專利名稱：新型胰島素衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在生理pH值下可溶并具有延長的作用特性的新型人胰島素衍生物。本發(fā)明還涉及提供這類衍生物的方法、含有它們的藥物組合物、使用本發(fā)明的胰島素衍生物治療糖尿病和高血糖的方法以及這類胰島素衍生物在治療糖尿病和高血糖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，對糖尿病，包括1型糖尿病和2型糖尿病的治療越來越依賴于所謂的強力胰島素治療。按照該方案，每天用多次胰島素注射治療患者，包括每天使用長效胰島素注射一次或兩次，以便覆蓋基本胰島素需求，并補充以大量濃注快速起效的胰島素以覆蓋與膳食相關(guān)的胰島素需求。
長效胰島素組合物在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因此，一種主要類型的長效胰島素組合物包括胰島素晶體或非晶形胰島素的可注射的水性混懸液。在這些組合物中，所用的胰島素化合物一般為魚精蛋白胰島素、鋅胰島素或者精蛋白鋅胰島素。
應(yīng)用胰島素混懸液有某些缺陷。因此，為了保證精確給藥，必須通過適度振搖使胰島素顆粒均勻混懸，然后才從小瓶中抽取或從藥筒放出確定體積的混懸液。此外，就胰島素混懸液的儲存而言，必須將溫度保持在比胰島素溶液更窄的范圍內(nèi)以避免形成塊或凝固。
盡管先前認(rèn)為魚精蛋白是非免疫原性的，但是目前已證明魚精蛋白在人體內(nèi)可能是免疫原性的，且其在醫(yī)療目的中的應(yīng)用可能導(dǎo)致抗體形成。此外，已有證據(jù)表明魚精蛋白-胰島素復(fù)合物自身為免疫原性的。因此，對某些患者而言，必須避免使用含有魚精蛋白的長效胰島素組合物。
另一種類型的長效胰島素組合物為具有低于生理pH的pH值的溶液，在注射該溶液時，胰島素將因pH值升高而從其中沉淀。使用這些溶液的缺陷在于注射時組織中形成的沉淀的顆粒大小分布、進而該藥物的釋放特性會以某種不可預(yù)測的方式取決于注射部位處的血流和其它參數(shù)。另一個缺陷在于胰島素的固體顆?？梢云鹁植看碳┑淖饔?，使注射部位處的組織產(chǎn)生炎癥。
WO 91/12817(Novo Nordisk A/S)中披露了包含鈷(III)的胰島素復(fù)合物的可溶性胰島素組合物。這些復(fù)合物的作用特性僅為適度的延長，而生物利用度相對于人胰島素而言有所下降。
人胰島素帶有三個伯氨基A-鏈和B-鏈的N-末端基團以及LysB29的ε-氨基。在這些基團的一個或多個上被取代的幾種胰島素衍生物是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。因此，美國專利US 3,528,960(Eli Lilly)涉及N-羧基芳酰基胰島素，其中該胰島素分子的1、2或3個伯氨基帶有羧基芳?；?。
GB專利號1.492.997(Nat.Res.Dev.Corp.)發(fā)現(xiàn)在NεB29上帶有氨基甲酰基取代的胰島素具有改善的降血糖作用特性。
JP待審專利申請?zhí)?-254699(Kodama Co.，Ltd.)中披露了脂肪酸與PheB1的氨基或與LysB29的ε-氨基結(jié)合或與它們兩者均結(jié)合的胰島素。所述的衍生化的目的在于獲得藥理學(xué)上可接受的穩(wěn)定胰島素制劑。
JP待審專利申請?zhí)?7-067548(Shionogi)中描述了在B30位上帶有含至少5個碳原子的氨基酸(其不一定由三聯(lián)體核苷酸編碼)的胰島素。其中宣稱這些胰島素類似物可用于治療糖尿病，特別是用于治療因?；蜇i胰島素抗體的產(chǎn)生而為胰島素抵抗的患者。
WO 95/07931(Novo Nordisk A/S)中披露了人胰島素衍生物，其中LysB29的ε-氨基帶有親脂性取代基。這些胰島素衍生物具有延長的作用特性且在生理pH值下可溶。
EP 894095中披露了胰島素衍生物，其中B-鏈的N-末端基團和/或B28、B29或B30位上Lys的ε-氨基帶有通式-CO-W-COOH的取代基，其中W可以為長鏈烴基。這些胰島素衍生物具有延長的作用特性且在生理pH值下可溶。
然而，對具有比迄今為止已知的胰島素衍生物具有更為延長的作用特性且同時在生理pH值下可溶、并且功效與人胰島素相當(dāng)?shù)囊葝u素仍然存在需求。
發(fā)明概述本發(fā)明基于如下認(rèn)識胰島素衍生物分子的總體疏水性在該衍生物的體內(nèi)功效方面起重要作用。
本發(fā)明在一個方面涉及胰島素衍生物及其任意的Zn2+復(fù)合物，該胰島素衍生物是在母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基處或者在母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基處連接了側(cè)鏈的天然存在的胰島素或其類似物，該側(cè)鏈具有如下一般通式-W-X-Y-Z其中W為·在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的α-氨基酸殘基，該殘基以其羧酸基團之一與母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基一起或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基一起形成酰胺基；·由彼此通過酰胺鍵連接的2、3或4個α-氨基酸殘基組成的鏈，該鏈通過酰胺鍵與母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基相連接，W的氨基酸殘基選自帶有中性側(cè)鏈的氨基酸殘基和在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的氨基酸殘基組成的組，使得W含有至少一個在側(cè)鏈上含有羧酸基團的氨基酸殘基；或者·X與母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基之間的共價鍵；X為·-CO-；·-CH(COOH)CO-；·-N(CH2COOH)CH2CO-；
·-N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-；·-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；·-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；·-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-；·-N(CH2CH2COOH)CH2CO-；或·-N(CH2COOH)CH2CH2CO-；a)當(dāng)W為氨基酸殘基或氨基酸殘基鏈時，上述X通過由加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵，或b)當(dāng)W為共價鍵時，上述X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵；Y為·-(CH2)m-，其中m為6-32的整數(shù)；·二價烴鏈，它含有1、2或3個-CH＝CH-基團和其數(shù)目足以在鏈上獲得10-32個碳原子總數(shù)的-CH2-基團；·通式-(CH2)vC6H4(CH2)W-的二價烴鏈，其中v和w為整數(shù)或其中之一為0，使得v與w之和在6-30的范圍內(nèi)；且Z為·-COOH；·-CO-Asp；·-CO-Glu；·-CO-Gly；·-CO-Sar；·-CH(COOH)2；·-N(CH2COOH)2；·-SO3H；或
·-PO3H；條件是當(dāng)W為共價鍵且X為-CO-時，Z不是-COOH。
在本發(fā)明的一個實施方案中，側(cè)鏈-W-X-Y-Z與母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基連接。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，側(cè)鏈-W-X-Y-Z與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基連接。在該實施方案的一個更具體的方面中，側(cè)鏈-W-X-Y-Z與B鏈28位上存在的Lys殘基的ε-氨基連接。在該實施方案的另一個更具體的方面中，側(cè)鏈-W-X-Y-Z與B鏈29位上存在的Lys殘基的ε-氨基連接。在該實施方案的另一個更具體的方面中，側(cè)鏈-W-X-Y-Z與B鏈30位上存在的Lys殘基的ε-氨基連接。
側(cè)鏈-W-X-Y-Z的亞結(jié)構(gòu)W可以為共價鍵。另一方面，W可以為在側(cè)鏈上帶有羧酸基團且含有總共4-10個碳原子的α-氨基酸的殘基。特別地，W可以為能夠由遺傳密碼編碼的α-氨基酸的殘基。因此，例如，W可以選自α-Asp、β-Asp、α-Glu和γ-Glu組成的組。W的其它選擇例如為α-hGlu和δ-hGlu。
在另一個實施方案中，W為由兩個α-氨基酸殘基組成的鏈，這兩個α-氨基酸殘基之一有4-10個碳原子，并且在側(cè)鏈上有羧酸基團，而另一個α-氨基酸殘基帶有2-11個碳原子，但不含游離羧酸基團。不含游離羧酸基團的α-氨基酸殘基可以為中性的可編碼的α-氨基酸殘基。該實施方案的W的實例為α-Asp-Gly；Gly-α-Asp；β-Asp-Gly；Gly-β-Asp；α-Glu-Gly；Gly-α-Glu；γ-Glu-Gly；Gly-γ-Glu；α-hGlu-Gly；Gly-α-hGlu；δ-hGlu-Gly；和Gly-δ-hGlu。
在另一個實施方案中，W為由兩個α-氨基酸殘基組成的鏈，這兩個α-氨基酸殘基獨立地含有4-10個碳原子，并且兩者均在側(cè)鏈上帶有羧酸基團。這些α-氨基酸殘基之一或它們兩者可以為可編碼的α-氨基酸殘基。該實施方案的W的實例為α-Asp-α-Asp；α-Asp-α-Glu；α-Asp-α-hGlu；α-Asp-β-Asp；α-Asp-γ-Glu；α-Asp-δ-hGlu；β-Asp-α-Asp；β-Asp-α-Glu；β-Asp-α-hGlu；β-Asp-β-Asp；β-Asp-γ-Glu；β-Asp-δ-hGlu；α-Glu-α-Asp；α-Glu-α-Glu；α-Glu-α-hGlu；α-Glu-β-Asp；α-Glu-γ-Glu；α-Glu-δ-hGlu；γ-Glu-α-Asp；γ-Glu-α-Glu；γ-Glu-α-hGlu；γ-Glu-β-Asp；γ-Glu-γ-Glu；γ-Glu-δ-hGlu；α-hGlu-α-Asp；α-hGlu-α-Glu；α-hGlu-α-hGlu；α-hGlu-β-Asp；α-hGlu-γ-Glu；α-hGlu-δ-hGlu；δ-hGlu-α-Asp；δ-hGlu-α-Glu；δ-hGlu-α-hGlu；δ-hGlu-β-Asp；δ-hGlu-γ-Glu；和δ-hGlu-δ-hGlu。
在另一個實施方案中，W為由三個獨立地含有4-10個碳原子的α-氨基酸殘基組成的鏈，該鏈的氨基酸殘基選自帶有中性側(cè)鏈的殘基和在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的殘基的組，使得該鏈含有至少一個在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的殘基。在一個實施方案中，所述的氨基酸殘基為可編碼的殘基。
在另一個實施方案中，W為由四個獨立地含有4-10個碳原子的α-氨基酸殘基組成的鏈，該鏈的氨基酸殘基選自帶有中性側(cè)鏈的殘基和在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的殘基的組，使得該鏈含有至少一個在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的殘基。在一個實施方案中，所述的氨基酸殘基為可編碼的殘基。
在一個實施方案中，W可以通過脲衍生物與B-鏈上的Lys殘基的ε-氨基連接。
側(cè)鏈-W-X-Y-Z的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-CH(COOH)CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-N(CH2COOH)CH2CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-N(CH2CH2COOH)CH2CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與存在于母體胰島素B鏈上的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-N(CH2COOH)CH2CH2CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與存在于母體胰島素B鏈上的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與存在于母體胰島素B鏈上的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與存在于母體胰島素B鏈上的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
在另一個實施方案中，所述側(cè)鏈的亞結(jié)構(gòu)X可以為通式-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-的基團，它通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵；或當(dāng)W為共價鍵時，X通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或與存在于母體胰島素B鏈上的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵。
側(cè)鏈-W-X-Y-Z的亞結(jié)構(gòu)Y可以為通式-(CH2)m-的基團，其中m為6-32、8-20、12-20或12-16的整數(shù)。
在另一個實施方案中，Y為二價烴鏈，它含有1、2或3個-CH＝CH-基團和數(shù)量足以在該鏈上獲得6-32、10-32、12-20或12-16的碳原子總數(shù)的-CH2-基團。
在另一個實施方案中，Y為通式-(CH2)vC6H4(CH2)W-的二價烴鏈，其中v和w為整數(shù)或其中之一為0，使得v與w之和在6-30、10-20或12-16的范圍內(nèi)。
