式給藥，優(yōu)選為腸道內(nèi)或非胃腸道給藥，尤其是口服給藥。就腸道內(nèi)給藥而言，除上述載體外片劑可包含其他添加劑如檸檬酸鈉、碳酸鈣及磷酸鈣，及其它各種添加劑如淀粉優(yōu)選為馬鈴薯淀粉、明膠等。此外，可伴隨使用潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉及滑石用于壓片。就用于口服給藥的水混懸劑和/或酏劑而言，除上述賦形劑外，活性成分中可加入各種矯味劑或著色劑。就非胃腸道給藥而言，可以采用使用適當(dāng)?shù)囊后w載體的活性成分溶液。一般而言，已發(fā)現(xiàn)利于以下述方式給藥獲得有效的結(jié)果，就靜脈內(nèi)給藥而言，每天約0.01到2.0mg/kg體重，優(yōu)選為約0.01到1.0mg/kg體重的劑量，而就腸道內(nèi)給藥而言，劑量則每天約0.01到2mg/kg體重，優(yōu)選為約0.01到1mg/kg體重。然而在一些情況下，根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物或患者的體重或給藥途徑，還基于動(dòng)物種類及其對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng)或進(jìn)行給藥的時(shí)間間隔，可能需要偏離上述的量。因此，在一些情況下使用少于上述最低的量就足夠，而另一些情況下，可能不得不超過(guò)所述的上限。在以相對(duì)大的量給藥的情況下，將那些量分為一天內(nèi)給藥的幾個(gè)單劑量是明智的。對(duì)于人類給藥，可使用相同的劑量范圍。上述評(píng)論類似地適用于該情況。藥物劑型的實(shí)例1.每個(gè)膠囊含100mg本發(fā)明化合物的膠囊制備下列組合物的溶液用于制備約10,000個(gè)膠囊本發(fā)明的化合物1.0kg甘油0.5kg聚乙二醇3.0kg水0.5kg5.0kg將該溶液以本領(lǐng)域已知的方式制成軟明膠膠囊。該膠囊適于咀嚼或吞服。2.包含100mg本發(fā)明化合物的片劑或包衣片劑或錠劑下述劑量用于制備100,000片片劑研細(xì)的本發(fā)明化合物10.0kg葡萄糖4.35kg乳糖4.35kg淀粉4.50kg研細(xì)的纖維素4.50kg將上述組份混合，然后提供由下列物質(zhì)制備的溶液，聚乙烯吡咯烷酮2.0kg聚山梨醇酯0.1kg以及水約5.0kg并以本領(lǐng)域已知的方式通過(guò)過(guò)篩(grating)所述濕顆粒，在加入0.2kg硬脂酸鎂后進(jìn)行干燥來(lái)進(jìn)行制粒。已完成的30.0kg片劑混合物加工形成重量為300mg的凸片。理論上，片劑可以本身已知的方式進(jìn)行包衣或包糖衣。貫穿本說(shuō)明書(shū)所定義的藥物組合物有利地包含至少一種QC活性效應(yīng)物和至少一種DPIV抑制劑的組合。這種藥物組合物尤其適用于阿爾茨海默癥和唐氏綜合征的治療。實(shí)施例實(shí)施例1人和木瓜QC的制備宿主株和培養(yǎng)基根據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)(Invitrogen)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化并分析用于人QC表達(dá)的Pichiapastoris菌株X33(AOX1，AOX2)。根據(jù)廠商的建議制備P.pastoris所需的培養(yǎng)基，即緩沖的甘油(BMGY)復(fù)合物或甲醇(BMMY)復(fù)合物培養(yǎng)基及發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基。編碼人QC的質(zhì)粒載體的分子克降所有的克隆步驟都應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行。載體pPICZαB(Invitrogen)用于在酵母中的表達(dá)。pQE-31載體(Qiagen)用于在大腸桿菌(E.coli.)中表達(dá)人QC。將由密碼子38起始的成熟QC的cDNA與質(zhì)粒編碼的6×組氨酸標(biāo)記(tag)符合讀框地融合。利用引物pQCyc-1和pQCyc-2(表1)擴(kuò)增和亞克隆后，利用SphI和HindIII的限制位點(diǎn)將片段插入表達(dá)載體中。P.postoris的轉(zhuǎn)化和小范圍表達(dá)根據(jù)廠商(Qiagen)的建議在E.coliJM109中擴(kuò)增和純化質(zhì)粒DNA。在所用的表達(dá)質(zhì)粒pPICZαB中，提供了三個(gè)限制位點(diǎn)用于線性化。由于SacI和BstXI在QCcDNA內(nèi)切割，故選擇PmeI來(lái)線性化。將20-30μg質(zhì)粒DNA用PmeI進(jìn)行線性化，經(jīng)乙醇沉淀，溶于無(wú)菌、去離子水中。然后根據(jù)廠商(BioRad)說(shuō)明書(shū)，通過(guò)電穿孔將10μg的DNA用于適當(dāng)?shù)?competent)P.pastoris細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在含有150μg/mlZeocin的板上進(jìn)行選擇。一使用線性化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化可得到幾百個(gè)轉(zhuǎn)化體。為測(cè)試用于QC表達(dá)的重組酵母克隆，將重組體在含有2mlBMGY的10ml圓錐形試管中生長(zhǎng)24h。隨后，該酵母經(jīng)離心并重新懸浮于含0.5％甲醇的2mlBMMY中。通過(guò)每24h添加甲醇來(lái)維持該濃度直到72h。隨后測(cè)定上清液中QC的活性。利用對(duì)準(zhǔn)(directedagainst)6×組氨酸標(biāo)記(Qiagen)的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡免疫分析(Westernblotanalysis)證實(shí)了融合蛋白的存在。選出顯示最高QC活性的克隆用于進(jìn)一步試驗(yàn)和發(fā)酵。發(fā)酵罐內(nèi)的大范圍表達(dá)基本如“Pichiafermentationprocessguidelines”(Invitrogen)所記載，在5l反應(yīng)器(BiostatB，B.Braunbiotech)中進(jìn)行QC的表達(dá)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞是在補(bǔ)充痕量鹽并以甘油作為單一的碳源的發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中(pH5.5)培養(yǎng)。在最初的約24h的分批式操作(batchphase)期及隨后約5h的流加式操作(fed-batch)期間，細(xì)胞質(zhì)量增加。一旦細(xì)胞濕重達(dá)到200g/l，使用甲醇利用三步喂養(yǎng)方案在約60h的整個(gè)發(fā)酵時(shí)間內(nèi)完成QC表達(dá)的誘導(dǎo)。隨后，通過(guò)以6000×g在4℃離心15min將細(xì)胞從含QC的上清液中除去。通過(guò)加入NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，將所得混濁液以37000×g在4℃再次離心40min。如果還混濁，使用纖維素膜(孔徑0.45μm)進(jìn)行額外的過(guò)濾步驟。在P.pastoris中表達(dá)的6×組氨酸標(biāo)記的QC的純化將His標(biāo)記的QC首先通過(guò)固定金屬親和色譜(IMAC)進(jìn)行純化。在代表性的純化中，將1000ml培養(yǎng)上清液應(yīng)用于Ni2+-填充的ChelatingSepharoseFF柱(1.6×20cm，Pharmacia)，該柱用含750mMNaCl的50mM，pH6.8的磷酸鹽緩沖液以5ml/min的流速平衡。用10倍柱體積的平衡緩沖液以及5倍柱體積的含5mM組氨酸的平衡緩沖液洗滌后，通過(guò)改用含150mMNaCl和100mM組氨酸的50mM，pH6.8的磷酸鹽緩沖液將結(jié)合蛋白質(zhì)洗脫。所得洗脫液用20mMBis-Tris/HCl，pH6.8，在4℃進(jìn)行透析過(guò)夜。隨后，通過(guò)陰離子交換色譜在用透析緩沖液平衡的MonoQ6柱(BioRad)上將QC進(jìn)行進(jìn)一步純化。將含QC的組份以4ml/min的流速上柱。然后將該柱用含100mMNaCl的平衡緩沖液進(jìn)行沖洗。通過(guò)兩個(gè)梯度完成洗脫，分別得到30或5倍柱體積的含240mM和360mMNaCl的平衡緩沖液。收集6ml餾分并通過(guò)SDS-PAGE分析其純度。合并含同源QC的餾分并通過(guò)超濾濃縮。為長(zhǎng)期儲(chǔ)存(-20℃)，可加入甘油至最終濃度為50％。根據(jù)Bradford或Gill和vonHippel(Bradford，M.M.1976AnalBiochem72，248-254；Gill，S.C.和yonHippel，P.H.1989AnalBiochem182，319-326.)的方法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。大腸桿菌中QC的表達(dá)和純化將編碼QC的構(gòu)建體(construct)轉(zhuǎn)化進(jìn)M15細(xì)胞(Qiagen)并在選擇性LB瓊脂板上于37℃下生長(zhǎng)。于室溫在含1％葡萄糖和1％乙醇的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600值達(dá)到約0.8時(shí)，用0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。經(jīng)過(guò)一個(gè)冷凍和融化的循環(huán)后，通過(guò)加入在含300mMNaCl和2mM組氨酸的50mM、pH8.0的磷酸鹽緩沖液中的2.5mg/ml溶菌酶進(jìn)行約30min的細(xì)胞溶解。通過(guò)以37000×g在4℃離心30min使該溶液澄清，隨后應(yīng)用玻璃粉(glassfrit)(DNA分離)進(jìn)行過(guò)濾以及應(yīng)用纖維素過(guò)濾器對(duì)粗和細(xì)沉淀進(jìn)行兩個(gè)另外的過(guò)濾步驟。該上清液(約500ml)以流速1ml/min應(yīng)用于Ni2+-親和柱(1.6×20cm)。用含150mMNaCl和100mM組氨酸的50mM的磷酸鹽緩沖液洗脫QC。通過(guò)超濾將含QC的餾分濃縮。來(lái)自木瓜膠乳的QC的純化根據(jù)之前報(bào)道的方法(Zerhouni，S.等，1989BiochimBiophysActa138，275-290)的改良版本使用BioCAD700E(PerseptiveBiosystems，Wiesbaden，Germany)進(jìn)行木瓜膠乳QC的制備。如此處所述，將50g膠乳溶于水并離心。用硫甲磺酸S-甲酯實(shí)施蛋白酶的滅活，將所得粗提取物進(jìn)行透析。透析之后，將整個(gè)上清液裝在用100mM、pH5.0的乙酸鈉緩沖液平衡的SP瓊脂糖凝膠快速柱(SPSepharoseFastFlowcolumn)(21×2.5cmi.d.)