專利名稱：華中五味子酮在制備防治阿爾茨海默病藥物或食品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是將華中五味子酮用于制備防治阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)藥物或食品的用途。
背景技術(shù)：
AD是一種以記憶減退、認(rèn)知障礙、人格改變?yōu)榕R床特征的老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著全球人口老齡化，AD的防治已經(jīng)成為一個突出的、亟待解決的醫(yī)療和社會問題，但由于AD的病因不完全明確，迄今尚無有效的防治藥物。
β-淀粉樣蛋白(Beta-Amyloid Protein，Aβ)異常沉積形成的老年斑是AD典型的病理特征。斑塊周圍顯著的神經(jīng)退行性改變和膠質(zhì)細(xì)胞的活化提示Aβ可能是引起AD中神經(jīng)元丟失和炎癥反應(yīng)的原因。在神經(jīng)退行性病變中，膠質(zhì)細(xì)胞的活化與神經(jīng)元的死亡具有同等重要的作用，且兩者之間存在一定聯(lián)系(詳見Bales KR，Du Y，et al.TheNF-kappaB/Rel family of proteins mediates Abeta-induced neurotoxicityand glial activation.Brain Res Mol Brain Res.1998；57(1)63-72.)。
2004年2月11日結(jié)束的國際氧化應(yīng)激與神經(jīng)變性病研討會上，來自10余個國家和地區(qū)的學(xué)者一致認(rèn)為，氧化應(yīng)激增強(qiáng)和伴發(fā)的炎癥反應(yīng)是包括AD在內(nèi)的許多神經(jīng)變性病共有的兩個主要特征。
華中五味子酮(Schisandrone)是從華中五味子(Schisandrasphenanthera Rehd.et Wils.)中提取分離得到的一種具有4-苯代四氫萘骨架的木脂素。有研究顯示華中五味子酮對維生素C-NADPH系統(tǒng)或Fe2+-半胱氨酸系統(tǒng)誘發(fā)的腦微粒體脂質(zhì)過氧化有抑制效應(yīng)，對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子具有清除作用，其抗氧化活性強(qiáng)于維生素E，對處于活性氧應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞具有保護(hù)作用(詳見 黃詒森、何燕、張均田.五味子三種成分的抗氧化作用.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志.1990，4(4)275-277.)。但其對AD是否具有防治作用尚未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用Aβ孵育原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的方法建立Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的細(xì)胞模型，以及大鼠側(cè)腦室內(nèi)微量注射Aβ的方法建立AD的動物模型，采用五味子酮進(jìn)行藥物干預(yù)，通過生物化學(xué)、半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、行為學(xué)等方法觀察體外及在體條件下Aβ的神經(jīng)毒性及五味子酮對Aβ所致毒性的干預(yù)作用。從細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，華中五味子酮對AD具有防治作用，其表現(xiàn)為華中五味子酮能夠減少Aβ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產(chǎn)生，降低Aβ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1beta，IL-1β)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)的轉(zhuǎn)錄水平；并對AD樣大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害有一定程度的改善作用。因此可將華中五味子酮用于制備防治AD的藥物或食品。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(一)動物 新生24小時內(nèi)SD大鼠，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
(二)藥品及試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，Neuro-basal+B27(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，馬血清(Gibco公司)，多聚-L-賴氨酸(Sigma公司)，阿糖胞苷(法瑪西亞公司)，Aβ25-35(Sigma公司)，華中五味子酮(純度＞98％)由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室陳海生教授提供(制備方法詳見Li LN，Xue H.Schisandrone，a new 4-aryltetralonelignan from Schisandra sphenanthera.Planta medica.1985；(3)217.)，活性氧測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，總RNA抽提試劑Trizol(Gibco公司)，One Step RNAPCRKit(TaKaRa公司)，瓊脂糖(Promega公司)。