在一個實施方案中，側(cè)鏈-W-X-Y-Z的亞結(jié)構(gòu)Z為-COOH，條件是當(dāng)W為共價鍵且X為-CO-時，Z不是-COOH。
在另一個實施方案中，Z為-CO-Asp。
在另一個實施方案中，Z為-CO-Glu。
在另一個實施方案中，Z為-CO-Gly。
在另一個實施方案中，Z為-CO-Sar。
在另一個實施方案中，Z為-CH(COOH)2。
在另一個實施方案中，Z為-N(CH2COOH)2。
在另一個實施方案中，Z為-SO3H。
在另一個實施方案中，Z為-PO3H。
在另一個實施方案中，W選自由α-Asp、β-Asp、α-Glu和γ-Glu組成的組；X為-CO-或-CH(COOH)CO；Y為-(CH2)m-，其中m為12-18的整數(shù)且Z為-COOH或-CH(COOH)2。
本發(fā)明胰島素衍生物的胰島素部分(在本文中也稱作母體胰島素)可以為天然存在的胰島素，諸如人胰島素或豬胰島素。另一方面，母體胰島素可以是胰島素類似物。
在一組母體胰島素類似物中，A21位上的氨基酸殘基是Asn。
在另一組母體胰島素類似物中，A21位上的氨基酸殘基是Gly。來自該組類似物的具體實例有GlyA21人胰島素、GlyA21des(B30)人胰島素和GlyA21ArgB31ArgB32人胰島素。
在另一組母體胰島素類似物中，B1位上的氨基酸殘基被缺失。該組母體胰島素類似物的具體實例為des(B1)人胰島素。
在另一組母體胰島素類似物中，B30位上的氨基酸殘基被缺失。該組母體胰島素類似物的具體實例為des(B30)人胰島素。
在另一組母體胰島素類似物中，B28位上的氨基酸殘基為Asp。該組母體胰島素類似物的具體實例為AspB28人胰島素。
在另一組母體胰島素類似物中，B28位上的氨基酸殘基為Lys且B29位上的氨基酸殘基為Pro。該組母體胰島素類似物的具體實例為LysB28ProB29人胰島素。
在另一組母體胰島素類似物中，B30位上的氨基酸殘基是Lys且B29位上的氨基酸殘基是除Cys、Met、Arg和Lys外的任意可編碼的氨基酸。實例為其中B29位上的氨基酸殘基為Thr且B30位上的氨基酸殘基為Lys的胰島素類似物。該組母體胰島素類似物的具體實例為ThrB29LysB30人胰島素。
在另一組母體胰島素類似物中，B3位上的氨基酸殘基是Lys且B29位上的氨基酸殘基是Glu。該組母體胰島素類似物的具體實例為LysB3GluB29人胰島素。
本發(fā)明胰島素衍生物的實例有下列化合物NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)17CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)18CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰島素；
NεB29-(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO-)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-α-Glu-N-(β-Asp))des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Gly-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-β-Asp)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-α-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-D-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)des(B30)人胰島素；NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)des(B30)人胰島素；NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)des(B30)人胰島素；NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰島素；NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰島素；和NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰島素。
可以以基本上不含鋅的化合物形式或鋅的復(fù)合物形式提供本發(fā)明的胰島素衍生物。當(dāng)提供本發(fā)明的胰島素衍生物的鋅復(fù)合物時，每個胰島素六聚物可以結(jié)合2個Zn2+離子、3個Zn2+離子或4個Zn2+離子。胰島素衍生物的鋅復(fù)合物的溶液含有這類物質(zhì)的混合物。
在本發(fā)明的另一個方面中，可以提供包括治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，用于對需要這種治療的患者治療1型糖尿病、2型糖尿病和其它導(dǎo)致血糖過高的狀態(tài)。本發(fā)明的胰島素衍生物可以用于制備治療1型糖尿病、2型糖尿病和其它導(dǎo)致血糖過高的狀態(tài)的藥物組合物。
本發(fā)明在另一個方面中提供了對需要這種治療的患者治療1型糖尿病、2型糖尿病和其它導(dǎo)致血糖過高的狀態(tài)的藥物組合物，其中包含治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物與具有快速起效的胰島素類似物或胰島素的混合物和藥學(xué)上可接受的載體和添加劑。
本發(fā)明在一個實施方案中提供了藥物組合物，它是本發(fā)明胰島素衍生物與選自AspB28人胰島素、LysB28ProB29人胰島素和LysB3GluB29人胰島素中的快速起效的胰島素類似物的混合物。
本發(fā)明在一個實施方案中提供了藥物組合物，其中包含NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素和AspB28人胰島素與藥學(xué)上可接受的載體和添加劑。
可以將本發(fā)明的胰島素衍生物與快速起效的胰島素類似物按照約90/10％，約70/30％或約50/50％的比例混合。
本發(fā)明在另一個方面中提供了對需要這種治療的患者治療1型糖尿病、2型糖尿病和其它導(dǎo)致血糖過高的狀態(tài)的方法，包括對所述患者給予治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物與藥學(xué)上可接受的載體和藥學(xué)上可接受的添加劑。
本發(fā)明在另一個方面中提供了對需要這種治療的患者治療1型糖尿病、2型糖尿病和其它導(dǎo)致血糖過高的狀態(tài)的方法，包括對所述患者給予治療有效量的本發(fā)明胰島素衍生物與胰島素或具有快速起效的胰島素類似物的混合物與藥學(xué)上可接受的載體和藥學(xué)上可接受的添加劑。
本發(fā)明在另一個方面中涉及具有基本上與人胰島素類似的總體疏水性的胰島素衍生物。
本發(fā)明在另一個方面中涉及疏水指數(shù)k′rel在約2-約200范圍內(nèi)的胰島素衍生物。
在另一個方面中，本發(fā)明的胰島素衍生物具有的疏水指數(shù)k′rel在約0.02-約10，約0.1-約5，約0.5-約5或約0.5-約2的范圍內(nèi)。
本發(fā)明一個實施方案的胰島素衍生物含有如上所述的側(cè)鏈-W-X-Y-Z，它帶有至少一個親水區(qū)和至少一個疏水區(qū)。
本發(fā)明另一個實施方案的胰島素衍生物含有如上所述的側(cè)鏈-W-X-Y-Z，它帶有至少一個游離羧酸基團；按照進一步的實施方案，該側(cè)鏈帶有至少兩個游離羧酸基團。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其中包含在生理pH值下可溶的本發(fā)明胰島素衍生物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其中包含在約6.5-約8.5區(qū)間內(nèi)的pH值下可溶的本發(fā)明胰島素衍生物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有延長的作用特性的藥物組合物，其中包含本發(fā)明胰島素衍生物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及溶液形式的藥物組合物，該溶液含有約120nmol/ml-約2400nmol/ml，約400nmol/ml-約2400nmol/ml，約400nmol/ml-約1200nmol/ml，約600nmol/ml-約2400nmol/ml或約600nmol/ml-約1200nmol/ml的本發(fā)明胰島素衍生物或本發(fā)明胰島素衍生物與快速起效的胰島素類似物的混合物。有關(guān)本發(fā)明胰島素衍生物的疏水性數(shù)據(jù)使用LiChrosorb RP18(5μm，250×4mm)HPLC柱，通過在40℃下等度洗脫測定本發(fā)明胰島素衍生物相對于人胰島素的疏水性(疏水指數(shù))k′rel，在洗脫中使用A)和B)的混合物作為洗脫劑A)0.1M磷酸鈉緩沖液，pH 7.3，含有10％乙腈；B)含50％乙腈的水。通過追蹤214nm處洗脫液的UV吸收監(jiān)測洗脫。通過注射0.1mM硝酸鈉測出空隙時間t0。通過改變A與B溶液之間的比例將人胰島素的保留時間t人調(diào)整到至少2t0。k′rel＝(t衍生物-t0)/(t人-t0)。對一些本發(fā)明胰島素衍生物測出的k′rel如表1中所示。
表1
藥物組合物可以通過非腸道途徑對需要治療的患者給予含有本發(fā)明胰島素衍生物的藥物組合物。非腸道給藥可以通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，借助于注射器，任選筆型注射器來進行。另一方面，非腸道給藥可以通過輸注泵來進行。其它選擇包括通過鼻部或通過肺部，優(yōu)選以特別為該目的設(shè)計的組合物、粉末或液體形式給予所述的胰島素。
可以使用制藥工業(yè)的常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明胰島素衍生物的可注射組合物，包括溶解和混合組分(如果需要)而得到所需終產(chǎn)品。因此，按照一種步驟，將本發(fā)明的胰島素衍生物溶于一定量的水，其體積稍低于待制備的組合物的終體積。如果需要，加入等滲劑、防腐劑和緩沖劑，并且如果必要，則根據(jù)需要使用酸(例如鹽酸)或堿(例如氫氧化鈉水溶液)調(diào)節(jié)溶液的pH值。最終用水將溶液的體積調(diào)節(jié)至所需的組分濃度。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、N-(羥甲基)甲基甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖劑中的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑進一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑，它選自苯酚、鄰-甲酚、間-甲酚、對-甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、芐醇、氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、甲醋吡喃酮鈉(sodium dehydroacetate)、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、芐索氯銨、氯苯甘醚(3p-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的存在濃度為0.1mg/ml-20mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的存在濃度為0.1mg/ml-5mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的存在濃度為5mg/ml-10mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑的存在濃度為10mg/ml-20mg/ml。這些具體防腐劑中的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中應(yīng)用防腐劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。為方便起見，參照Remington《制藥科學(xué)與實踐》(The Science and Practice of Pharmacy)，第19版，1995。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述制劑進一步包括等滲劑，它選自鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛糖醇(例如甘油(glycerol)(甘油(glycerine))、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物組成的組。可以使用任意的糖，諸如單糖、二糖或多糖類或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普魯蘭、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素-Na。在一個實施方案中，糖添加劑為蔗糖。將糖醇定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8烴，其包括例如甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，該糖醇添加劑為甘露糖醇。上述糖類或糖醇類可以單獨使用或組合使用。對用量沒有固定的限制，只要所述的糖或糖醇溶于液體制劑且不會對使用本發(fā)明方法獲得的穩(wěn)定化作用產(chǎn)生不良影響即可。在一個實施方案中，糖或糖醇的濃度為約1mg/ml-約150mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的存在濃度為1mg/ml-50mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的存在濃度為1mg/ml-7mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的存在濃度為8mg/ml-24mg/ml。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲劑的存在濃度為25mg/ml-50mg/ml。這些具體等滲劑中的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中應(yīng)用等滲劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。為方便起見，參照Remington《制藥科學(xué)與實踐》(The Science andPractice of Pharmacy)，第19版，1995。