上(流速3ml/min)。以2ml/min的流速通過(guò)逐漸增加乙酸鈉緩沖液的濃度在三步內(nèi)完成洗脫。第一步為在0.5柱體積內(nèi)采用0.1至0.5M乙酸鹽緩沖液的線性梯度。第二步為在四個(gè)柱體積內(nèi)以0.5至0.68M的線性增加緩沖液濃度。在最后的洗脫步驟中，應(yīng)用一個(gè)柱體積的0.85M的緩沖液。合并含最高酶活性的餾分(6ml)。通過(guò)超濾完成濃縮并將緩沖液變化為0.02MTris/HCl、pH8.0(Amicon，膜分子量截留值(cut-off)為10kDa)。將硫酸銨加入到濃縮的由離子交換色譜步驟所得的木瓜酶中至最終濃度為2M。將該溶液應(yīng)用于(21×2.5cmi.d.)用2M硫酸銨、0.02MTris/HCl，pH8.0平衡的丁基瓊脂糖凝膠4快速柱(Butylsepharose4FastFlowcolumn)(流速1.3ml/min)上。減少硫酸銨的濃度，在三步內(nèi)完成洗脫。第一步中以1.3ml/min的流速應(yīng)用0.5個(gè)柱體積的2至0.6M的硫酸銨、0.02MTris/HCl，pH8.0的線性梯度。第二步中以1.5ml/min的流速應(yīng)用5個(gè)柱體積0.6至0M的硫酸銨、0.02MTris/HCl、pH8.0的線性梯度。通過(guò)以1.5ml/min的流速應(yīng)用2個(gè)柱體積的0.02MTris/HCl、pH8.0來(lái)進(jìn)行最后的洗脫步驟。合并所有含QC活性的餾分，并通過(guò)超濾濃縮。所得的同源QC在-70℃儲(chǔ)存。使用Bradford法與由牛血清白蛋白得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較測(cè)定最終的蛋白濃度。實(shí)施例2谷氨酰胺?；h(huán)化酶活性的測(cè)定熒光分析所有的測(cè)定在30℃下用BioAssayReaderHTS-7000Plus微孔板讀板器(PerkinElmer)完成。QC活性使用H-Gln-βNA利用熒光測(cè)定法評(píng)估。該樣品是由0.2mM熒光底物、含20mMEDTA的0.2MTris/HCl、pH8.0中的0.25U焦谷氨酰氨肽酶(Unizyme，Denmark)以及最終體積為250μl的適當(dāng)?shù)叵♂尩腝C等分試樣組成。激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為320/410nm。通過(guò)加入谷氨酰胺酰基環(huán)化酶開(kāi)始分析反應(yīng)。在分析條件下QC活性由β-萘胺標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定。一個(gè)單位定義為在所述條件下每分鐘催化自H-Gln-βNA生成1μmolpGlu-βNA的QC的量。在第二種熒光分析中，使用H-Gln-AMC作為底物來(lái)測(cè)定QC的活性。反應(yīng)是利用NOVOStar微孔板讀板器(BMGlabtechnologies)在30℃下進(jìn)行。該樣品是由不同濃度的熒光底物、含5mMEDTA的0.05MTris/HCl、pH8.0中的0.1U焦谷氨酰氨肽酶(Qiagen)以及最終體積為250μl的適當(dāng)?shù)叵♂尩腝C等分試樣組成。激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為380/460nm。通過(guò)加入谷氨酰胺酰基環(huán)化酶開(kāi)始分析反應(yīng)。在分析條件下QC活性由7-氨基-4-甲基香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定。使用GraFit軟件評(píng)估動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。QC的分光光度法分析這種新的試驗(yàn)被用于測(cè)定大多數(shù)QC底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。QC活性使用源自由先前不連續(xù)分析(Bateman，R.C.J.1989JNeurosciMethods30，23-28)改編的連續(xù)方法，利用谷氨酸脫氫酶作為輔助酶(auxiliaryenzyme)進(jìn)行分光光度分析。該樣品是由各自的QC底物、0.3mMNADH、14mMα-酮戊二酸和最終體積為250μl的30U/ml谷氨酸脫氫酶組成。通過(guò)加入QC開(kāi)始反應(yīng)并通過(guò)監(jiān)測(cè)8-15min內(nèi)340nm處吸光度的減少跟蹤(persue)。產(chǎn)物生成的典型的時(shí)間過(guò)程見(jiàn)圖1。在測(cè)定條件下評(píng)估最初的速率，從氨氣標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定酶的活性。所有樣品在30℃下使用SPECTRAFluorPlus或使用Sunrise(均來(lái)自TECAN)的微孔板讀板器進(jìn)行測(cè)定。使用GraFit軟件評(píng)估動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。抑制劑試驗(yàn)對(duì)于抑制劑測(cè)試，樣品成分除了加入推斷的抑制化合物外與以上所述的相同。為快速測(cè)定QC抑制作用，樣品包含4mM的各自的抑制劑和濃度為1KM的底物。為詳細(xì)研究抑制作用并確定Ki值，首先研究了抑制劑對(duì)輔助酶的影響。在所有情況下，未發(fā)現(xiàn)對(duì)任一種酶產(chǎn)生影響，因此可以可靠地測(cè)定QC抑制作用。使用GraFit軟件通過(guò)用競(jìng)爭(zhēng)性抑制的通用方程擬合過(guò)程曲線來(lái)評(píng)估抑制常數(shù)。實(shí)施例3MALDI-TOF質(zhì)譜分析使用具有線性飛行時(shí)間分析器的Hewlett-PackardG2025LD-TOFSystem來(lái)進(jìn)行基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜分析。該裝置配備有337nm的氮激光、電壓加速源(5kV)和1.0m的飛行管道。檢測(cè)器為陽(yáng)離子模式，使用與個(gè)人電腦相連接的LeCroy9350M數(shù)字存儲(chǔ)示波器來(lái)記錄和過(guò)濾信號(hào)。樣品(5μl)與等體積的基質(zhì)溶液混合。對(duì)于基質(zhì)溶液，我們使用通過(guò)將30mg2’，6’-二羥基苯乙酮(Aldrich)和44mg檸檬酸氫二銨(Fluka)溶于1ml乙腈/0.1％TFA的水溶液(1/1，v/v)中制備的DHAP/DAHC。將小體積(＝1μl)的基質(zhì)—分析物—混合物轉(zhuǎn)移至探針尖上并在真空室(Hewlett-PackardG2024A樣品制備附件)中立即蒸發(fā)以確保樣品結(jié)晶快速而均勻。為了長(zhǎng)期測(cè)定Glu1環(huán)化作用，于30℃在100μl0.1M、pH5.2的乙酸鈉緩沖溶液或0.1MBis-Tris、pH6.5的緩沖溶液中溫育Aβ-衍生的肽。將該肽以0.5mM[Aβ3-11a]或0.15mM[Aβ3-21a]的濃度應(yīng)用，并在整個(gè)24小時(shí)加入0.2UQC。就Aβ3-21a而言，該試驗(yàn)包含1％的DMSO。在不同時(shí)間，將樣品從試管中移出，根據(jù)廠商的建議用ZipTips(Millipore)提取的肽與基質(zhì)溶液混合(1∶1v/v)，并隨后記錄質(zhì)譜。陰性對(duì)照不包括QC或包含熱滅活的酶。用于抑制劑研究的樣品成分除了加入抑制化合物(5mM苯并咪唑或2mM1，10-二氮雜菲)外與上述的相同。實(shí)施例4pH依賴性在一級(jí)速率條件下研究人和木瓜QC催化作用的pH依賴性，從而反映質(zhì)子濃度對(duì)專一性常數(shù)kcat/KM的影響。為了該目的，使用以焦谷氨酰氨肽酶作為輔助酶、Gln-βNA作為底物的偶聯(lián)酶試驗(yàn)(coupledenzymaticassay)。發(fā)現(xiàn)焦谷氨酰氨肽酶在pH5.5-8.5(Tsuru，D.等，1978JBiochem(Tokyo)84，467-476)之間有活性且穩(wěn)定。因此該試驗(yàn)使得可在此pH-范圍內(nèi)進(jìn)行QC催化的研究。如圖2所示，所得速率曲線符合經(jīng)典鐘型曲線。人QC具有非常窄的pH依賴性，其最佳值約為pH7.8-8.0。在偏堿性pH下速率傾向于減小。這與直到pH8.5(圖2，插圖)活性并不下降的木瓜QC觀察到的速率曲線形成對(duì)比。然而，兩種酶在pH8都具有其最佳特異性。出人意料的是，對(duì)曲線的評(píng)估顯示出人及木瓜QC分別在7.17±0.02和7.15±0.02的酸性范圍內(nèi)具有相同的pKa值。在堿性pH值下人QC活性明顯下降，這是由于pKa值約為8.5的基團(tuán)的解離所引起。就木瓜QC而言，在堿性pH范圍未收集到額外的數(shù)據(jù)點(diǎn)從而能夠可靠地確定第二pKa值。與將數(shù)據(jù)以雙解離模型擬合相比，將數(shù)據(jù)以單解離模型擬合得到幾乎相同的pKa值(pKa7.13±0.03)，從而支持這一觀點(diǎn)。這說(shuō)明兩個(gè)pKa值相當(dāng)獨(dú)立。pH穩(wěn)定性通過(guò)在30℃、pH4-10之間的不同pH值下溫育植物和動(dòng)物酶30min來(lái)研究谷氨酰胺?；h(huán)化酶的穩(wěn)定性。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定QC活性。結(jié)果如圖3所示。來(lái)自木瓜膠乳的QC在試驗(yàn)pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，在酸性或堿性范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的不穩(wěn)定趨勢(shì)。相反，人QC僅在7和8.5之間的pH范圍內(nèi)顯示出相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，表明它在pH值大于8.5和小于6時(shí)具有顯著的不穩(wěn)定性。因此，pH8左右的范圍似乎對(duì)植物和人QC活性和穩(wěn)定性為最佳，并且是實(shí)施QC的底物特異性比較的合適的pH值。實(shí)施例5QC底物特異性的測(cè)定分光光度試驗(yàn)按照實(shí)施例2所述進(jìn)行連續(xù)分光光度試驗(yàn)。因此，通過(guò)在340nm因氨氣釋放和隨后因α-酮戊二酸生成谷氨酸引起NADH/H+的消耗所引起的吸光度降低反映QC活性。如圖1所示，監(jiān)測(cè)線性進(jìn)程曲線，且在所測(cè)定的活性和QC濃度之間存在線性關(guān)系。此外，使用這里提出的連續(xù)試驗(yàn)得到的H-Gln-Gln-OH動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表1)與使用非連續(xù)方法(KM＝175±18μM、kcat＝21.3±0.6s-1)得到的參數(shù)非常一致。