(三)制備神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞 取新生24小時內(nèi)SD大鼠，無菌條件下取腦，剔除腦膜和血管，分離出雙側(cè)海馬，冰浴解剖液洗2次，剪碎，加入1.25g/L胰酶2ml，置37℃、5％(V/V)CO2培養(yǎng)箱中消化15分鐘，終止消化后用尖端已被火焰拋光的滴管吹打成懸液，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，沉淀用完全培養(yǎng)液(含100g/L胎牛血清和100g/L馬血清的DMEM培養(yǎng)液)吹打成細(xì)胞懸液，過200目不銹鋼篩網(wǎng)，并將濾液細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×106個/ml，以5ml/瓶接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的75cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中貼壁24小時后全量換液，以后每2天半量換液1次，此為混合細(xì)胞。第5天，取部分混合細(xì)胞，加入含終濃度為5μmol/L阿糖胞苷的上述完全培養(yǎng)液培養(yǎng)以抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，得到神經(jīng)元細(xì)胞備用；其余混合細(xì)胞置37℃空氣恒溫浴中低速振蕩4小時，收集脫落細(xì)胞懸液，接種于直徑3.5cm培養(yǎng)皿中，貼壁1小時，棄去未貼壁細(xì)胞，加入上述完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，得到小膠質(zhì)細(xì)胞備用。
(四)觀察華中五味子酮對神經(jīng)細(xì)胞受Aβ?lián)p傷的保護(hù)作用1.溶液配制①配制含Aβ的無血清培養(yǎng)液a.將Aβ25-35溶于Neuro-basal+B27無血清培養(yǎng)液，使Aβ濃度為50μmol/L，用于培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞；b.將Aβ25-35溶于DMEM無血清培養(yǎng)液，使之濃度為50μmol/L，用于培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞。
上述配制好的含Aβ的無血清培養(yǎng)液需置37℃恒溫箱內(nèi)孵育3天進(jìn)行老化后才能使用，可置37℃儲存?zhèn)溆谩?br> ②配制含華中五味子酮的無血清培養(yǎng)液同法將華中五味子酮分別溶于上述兩種無血清培養(yǎng)液，濃度均為10mmol/L，置37℃?zhèn)溆谩?br> 2.細(xì)胞分組 將上述(三)所制備并培養(yǎng)7天的神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞各分為3組空白對照組、Aβ?lián)p傷組和華中五味子酮干預(yù)組。
①神經(jīng)元細(xì)胞a.空白對照組用Neuro-basal+B27無血清培養(yǎng)液換液；b.Aβ?lián)p傷組用上述配制的含Aβ25-35的Neuro-basal+B27無血清培養(yǎng)液換液，Aβ終濃度為1μmol/L；c.華中五味子酮干預(yù)組用上述配制的含Aβ25-35的Neuro-basal+B27無血清培養(yǎng)液和含華中五味子酮的Neuro-basal+B27無血清培養(yǎng)液換液后共孵育，培養(yǎng)液中Aβ終濃度為1μmol/L，華中五味子酮終濃度為100μmol/L。
經(jīng)上述換液后的神經(jīng)元細(xì)胞置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，檢測神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。
②小膠質(zhì)細(xì)胞a.空白對照組用DMEM無血清培養(yǎng)液換液；b.Aβ?lián)p傷組用上述配制的含Aβ25-35的DMEM無血清培養(yǎng)液換液，Aβ終濃度為1μmol/L；c.華中五味子酮干預(yù)組用上述配制的含Aβ25-35的DMEM無血清培養(yǎng)液和含華中五味子酮的DMEM無血清培養(yǎng)液換液后共孵育，培養(yǎng)液中Aβ終濃度為1μmol/L，華中五味子酮終濃度為100μmol/L。
經(jīng)上述換液后的小膠質(zhì)細(xì)胞置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，檢測小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、iNOS的轉(zhuǎn)錄水平。
3.對神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響 將上述培養(yǎng)48小時后的神經(jīng)元細(xì)胞用生理鹽水沖洗3遍，加入1.25g/L胰蛋白酶2ml，置37℃、5％(V/V)CO2培養(yǎng)箱中消化15分鐘，顯微鏡下見細(xì)胞變?yōu)閳A形，震蕩培養(yǎng)瓶使之脫落，隨即加入Neuro-basal+B27無血清培養(yǎng)液終止消化，收集于離心管，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用生理鹽水2ml吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×106個/ml，超聲粉碎細(xì)胞，功率15瓦，5秒/次共3次，間歇10秒，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清進(jìn)行ROS的測定和計(jì)算，具體方法詳見試劑盒說明書。結(jié)果見表1。