典型的等滲劑為氯化鈉、甘露糖醇、二甲亞砜和甘油，典型的防腐劑為苯酚、間-甲酚、對羥基苯甲酸甲酯和芐醇。
表面活性劑的實例為乙酸鈉、甘氨酰甘氨酸、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸鈉。
例如，可以如歐洲專利EP272097(授予Novo Nordisk A/S)中所述制備用于鼻部給予本發(fā)明胰島素衍生物的組合物。
可以將含有本發(fā)明胰島素的組合物用于治療對胰島素敏感的病況。因此，它們可以用于治療1型糖尿病、2型糖尿病和血糖過高，例如正如有時在受到嚴(yán)重?fù)p傷的人和進行了大外科手術(shù)的人中觀察到的。用于任何患者的最佳劑量水平取決于各種因素，包括所用具體胰島素衍生物的功效、患者的年齡、體重、身體活動和膳食；取決于與其它藥物的可能的組合；并取決于所治療情況的嚴(yán)重程度。建議由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照與已知胰島素組合物類似的方式針對每一患者個體確定本發(fā)明胰島素衍生物的每日劑量。
如在方便時，可以使用本發(fā)明胰島素衍生物與其它類型的胰島素，例如具有更快速起效作用的胰島素類似物的混合物。這類胰島素類似物的實例描述在例如公開號為EP 214826(Novo Nordisk A/S)、EP375437(Novo Nordisk A/S)和EP 383472(Eli Lilly & Co.)的歐洲專利申請中。
通過下列實施例進一步解釋本發(fā)明，但這些實施例并不用來限定本發(fā)明的范圍。
定義本文所用的″胰島素類似物″指的是在形式上可以通過缺失和/或交換天然存在的胰島素中存在的至少一個氨基酸殘基和/或添加至少一個氨基酸殘基而衍生自天然存在的胰島素(例如人胰島素)結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)的多肽。所添加和/或交換的氨基酸殘基可以為可編碼的氨基酸殘基或其它天然存在的殘基或純屬合成的氨基酸殘基。胰島素類似物可以為這類化合物，其中B鏈的28位可以由天然的Pro殘基修飾成Asp、Lys或Ile之一。在另一個實施方案中，B29位上的Lys被修飾成Pro。在一個實施方案中，B30可以為Lys且B29可以為除Cys、Met、Arg和Lys外的任意可編碼的氨基酸。
此外，可以將A21位上的Asn修飾成Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特別是修飾成Gly、Ala、Ser或Thr，優(yōu)選修飾成Gly。此外，可以將B3位上的Asn修飾成Lys或Asp。胰島素類似物的其它實例為des(B30)人胰島素；des(B30)人胰島素類似物；其中PheB1已經(jīng)缺失的胰島素類似物；其中A-鏈和/或B-鏈具有N-末端延伸的胰島素類似物；和其中A-鏈和/或B-鏈具有C-末端延伸的胰島素類似物。因此，可以將一個或兩個Arg添加到B1位上。
本文所用的術(shù)語″胰島素衍生物″指的是已被化學(xué)方式修飾過的天然存在的胰島素或胰島素類似物，該修飾可以是例如在胰島素骨架的一個或多個位置上引入側(cè)鏈或者氧化或還原胰島素上氨基酸殘基的基團或者將游離羧基轉(zhuǎn)化成酯基或?；坞x氨基或羥基。
表達方式″可編碼的氨基酸″或″可編碼的氨基酸殘基″用于表示可以由核苷酸三聯(lián)體(″密碼子″)編碼的氨基酸或氨基酸殘基。
hGlu為高谷氨酸。
α-Asp為-HNCH(CO-)CH2COOH的L-形式。
β-Asp為-HNCH(COOH)CH2CO-的L-形式。
α-Glu為-HNCH(CO-)CH2CH2COOH的L-形式。
γ-Glu為-HNCH(COOH)CH2CH2CO-的L-形式。
α-hGlu為-HNCH(CO-)CH2CH2CH2COOH的L-形式。
δ-hGlu為-HNCH(COOH)CH2CH2CH2CO-的L-形式。
β-Ala為-NH-CH2-CH2-COOH。
Sar為肌氨酸(N-甲基甘氨酸)。
表達方式″在側(cè)鏈上具有羧酸基團的氨基酸殘基″表示象Asp、Glu和hGlu之類的氨基酸殘基。氨基酸可以為L-或D-構(gòu)型。如果沒有具體指明，則應(yīng)理解氨基酸殘基為L構(gòu)型。
表達方式″帶有中性側(cè)鏈的氨基酸殘基″表示象Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Tyr、Asn和Gln之類的氨基酸殘基。
當(dāng)將本發(fā)明的胰島素衍生物描述為″在生理pH值下可溶″時，它指的是該胰島素衍生物可以用于制備在生理pH值下完全溶解的可注射胰島素組合物。這類有利溶解性可能僅是因胰島素衍生物的內(nèi)在特性所致，或是胰島素衍生物與載體中包含的一種或多種組分之間的有利相互作用的結(jié)果。
本說明書和實施例中使用下列縮寫Aadα-氨基-己二酸(高谷氨酸)Bzl＝Bn芐基DIEAN，N-二異丙基乙胺DMFN，N-二甲基甲酰胺IDA亞氨基二乙酸Sar肌氨酸(N-甲基-甘氨酸)tBu叔丁基TSTUO-(N-琥珀酰亞胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽THF四氫呋喃EtOAc乙酸乙酯DIPEA二異丙基乙胺HOAt1-羥基-7-氮雜苯并三唑TEA三乙胺Su琥珀酰亞胺基＝2，5-二氧代-吡咯烷-1-基TFA三氟乙酸DCM二氯甲烷DMSO二甲亞砜TLC薄層色譜法RT室溫實施例實施例1NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素的合成將200mg des(B30)人胰島素溶于置于15℃水浴中的試管內(nèi)包含的10ml 50mM Na2CO3(pH 10.2)中。將甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(37.90mg，如下所述制備)溶于10ml乙腈，隨后加入胰島素溶液中。在30分鐘后，通過添加3.8ml用稀HCl調(diào)節(jié)至pH9.0的0.2M乙醇胺終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)率如RP-HPLC所測定的為37％。在添加2.5體積的水并將pH調(diào)節(jié)至5.5后產(chǎn)物沉淀。然后將該沉淀溶于pH 8下的10ml水并放入冰中。向該溶液中加入10ml冰冷的0.2M NaOH以便皂化，并在用冰冷卻的同時將該混合物保溫40分鐘，然后調(diào)節(jié)至pH 5.5以便沉淀產(chǎn)物。分離沉淀并將其溶于5ml A-緩沖液(參見下文)，用33ml的42.5％ w/w乙醇水溶液分三份稀釋，進行陰離子交換色譜，其中使用ResourceTM6ml陰離子交換柱，用由A-緩沖液和B-緩沖液組成的緩沖系統(tǒng)洗脫，其中A-緩沖液Tris 0.24％w/w，NH4Ac 0.25％，42％乙醇w/w，pH 7.5；B-緩沖液Tris 0.24％w/w，NH4Ac1.25％，42％乙醇w/w pH 7.5。以6ml/分鐘的流速，在30分鐘內(nèi)以0-100％B-緩沖液的梯度洗脫樣品。通過RP-HPLC鑒定含有所需化合物的級分。所需產(chǎn)物的產(chǎn)率為15.3mg(純度72.9％)。在真空中將含有所需化合物的合并級分的體積減少至20ml，然后通過RP-HPLC對該溶液進行純化，其中使用反相HPLC柱Nucleosil，C4 250/10mm，10μm，300。緩沖系統(tǒng)由A-緩沖液10mM Tris，15mM(NH4)2SO4，10％乙醇，pH 7.3和B-緩沖液70％vol/vol乙醇組成。
在120分鐘內(nèi)用10％-60％的B-緩沖液梯度以2ml/分鐘的流速洗脫產(chǎn)物。合并合適的級分并沉淀化合物且凍干。產(chǎn)量為7.7mg(純度99.4％)。
通過質(zhì)譜測得分子量為6097.2，計算值為6104.1。在用金黃色葡萄球菌蛋白酶消化后得到含有側(cè)鏈的B-末端肽。通過質(zhì)譜測得分子量為1413.1，計算值為1413.5。
甲基十六烷二?；?Glu(OSu)-OMe的制備使用1.0當(dāng)量的NaOH在MeOH中皂化十六烷二酸二甲酯，在使用HCl酸化時通過從庚烷中重結(jié)晶分離單甲酯。
將十六烷基二酸單甲酯(275mg，0.91mmol)溶于THF(3ml)，用四甲基脲鎓四氟硼酸琥珀酰亞胺鹽(酯)(331mg，1.1mmol)和N，N-二異丙基乙胺(188μL，1.1mmol)處理，并將該混合物攪拌20小時。在真空中除去溶劑，將殘余物溶于乙酸乙酯，并用0.1M HCl(兩次)和水洗滌。用MgSO4干燥有機相，過濾并在真空中蒸發(fā)，得到350mg(96％)的十六烷二酸甲基琥珀酰亞胺基酯。
1H-NMR(CDCl3)□3.66(s，3H)，2.83(s，4H)，2.60(t，2H)，2.30(t，2H)，1.74(p，2H)，1.62(p，2H)，1.40(m，2H)，1.35-1.22(m，18H)。
用GluOMe(93mg，0.58mmol)和N，N-二異丙基乙胺(200μL，1.16mmol)處理在二甲基甲酰胺(5ml)中的十六烷二酸甲基琥珀酰亞胺基酯(240mg，0.58mmol)。將該混合物攪拌20小時，然后在真空中蒸發(fā)。將殘余物重新溶于乙酸乙酯。用0.1M HCl和水洗滌，隨后干燥(MgSO4)并在真空中蒸發(fā)，得到226mg(88％)的甲基十六烷二?；?Glu-Ome。
1H-NMR□6.22(d，1H)，4.65(m，1H)，3.76(s，3H)，3.66(s，3H)，2.42(t，2H)，2.29(m，4H)，2.22(t，2H)，1.97(m，2H)，1.62(m，4H)，1.35-1.22(m，20H)。
將甲基十六烷二?；?Glu-OMe(200mg，0.45mmol)溶于二氯甲烷(4ml)，用冰浴冷卻，并用二環(huán)己基碳化二亞胺(93mg，0.45mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(52mg，0.45mmol)處理。將該混合物攪拌20小時，過濾并在真空中蒸發(fā)，得到243mg(100％)的所需中間體。
1H-NMR(CDCl3)□6.34(d，1H)，4.67(m，1H)，3.73(s，3H)，3.64(s，3H)，2.81(s，4H)，2.66(m，2H)，2.27(m，4H)，2.20(t，2H)，1.89(m，1H)，1.70(m，1H)，1.58(m，4H)，1.29-1.20(m，20H)。
實施例2NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素的合成如實施例1中所述將300mg des(B30)人胰島素?；?，純化并分離，但在本實施例中將甲基十八烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(如下所述制備)用作?；瘎?，而不是實施例1中所用的甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe。得到25.5mg標(biāo)題化合物(純度97.4％)。通過質(zhì)譜測得分子量為6136.6，計算值為6132。在通過金黃色葡萄球菌蛋白酶消化后得到含有配體的B-末端肽。通過質(zhì)譜測得分子量為1439.1，計算值為1442.5。
甲基十八烷二酰基-Glu(OSu)-OMe的制備按照與實施例1中所述的十六烷二?；苌镱愃频姆绞接墒送槎岫柞ブ苽湓摶衔?。
1H-NMR(CDCl3)□6.20(d，1H)，4.70(m，1H)，3.78(s，3H)，3.67(s，3H)，2.84(s，4H)，2.70(m，2H)，2.30(m，4H)，2.22(t，2H)，1.93(m，1H)，1.70(m，1H)，1.62(m，4H)，1.33-1.23(m，24H)。
實施例3NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))des(B30)人胰島素的合成按照如實施例1中所述類似的方式，用甲基十八烷二?；?Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe?；?00mg的des(B30)人胰島素。如上所述進行陰離子交換純化。然而，用100％B-緩沖液進行延長洗脫以便洗脫所需產(chǎn)物。通過RP-HPLC鑒定含有所需產(chǎn)物的級分，獲得47.5mg產(chǎn)物，純度為55％。在真空中減少含有所需產(chǎn)物的級分的體積，通過RP-HPLC對所得溶液進行純化，其中使用來自Phenomerex的反相HPLCJupiter柱，C4 250/10mm，10μm，300。緩沖系統(tǒng)由A-緩沖液(0.1％TFA，10％ vol/vol乙醇)和B-緩沖液(80％ vol/vol乙醇)組成。用40℃的40％-60％的B-緩沖液梯度在120分鐘內(nèi)以2ml/分鐘的流速洗脫樣品。合并合適的級分并凍干，得到31.1mg的標(biāo)題化合物(純度94％)。
通過質(zhì)譜測得標(biāo)題化合物的分子量為6259.65，計算值為6261.2。在用金黃色葡萄球菌蛋白酶消化后得到的含有側(cè)鏈的B-末端肽的分子量(根據(jù)質(zhì)譜)的測定值為1569.88，計算值為1569.88。
甲基十八烷二?；?Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe的制備用GluOMe(62mg，0.39mmol)和N，N-二異丙基乙胺(90μL，53mmol)處理在二甲基甲酰胺(5ml)中的甲基十八烷二?；?Glu(OSu)-OMe(如實施例2中所述制備，200mg，0.35mmol)，將該混合物攪拌20小時。在真空中除去溶劑，并將殘余物溶于乙酸乙酯，用0.2M HCl、水和鹽水洗滌兩次。用MgSO4干燥并蒸發(fā)后，得到甲基十八烷二?；?Glu(Glu-OMe)-OMe，180mg(83％)。