另外，表1所示的底物H-Gln-Ala-OH、H-Gln-Glu-OH、H-Gln-Gln-OH、H-Gln-OtBu和H-Gln-NH2被木瓜QC轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與使用直接方法在pH8.8及37℃下(Gololobov，M.Y.等，1996BiolChemHoppeSeyler377，395-398)測(cè)得的參數(shù)非常一致。因此，很明顯新的連續(xù)試驗(yàn)?zāi)芴峁┛煽康慕Y(jié)果。二-、三-和二肽-替代品利用上述新的連續(xù)試驗(yàn)測(cè)定了為木瓜和人QC的潛在底物的約30個(gè)化合物。結(jié)果如表5所示。通過(guò)比較其特異性表明，與人酶相比，幾乎所有的短肽底物可更有效地由木瓜QC轉(zhuǎn)化。令人感興趣的是，如通過(guò)比較H-Gln-Tyr-Ala-OH、H-Gln-Phe-Ala-NH2和H-Gln-Trp-Ala-NH2與其它三肽的特異性或通過(guò)比較發(fā)色底物(chromophoricsubstrate)H-Gln-AMC、H-Gln-βNA和H-Gln-Tyr-OH與二肽底物的反應(yīng)性所顯示，對(duì)于在第二位置具有較大疏水性殘基的兩種酶底物最為有效。對(duì)于木瓜QC，該發(fā)現(xiàn)與早期發(fā)現(xiàn)的特異性與第二氨基酸殘基的尺寸有關(guān)的結(jié)果(Gololobov，M.Y.等，1996BiolChemHoppeSeyler377，395-398)相一致。僅在H-Gln-OtBu上觀察到植物和動(dòng)物特異性的顯著差別。盡管該酯被木瓜QC以與二肽底物相比相似的特異性所轉(zhuǎn)化，但該轉(zhuǎn)化約比由人QC進(jìn)行的轉(zhuǎn)化慢一個(gè)數(shù)量級(jí)。寡肽除個(gè)別二肽和三肽以外，還測(cè)試了許多寡肽被木瓜和人QC的轉(zhuǎn)化(表5)。有趣的是，對(duì)于一系列的四肽，人和木瓜QC兩者間特異性的總體差異沒(méi)有象在二肽和三肽底物上所觀測(cè)到的那么大。這顯示在第三和第四位的氨基酸仍影響尤其是人QC的動(dòng)力學(xué)行為。然而一個(gè)例外為，在結(jié)構(gòu)為H-Gln-Xaa-Tyr-Phe-NH2的一系列四肽中在第二氨基酸位置具有脯氨酸殘基的肽顯示kcat/KM值顯著減小(表5)。人QC特異性降低更為明顯，導(dǎo)致與木瓜QC相比kcat/KM值大約相差8倍。如通過(guò)比較H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2、H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2和H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2與其它四肽的特異性所顯示，具有荷正電的氨基酸C-端谷氨酰胺的底物的轉(zhuǎn)化中也觀測(cè)到人QC特異性的略微降低。顯然，特異性的降低主要由于較小的轉(zhuǎn)化數(shù)。植物酶中不存在這種作用。表5人和木瓜QC的肽底物的動(dòng)力學(xué)評(píng)估(n.r.，非反應(yīng)性；n.i.，無(wú)抑制；n.d.未測(cè)定；*，底物的抑制)由四肽得到的結(jié)果也產(chǎn)生另一種結(jié)論。正如已指出的，木瓜QC對(duì)二肽顯示出較高的選擇性。然而，對(duì)于在第二氨基酸位置含有谷氨酸的一系列肽，如以表5中數(shù)據(jù)作圖得到的圖4所示，觀測(cè)到人QC對(duì)于一些四肽具有較高的專一性常數(shù)。此外，與以木瓜QC得到的結(jié)果不同，隨著鏈長(zhǎng)從二肽增加到四肽，人QC的選擇性增加。另外，記錄到人QC對(duì)于在第三和第四氨基酸位置含有大體積(bulk)疏水性殘基的肽具有最高選擇性，提示與該酶具有疏水性相互作用。通過(guò)比較各個(gè)肽的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，變化似乎主要由KM值降低引起，而發(fā)現(xiàn)肽轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化數(shù)相似。因此，認(rèn)為人QC對(duì)較長(zhǎng)肽的較高選擇性是更為疏水的底物與該酶結(jié)合更緊密的結(jié)果。通過(guò)比較酶對(duì)H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2和H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2或H-Gln-Gln-OH和H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH的專一性常數(shù)，對(duì)在3rd位和4th位含疏水性氨基酸的肽所觀測(cè)到的人和植物QC之間的差異也變得明顯。還發(fā)現(xiàn)對(duì)于含有N-端Gln和數(shù)量增加的C-端Ala殘基的同源底物，人QC具有更大的選擇性(表6)。盡管人QC的選擇性隨底物長(zhǎng)度增加而增大，但木瓜QC沒(méi)有這樣的趨勢(shì)。因?yàn)槿薗C對(duì)序列中含有Ser殘基的肽具有較小的特異性，因此側(cè)鏈的種類似乎也很重要(表6)。表6底物長(zhǎng)度對(duì)人和木瓜QC活性的影響離子強(qiáng)度對(duì)催化作用的影響所研究的有關(guān)對(duì)底物特異性產(chǎn)生影響的另一個(gè)參數(shù)為離子強(qiáng)度。出于該目的，在含和不含0.5MKCl的條件下測(cè)定了幾種底物環(huán)化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表7)。令人驚奇的是，就來(lái)自木瓜膠乳的QC和人的QC而言加入鹽不能明顯改變具有不荷電的主鏈的底物的選擇性。然而人QC對(duì)H-Gln-Ala-OH和H-Gln-Glu-OH的專一性常數(shù)隨著KCl的加入而減小。正如個(gè)別的動(dòng)力學(xué)參數(shù)所顯示，這種作用是由于KM的增加和kcat值的略微減少所引起。就木瓜QC而言，對(duì)所測(cè)的任一參數(shù)都沒(méi)有影響。該作用似乎同樣不是由于荷負(fù)電的底物所引起，因?yàn)閷?duì)于荷負(fù)電的肽H-Gln-Glu-Asp-Leu-NH2未發(fā)現(xiàn)參數(shù)發(fā)生變化。在荷正電的底物H-Gln-Arg-Gly-Ile-NH2和H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2中發(fā)現(xiàn)鹽的加入可產(chǎn)生有趣的影響。就植物和人QC而言，所測(cè)定的對(duì)催化作用的正影響主要是因較小的KM值和略微升高的轉(zhuǎn)化數(shù)引起的。表7離子強(qiáng)度對(duì)人和木瓜QC的催化作用的影響生理學(xué)底物在早期的研究中，對(duì)于來(lái)自牛和豬垂體的QC已發(fā)現(xiàn)通過(guò)QC進(jìn)行的[Gln1]-TRH和[Gln1]-GnRH的轉(zhuǎn)化(Busby，W.H.J.等，1987JBiolChem262，8532-8536；Fischer，W.H.和Spiess，J.1987ProcNatlAcadSciUSA84，3628-3632)。除已研究的垂體激素以外，合成了三種可能的人QC的生理學(xué)底物，即[Gln1]胃泌素、[Gln1]神經(jīng)降壓肽和[Gln1]FPP，并測(cè)試其轉(zhuǎn)化。它們轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)在表1中列出。有趣的是，谷氨酰胺?；谋晦D(zhuǎn)化為根據(jù)其尺寸專一性常數(shù)增加的各自的焦谷氨酰肽，即首先為最大的具有17個(gè)氨基酸的前胃泌素(pro-gastrin)，接著為前神經(jīng)降壓肽(pro-neurotensin)、pro-GnRH、pro-TRH和pro-FPP。這些發(fā)現(xiàn)與由合成肽得到的數(shù)據(jù)一致。出人意料地，較長(zhǎng)的底物也通過(guò)植物酶以較高的選擇性進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該結(jié)果是與由較短的寡肽得到的結(jié)果部分相反。在底物和遠(yuǎn)離作用位點(diǎn)的酶之間存在次級(jí)結(jié)合相互作用(secondarybindinginteraction)。含經(jīng)修飾的氨基酸的肽為了進(jìn)一步研究QC的特異性和選擇性，合成了在第二位含經(jīng)修飾的N端谷氨酰胺?；鶜埢蚪?jīng)修飾的氨基酸的肽。利用MALDI-TOF質(zhì)譜來(lái)定性地研究這些肽的轉(zhuǎn)化(仍參見(jiàn)實(shí)施例3)。由于谷氨酰胺酰基殘基或其類似物的環(huán)化，分別探測(cè)到底物和催化產(chǎn)物的質(zhì)量的差別。在每摩爾底物釋放一摩爾的氨氣的情況下，使用分光光度分析也定量地分析該轉(zhuǎn)化。H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2。將該N端成支鏈的在N端含有兩個(gè)谷氨酰胺?；鶜埢c賴氨酰殘基通過(guò)肽-和部分異肽鍵結(jié)合的肽用人(圖5)和木瓜QC(沒(méi)有顯示)以表觀(apparently)相同的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如一致的底物轉(zhuǎn)化所顯示，兩種谷氨酰胺?；鶜埢D(zhuǎn)化為焦谷氨酸，對(duì)于不同的殘基無(wú)任何可探測(cè)的優(yōu)先性(圖5)。因此對(duì)于不同地結(jié)合的谷氨酰胺?；鶜埢鶃?lái)說(shuō)QC的選擇性沒(méi)有根本的不同。H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2。甲基化的谷氨酰胺酰基殘基只被木瓜QC轉(zhuǎn)化為焦谷氨酰殘基(圖6)。另外，未監(jiān)測(cè)到人QC被肽抑制，這顯示甲基化的殘基不能被人QC識(shí)別。H-Glu(OMe)-βNA和H-Glu-βNA。這些化合物都不能被木瓜或人QC轉(zhuǎn)化。利用焦谷氨酰氨肽酶作為輔助酶對(duì)這些熒光底物進(jìn)行熒光分析。然而，O-甲基化的谷氨酸殘基在Tris和Tricine緩沖液中表現(xiàn)出顯著的不穩(wěn)定性，傾向于非酶催化的環(huán)化作用。并且，兩種QC作為底物對(duì)H-Gln-AMC的活性不被較長(zhǎng)的肽H-Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2或H-Glu-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2抑制，這顯示兩種QC形式不能識(shí)別谷氨酸或衍生物。結(jié)果還提示肽自作用部位被排斥的原因不僅僅是谷氨酸殘基的負(fù)電荷。