表1 各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的ROS含量(x±s)例數(shù)(n)ROS含量(U/ml)空白對照組 325.46±1.58Aβ?lián)p傷組3244.58±3.86★華中五味子酮干預(yù)組 3215.70±2.13☆※★Aβ?lián)p傷組與空白對照組比較，P＜0.01☆華中五味子酮干預(yù)組與空白對照組比較，P＜0.01※華中五味子酮干預(yù)組與Aβ?lián)p傷組比較，P＜0.01由表1可見，Aβ?lián)p傷組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯高于空白對照組(P＜0.01)，說明Aβ對神經(jīng)細(xì)胞有毒害；而華中五味子酮干預(yù)組由于華中五味子酮的干預(yù)，使神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯低于Aβ?lián)p傷組(P＜0.01)，雖較空白對照組為高，但仍顯示出華中五味子酮對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。
4.對小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β、iNOS轉(zhuǎn)錄水平的影響①設(shè)計(jì)并合成引物 引物由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列見表2。
表2 人工合成引物序列目標(biāo)產(chǎn)物引物序列產(chǎn)物片斷上游引物5’-CTC CAT GAG CTT TGT ACA AGG-3’IL-1β 245bp下游引物5’-TGC TGA TGT ACC AGT TGG GG-3’上游引物5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCA TG-3’iNOS317bp下游引物5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’β-actin上游引物5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’764bp(內(nèi)參照)下游引物5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCTAG-3’②制備細(xì)胞總RNA 用Trizol試劑按照說明書抽提上述培養(yǎng)48小時后的小膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA。
③RT-PCR 以引物為介導(dǎo)、總RNA為模板使mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系的建立詳見One Step RNA PCR Kit的說明書。反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄50℃30分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶94℃2分鐘；進(jìn)入循環(huán)變性94℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分鐘，共40個循環(huán)。
④產(chǎn)物分析 將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖(含0.5μg/ml溴化乙錠)凝膠電泳，并置于自動凝膠成像儀中，用隨機(jī)軟件分析各條帶的光密度值，得到IL-1β或iNOS mRNA的相對表達(dá)量(內(nèi)參照為β-actin)。結(jié)果見表3。
表3 各組小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β及iNOS的mRNA水平(x±s)例數(shù)(n)IL-1β iNOS空白對照組 15 0.3066±0.09830.4553±0.0975Aβ?lián)p傷組 15 0.8474±0.11341.0080±0.1058★華中五味子酮預(yù)組15 0.4240±0.10540.5138±0.1053☆※★Aβ?lián)p傷組與空白對照組比較，P＜0.01☆華中五味子酮干預(yù)組與Aβ?lián)p傷組比較，P＜0.01※華中五味子酮干預(yù)組與空白對照組比較，P＞0.01由表3可見，Aβ?lián)p傷組小膠質(zhì)細(xì)胞的IL-1β或iNOS轉(zhuǎn)錄水平較空白對照組有明顯升高(P＜0.01)，說明Aβ對神經(jīng)細(xì)胞有毒害作用；而華中五味子酮干預(yù)組由于華中五味子酮的干預(yù)，使IL-1β、iNOS的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于Aβ?lián)p傷組(P＜0.01)，并與空白對照組無明顯差異(P＞0.01)，說明華中五味子酮對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。
實(shí)施例2.動物實(shí)驗(yàn)(一)動物及飼養(yǎng) 雄性SD大鼠，鼠齡8-12周，體重250-300g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)溫度(23±0.5)℃，濕度(50±0.5)％，自然光線，自由進(jìn)食進(jìn)水。
(二)溶液配制1.腦室內(nèi)注射用Aβ溶液的配制 將Aβ25-35溶于無菌生理鹽水，使Aβ濃度為10mmol/L，置37℃恒溫箱內(nèi)孵育3天老化后備用。
2.灌胃用華中五味子酮溶液的配制 將華中五味子酮溶于玉米油，使之濃度為1mmol/L備用。
(三)實(shí)驗(yàn)方法 將SD大鼠隨機(jī)分為3組空白對照組、Aβ?lián)p傷組和華中五味子酮干預(yù)組。
1.空白對照組 大鼠予玉米油灌胃7天，方法為用灌胃針將2ml玉米油灌入大鼠胃內(nèi)，1次/天，第8天側(cè)腦室內(nèi)注射無菌生理鹽水，再繼續(xù)用玉米油灌胃7天；2.Aβ?lián)p傷組 大鼠予玉米油灌胃7天，方法同上，第8天側(cè)腦室內(nèi)注射上述配制的Aβ溶液，再繼續(xù)用玉米油灌胃7天，；3.華中五味子酮干預(yù)組 大鼠予上述配制的含華中五味子酮的玉米油灌胃7天，方法同上，第8天側(cè)腦室內(nèi)注射上述配制的Aβ溶液，再繼續(xù)用含華中五味子酮的玉米油灌胃7天。