將甲基十八烷二酰基-Glu(Glu-OMe)-OMe(180mg，0.29mmol)溶于THF(9ml)，用四甲基脲鎓四氟硼酸琥珀酰亞胺鹽(酯)(106mg，0.35mmol)和N，N-二異丙基乙胺(60μL，0.35mmol)處理。將該混合物攪拌過夜，蒸發(fā)，重新溶于乙酸乙酯，并用2×0.1M HCl和水洗滌。用MgSO4干燥并蒸發(fā)后，得到190mg(93％)的所需中間體。
1H-NMR(CDCl3)δ6.73(d，1H)，6.43(d，1H)，4.69(m，1H)，4.56(m，1H)，3.77(s，3H)，3.74(s，3H)，3.66(s，3H)，2.85(s，4H)，2.72(m，2H)，2.41-2.12(m，8H)，2.95(m，2H)，1.72-1.56(m，6H)，1.35-1.22(m，22H)。
實施例4NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成在室溫下將des(B30)人胰島素(500mg，0.088mmol)溶于100mMNa2CO3(5ml，pH 10.2)。將叔丁基十六烷二?；?Glu(OSu)-OtBu(66mg，0.105mmol，如下所述制備)溶于乙腈(5ml)，隨后加入到胰島素溶液中。30分鐘后，加入0.2M甲胺(0.5ml)。用HCl將pH調(diào)節(jié)至5.5，通過離心收集等電沉淀，在真空中干燥后得到525mg。偶聯(lián)產(chǎn)率為78％(RP-HPLC，C4柱；緩沖液A在0.1％TFA-水中的10％ MeCN；緩沖液B在0.1％ TFA-水中的80％ MeCN；梯度20％-90％ B，在16分鐘內(nèi))。將被保護的產(chǎn)物溶于TFA(10ml)，保持30分鐘并在真空中蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物溶于水并凍干(610mg)。通過用C4-柱進行RP-HPLC純化0454，其中緩沖液A20％ EtOH+0.1％ TFA，緩沖液B80％EtOH+0.1％ TFA；梯度15-60％ B，隨后用C4-柱進行HPLC，其中緩沖液A10mM Tris+在20％ EtOH中的15mM硫酸銨，pH 7.3，緩沖液B80％ EtOH，梯度15-60％ B。用Sep-Pak與70％乙腈+0.1％TFA對收集的級分脫鹽，通過添加氨中和，凍干。未優(yōu)化的產(chǎn)率為64mg，12％。通過HPLC評估的純度為99.2％。LCMS 6102.9，C274H411N65O81S6理論值6104.1。在用金黃色葡萄球菌蛋白酶消化后得到含有側(cè)鏈的B-末端肽(RGFFYTPK(Nε-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-L-Glu)。MALDI-MS1413.1，計算值1412.7。
叔丁基十六烷二?；?L-Glu(OSu)-OtBu的制備將十六烷二酸(40.0g，140mmol)懸浮于甲苯(250ml)中，并將該混合物加熱至回流。在4小時內(nèi)滴加N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛(76.3g，375mmol)。將該混合物回流過夜。在50℃下真空中除去溶劑，將粗物質(zhì)懸浮于DCM/AcOEt(500ml，1∶1)中，攪拌15分鐘。通過過濾收集固體，并與DCM(200ml)一起研磨。在真空中蒸發(fā)濾液，得到十六烷二酸一叔丁酯粗品30克。將該物質(zhì)懸浮于DCM(50ml)，用冰冷卻10分鐘并過濾。在真空中除去溶劑而得到25克十六烷二酸一叔丁酯粗品，使其從庚烷(200ml)中重結(jié)晶，得到十六烷二酸一叔丁酯15.9g(33％)。作為重結(jié)晶的備選，可以通過使用AcOEt/庚烷的硅膠色譜法純化所述的一酯。
1H-NMR(CDCl3)δ2.35(t，2H)，2.20(t，2H)，1.65-1.55(m，4H)，1.44(s，9H)，1.34-1.20(m，20H)。
將該一叔丁酯(2g，5.8mmol)溶于THF(20ml)，并用TSTU(2.1g，7.0mmol)和DIEA(1.2ml，7.0mmol)處理，攪拌過夜。過濾該混合物，在真空中蒸發(fā)濾液。將殘余物溶于AcOEt，用冷0.1M HCl和水洗滌兩次。用MgSO4干燥，在真空中蒸發(fā)，得到十六烷二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯2.02g(79％)。
1H-NMR(CDCl3)δ2.84(s，4H)，2.60(t，2H)，2.20(t，2H)，1.74(p，2H)，1.56(m，2H)，1.44(s，9H)，1.40(m，2H)，1.30-1.20(m，18H)。
將十六烷二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯(1g，2.27mmol)溶于DMF(15ml)，用L-Glu-OtBu(0.51g，2.5mmol)和DIEA(0.58ml，3.41mmol)處理，將該混合物攪拌過夜。在真空中蒸發(fā)溶劑，將粗產(chǎn)物溶于AcOEt，用0.2M HCl洗滌兩次，用水和鹽水洗滌。用MgSO4干燥，在真空中蒸發(fā)，得到叔丁基十六烷二?；?L-Glu-OtBu，1.2g(100％)。
1H-NMR(CDCl3)δ6.25(d，1H)，4.53(m，1H)，2.42(m，2H)，2.21(m，4H)，1.92(m，1H)，1.58(m，4H)，1.47(s，9H)，1.43(s，9H)，1.43-1.22(m，18H)。
將叔丁基十六烷二?；?L-Glu-OtBu(1.2g，2.27mmol)溶于THF(15ml)，用TSTU(0.82g，2.72mmol)和DIEA(0.47ml，2.72mmol)處理，攪拌過夜。過濾該混合物并在真空中蒸發(fā)濾液。將殘余物溶于AcOEt，用冷0.1M HCl和水洗滌兩次。用MgSO4干燥并在真空中蒸發(fā)后，得到叔丁基十六烷二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu，1.30g(92％)。
1H-NMR(CDCl3)δ6.17(d，1H)，4.60(m，1H)，2.84(s，4H)，2.72(m，1H)，2.64(m，1H)，2.32(m，1H)，2.20(m，4H)，2.08(m，1H)，1.6(m，4H)，1.47(s，9H)，1.43(s，9H)，1.33-1.21(m，20H)。
實施例5NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成將desB30胰島素(50mg，9μmol)溶于pH 10.5的0.1M Na2CO3水溶液(0.65ml)。將十八烷二?；?L-Glu(OSu)(50.1mg，9.9μmol，如下所述制備)溶于乙腈(0.65ml)并加入到該胰島素溶液中；pH為10.3。30分鐘后，加入0.2M甲胺(50μl)。用HCl將pH調(diào)節(jié)至5.5，通過離心收集等電沉淀，在真空中干燥。HPLC顯示粗偶聯(lián)產(chǎn)率為52％(未優(yōu)化)；C4柱；緩沖液A在0.1％ TFA-水中的10％ MeCN，緩沖液B在0.1％ TFA-水中的80％ MeCN；梯度20％-90％ B，16分鐘內(nèi))。LCMS 6133.2，C276H415N65O81S6理論值6132.2。
十八烷二?；?L-Glu(OSu)的制備將十八烷二酸(2.5g，8.0mmol)懸浮于DCM(60mL)，用三乙胺(1.16mL，8.3mmol)處理并用冰冷卻。在氮氣環(huán)境中滴加氯甲酸芐基酯(1.14mL)，將該混合物攪拌10分鐘，此時加入DMAP(0,097g，0.80mmol)。在4℃下攪拌20分鐘(TLC，1∶1 AcOEt∶庚烷)后，將該反應(yīng)體系蒸發(fā)至干。將粗物質(zhì)(3.9g)溶于DCM(60ml)，用二氧化硅(15g)處理并蒸發(fā)。將二氧化硅裝載到硅膠柱(175g)上，并用AcOEt/庚烷1∶7-1∶1洗脫產(chǎn)物。蒸發(fā)所需級分，得到十八烷二酸一芐酯(1.15g，36％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.35(m，5H)，5.11(s，2H)，2.35(t，4H)，1.63(t，4H)，1.30-1.22(m，24)。
將十八烷二酸一芐酯溶于DMF(3.5mL)和THF(7mL)中，并用冰浴冷卻。加入DIEA(0.103mL)和TSTU，將該混合物在冰浴下攪拌1小時且在RT下攪拌過夜。在真空中蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶于AcOEt，用0.2N HCl、飽和NaHCO3洗滌兩次，干燥，過濾并蒸發(fā)至干，得到琥珀酰亞胺基一芐基十八烷二酸酯(0.25g，100％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.35(m，5H)，5.11(s，2H)，2.83(s，4H)，2.60(t，2H)，2.35(t，2H)，1.80-1.60(m，4H)，1.40-1.20(m，24)。
將琥珀酰亞胺基一芐基十八烷二酸酯(95mg，0.19mmol)溶于DMF(1.5ml)，并用L-Glu-OBzl(49mg，0.21mmol)和DIEA(50□l，0.28mmol)處理，將該混合物攪拌過夜。在真空中蒸發(fā)溶劑，將粗產(chǎn)物溶于AcOEt，用0.2M HCl洗滌兩次、用水和鹽水洗滌。用MgSO4干燥并在真空中蒸發(fā)，得到BzlO-十八烷二?；?L-Glu-OBzl，114mg(97％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.35(m，5H)，6.22(d，2H)，5.17(s，2H)，5.11(s，2H)，4.71(m，1H)，2.37(m，4H)，2.22(m，3H)，1.98(m，1H)，1.63(m，4H)，1.31-1.20(m，24H)。
將BzlO-十八烷二?；?L-Glu-OBzl(110g，0.18mmol)溶于THF(2ml)，并用TSTU(64mg，0.21mmol)和DIEA(36μl，0.21mmol)處理，攪拌過夜。過濾該混合物并在真空中蒸發(fā)濾液。將殘余物溶于AcOEt，用冷0.1M HCl和水洗滌兩次。用MgSO4干燥并在真空中蒸發(fā)，得到BzlO-十八烷二?；?L-Glu(OSu)-OBzl，119g(94％)。
1H-NMR(CDCl3)δ7.36(m，5H)，6.40(d，2H)，5.19(s，2H)，5.11(s，2H)，4.75(m，1H)，2.82(s，4H)，2.68(m，1H)，2.59(m，1H)，2.35(t，2H)，2.19(t，2H)，1.62(m，4H)，1.32-1.21(m，24H)。
將BzlO-十八烷二?；?L-Glu(OSu)-OBzl(59mg，0.082mmol)溶于丙酮/0.1％ TFA(1ml)。加入Pd/C(20mg)。將燒瓶抽真空并充幾次N2，連接充滿H2的氣囊。將該混合物在RT下攪拌3小時，然后通過C鹽過濾。從庚烷中沉淀并蒸發(fā)殘余溶劑，得到十八烷二?；?L-Glu(OSu)(27mg，61％)。
1H-NMR(CDCl3)δ6.32(d，1H)，4.70(m，1H)，3.70(m，1H)，3.06(m，2H)，2.88(s，4H)，2.62(m，2H)，2.35(m，2H)，2.24(m，1H)，1.74(m，1H)，1.64(m，2H)，1.50-1.20(m，26H)。
實施例6NεB29-(N-(L-Asp-OC(CH2)16CO)-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-Asp(OtBu)-OtBu與十八烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-GluOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。
LCMS 6247.5，計算值6247.3。
實施例7NεB29-(N-(L-Glu-OC(CH2)14CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-Glu(OtBu)-OtBu與十六烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-GluOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6261.3，計算值6261.3。
實施例8NεB29-(N-(L-Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-Glu(OtBu)-OtBu與十六烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6130.8，計算值6132.2。
實施例9NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu)-N-(β-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-Glu(OtBu)反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-AspOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6246.9，計算值6247.3。
實施例10NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十七烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯(A.C.Cope，U.Axen，E.P.Burrows，J.Weinlich，《美國化學(xué)協(xié)會雜志》(J.Am.Chem Soc.)1966，88，4228)與L-GluOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6118.3，計算值6118.1。
實施例11NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-GlyOtBu與十五烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-GluOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6147.5，計算值6147.1。