H-Gln-環(huán)(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)。對(duì)含分子內(nèi)部分異肽鍵的H-Gln-環(huán)(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行定量分析，揭示對(duì)于人和木瓜QC的KM值分別為240±14μM和133±5μM。由于與人QC(22.8±0.6s-1)相比，木瓜QC(49.4±0.6s-1)催化的轉(zhuǎn)化具有較高的轉(zhuǎn)化數(shù)，因此植物酶具有372±9mM-1min-1的高于人QC幾乎4倍的kcat/KM值。因此，就木瓜QC而言，與具有小尺寸的底物如H-Gln-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-NH2相比，專一性常數(shù)僅稍小。然而，發(fā)現(xiàn)人QC的kcat/KM值為95±3mM-1min-1，與小尺寸的底物相比較約小一個(gè)數(shù)量級(jí)(表5)。H-β高Gln-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2。分別通過(guò)人和木瓜QC的催化作用將N-端β-高谷氨酰胺?；鶜埢D(zhuǎn)化為五元內(nèi)酰胺環(huán)。通過(guò)之前所述的分光光度法及MALDI-tof分析所伴隨的氮?dú)忉尫?。?dāng)不加入QC或QC被煮沸時(shí)未檢測(cè)到氨氣的釋放，這表明環(huán)化的特異催化作用。有趣的是，來(lái)自番木瓜(KM＝3.1±0.3mM，kcat＝4.0±0.4S-1)和人(KM＝2.5±0.2mM，kcat＝3.5±0.1S-1)的QC催化該肽的轉(zhuǎn)化具有幾乎一致的kcat/KM值，分別為1.4±0.1和1.3±0.1mM-1s-1。因而與相似尺寸的在N端含谷氨酰胺?；鶜埢碾南啾?，β-高谷氨酰胺殘基被催化的效率大約小1000倍。這顯示底物α-碳的構(gòu)造對(duì)于底物被QC形式識(shí)別很重要，但不是必需的。在環(huán)化的長(zhǎng)度和傾斜角度上，作為底物的基本要求為傾向于環(huán)化的γ-酰胺基和未質(zhì)子化的N端氨基基團(tuán)，N-端谷氨酰胺?；挺?高谷氨酰胺酰基殘基可以滿足這一要求。實(shí)施例6QC底物的合成寡肽。按照先前所述(Schilling，S.等，2002Biochemistry41，10849-10857)使用肽合成儀(LabortecSP650，Bachem，Switzerland)以0.5mmol的規(guī)模半自動(dòng)化合成肽。較長(zhǎng)的肽按照記載(Manhart，S.等，2003Biochemistry42，3081-3088)使用自動(dòng)化Symphony肽合成儀以25μmol的規(guī)模進(jìn)行合成。所有的肽偶聯(lián)應(yīng)用改良的固相肽合成的Fmoc方案，使用2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲(uronium)(TBTU；Novabiochem)/堿(二異丙基乙胺或N-甲基-嗎啉；Merck)，或者較難的偶聯(lián)使用N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3，-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亞甲基]-N-甲基甲烷銨六氟磷酸鹽N-氧化物(4、5)(HATU；AppliedBiosystems)/二異丙基乙胺作為活化試劑。在用含有混合物(cocktail)的三氟乙酸(TFA；Merck)從樹(shù)脂上斷裂后，粗肽用制備HPLC使用無(wú)酸溶劑系統(tǒng)進(jìn)行純化以防止N-端谷氨酰胺的進(jìn)一步環(huán)化。制備HPLC通過(guò)250-21LunaRP18柱(Phenomenex)以乙腈(Merch)/水線性梯度(在40min內(nèi)乙腈5-40％或65％)實(shí)施。應(yīng)用分析HPLC和ESI-MS確認(rèn)肽的純度并鑒定。Glu(NH-NH2)-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc-操作(Schilling，S.等，2002Biochemistry41，10849-10857)在RinkamideMBHA樹(shù)脂(Novabiochem)上合成線性肽前體(Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-NH2)。Fmoc-保護(hù)的肽從樹(shù)脂上斷裂后，將該肽用乙醚(Merck)沉淀、過(guò)濾、干燥。在二氯甲烷(DCM，Merck)中應(yīng)用HMBA-AM樹(shù)脂(1.16mmol/g，Novabiochem)進(jìn)行前體肽(3當(dāng)量)的谷氨酸的γ-羧酸基團(tuán)的偶聯(lián)。二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，Serva)(4當(dāng)量)和二甲氨基吡啶(DMAP，Aldrich)(0.1當(dāng)量)用作偶聯(lián)劑。12小時(shí)后過(guò)濾樹(shù)脂，用DCM沖洗，重復(fù)該反應(yīng)。用20％的哌啶DMF溶液(3×5min)將N端Fmoc基團(tuán)去保護(hù)之后，將肽樹(shù)脂用5％的肼溶液(20ml/g)處理1.5小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾、用二甲基甲酰胺(DMF，Roth，Germany)和TFA洗滌。蒸發(fā)后，將粗肽用乙醚沉淀，收率為76％。H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc/tBu操作在RinkamideMBHA(Schilling，S.等，2002Biochemistry41，10849-10857)上使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH作為倒數(shù)第二個(gè)氨基酸偶聯(lián)來(lái)合成線性肽。用20％的哌啶(Merck)的DMF溶液將賴氨酸的兩個(gè)氨基保護(hù)基去保護(hù)之后，4當(dāng)量的Fmoc-Gln(Trt)-OH得以偶聯(lián)。標(biāo)準(zhǔn)的斷裂操作得到95％的收率。H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2。從裝在Fmoc-MI-AM(Novabiochem)樹(shù)脂上的Fmoc-Glu-OtBu起始合成Fmoc-Gln(NMe)-OH。用DCM溶脹后，用DMF洗滌樹(shù)脂(0.5g)、用20％哌啶的DMF溶液脫保護(hù)。將樹(shù)脂倒入5mlDMF中，隨后加入5當(dāng)量Fmoc-Glu-OtBu、5當(dāng)量HATU和10當(dāng)量DIPEA，振搖6小時(shí)。過(guò)濾、洗滌后，以標(biāo)準(zhǔn)的TFA斷裂條件來(lái)斷裂產(chǎn)品。根據(jù)記載(Schilling，S.等，2002Biochemistry41，10849-10857)合成肽H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2。Fmoc-Gln(NMe)-OH與HATU/DIPEA偶聯(lián)過(guò)夜。標(biāo)準(zhǔn)的斷裂操作得到78％的肽粗品。H-Glu(OMe)-β-萘胺、H-Gln-Val-OH、H-Gln-Tyr-OH。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的混合酸酐操作使用氯甲酸異丁酯(Merck)合成Boc-保護(hù)的二肽。通過(guò)1NNaOH的二氧六環(huán)溶液將C-端甲基酯Boc-Gln-Tyr-OMe和Boc-Gln-Val-OMe進(jìn)行皂化。使用HCl/二氧六環(huán)溶液使Boc-保護(hù)的肽脫保護(hù)10分鐘。蒸發(fā)后將殘余物用幾種溶劑重結(jié)晶得到60-70％的固體化合物。H-Gln-環(huán)(Nε-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe)。在酸敏感的2-氯三苯甲基樹(shù)脂上合成線性前體Boc-Gln(Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe-OH。使用標(biāo)準(zhǔn)的利用Fmoc-Lys(Mtt)-OH的Fmoc/Bu-方案進(jìn)行偶聯(lián)。在DCM(10次5min)中用3％的TFA溶液斷裂以后，將該溶液在甲醇中(MeOH；Merck)用10％的吡啶(Merck)中和，用DCM和MeOH洗3次，濃縮至體積的5％、粗肽用冰水沉淀。接著使用DCC/N-羥基苯并三唑(HOBt；Aldrich)活化來(lái)環(huán)化粗肽。將粗肽溶于無(wú)水二氯甲烷中(0.2mmol/50ml)中，加入0.2mmolN-甲基嗎啉和0.4mmol1-羥基苯并三唑。在0℃將將該溶液滴加進(jìn)0.4mmol二環(huán)己基碳二亞胺的250ml二氯甲烷溶液中。在室溫下攪拌過(guò)夜來(lái)完成該反應(yīng)。將N，N′-二環(huán)己基脲過(guò)濾后，蒸除溶劑。將殘余物溶于乙酸乙酯中，并用1NHCl、NaHCO3飽和溶液及水洗若干次。將該溶液用無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾、在真空下蒸干。實(shí)施例7QC效應(yīng)物的特征咪唑衍生物測(cè)試作為QC抑制劑的在5元環(huán)的不同位置含取代基的咪唑及苯并咪唑衍生物(表3)。按照咪唑環(huán)編號(hào)。在實(shí)施例2中記載了所應(yīng)用的方法。C-4(5)和C-4，5衍生物。在咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)等效的4-或5-位或兩個(gè)位置均帶有取代基的化合物顯示出對(duì)人QC抑制的明顯減少。然而唯一的例外為已證明為最有效的抑制化合物之一的N-ω-乙酰化的組胺。正如5-羥甲基-4-甲基-咪唑具有與咪唑類似的抑制常數(shù)所顯示，在這些位置的小取代基對(duì)結(jié)合僅有微弱的作用。連接到這些位點(diǎn)上的大基團(tuán)或更龐大的基團(tuán)會(huì)減弱或破壞酶對(duì)化合物的結(jié)合。已知所測(cè)試的某些其它取代基發(fā)揮能夠降低咪唑環(huán)的電子云密度的負(fù)誘導(dǎo)效應(yīng)或中介效應(yīng)，這也促成了較低的結(jié)合常數(shù)。L-組氨酸和組氨酰胺Ki值的差異也表明了一定的電荷對(duì)結(jié)合的影響。荷電底物的靜電排斥的證據(jù)在底物特異性研究中已顯示，即谷氨酰胺(glutaminamide)容易被人QC轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而以游離谷氨酸作為底物未觀察到任何活性。C-2衍生物。所測(cè)試的所有衍生物都比咪唑更微弱地抑制QC。比質(zhì)子更大的任何取代基都能抑制正常的QC結(jié)合。