上述第8天側(cè)腦室注射的方法；先將大鼠用2％戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40-50mg/kg體重)后，固定于腦立體定向儀上，剪去頭頂部毛發(fā)，碘酊消毒后切開皮膚，參照Paxinos的《大鼠腦立體定位圖》選擇右側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū)，于前囟向后1.0mm，中線旁開1.7mm處，用牙科鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，再用微量注射器以15μm秒的速度自腦表面垂直進(jìn)針3.8mm，將10mmol/L Aβ25-35溶液5μl緩慢注入，留針2分鐘后緩慢撤針，縫合切口?？瞻讓φ战M則注入等體積無菌生理鹽水。
(四)觀察華中五味子酮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用 將各組大鼠進(jìn)行Y型電迷宮測試。選用電壓30V，設(shè)A臂為起步區(qū)，按B→C→A臂順序輪流作為安全區(qū)。大鼠在A臂起步區(qū)停留1分鐘后，予以電擊致其逃至安全區(qū)，再以此區(qū)作為起步區(qū)，作連續(xù)循環(huán)電擊，兩次電擊之間休息1分鐘。
1.學(xué)習(xí)測試 規(guī)定大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng)，以達(dá)到連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)(即嘗試次數(shù))表示其學(xué)習(xí)獲得能力。若嘗試次數(shù)超過35次則不再測試，并以35次為最大值計(jì)數(shù)。
2.記憶測試 大鼠休息24小時后，同法檢測記憶力。以達(dá)到連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)前所需的電擊次數(shù)作為記憶成績，同樣以35次為最大值。結(jié)果見表4。
表4 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶水平(x±s)例數(shù)(n) 學(xué)習(xí)成績(次) 記憶成績(次)空白對照組 88.25±11.76 5.75±6.43Aβ?lián)p傷組 834.17±10.03 25.83±14.37★華中五味子酮干預(yù)組 814.63±11.92 6.38±12.85☆※★Aβ?lián)p傷組與空白對照組比較，P＜0.01☆華中五味子酮干預(yù)組與Aβ?lián)p傷組比較，P＜0.01※華中五味子酮干預(yù)組與空白對照組比較，P＞0.01由表4可見，Aβ?lián)p傷組大鼠的學(xué)習(xí)記憶水平明顯較空白對照組差(P＜0.01)，說明Aβ對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害；而華中五味子酮干預(yù)組由于華中五味子酮的干預(yù)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶水平明顯優(yōu)于Aβ?lián)p傷組(P＜0.01)，且與空白對照組無明顯差異(P＞0.01)，說明華中五味子酮對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害有改善作用。
上述各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，華中五味子酮能夠減少Aβ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產(chǎn)生，降低Aβ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1 beta，IL-1β)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase，iNOS)的轉(zhuǎn)錄水平；并對AD樣大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害有一定程度的改善作用。因此可將華中五味子酮用于制備防治AD的藥物或食品。
權(quán)利要求
1.華中五味子酮在制備防治阿爾茨海默病藥物或食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是華中五味子酮用于制備防治阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)藥物或食品的用途。華中五味子酮(Schisandrone)是從華中五味子中提取分離得到的一種具有4－苯代四氫萘骨架的木脂素。本發(fā)明通過細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)，顯示華中五味子酮對AD具有防治作用，其表現(xiàn)為華中五味子酮能夠減少Aβ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中活性氧(ROS)的產(chǎn)生，降低Aβ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中白細(xì)胞介素－1β(IL－1β)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的轉(zhuǎn)錄水平；并對AD樣大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害有一定的改善作用。因此華中五味子酮可用于制備防治AD的藥物或食品。本發(fā)明為華中五味子酮的應(yīng)用開辟了一個新途徑。
文檔編號A61K31/075GK1561975SQ20041001764
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月13日
發(fā)明者拓西平, 陳海生, 賈麗艷, 周俊, 朱嘉琦 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)