實施例12NεB29-(N-(L-Sar-OC(CH2)13CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-Sar-OtBu與十八烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-GluOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6161.0，計算值6161.1。
實施例13NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)-N-(β-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-Asp(OtBu)反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-AspOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6233.8，計算值6233.2。
實施例14NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-GlyOtBu與十六烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-GluOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6160.7，計算值6161.1。
實施例15NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-Asp(OtBu)與十六烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6089.8，計算值6089.8。
實施例16NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-Asp(OtBu)反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6117.8，計算值6118.1。
實施例17NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使L-GlyOtBu與十八烷二酸琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與L-GluOtBu反應(yīng)，用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6189.2，計算值6189.2。
實施例18NεB29-(N-(HOOC(CH2)14CO-ε-L-LysCO-)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十六烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-Lys(Z)-OtBu反應(yīng)，隨后用Pd/C氫化并在原位用氯甲酸4-硝基苯基酯活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6189.2，計算值6189.2。
實施例19NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-Glu(OtBu)反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6132.1，計算值6132.2。
實施例20NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-Asp(OtBu)反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6117.8，計算值6118.1。
實施例21NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-β-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十七烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-AspOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6104.2，計算值6104.1。
實施例22NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-D-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與D-GluOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6132.4，計算值6132.2。
實施例23NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-L-Aad)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-AadOtBu(由商品L-Aad(OMe)，通過用AcOtBu/BF3.OEt2叔丁基化并對該甲酯皂化而制備)反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6116.9，計算值6118.1。
實施例24NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十五烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-AspOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6074.7，計算值6076.1。
實施例25NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Glu)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十五烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與L-GluOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。MALDI-MS 6080.6，計算值6076.1。
實施例26NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-D-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十六烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與D-AspOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6089.1，計算值6090.1。
實施例27NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亞胺基酯與D-AspOtBu反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6117.1，計算值6118.1。
實施例28NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)des(B30)人胰島素的合成按照與實施例4類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使叔丁基3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3-基十六烷二酸酯與亞氨基二乙酸反應(yīng)，隨后用TSTU活化，與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。LCMS 6089.1，計算值6090.1。
實施例29NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰島素的合成將A1N，B1N-diBoc DesB30人胰島素(Kurtzhals P；Havelund S；Jonassen I；Kiehr B；Larsen UD；Ribel U；Markussen J《生物化學(xué)雜志》(Biochemical Journal)，1995，312，725-731)(186mg，0.031mmol)溶于DMSO(1.8ml)。加入叔丁基十八烷二?；?N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OSu(27mg，0.04mmol)在THF(1.8ml)和三乙胺(0.045ml，0.31mmol)中的溶液(pH為10)。在室溫下緩慢攪拌45分鐘后，用0.2M在THF(0,20ml)中的甲胺使反應(yīng)猝滅。加入水(5ml)并用1N HCl將pH調(diào)節(jié)至5.5。通過離心收集等電沉淀并凍干，得到150mg。偶聯(lián)產(chǎn)率為74％(LCMS m/z2148.9[(M+3)/3]，rt 5.04)。將被保護的產(chǎn)物溶于TFA(2.5ml)并保持1小時，在真空中蒸發(fā)。通過用C4-柱進行RP-HPLC純化粗產(chǎn)物，其中使用緩沖液A0.1％ TFA，緩沖液BMeCN+0.1％ TFA；梯度10-70％ B。凍干收集的級分。產(chǎn)率為75mg，52％。通過HPLC評估的純度為97.2％。
MALDI-MS6132.1，計算值6132.2。
叔丁基十八烷二?；?N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OSu的制備在115℃下將十八烷二酸(5.64g，17.9mmol)溶于甲苯(80ml)。在1.5小時內(nèi)滴加N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛(12.9ml，53.8mmol)。在回流3小時后，在20分鐘內(nèi)再加入N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛(2.15ml)。持續(xù)回流過夜并在20分鐘內(nèi)再加入N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛(2.15ml)。再攪拌2小時后，將該反應(yīng)混合物冷卻至RT。加入水和DCM。通過過濾除去二酸。用硅膠(40g)濃縮濾液并在1.5L硅膠柱上使用DCM/MeOH 14∶1進行純化。分離到十八烷二酸一叔丁酯，產(chǎn)率為53％(3.52g)。
LC-MS393(M+Na)，rt 6.40.
1H-NMR(DMSO-d6)δ1.22(br s，24H)，1.38(s，9H)，1.47(m，4H)，2.14(t，2H)，2.18ppm(t，2H)。
向十八烷二酸一叔丁酯(1,00g，2.7mmol)在無水THF(8ml)中的溶液中加入DIPEA(0,555ml，3.2mmol)，隨后加入TSTU(1,00g，3.2mmol)。將該反應(yīng)混合物在氮氣環(huán)境中攪拌18小時。蒸發(fā)溶劑。將AcOEt加入到殘余物中并過濾所得混懸液。用冷0.1M HCl(2x)和水洗滌濾液，干燥并濃縮，得到十八烷二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯，為白色固體。
1H-NMR(CDCl3)δ1.25(m s，20H)，1.39(m，2H)1.44(s，9H)，1.58(m，4H)，1.74(p，2H)，2.2(t，2H)，2.60(t，2H)，2,85ppm(m，2H)。
向H-Gly-OtBu(1.00g，6.0mmol)在無水DMF(6ml)中的混懸液中加入三乙胺(0.835ml，6.0mmol)。觀察到三乙胺鹽酸鹽沉淀。加入丙烯酸芐酯(0.910ml，6.0mmol)在DMF(6ml)中的溶液。將所得混懸液在室溫下攪拌2天。通過過濾除去沉淀并濃縮濾液。將殘余物溶于AcOEt并用飽和NaHCO3洗滌。干燥有機層(MgSO4)，過濾并濃縮得到澄清油狀物，將其通過快速色譜法純化，使用AcOEt/庚烷1∶3和1∶1作為洗脫劑。分離到N-叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn，產(chǎn)率為29％(0.505g)。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.43(s，9H)，2.55(t，2H)，2.92(t，2H)，3.30(s，2H)，5.15(s，2H)，7.65(m，5H)。
將十八烷二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯(0.15g，0.32mmol)和N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn(0.10g，0,32mmol)溶于無水DMF(2.5ml)并加入DIEA(0,070ml，0.38mmol)。在氮氣環(huán)境中攪拌30分鐘后，加入HOAt(0,045g，0.32mmol)，該混合物變成黃色。出于便利考慮，在RT下氮氣環(huán)境中持續(xù)攪拌13天。濃縮該反應(yīng)混合物。將殘余物溶于AcOEt，用0.1N HCl(2x)和水洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮得到叔丁基十八烷二?；?N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn，為白色油狀物。205mg，產(chǎn)率99％。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.25(m，26H)，1.45(s，9H)，1.50(s，9H)，1.6(m，4H)，2.20(t，2H)，2.40(t，2H)，2.75(q，2H)，3.62(t，2H)，3.97(s，2H)，5.20(s，2H)；7.35(m，5H)。
將叔丁基十八烷二?；?N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn(200mg，0.31mmol)溶于EtOAc(10ml)和THF(5ml)。加入10％ Pd/C并將該混合物在1atm下氫化16小時。過濾該反應(yīng)混合物，濃縮得到叔丁基十八烷二?；?N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OH，為澄清油狀物。產(chǎn)率180mg，100％。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.25(m，26H)，1.45(s，9H)，1.50(s，9H)，1.6(m，4H)，2.20(t，2H)，2.40(t，2H)，2.70(m，2H)，3.65(m，2H)，4.05(s，2H)。