僅僅由于2-甲基-苯并咪唑的甲基，抑制常數(shù)就下降約一個(gè)數(shù)量級(jí)。比較苯并咪唑和2-氨基-苯并咪唑的Ki值可發(fā)現(xiàn)非常類似的關(guān)系。此外，該結(jié)果表明這種作用與電性變化(electronicalteration)無(wú)關(guān)。N-1衍生物。在測(cè)試對(duì)人QC的抑制作用的咪唑衍生物中，發(fā)現(xiàn)與咪唑相比能提高Ki值的大多數(shù)化合物在一個(gè)氮原子上有變化。這些化合物也包括最有效的QC抑制劑之一，1-芐基咪唑。有趣的是，僅僅對(duì)該結(jié)構(gòu)的微小變化都能導(dǎo)致抑制性質(zhì)的喪失，如在1-苯甲酰咪唑和苯基咪唑中所見(jiàn)，它們?cè)趯?shí)驗(yàn)條件下無(wú)活性。同樣在這種情況下，所觀測(cè)的變化似乎并不僅僅是由于苯基的負(fù)中介效應(yīng)(negativemesomericeffect)導(dǎo)致咪唑環(huán)的電子密度降低所引起，因?yàn)辇嫶蟮娘@示正誘導(dǎo)效應(yīng)的三甲基甲硅烷基與其它基團(tuán)相比同樣表現(xiàn)出較低的結(jié)合。有趣的是，該組中活性較弱的化合物之一為1-氨基丙基-咪唑。既然立體地(sterically)類似的化合物1-甲基咪唑和1-乙烯基咪唑改善了與活性部位的結(jié)合，那么該化合物的功效微弱則是因堿性氨基所引起。因此，荷正電的氨基說(shuō)明了Ki值較小的問(wèn)題，通過(guò)比較N-ω-乙?；慕M胺(表3)與組胺(表4)的Ki值確證了這一結(jié)果。3，4和4，5衍生化的作用。在4(5)位或兩者皆含取代基的咪唑衍生物與酶結(jié)合的效力有限。通過(guò)比較L-組胺以及組胺生物降解中的兩種中間體3-甲基-4-組胺和3-甲基-5-組胺的抑制常數(shù)可確定特定取代基的作用(表4)。已發(fā)現(xiàn)L-組胺的Ki值與其乙?；膶?duì)應(yīng)物相比要小約一個(gè)數(shù)量級(jí)。就3-甲基-4-組胺而言，一個(gè)氮原子的甲基化可使功效顯著提高。然而，生成3-甲基-5-組胺的甲基化可導(dǎo)致抑制活性的完全喪失。因此，所觀測(cè)的結(jié)果似乎主要是由于與堿性氮鄰接的碳的衍生化導(dǎo)致的結(jié)合空間位阻所引起。據(jù)推測(cè)，該堿性氮在與酶結(jié)合中起關(guān)鍵的作用。實(shí)施例8Aβ3-40/42衍生物的生成該測(cè)定是采用Aβ3-40/42的兩種短的N-末端肽序列，在3位包含谷氨酰胺而不是谷氨酸殘基的[Gln3]-Aβ1-11(序列DAQFRHDSGYE)以及[Gln3]Aβ3-11實(shí)施。采用MALDL-TOF質(zhì)譜法來(lái)測(cè)試DPIV對(duì)兩種肽的切割作用和QC對(duì)這兩種肽的N-末端谷氨酰胺殘基的環(huán)化作用。使用純化的DPIV(豬腎)或豬垂體勻漿的粗品作為QC的來(lái)源實(shí)施測(cè)定，并測(cè)定兩種酶的連續(xù)催化。結(jié)果1、通過(guò)DPIV催化的由[Gln3]-Aβ1-11a至[Gln3]Aβ3-11a的生成以及DPIV抑制劑Val-吡咯烷酰胺(Val-Pyrr)對(duì)其的抑制DPIV及DPIV樣活性切割[Gln3]-Aβ1-11a生成[Gln3]-Aβ3-11a(圖7)。第三位置的殘基因切割而暴露并因而可被其它酶，即QC修飾。正如所料，催化作用可被Val-Pyrr完全抑制(圖8)。2、垂體勻漿中的QC催化的由[Gln3]Aβ3-11a至[pGlu3]Aβ3-11a的生成以及1，10-二氮雜菲對(duì)其的抑制存在于豬垂體勻漿中的谷氨酰胺酰基環(huán)化酶催化[Gln3]Aβ3-11a轉(zhuǎn)化為[pGlu3]Aβ3-11a(圖9)。通過(guò)加入1，10-二氮雜菲可抑制[pGlu3]Aβ3-11a的生成。3、DPIV和QC的連續(xù)催化導(dǎo)致生成[pGlu3]Aβ3-11a以及Val-Pyrr和1，10-二氮雜菲對(duì)其的抑制在加入豬腎DPIV的豬垂體勻漿粗品中測(cè)定，發(fā)現(xiàn)由[Gln3]Aβ3-11a生成[pGlu3]Aβ3-11a發(fā)生在DPIV和QC的連續(xù)催化之后(圖11)。當(dāng)加入QC抑制劑1，10-二氮雜菲(圖12)或DPIV抑制劑Val-Pyrr(圖13)時(shí)，不生成[pGlu3]Aβ3-11a。如同樣由[Gln3]Aβ2-11a的生成所示，出現(xiàn)的少量[pGlu3]Aβ3-11a是因?yàn)榘彪拿盖懈钜约半S后的谷氨酰胺環(huán)化。4、粗垂體勻漿中由氨肽酶催化的[pGlu3]Aβ3-11a的生成由于[pGlu3]Aβ3-11a的生成不依賴于DPIV的催化，因此在原生的垂體勻漿中不加入DPIV而研究[Gln3]Aβ1-11a的降解(圖14)。正如根據(jù)第4節(jié)的數(shù)據(jù)所預(yù)料，觀察到[pGlu3]Aβ3-11a的生成。該數(shù)據(jù)表明[Gln3]Aβ1-11a的降解同樣可被氨肽酶催化，從而形成[pGlu3]Aβ3-11a。因此，該結(jié)果表明焦谷氨酰(pyroglutamyl)的形成是該組織中N-末端肽降解的終點(diǎn)，進(jìn)一步支持了QC在斑塊形成中的作用。實(shí)施例9重組人QC對(duì)[Gln3]Aβ3-11a、3-21a以及3-40的轉(zhuǎn)化所有所測(cè)試的[Gln3]Aβ衍生肽都被人QC高效地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的焦谷氨酰形式(表8)。由于[Gln3]Aβ3-21a和[Gln3]Aβ3-40在水溶液中的低溶解度，在1％DMSO存在下進(jìn)行該測(cè)定。然而，由于[Gln3]Aβ3-11a具有較好的溶解度，因此允許在存在或不存在DMSO時(shí)對(duì)QC-催化轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析(表8)。放在一起考慮，對(duì)作為QC底物的鏈長(zhǎng)為8、18及37個(gè)氨基酸的Aβ肽的研究(參見(jiàn)表8)證實(shí)了人QC活性隨著底物長(zhǎng)度而增強(qiáng)的發(fā)現(xiàn)。因此，考慮到專一性常數(shù)，Gln1-胃泌素、Gln1-神經(jīng)降壓肽、Gln1-GnRH都屬于最好的QC-底物。類似地，迄今研究的最大的QC底物[Gln3]Aβ-40以及胰高血糖素，即使在1％DMSO存在下也顯示出高的二級(jí)速率常數(shù)(分別為449mM-1s-1和526mM-1s-1)(表8)。有趣的是，所研究的淀粉樣多肽轉(zhuǎn)化的動(dòng)力學(xué)參數(shù)并不隨著尺寸的增加而顯著改變，表明僅Aβ的C-末端部分對(duì)QC催化具有中等程度的作用。因此，由于具有較好的溶解度和實(shí)驗(yàn)操作性，對(duì)涉及這些肽的N-末端氨肽酶加工的進(jìn)一步研究是通過(guò)使用Aβ的更小的片斷[Gln3]Aβ1-11a、[Gln3]Aβ3-11a以及Aβ3-11a實(shí)施。表8在含有1％DMSO的緩沖液中重組人QC轉(zhuǎn)化含有N-末端Gln的肽的動(dòng)力學(xué)參數(shù)#在DMSO存在下測(cè)定實(shí)施例10重組人QC對(duì)Aβ3-11a和Aβ3-21a的轉(zhuǎn)化在QC存在下對(duì)Aβ3-11a和Aβ3-21a的溫育表明，與先前的研究不同，含谷氨酸的肽也能用作QC-底物(圖15C和D)。分別在pH5.2和6.5的條件下研究QC催化的[pGlu3]Aβ3-11a和[pGlu3]Aβ3-21a的生成。如果在加入QC開(kāi)始試驗(yàn)之前向溶液中加入QC-抑制劑苯并咪唑，則底物生成[pGlu3]Aβ3-11a或[pGlu3]Aβ3-21a的轉(zhuǎn)化受到抑制(圖15E和F)。如果QC在加入之前煮沸，則pGlu-肽的生成可忽略不計(jì)(圖15A和B)。實(shí)施例11木瓜QC-催化的Gln-βNA和Glu-βNA的環(huán)化作用的pH-依賴性根據(jù)Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)木瓜QC在最高2mM(受底物溶解度的限制)的濃度范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化Glu-βNA(圖16)。檢視研究pH6.1-8.5之間的QC-催化的Glu-βNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化對(duì)底物濃度的圖表，發(fā)現(xiàn)Glu-底物的兩個(gè)參數(shù)KM和Kcat都是以pH依賴性的方式改變(圖16)。這與之前記載的QC-催化的谷氨酸酯環(huán)化不同，其中在所給的pH范圍內(nèi)僅觀察到KM發(fā)生變化(Gololobov，M.Y.，Song，I.，Wang，W.，和Bateman，R.C.(1994)ArchBiochemBiophys309，300-307)。隨后，為研究Glu-和Gln-環(huán)化期間質(zhì)子濃度的影響，在一級(jí)速率定律條件下(即底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于KM值)研究了Glu-βNA和Gln-βNA環(huán)化作用的pH依賴性(圖17)。與最佳pH為pH6.0的谷氨酸環(huán)化相比，谷氨酰胺環(huán)化的最佳pH為pH8.0。盡管在各自最佳pH下的專一性常數(shù)相差約80,000倍，但在pH6.0左右QC對(duì)EC活性的比例僅僅約為8,000。對(duì)pH6.0時(shí)無(wú)酶催化的由Gln-βNA至pGlu生成的研究持續(xù)4周，并發(fā)現(xiàn)一級(jí)速率常數(shù)為1.2×10-7s-1。然而，在同一時(shí)期內(nèi)，并沒(méi)有pGlu-βNA自Glu-βNA生成，從而可估計(jì)對(duì)轉(zhuǎn)化的限制性速率常數(shù)為1.0×10-9s-1。實(shí)施例12酶滅活/再活化過(guò)程將人QC的等分試樣以3000倍過(guò)量的5mM1，10-二氮雜菲或5mM二吡啶羧酸的pH6.8的0.05MBis-Tris/HCI溶液透析過(guò)夜進(jìn)行滅活。隨后，通過(guò)以包含1mMEDTA的pH6.8的0.05MBis-Tris/HCI對(duì)樣品進(jìn)行透析(3周期，2000倍過(guò)量)，從而將滅活劑小心移除。在室溫下使用Zn++、Mn++、Ni++、Ca++、K+和Co++離子在濃度為1.0、0.5、0.25mM的包含0.5mMEDTA的pH6.8的0.025MBis-Tris溶液中進(jìn)行再活化試驗(yàn)15分鐘。為避免因緩沖溶液中存在的痕量金屬離子引起迅速再活化，QC活性試驗(yàn)是在包含2mMEDTA的pH8.0的0.05MTris/HCI溶液中進(jìn)行。通過(guò)1，10-二氮雜菲抑制豬QC已有記載(Busby，W.H.J.等.1987JBiolChem262，8532-8536，Bateman，R.C.J.等.2001Biochemistry40)。然而，已發(fā)現(xiàn)EDTA對(duì)QC催化具有活化作用的事實(shí)表明被二氮雜菲的抑制并不是由于金屬螯合作用導(dǎo)致(Busby，W.H.J.