將叔丁基十八烷二?；?N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OH(0,110g，0.2mmol)溶于無水THF(2ml)。加入DIEA(0,045ml，0.24mmol)和TSTU(0,075g，0.24mmol)。將該混合物在氮氣環(huán)境中攪拌18小時。過濾該反應(yīng)混合物。將AcOEt加入到濾液中，用0.2M HCl(2x)、鹽水(1x)洗滌，干燥(Na2SO4)，濃縮得到叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OSu，為澄清糖漿狀物。產(chǎn)率124mg，96％。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.25(m，26H)，1.40(s，9H)，1.57(s，9H)，1.6(m，4H)，2.40(m，4H)，2.58(br s，4H)，3.0(t，2H)，3.7(t，2H)，4.03(s，2H)。
實施例30NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(2-羧乙基)-Gly]des(B30)人胰島素的合成將A1N，B1N-diBoc DesB30人胰島素(Kurtzhals P；Havelund S；Jonassen I；Kiehr B；Larsen UD；Ribel U；Markussen J《生物化學(xué)雜志》(Biochemical Journal)，1995，312，725-731)(120mg，0.020mmol)溶于DMSO(1.2ml)。加入叔丁基十八烷二?；?N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OSu(16mg，0.025mmol)在THF(1.2ml)和三乙胺(0.033ml，0.24mmol)中的溶液(pH為10)。在室溫下緩慢攪拌3小時20分鐘后，加入水(4ml)并用1N HCl將pH調(diào)節(jié)至5.5。通過離心收集等電沉淀，用水洗滌并通過離心分離。凍干產(chǎn)物。通過用C18-柱進行RP-HPLC純化粗產(chǎn)物，其中使用緩沖液A0.1％ TFA，緩沖液BMeCN+0.1％ TFA；梯度20-90％ B。凍干收集的級分。未優(yōu)化的偶聯(lián)產(chǎn)率為15mg，11％(MALDI-MS 6441，計算值6444.5)。將被保護的產(chǎn)物溶于TFA(1ml)并保持1小時，在真空中蒸發(fā)。通過下列步驟純化粗產(chǎn)物用C4-柱進行RP-HPLC，其中使用緩沖液A0.1％ TFA，緩沖液BMeCN+0.1％ TFA；梯度10-80％ B；并用C4-柱進行RP-HPLC，其中使用緩沖液A20％ EtOH+0.1％ TFA，緩沖液B80％ EtOH+0.1％ TFA；梯度15-60％ B；隨后使用C4-柱進行HPLC，其中使用緩沖液A在20％ EtOH中的10mM Tris+15mM硫酸銨，pH 7.3，緩沖液B80％ EtOH，梯度15-60％ B。在Sep-Pak上使用70％乙腈+0.1％TFA給收集的級分脫鹽，通過添加氨中和并凍干。未優(yōu)化的產(chǎn)率為1.8mg，13％。通過HPLC評估的純度為96.4％。
MALDI6132.1，計算值6132.2。
叔丁基十八烷二?；?N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OSu的制備將H-Gly-OBn，HCl(3.03g，15mmol)溶于無水DMF(15ml)并在冰浴上冷卻。在TEA-鹽酸鹽沉淀中加入TEA(2.10，15mmol)。將該混懸液攪拌5分鐘，此后加入丙烯酸叔丁酯(2.20ml，15mmol)。使冷卻浴緩慢達到RT并在氮氣環(huán)境中持續(xù)攪拌2天。過濾該反應(yīng)混合物并濃縮濾液。將仍然含有DMF的殘余物溶于AcOEt并用飽和NaHCO3(2x)水溶液和水(1x)洗滌。過濾有機層，此后干燥(Na2SO4)并濃縮至得到黃色油狀物。通過快速色譜法或制備型HPLC純化，得到N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn，為澄清油狀物(0.739g，17％)。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.46(s，9H)2.50-2.61(m，2H)2.82-2.99(m，2H)3.31(s，2H)5.14(s，2H)7.29-7.43(m，5H)。
將N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn(0,030g，0.1mmol)和十八烷二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯(如實施例29中所述，0,050mg，0.1mmol)懸浮于無水DMF(1ml)中。加入HOAt(0,014g，0.1mmol)和DIEA(0,21ml，1.2mmol)。將該黃色反應(yīng)混合物在氮氣環(huán)境中攪拌42小時。濃縮該反應(yīng)混合物。將殘余物重新溶于AcOEt并用0.1NHCl(2x)、水(1x)洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮，得到叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn，產(chǎn)率為85％(55mg)。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.3(m，26H)1.38(s，9H)，1.46(s，9H)，1.6(m，4H)，2.2(m，2H)，2.35(m，2H)，2.65(m，2H)，2.85(s，2H)3.65(m，2H)，5.15(s，2H)7.35(m，5H)。
將叔丁基十八烷二?；?N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn(0,054g，0.08mmol)溶于THF(2ml)。加入10％披鈀碳并在周末將該混合物在1atm和RT下氫化。將無水反應(yīng)混合物溶于AcOEt并過濾3次以除去碳。濃縮濾液，得到叔丁基十八烷二?；?N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OH，產(chǎn)率為80％(37mg)。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.3(m，26H)1.40(s，9H)，1.46(s，9H)，1.6(m，4H)，1.75(p，2H)，2.2(m，2H)，2.35(m，2H)，2.63(m，2H)，2.83(s，2H)。
將叔丁基十八烷二?；?N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OH(0.07mmol)溶于無水THF(2ml)。加入TSTU(24mg，0.08mmol)和DIPEA(15uL，0.08mmol)。在RT下和氮氣環(huán)境中攪拌該混合物。19小時后，根據(jù)TLC(DCM/MeOH 10∶1)發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)未完成。再加入DIEA(20uL，0.11mmol)并持續(xù)攪拌。42小時后，過濾該反應(yīng)混合物。用AcOEt稀釋濾液并用0.1N HCl(2x)和鹽水(1x)洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮，得到叔丁基十八烷二?；?N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OSu，為白色固體，產(chǎn)率為84％(36mg)。
1H-NMR(CDCl3)δppm 1.3(m，26H)1.40(m，2H)，1.44(s，9H)，1.46(s，9H)，1.58(m，2H)，1.73(p，2H)，2.2(t，2H)，2.60(t，2H)，2.8(m，6H)。
實施例31NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰島素的合成按照與實施例30類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn與十六烷二酸琥珀酰亞胺酯(如實施例4中所述)反應(yīng)，隨后脫芐基化，用TSTU活化，與A1N，B1N-diBOC-Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。
MALDI-MS6093.0，計算值6104.1。
實施例32NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰島素的合成按照與實施例29類似的方式，通過下列步驟制備該化合物使N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn與十六烷二酸琥珀酰亞胺酯(如實施例4中所述)反應(yīng)，隨后脫芐基化，用TSTU活化，與A1N，B1N-diBOC-Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用TFA脫保護。
MALDI-MS6097.6，計算值6104.1。
實施例33NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO]-γ-L-Glu]des(B30)人胰島素的合成如實施例1中所述，使用如下所述制備的(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe作為?；瘎┲苽湓摶衔铩?br> LCMS(電霧化)M+32049，計算值2050；M+41538，計算值1537.8；M+51231，計算值1230.4.
MALDI-TOF MS計算值6147；測定值6153.
(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe的制備將MeOH(40ml)冷卻至0-5℃并在30分鐘過程中通過攪拌滴加SOCl2(4ml)。加入12-氨基十二酸(3g，13.9mmol)并在0-5℃下攪拌所得混懸液，同時熔化冰浴中的冰且在16小時過程中溫至室溫。過濾該混合物并通過抽吸干燥固體，得到2.23g(60％)的12-氨基十二酸甲酯鹽酸鹽。從母液中再分離到一批0.92g(25％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.97(bs，3H)，3.58(s，3H)，2.73(m，2H，2.28(t，2H)，1.52(m，4H)，1.25(“s”，14H)。
將12-氨基十二酸甲酯鹽酸鹽(1g，3.8mmol)懸浮于THF(15ml)中并加入戊二酸酐(1.29g，3.8mmol)和TEA(0.52ml，3.8mmol)，將所得混合物(混懸液)在室溫下攪拌16小時。逐步加入水(75ml)。25ml后，得到溶液，此后出現(xiàn)混懸液。將該混合物在室溫下攪拌1小時并過濾、用水洗滌固體并在真空中干燥。該步驟得到1.02g(80％)的12-(4-羧基丁酰氨基)十二酸甲酯。
1H-NMR(DMSO-d6)δ12(bs，1H)，7.73(t，1H)，3.57(s，3H)，3.00(q，2H)，2.28(t，2H)，2.18(t，2H)，2.06(t，2H)，1.69(p，2H)，1.50(p，2H)，1.36(p，2H)，1.23(“s”，14H)。
將12-(4-羧基丁酰氨基)十二酸甲酯(0.33g，0.95mmol)溶于THF與DMF(2∶1，6ml)的混合物中并加入DIEA(0.178ml，1.04mmol)。將該混合物冷卻至0-5℃并加入TSTU(0.314g，1.04mmol)。將該混合物在0-5℃下攪拌1小時并在室溫下攪拌16小時。將該混合物在真空中濃縮至干。將殘余物(OSu-活化的12-(4-羧基丁酰氨基)十二酸甲酯)溶于DMF(10ml)，并加入DIEA(0.24ml，1.4mmol)和H-Glu-OMe(0.168g，1.04mmol)，將該混合物在室溫下攪拌16小時。在真空中濃縮該混合物并將殘余物溶于AcOEt(100ml)，用0.2M鹽酸(3×50ml)洗滌。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮。該步驟得到0.358g(78％)的(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe。
1H-NMR(DMSO-d6)，δ12(bs，1H)，8.22(d，1H)，7.73(t，1H)，4.24(m，1H)，3.61(s，3H)，3.57(s，3H)，3.00(q，2H)，2.27(m，4H)，2.10(t，2H)，2.04(t，2H)，1.9(m，1H)，1.8(m，1H)，1.68(t，2H)，1.50(m，2H)，1.36(m，2H)，1.23(“s”，14H)。
將(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe(0.36g，0.36mmol)溶于THF(10ml)并冷卻至0-5℃。加入DIEA(0.13ml)和TSTU(0.129g，0.43mmol)并將該混合物在0-5℃下攪拌幾小時，在室溫下攪拌3天。在真空中濃縮該混合物。將從殘余物溶于AcOEt(100ml)并用0.2N鹽酸(3×50ml)和飽和NaHCO3水溶液(3×100ml)洗滌。干燥(Na2SO4)并在真空中濃縮，得到0.17g(84％)的(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe。
1H-NMR(DMSO-d6)，選擇的峰，δ8.27(d，1H)，7.72(t，1H)，4.31(m，1H)，3.63(s，3H)，3.57(s，3H)，3.00(q，2H)，2.81(s，4H)，2.28(t，2H)，2.12(t，2H)，2.05(t，2H)，1.70(m，2H)，1.50(m，2H)，1.35(m，2H)，1.23(“s”，14H)。
實施例34NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)2CO]-γ-L-Glu]des(B30)人胰島素的合成按照與實施例1中所述類似的方式，使用(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)2CO)-Glu(OSu)-OMe(它是按照與如實施例33中所述類似的方式，使用琥珀酸酐而非戊二酸酐制備的)作為酰化劑制備該化合物。
MALDI-TOF MS計算值6133；測定值6134。
實施例35NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)16CO)]-Gly-γ-L-Glu des(B30)人胰島素的合成按照與如實施例4中所述類似的方式，使用如下所述制備的叔丁基十八烷二?；?Gly-Glu(OSu)-OtBu作為?；瘎┲苽湓摶衔?。
MALDI-TOF MS計算值6189；測定值6191。
叔丁基十八烷二?；?Gly-Glu(OSu)-OtBu的制備向Z-Gly-OH(1.0g，4.78mmol)中加入THF(10ml)、DIEA(0.98ml，5.74mmol)和TSTU(1.7g，5.74mmol)，將所得混合物在室溫下攪拌2小時。加入AcOEt(100ml)并用0.2N鹽酸(100ml)和水(2×100ml)洗滌該混合物。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮，得到1.34g(92％)的Z-Gly-OSu，為油狀物。
1H-NMR(CDCl3)，δ7.35(s，5H)，5.32(t，1H)，5.15(s，2H)，4.35(d，2H)，2.83(s，4H)。
將Z-Gly-OSu(1.3g，4.25mmol)溶于DMF(15ml)并加入DIEA(1.82ml，10.6mmol)和H-Glu-OtBu(0.949g，4.67mmol)，將所得混合物在室溫下攪拌16小時。加入AcOE(100ml)并用0.2N鹽酸(100ml)和水(2×100ml)洗滌該混合物。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮，得到1.7g(定量)的Z-Gly-Glu-OtBu，為油狀物。
1H-NMR(CDCl3)，δ7.33(s，5H)，7.1(d，1H)，5.80(t，1H)，5.12(s，2H)，4.53(m，1H)，3.90(d，2H)，2.36(t，2H)，2.22(m，1H)，1.95(m，1H)，1.45(s，9H)。
將Z-Gly-Glu-OtBu(1.7g，4.3mmol)溶于1，4-二噁烷(15ml)并在N2環(huán)境中加入10％鈀黑(0.6g)。將該混合物在大氣壓下氫化5小時。過濾該混合物并將鈀與水(200ml)一起攪拌2小時，過濾并凍干濾液。該步驟得到0.65g(58％)的H-Gly-Glu-OtBu。
1H-NMR(DMSO-d6)，選擇的峰，δ8.31(d，1H)，2.20(t，2H)，1.91(m，1H)，1.80(m，1H)，1.40(s，9H)。
將H-Gly-Glu-OtBu(0.15g，0.58mmol)懸浮于DMF(5ml)中并加入DIEA(0.15ml，0.86mmol)和十八烷二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯(0.27g，0.58mmol)，將所得混合物在室溫下攪拌16小時。加入AcOEt(50ml)并用0.2N鹽酸(100ml)和水(3×100ml)洗滌該混合物。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮，得到0.34g(定量)的叔丁基十八烷二?；?Gly-Glu-OtBu。
1H-NMR(CDCl3)，δ7.11(d，1H)，6.55(t，1H)，4.55(dt，1H)，4.00(dq，2H)，2.40(t，2H)，2.26(t，2H)，2.20(t，4H)，2.00(m，1H)，1.57-1.65(m，5H)，1.47(s，9H)，1.44(s，9H)，1.25(“s”，22H，與HDO重疊)。
將叔丁基十八烷二?；?Gly-Glu-OtBu(0.32g，0.52mmol)溶于THF(5ml)并加入DIEA(0.11ml，0.63mmol)和TSTU(0.19g，0.63mmol)，將所得混合物在室溫下和N2中攪拌3天。加入AcOEt(100ml)并用0.15N鹽酸(100ml)和水(3×100ml)洗滌該混合物。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮，得到0.3g(81％)的叔丁基十八烷二?；?Gly-Glu(OSu)-OtBu。
1H-NMR(CDCl3)，選擇的峰，δ6.89(d，1H)，6.44(t，1H)，4.60(m，1H)，3.95(dq，2H)，2.86(s，4H)，2.68(q，2H)，2.24(t，2H)，2.20(t，4H)，1.57-1.65(m，5H)，1.48(s，9H)，1.44(s，9H)，1.25(“s”，22H，與HDO重疊)。
實施例36NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(2-羧乙基)-β-Ala]des B30人胰島素的合成按照與實施例1類似的方式制備該化合物，步驟如下使15-[[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-(2-甲氧羰基-乙基)-氨基甲?；鵠-十五烷酸甲酯與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)，并用NaOH脫保護。
LC-MSM+4.1530.3，計算值1529.5甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu的制備將H-β-Ala-OMe鹽酸鹽(5.45g，39mmol)溶于DMSO(100ml)，加入丙烯酸叔丁酯(5.71ml，39mmol)和DIEA(13.4ml，78mmol)，將所得混合物在室溫下攪拌6天。使該混合物在水(500ml)與AcOEt(2×250ml)之間分配。用飽和NH4Cl水溶液洗滌合并的有機相，干燥(MgSO4)并在真空中濃縮。該步驟得到7.24g(80％)的N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OtBu。
1H-NMR(CDCl3)δ3.58(s，3H)，2.72(t，2H)，2.67(t，2H)，2.41(t，2H)，2.29(t，2H)，1.39(s，9H)。
將十六烷二酸一甲酯(150mg，0.5mmol)溶于DMF(5mL)。加入HOAt(102mg，0.75mmol)和EDAC(143mg，0.75mmol)，將該反應(yīng)體系在50℃下攪拌1小時。在冷卻至室溫后，加入DIEA(0.256mL，1.5mmol)和N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OtBu(139mg，0.6mmol)。將該反應(yīng)體系在室溫下攪拌過夜。使該混合物在水(2×50mL)與AcOEt(100mL)之間分配。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮，得到油狀物。加入DCM(10mL)和TFA(10mL)，將該混合物在室溫下攪拌1小時，在真空中除去溶劑，得到170mg(87％)的甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基-β-Ala-OH。
LC-MS458(M+1)。
將甲基十六烷二?；鵑-(2-(甲氧羰基)乙基-β-Ala-OH(161mg，0.351mmol)溶于THF(10mL)。加入DIEA(0.073mL，0.42mmol)和TSTU(127mg，0.42mmol)。攪拌該混合物，同時用冰浴冷卻30分鐘，隨后在室溫下攪拌2小時。使該混合物分配在AcOEt(100mL)與HCl水溶液(0.2N，2×80mL)之間。干燥有機相(Na2SO4)并在真空中濃縮。該步驟得到140mg(72％)的甲基十六烷二?；鵑-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu，為油狀物。
LC-MS555(M+1)。
實施例37NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(2-羧乙基)-β-Ala]des B30人胰島素的合成按照與實施例1和36類似的方式，通過使甲基十八烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu與Des(B30)人胰島素偶聯(lián)并用NaOH脫保護而制備該化合物。
甲基十八烷二?；鵑-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu的制備按照與甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu類似的方式，使用十八烷二酸一甲酯合成該化合物。
MALDI-TOF MS計算值6146；測定值6151LC-MS583(M+1)藥理學(xué)方法試驗(I)本發(fā)明胰島素衍生物的胰島素受體結(jié)合通過SPA試驗(閃爍近似測定法)微量滴定板抗體俘獲試驗測定本發(fā)明胰島素類似物對人胰島素受體的親和性。將SPA-PVT抗體結(jié)合珠、抗-小鼠試劑(Amersham Biosciences，Cat No.PRNQ0017)與25ml結(jié)合緩沖液(100mM HEPES pH 7.8；100mM氯化鈉，10mM MgSO4，0.025％Tween-20)混合。用于單一Packard Optiplate(Packard No.6005190)的試劑混合物由2.4μl的1∶5000稀釋的純化重組人胰島素受體-外顯子11、相當(dāng)于5000cpm/100μl試劑混合物用量的A14 Tyr[125I]-人胰島素儲備溶液、12μl的1∶1000 F12抗體稀釋液、3ml的SPA-珠和結(jié)合緩沖液總計達12ml所組成。然后加入總計100μl，由合適的樣品制備一系列稀釋液。隨后向該稀釋液中加入100μl試劑混合物，將樣品保溫16小時，同時適度振搖。然后通過離心1分鐘分離各相并在Topcounter中對平板計數(shù)。使用非線性回歸算法，用GraphPadPrism 2.01(GraphPad Software，San Diego，CA)擬合結(jié)合數(shù)據(jù)。
單克隆mIR抗體的制備通過單克隆技術(shù)生產(chǎn)特異性抗體(F12)通過皮下注射在FCA中的50μg純化的mIR，隨后注射兩次在FIA中的20μgmIR，對RBF小鼠進行免疫接種。對高應(yīng)答者小鼠通過靜脈內(nèi)加強注射25μgmIR，在3天后取出脾。將脾細(xì)胞與骨髓瘤Fox細(xì)胞系(Khler，G & MilsteinC.(1976)，《歐洲免疫學(xué)雜志》(European J.Immunology)，6511-19；Taggart RT等(1983)，《科學(xué)》(Science)2191228-30)融合。在mIR特異性ELISA中篩選上清液的抗體產(chǎn)生?？寺￡栃钥撞⒃诘鞍踪|(zhì)印跡中測試。
表2
試驗(II)本發(fā)明胰島素衍生物相對于人胰島素的功效將在實驗當(dāng)天稱重為238-383g的Sprague Dawley雄性大鼠用于卡鉗實驗。使大鼠在受控的環(huán)境條件下自由攝食并在卡鉗實驗前禁食過夜(從3pm開始)。
實驗方案在實施外科手術(shù)前使大鼠適應(yīng)動物設(shè)施至少1周。在卡鉗實驗前約1周，在氟烷麻醉條件下將Tygon導(dǎo)管插入頸靜脈(用于輸注)和頸動脈(用于采集血樣)，取出并固定在頸背上。手術(shù)后對大鼠給予Streptocilin vet.(Boehringer Ingelheim；0.15ml/大鼠，肌內(nèi))并在恢復(fù)期過程中將其放入動物護理裝置內(nèi)(25℃)。為了獲得止痛作用，在麻醉過程中給予Anorphin(0.06mg/大鼠，皮下)，并在從麻醉狀態(tài)完全恢復(fù)后(2-3小時)給予卡洛芬(1.5mg/kg，s.c.)，并再每天一次給予2天。
采用來自(1)所用的卡鉗技術(shù)。將在實驗當(dāng)天的7am時，對禁食過夜(從前一天的3pm開始)的大鼠稱重，并與取樣注射器和輸注系統(tǒng)Harvard 22 Basic泵，Harvard，和Perfectum皮下玻璃注射器，Aldrich)連接，然后將其放入各自的卡鉗籠，在那里使它們靜止約45分鐘，此后開始實驗。大鼠能夠在整個實驗過程中在其常用的襯墊上自由運動，并可以自由飲水。30分鐘基礎(chǔ)期(在此過程中以10分鐘間隔測定血糖水平)后，以恒定速率將測試的胰島素衍生物和人胰島素(1個劑量水平/大鼠，n＝6-7/劑量水平)輸注(靜脈內(nèi))300分鐘。自始至終以10分鐘間隔測定血糖水平，并相應(yīng)地調(diào)節(jié)20％葡萄糖水溶液的輸注以便維持血糖正常。將來自每只大鼠的重懸浮紅細(xì)胞樣品合并，并通過頸動脈導(dǎo)管以約 體積返回。
在每一實驗天時，在卡鉗實驗前和該實驗結(jié)束時取測試的各胰島素衍生物溶液和人胰島素溶液的樣品，并通過HPLC證實肽類的濃度。在研究前和結(jié)束時的相關(guān)時間點處測定大鼠胰島素和C-肽以及待測試的胰島素衍生物和人胰島素的血漿濃度。在實驗結(jié)束時使用超劑量<p>實施例1連續(xù)、大規(guī)模一列式放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)該實施例以及隨后的實施例描述了成功發(fā)展了大規(guī)模放射性標(biāo)記的方法和裝置，具有可用于制藥工業(yè)中的優(yōu)勢。
本發(fā)明者已經(jīng)使用本發(fā)明的裝置和方法，尤其是以上結(jié)合圖9和

圖10所述的裝置和方法來放射性標(biāo)記，批量高達結(jié)合單克隆抗體的487GBq131I(表1)。整個過程需要約40分鐘，包括反應(yīng)時間，純化和最終配制。游離碘為0.1至2.1％?？偖a(chǎn)率最小為85％，最大量為96％。對每批標(biāo)記的抗體進行體積排阻色譜分析，其顯示可忽略的抗體裂解和凝聚，和高于95％的完整放射性標(biāo)記的抗體單體。大規(guī)模生產(chǎn)的示范性結(jié)果列于表1中。進行細(xì)胞結(jié)合潛能試驗來證明產(chǎn)物的高質(zhì)量，相對于同批生產(chǎn)中的未標(biāo)記抗體，其顯示出超過80％的潛能。