等，1987JBiolChem262，8532-8536，Bateman，R.C.J.等，2001Biochemistry40)。同樣，除了受1，10-二氮雜菲抑制外，人QC催化的底物環(huán)化作用在其它金屬酶抑制劑二吡啶羧酸和8-羥基喹啉存在下被徹底革除。這些螯合劑以競(jìng)爭(zhēng)性和時(shí)間依賴性的方式抑制QC，即發(fā)現(xiàn)以這些化合物延長(zhǎng)溫育之后已競(jìng)爭(zhēng)性地抑制的最初活性會(huì)進(jìn)一步降低(圖18、19)。有趣的是，無(wú)論溫育時(shí)間多長(zhǎng)或在任何條件下EDTA都不顯示顯著的抑制作用。在以5mM1，10-二氮雜菲或5mM二吡啶羧酸徹底透析之后，人QC幾乎完全失活。在以不含螯合劑的緩沖溶液反復(fù)整夜透析之后，QC活性部分再活化至50-60％。然而，當(dāng)以含1mMEDTA的緩沖溶液透析時(shí)，觀測(cè)不到再活化。通過(guò)以0.5mMZnSO4在0.5mMEDTA存在下溫育蛋白質(zhì)10分鐘，可在被二吡啶羧酸或1，10-二氮雜菲滅活之后幾乎完全恢復(fù)QC活性(圖20)。類似地，使用Co++和Mn++離子再活化可使QC活性部分恢復(fù)。即使在0.25mMZn++存在下，其活性也可能恢復(fù)到初始活性的25％。當(dāng)應(yīng)用Ni++、Ca++或K+離子時(shí)未觀察到再活化作用。類似地，以這些離子溫育活性完全的QC對(duì)酶活性無(wú)任何影響。序列表<110>前體生物藥物股份公司<120>谷氨酰胺酰基和谷氨酸環(huán)化酶效應(yīng)物的應(yīng)用<130>14981<140>PCT/EP2004/004778<141>2004-05-05<150>US60/468,043<151>2003-05-05<150>US60/468,014<151>2003-05-05<150>US60/512,038<151>2003-10-15<160>28<170>PatentInversion3.1<210>1<211>42<212>PRT<213>Homosapiens<400>1AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIle202530GlyLeuMetValGlyGlyValValIleAla3540<210>2<211>40<212>PRT<213>Homosapiens<400>2AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLys151015LeuValPhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIle202530GlyLeuMetValGlyGlyValVal3540<210>3<211>40<212>PRT<213>Homosapiens<400>3GluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal151015PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu202530MetValGlyGlyValValIleAla3540<210>4<211>38<212>PRT<213>Homosapiens<400>4GluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal151015PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu202530MetValGlyGlyValVal35<210>5<211>11<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(11)..(11)<223>AMIDATION<400>5AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGlu1510<210>6<211>9<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(9)..(9)<223>AMIDATION<400>6GluPheArgHisAspSerGlyTyrGlu15<210>7<211>21<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(21)..(21)<223>AMIDATION<400>7AspAlaGluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLys151015LeuValPhePheAla20<210>8<211>19<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(19)..(19)<223>AMIDATION<400>8GluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal151015PhePheAla<210>9<211>38<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<400>9GlnPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal151015PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu202530MetValG1yGlyValVal35<210>10<211>19<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(19)..(19)<223>AMIDATION<400>10GlnPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal151015PhePheAla<210>11<211>11<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(11)..(11)<223>AMIDATION<400>11AspAlaGlnPheArgHisAspSerGlyTyrGlu1510<210>12<211>9<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<220><221>MOD_RES<222>(9)..(9)<223>AMIDATION<400>12GlnPheArgHisAspSerGlyTyrGlu15<210>13<211>32<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>13GluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer151015AsnLysGlyAlaIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValValIleAla202530<210>14<211>30<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>14GluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer151015AsnLysGlyAlaIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValVal202530<210>15<211>33<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>15GluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer151015AsnLysGlyAlaIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValValIleAla202530Thr<210>16<211>31<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<400>16GluValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGluAspValGlySer151015AsnLysGlyAlaIleIleGlyLeuMetValGlyGlyValValIle202530<210>17<211>39<212>PRT<213>Artificialsequence<220><223>Syntheticpeptide<400>17GluPheArgHisAspSerGlyTyrGluValHisHisGlnLysLeuVal151015PhePheAlaGluAspValGlySerAsnLysGlyAlaIleIleGlyLeu202530MetValGlyGlyValValIle35<210>18<211>17<212>PRT<213>Homosapiens<220><221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>AMIDATION<400>18GlnGlyProTrpLeuGluGluGluGluGluAlaTyrGlyTrpMetAsp151015Phe<210>19<211>13<212>PRT<213>Homosapiens<400>19GlnLeuTyrGluAsnLysProArgArgProTyrIleLeu1510<210>20<211>10<212>PRT<213>Homosapiens<220><221>MOD_RES<222>(10)..(10)<223>AMIDATION<400>20GlnHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGly1510<210>21<211>97<212>PRT<213>Homosapiens<400>21GlnProLysValProGluTrpValAsnThrProSerThrCysCysLeu151015LysTyrTyrGluLysValLeuProArgArgLeuValValGlyTyrArg202530LysAlaLeuAsnCysHisLeuProAlaIleIlePheValThrLysArg354045AsnArgGluValCysThrAsnProAsnAspAspTrpValGlnGluTyr505560IleLysAspProAsnLeuProLeuLeuProThrArgAsnLeuSerThr65707580ValLysIleIleThrAlaLysAsnGlyGlnProGlnLeuLeuAsnSer859095Gln<210>22<211>76<212>PRT<213>Homosapiens<400>22GlnProAspSerValSerIleProIleThrCysCysPheAsnValIle151015AsnArgLysIleProIleGlnArgLeuGluSerTyrThrArgIleThr202530AsnIleGlnCysProLysGluAlaValIlePheLysThrLysArgGly354045LysGluValCysAlaAspProLysGluArgTrpValArgAspSerMet505560LysHisLeuAspGlnIlePheGlnAsnLeuLysPro657075<210>23<211>76<212>PRT<213>Homosapiens<400>23GlnProAspAlaIleAsnAlaProValThrCysCysTyrAsnPheThr151015AsnArgLysIleSerValGlnArgLeuAlaSerTyrArgArgIleThr202530SerSerLysCysProLysGluAlaValIlePheLysThrIleValAla354045LysGluIleCysAlaAspProLysGlnLysTrpValGlnAspSerMet505560AspHisLeuAspLysGlnThrGlnThrProLysThr657075<210>24<211>68<212>PRT<213>Homosapiens<400>24GlnValGlyThrAsnLysGluLeuCysCysLeuValTyrThrSerTrp151015GlnIleProGlnLysPheIleValAspTyrSerGluThrSerProGln202530CysProLysProGlyValIleLeuLeuThrLysArgGlyArgGlnIle354045CysAlaAspProAsnLysLysTrpValGlnLysTyrIleSerAspLeu505560LysLeuAsnAla65<210>25<211>373<212>PRT<213>Homosapiens<400>25GlnHisHisGlyValThrLysCysAsnIleThrCysSerLysMetThr151015SerLysIleProValAlaLeuLeuIleHisTyrGlnGlnAsnGlnAla202530SerCysGlyLysArgAlaIleIleLeuGluThrArgGlnHisArgLeu354045PheCysAlaAspProLysGluGlnTrpValLysAspAlaMetGlnHis505560LeuAspArgGlnAlaAlaAlaLeuThrArgAsnGlyGlyThrPheGlu65707580LysGlnIleGlyGluValLysProArgThrThrProAlaAlaGlyGly859095MetAspGluSerValValLeuGluProGluAlaThrGlyGluSerSer100105110SerLeuGluProThrProSerSerGlnGluAlaGlnArgAlaLeuGly115120125ThrSerProGluLeuProThrGlyValThrGlySerSerGlyThrArg130135140LeuProProThrProLysAlaGlnAspGlyGlyProValGlyThrGlu145150155160LeuPheArgValProProValSerThrAlaAlaThrTrpGlnSerSer165170175AlaProHisGlnProGlyProSerLeuTrpAlaGluAlaLysThrSer180185190GluAlaProSerThrGlnAspProSerThrGlnAlaSerThrAlaSer195200205SerProAlaProGluGluAsnAlaProSerGluGlyGlnArgValTrp210215220GlyGlnGlyGlnSerProArgProGluAsnSerLeuGluArgGluGlu22523035240MetGlyProValProAlaHisThrAspAlaPheGlnAspTrpGlyPro245250255GlySerMetAlaHisValSerValValProValSerSerGluGlyThr260265270ProSerArgGluProValAlaSerGlySerTrpThrProLysAlaGlu275280285GluProIleHisAlaThrMetAspProGlnArgLeuGlyValLeuIle290295300ThrProValProAspAlaGlnAlaAlaThrArgArgGlnAlaValGly305310315320LeuLeuAlaPheLeuGlyLeuLeuPheCysLeuGlyValAlaMetPhe325330335ThrTyrGlnSerLeuGlnGlyCysProArgLysMetAlaGlyGluMet340345350AlaGluGlyLeuArgTyrIleProArgSerCysGlySerAsnSerTyr355360365ValLeuValProVal370<210>26<211>76<212>PRT<213>Homosapiens<400>26GlnProValGlyIleAsnThrSerThrThrCysCysTyrArgPheIle151015AsnLysLysIleProLysGlnArgLeuGluSerTyrArgArgThrThr202530SerSerHisCysProArgGluAlaValIlePheLysThrLysLeuAsp354045LysGluIleCysAlaAspProThrGlnLysTrpValGlnAspPheMet505560LysHisLeuAspLysLysThrGlnThrProLysLeu657075<210>27<211>33<212>PRT<213>Homosapiens<400>27GlnProLeuProAspCysCysArgGlnLysThrCysSerCysArgLeu151015TyrGluLeuLeuHisGlyAlaGlyAsnHisAlaAlaGlyIleLeuThr202530Leu<210>28<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>28ArgProLysProGlnGlnPhePheGlyLeuMet1510權(quán)利要求1.谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)效應(yīng)物在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物用于c)治療可通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)QC活性治療的哺乳動(dòng)物疾病和/或d)調(diào)節(jié)基于由QC活性調(diào)節(jié)引起的含pGlu肽的作用的生理過(guò)程。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于在至少一種選自以下組中的QC底物中改變N-末端谷氨酸或谷氨酰胺殘基向焦谷氨酸殘基的轉(zhuǎn)化，其中所述組組成如下Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]胃泌素(17和34)、[Gln1]神經(jīng)降壓肽、[Gln1]FPP、[Gln1]TRH、[Gln1]GnRH、[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18、[Gln1]ELA、[Gln1]分形素、[Gln1]胖素A、[Gln3]胰高血糖素3-29及[Gln5]物質(zhì)P5-11。3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于治療阿爾茨海默癥和唐氏綜合征。4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于調(diào)節(jié)和/或控制男性生育力。5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于治療選自以下組中的疾病，其中所述組組成如下伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌感染的潰瘍病和胃癌、致病性精神病、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、惡性轉(zhuǎn)移、黑素瘤、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附和遷移過(guò)程、食物攝取障礙、失眠、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙、激素平衡障礙以及體液調(diào)節(jié)障礙。6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于刺激胃腸道細(xì)胞優(yōu)選為胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖、急性酸分泌和產(chǎn)酸性壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的分化。7.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于抑制髓祖細(xì)胞的增殖。8.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其用于治療選自亨廷頓病和肯尼迪氏病的疾病。9.如以上任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中QC效應(yīng)物與DPIV或DPIV樣酶的抑制劑和/或氨肽酶抑制劑聯(lián)合給藥。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中DPIV樣酶生成H-isoAsp-Ala-OH的活性被阻斷。11.如權(quán)利要求9或10所述的應(yīng)用，其中該DPIV樣酶為DPII。12.一種用于非胃腸道、腸道或口服給藥的藥物組合物，其特征為其包含至少一種任選地與常規(guī)載體和/或賦形劑相結(jié)合的QC效應(yīng)物。13.一種用于非胃腸道、腸道或口服給藥的藥物組合物，其特征為其包含至少一種任選地與常規(guī)載體和/或賦形劑相結(jié)合并與至少一種DPIV或DPIV樣酶抑制劑和/或至少一種氨肽酶抑制劑相結(jié)合的QC效應(yīng)物。14.如權(quán)利要求12或13所述的藥物組合物的應(yīng)用，其用于在體內(nèi)調(diào)節(jié)QC和/或DPIV和DPIV樣酶和/或氨肽酶的活性。15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中DPIV樣酶生成H-isoAsp-Ala-OH的活性被阻斷。16.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中所述DPIV樣酶為DPII。17.如權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于在至少一種選自以下組中的QC底物中改變N-末端谷氨酸或谷氨酰胺殘基向焦谷氨酰(5-氧代-脯氨?；?殘基的轉(zhuǎn)化，其中所述組組成如下Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]胃泌素(17和34)、[Gln1]神經(jīng)降壓肽、[Gln1]FPP、[Gln1]TRH、[Gln1]GnRH、[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18、[Gln1]ELA、[Gln1]分形素、[Gln1]胖素A。18.如權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于治療阿爾茨海默癥和唐氏綜合征。