表1
實施例2連續(xù)、一列式放射性標(biāo)記并通過滲析純化該實施例特別涉及使用滲析來純化本發(fā)明大規(guī)模生產(chǎn)方法的放射性標(biāo)記產(chǎn)物。
該實施例中，待標(biāo)記蛋白質(zhì)是Lym-1抗體。涉及Lym-1抗體及其使用的進一步細(xì)節(jié)提供于美國專利No.4,724,213，發(fā)明名稱為“小鼠雜交瘤Lym-1以及因此產(chǎn)生的診斷抗體”；美國專利No.4,861,579，中的13170 mCi I-131，pH7.4。23ml硅反應(yīng)管118用于該放射性標(biāo)記批次。使用離子交換柱122來純化所得到的放射性標(biāo)記產(chǎn)物。該配置的流速是2.3ml/分鐘，其使用23ml反應(yīng)管給予了10分鐘反應(yīng)時間。該批次的標(biāo)記效率測定為95.6％。
實施例4ch-TNT-1/b抗體的連續(xù)、一列式放射性標(biāo)記和純化該實施例記載了使用離子交換柱來純化由本發(fā)明方法制得的第二種放射性標(biāo)記的抗體。
該研究中，待標(biāo)記的蛋白質(zhì)是Ch-TNT-1/b抗體。關(guān)于TNT抗體的更多細(xì)節(jié)提供于美國專利No.6,071,491，發(fā)明名稱為“壞死惡性組織的檢測及相關(guān)治療”，其特地在此以其整體引入作為參考。
使用如上實施例3中所述的相似配置用I-131(鈉鹽)標(biāo)記Ch-TNT-1/b抗體，用17ml硅反應(yīng)管和3ml Dowex離子交換柱。每種試劑所用的體積如下4ml I-131，4ml抗體和22ml氯胺-T，以及其各自的濃度顯示于以下的表2中。收集瓶裝滿輻射防護劑，包括1.4至1.5g抗壞血酸鈉和37至39ml 25％的血清白蛋白。然后將所得到的放射性標(biāo)記產(chǎn)物稀釋入0.9％鹽水中來獲得終濃度。顯示于表2中的結(jié)果表明88％或更高的產(chǎn)量或標(biāo)記效率，使用10分鐘洗脫或反應(yīng)時間，使用如圖10所示的配置。
表權(quán)利要求
1.胰島素衍生物及其任意的Zn2+復(fù)合物，該胰島素衍生物是在母體胰島素B鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基處或者在B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基處連接了側(cè)鏈的天然存在的胰島素或其類似物，該側(cè)鏈具有如下一般通式-W-X-Y-Z其中W為·在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的α-氨基酸殘基，該殘基以其羧酸基團之一和母體胰島素B鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基一起形成酰胺基；·由彼此通過酰胺鍵連接的2、3或4個α-氨基酸殘基組成的鏈，該鏈通過酰胺鍵與母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基相連接，W的氨基酸殘基選自帶有中性側(cè)鏈的氨基酸殘基和在側(cè)鏈上帶有羧酸基團的氨基酸殘基組成的組，使得W具有至少一個在側(cè)鏈上含有羧酸基團的氨基酸殘基；或·X與母體胰島素B鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基之間的共價鍵；X為·-CO-；·-CH(COOH)CO-；·-N(CH2COOH)CH2CO-；·-N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-；·-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；·-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-；·-N(CH2CH2COOH)CH2CO-；或·-N(CH2COOH)CH2CH2CO-；a)當(dāng)W為氨基酸殘基或氨基酸殘基鏈時，上述X的基團通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與W上的氨基形成酰胺鍵，或b)當(dāng)W為共價鍵時，上述X的基團通過來自加下劃線的羰基碳的鍵與母體胰島素B鏈上的N-末端α-氨基或者與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵；Y為·-(CH2)m-，其中m為6-32的整數(shù)；·二價烴鏈，其中含有1、2或3個-CH＝CH-基團和大量足以在鏈上獲得10-32個碳原子總數(shù)的-CH2-基團；·通式-(CH2)vC6H4(CH2)W-的二價烴鏈，其中v和w為整數(shù)或其中之一為0，使得v與w之和在6-30的范圍；且Z為·-COOH；·-CO-ASp；·-CO-Glu；·-CO-Gly；·-CO-Sar；·-CH(COOH)2；·-N(CH2COOH)2；·-SO3H；或·-PO3H；條件是當(dāng)W為共價鍵且X為-CO-時，Z不是-COOH。
2.權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中側(cè)鏈-W-X-Y-Z與母體胰島素B鏈的N-末端氨基酸殘基的α-氨基連接。
3.權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其中側(cè)鏈-W-X-Y-Z與母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基連接。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項的胰島素衍生物，其中W為共價鍵。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項的胰島素衍生物，其中W為有4-10個碳原子的α-氨基酸殘基。
6.權(quán)利要求5的胰島素衍生物，其中W選自α-Asp、β-Asp、α-Glu、γ-Glu、α-hGlu和δ-hGlu組成的組。
7.權(quán)利要求1-3中任意一項的胰島素衍生物，其中W為由兩個α-氨基酸殘基組成的鏈，在這兩個α-氨基酸殘基之中，其一帶有4-10個碳原子和游離的羧酸基團，而另一個帶有2-11個碳原子，但不含游離羧酸基團。
8.權(quán)利要求7的胰島素衍生物，其中W選自α-Asp-Cly、Gly-α-Asp、β-Asp-Gly、Gly-β-Asp、α-Glu-Gly、Gly-α-Glu、γ-Glu-Gly、Gly-γ-Glu、α-hGlu-Gly、Gly-α-hGlu、δ-hGlu-Gly和Gly-δ-hGlu組成的組。
9.權(quán)利要求1-3中任意一項的胰島素衍生物，其中W為由兩個α-氨基酸殘基組成的鏈，這兩個α-氨基酸殘基獨立地有4-10個碳原子且均具有游離羧酸基團。
10.權(quán)利要求9的胰島素衍生物，其中W選自下述組中α-Asp-α-Asp；α-Asp-α-Glu；α-Asp-α-hGlu；α-Asp-β-Asp；α-Asp-γ-Glu；α-Asp-δ-hGlu；β-Asp-α-Asp；β-Asp-α-Glu；β-Asp-α-hGlu；β-Asp-β-Asp；β-Asp-γ-Glu；β-Asp-δ-hGlu；α-Glu-α-Asp；α-Glu-α-Glu；α-Glu-α-hGlu；α-Glu-β-Asp；α-Glu-γ-Glu；α-Glu-δ-hGlu；γ-Glu-α-Asp；γ-Glu-α-Glu；γ-Glu-α-hGlu；γ-Glu-β-Asp；γ-Glu-γ-Glu；γ-Glu-δ-hGlu；α-hGlu-α-Asp；α-hGlu-α-Glu；α-hGlu-α-hGlu；α-hGlu-β-Asp；α-hGlu-γ-Glu；α-hGlu-δ-hGlu；δ-hGlu-α-Asp；δ-hGlu-α-Glu；δ-hGlu-α-hGlu；δ-hGlu-β-Asp；δ-hGlu-γ-Glu；和δ-hGlu-δ-hGlu。
11.上述權(quán)利要求中任意一項的胰島素衍生物，其中X為-CO-或-CH(COOH)CO-。
12.權(quán)利要求1-10中任意一項的胰島素衍生物，其中X為·-N(CH2COOH)CH2CO-；·-N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-；·-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-·-N(CH2CH2COOH)CH2CO-；或·-N(CH2COOH)CH2CH2CO-。
13.上述權(quán)利要求中任意一項的胰島素衍生物，其中Y為-(CH2)m-，其中m為6-32、8-20、12-20或12-16的整數(shù)。
14.上述權(quán)利要求中任意一項的胰島素衍生物，其中Z為-COOH。
15.權(quán)利要求1-13中任意一項的胰島素衍生物，其中Z為-CH(COOH)2。
16.權(quán)利要求1-13中任意一項的胰島素衍生物，其中Z為-N(CH2COOH)2。
17.權(quán)利要求1-13中任意一項的胰島素衍生物，其中Z為-SO3H。
18.權(quán)利要求1-13中任意一項的胰島素衍生物，其中Z為-PO3H。
19.上述權(quán)利要求中任意一項的胰島素衍生物，其中母體胰島素在A21位上具有Asn或Gly。
20.權(quán)利要求1-18中任意一項的胰島素衍生物，其中母體胰島素為des(B1)類似物。
21.權(quán)利要求1-18中任意一項的胰島素衍生物，其中母體胰島素為des(B30)類似物.
22.權(quán)利要求1-18中任意一項的胰島素衍生物，其中母體胰島素上的B29位可以是除Cys、Met、Arg和Lys外的任意可編碼的氨基酸，并且B30位上的氨基酸是Lys。
23.權(quán)利要求1-18中任意一項的胰島素衍生物，其中母體胰島素在B29位上具有Thr，并且在B30位上具有Lys。
24.權(quán)利要求1-18中任意一項的胰島素衍生物，其中母體胰島素選自人胰島素、des(B1)人胰島素、des(B30)人胰島素、GlyA21人胰島素、GlyA21des(B30)人胰島素、AspB28人胰島素、豬胰島素、LysB28ProB29人胰島素、GlyA21ArgB31ArgB32人胰島素和LysB3GluB29人胰島素組成的組。
25.權(quán)利要求1的胰島素衍生物，其選自下組中NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)17CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)18CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO-)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-α-Glu-N-(β-Asp))des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Gly-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素；(NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-β-Asp)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-α-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-D-Glu)des(B30)人胰島素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)des(B30)人胰島素NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)des(B30)人胰島素；NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)des(B30)人胰島素；NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)des(B30)人胰島素；NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰島素；NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰島素；和NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰島素。
26.上述權(quán)利要求中任意一項的胰島素衍生物的鋅復(fù)合物，其中每個胰島素六聚物結(jié)合2個鋅離子、3個鋅離子或4個鋅離子。
27.用于對需要治療的患者治療糖尿病的藥物組合物，其中包含治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物和藥學(xué)上可接受的載體。
28.用于對需要治療的患者治療糖尿病的藥物組合物，其中包含治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物與具有快速起效的胰島素類似物或胰島素的混合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
29.對需要治療的患者治療糖尿病的方法，包括對所述患者給予治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物與藥學(xué)上可接受的載體。
30.對需要治療的患者治療糖尿病的方法，包括對所述患者給予治療有效量的權(quán)利要求1的胰島素衍生物與具有快速起效的胰島素類似物或胰島素的混合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰島素衍生物，該胰島素衍生物是在母體胰島素B鏈N－末端氨基酸殘基的α－氨基處或者在母體胰島素B鏈上存在的Lys殘基的ε－氨基處連接了側(cè)鏈的天然存在的胰島素或其類似物，該側(cè)鏈具有如下一般通式－W－X－Y－Z；其中W、X、Y和Z如本說明書中所定義。
文檔編號A61P5/50GK1829738SQ200480021733
公開日2006年9月6日 申請日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月5日
發(fā)明者I·約納森, T·赫格-延森, S·哈韋倫德, U·里貝爾-馬德森, T·M·塔格莫塞, P·馬德森 申請人:諾沃挪第克公司