19.如權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中通過(guò)給藥QC效應(yīng)物以調(diào)節(jié)男性生殖力。20.如權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于治療選自以下組中的疾病，所述組組成如下伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌感染的潰瘍病和胃癌、致病性精神病、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、惡性轉(zhuǎn)移、黑素瘤、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附和遷移過(guò)程、食物攝取障礙、失眠、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙、激素平衡障礙以及體液調(diào)節(jié)障礙。21.如權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于刺激胃腸道細(xì)胞優(yōu)選為胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖、急性酸分泌和產(chǎn)酸性壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的分化。22.如權(quán)利要求14至16任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其用于抑制髓祖細(xì)胞的增殖。23.一種鑒定和選擇QC效應(yīng)物的篩選方法，其包括以下步驟a)在允許其相結(jié)合的條件下使QC接觸所述化合物；b)加入QC底物；c)監(jiān)測(cè)底物轉(zhuǎn)化或任選地測(cè)定殘余的QC活性；以及d)計(jì)算底物轉(zhuǎn)化和/或QC酶活性的變化以鑒定QC的活性修飾效應(yīng)物。24.一種鑒定及選擇直接或間接與QC活性位點(diǎn)結(jié)合的金屬離子相互作用的效應(yīng)物的篩選方法，其包括以下步驟a)在允許其相結(jié)合的條件下使QC接觸所述化合物；b)加入QC的底物；c)監(jiān)測(cè)底物轉(zhuǎn)化或任選地測(cè)定殘余的QC活性；以及d)計(jì)算底物轉(zhuǎn)化和/或QC酶活性的變化以鑒定QC的活性修飾效應(yīng)物。25.通過(guò)如權(quán)利要求23或24所述的篩選方法鑒定的QC效應(yīng)物。26.一種治療可通過(guò)以下方式治療的哺乳動(dòng)物疾病的方法，a)通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)QC活性和/或b)通過(guò)調(diào)節(jié)基于QC活性的調(diào)節(jié)引起的含pGlu肽的作用的生理過(guò)程，其包括向所述的哺乳動(dòng)物給藥治療有效量的至少一種谷氨酰胺?；h(huán)化酶(QC)的效應(yīng)物以調(diào)節(jié)QC對(duì)Gln或Glu肽的活性。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述QC活性的調(diào)節(jié)在至少一種選自以下組中的QC底物中改變N-末端谷氨酸或谷氨酰胺殘基向焦谷氨酸殘基的轉(zhuǎn)化，其中所述組組成如下Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]胃泌素(17和34)、[Gln1]神經(jīng)降壓肽、[Gln1]FPP、[Gln1]TRH、[Gln1]GnRH、[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18、[Gln1]ELA、[Gln1]分形素、[Gln1]胖素A、[Gln3]胰高血糖素3-29及[Gln5]物質(zhì)P5-11。28.如權(quán)利要求26所述的方法，其用于治療阿爾茨海默癥和唐氏綜合征。29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述QC活性的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)和/或控制男性生育力。30.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述疾病選自以下組中，所述組組成如下伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌感染的潰瘍病和胃癌、致病性精神病、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、惡性轉(zhuǎn)移、黑素瘤、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附和遷移過(guò)程、食物攝取障礙、失眠、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙、激素平衡障礙以及體液調(diào)節(jié)障礙。31.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述治療導(dǎo)致刺激胃腸道細(xì)胞增殖，胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞增殖，急性酸分泌以及產(chǎn)酸性壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的分化。32.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述治療導(dǎo)致對(duì)髓祖細(xì)胞增殖的抑制。33.如權(quán)利要求26至32任一項(xiàng)所述的方法，其中所述QC效應(yīng)物與DPIV或DPIV樣酶抑制劑和/或氨肽酶抑制劑聯(lián)合給藥。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中DPIV樣酶產(chǎn)生H-isoAsp-Ala-OH的活性被阻斷。35.如權(quán)利要求34所述的治療方法，其中所述DPIV樣酶為DPII。36.一種用于非胃腸道、腸道或口服給藥的藥物組合物，其包含至少一種任選地與治療學(xué)可接受的載體和/或賦形劑相結(jié)合的QC效應(yīng)物。37.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其還包含至少一種DPIV或DPIV樣酶抑制劑和/或至少一種氨肽酶抑制劑。38.一種治療可通過(guò)以下方式治療的哺乳動(dòng)物疾病的方法，a)通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)QC活性和/或b)通過(guò)調(diào)節(jié)基于體內(nèi)QC活性和/或DPIV或DPIV樣酶活性和/或氨肽酶活性的調(diào)節(jié)引起的含pGlu肽的作用的生理過(guò)程，其包括向所述的哺乳動(dòng)物給藥如權(quán)利要求36或37所述的藥物組合物。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其用于在至少一種選自以下組中的QC底物中改變N-末端谷氨酸或谷氨酰胺殘基向焦谷氨酰(5-氧代-脯氨酰基)殘基的轉(zhuǎn)化，其中所述組組成如下Aβ3-40/42、[Gln3]Aβ3-40/42、[Glu11]Aβ11-40/42、[Gln11]Aβ11-40/42、[Gln1]胃泌素(17和34)、[Gln1]神經(jīng)降壓肽、[Gln1]FPP、[Gln1]TRH、[Gln1]GnRH、[Gln1]CCL2、[Gln1]CCL7、[Gln1]CCL8、[Gln1]CCL16、[Gln1]CCL18、[Gln1]ELA、[Gln1]分形素、[Gln1]胖素A。40.如權(quán)利要求38所述的方法，其用于治療阿爾茨海默癥和唐氏綜合征。41.如權(quán)利要求38所述的方法，其用于調(diào)節(jié)男性生育力。42.如權(quán)利要求38所述的方法，其用于治療選自以下組中的疾病，所述組組成如下伴隨或不伴隨幽門(mén)螺桿菌感染的潰瘍病和胃癌、致病性精神病、精神分裂癥、不育癥、瘤形成、炎性宿主應(yīng)答、癌癥、惡性轉(zhuǎn)移、黑素瘤、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化癥、體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答障礙、內(nèi)皮中白細(xì)胞的粘附和遷移過(guò)程、食物攝取障礙、失眠、能量代謝平衡調(diào)節(jié)障礙、自主功能障礙、激素平衡障礙以及體液調(diào)節(jié)障礙。43.如權(quán)利要求38所述的方法，其用于刺激胃腸道細(xì)胞增殖，刺激胃粘膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增殖，急性酸分泌以及刺激產(chǎn)酸性壁細(xì)胞和分泌組胺的腸嗜鉻樣細(xì)胞的分化。44.如權(quán)利要求38所述的方法，其用于刺激髓祖細(xì)胞的增殖。45.一種鑒定和選擇QC效應(yīng)物的篩選方法，其包括以下步驟a)在允許其相結(jié)合的條件下使QC接觸所述化合物；b)加入QC底物；c)監(jiān)測(cè)底物轉(zhuǎn)化或任選地測(cè)定殘余的QC活性；以及d)計(jì)算底物轉(zhuǎn)化和/或QC酶活性的變化以鑒定QC的活性修飾效應(yīng)物。46.一種鑒定及選擇直接或間接與QC活性位點(diǎn)結(jié)合的金屬離子相互作用的效應(yīng)物的篩選方法，其包括以下步驟a)在允許其相結(jié)合的條件下使QC接觸所述化合物；b)加入可被QC轉(zhuǎn)化的QC底物；c)監(jiān)測(cè)底物轉(zhuǎn)化或任選地測(cè)定殘余的QC活性；以及d)計(jì)算底物轉(zhuǎn)化和/或QC酶活性的變化，其中所述變化可用于鑒定QC的活性修飾效應(yīng)物。47.用如權(quán)利要求45或46所述的篩選方法鑒定的QC效應(yīng)物。全文摘要本發(fā)明提供了哺乳動(dòng)物谷氨酰胺酰基環(huán)化酶(QC，EC2.3.2.5)的新生理底物、QC的新效應(yīng)物、篩選該效應(yīng)物的方法、該效應(yīng)物以及包含該效應(yīng)物的藥物組合物在治療可通過(guò)調(diào)節(jié)QC活性治療的疾病中的應(yīng)用。優(yōu)選的組合物還包括DPIV或DPIV樣酶抑制劑以治療或減輕可通過(guò)調(diào)節(jié)QC和DPIV活性治療的疾病。文檔編號(hào)A61K31/4745GK1784220SQ200480012386公開(kāi)日2006年6月7日申請(qǐng)日期2004年5月5日優(yōu)先權(quán)日2003年5月5日發(fā)明者漢斯-烏爾里?！さ履绿?托爾斯滕·霍夫曼,安德烈·J.·尼斯特羅杰,斯特凡·席林,烏爾里?！ず缮暾?qǐng)人:前體生物藥物股份公司