專利名稱：土槿皮酸類衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及半合成抗腫瘤或抗真菌藥物，具體涉及半合成新的土槿皮酸類衍生物以及它們的制備方法和用途。
本發(fā)明首次發(fā)現土槿皮酸類化合物以及它們新的衍生物可以抑制人微血管內皮細胞的生長，因而它們可以通過抑制腫瘤組織內血管的形成(腫瘤的惡性增生取決于腫瘤組織內血管的生長)，減少腫瘤細胞所需的氧及養(yǎng)分的供應，來抑制腫瘤細胞的分裂繁殖，從而導致腫瘤萎縮甚至消失。
同時，由于腫瘤組織內血管生長被抑制，腫瘤細胞通過腫瘤組織內新生的血管侵入循環(huán)系統的通道即被切斷，從而可以防止腫瘤的轉移。因而在治療癌癥時，它們可以用作血管生長抑制劑來提高治療的效果，尤其在治療中如果長期用藥可防止腫瘤轉移和復發(fā)。而目前，尚無作用于此靶標的藥物上市。
關于血管生成與癌癥之間的關系，公開于下列文獻中1. Cockerill G.W.，Gamble T.R.，Vadas M.A.，＂Angiogenesismodels andmodulators＂，Int.Rev.Cytol.，Vol.159(1995)，pp.113-160；2. Senger D.R.，Van de water L.，Brown L.F.，et al.，＂VaScular permeabilityfactor(VPF，VEGF) in tumor biology＂，Cancer Metastasis Rev.，Vol.12(1993)，pp.303-324；3. Donovan D.，Harmey J.H.，Redmond H.P.et al.，＂Ascites revisitedanovel role for tamoxifen＂，Eur.J.Surg.Oncol.，Vo.123(1997)，pp.570；4. Ingber D，Fujita T.，Kishimoto S.et al.，＂Synthetic analogues offumagillin that inhabit angiogenesis and suppress tumor growth＂，Nature，Vol.348(1990)，pp.555-560；5. Jiang W.G.，Puntis M.C.A.，Hallett M.B.，＂molecular and cellular basis ofcancer invasion and metastasisimplications for treatment＂，Br. J. Surg，Vol.81(1994)，pp.1576-1590；6. Fidle I.J.，Gerstein D.M.，Hart I.R.，＂The biology of cancer invasion andmetastasis＂，Adv.Cancer Res.，Vol.28(1978)，pp.149-250；7. Hanahan D.，Folkman J.，＂Patterns and emerging mechanisms of theangiogenic Switch during tumorigenesis＂，Cell.，Vol.86(1996)，pp.353-364；8. Ferrara N.，＂The role of vascular endothelial growth factor inpathological angiogenesis＂，Breast Cancer Res.Treat，Vol.36(1995)，pp.127-137；9.O′Reilly M.，Holmgren L.，Shing Y.，et al.，＂Angiostainanovel angenesisinhabitor that medicates the suppression of metastases by a Lewis lungcarcinoma＂，Cell.，Vol.79(1994)，pp.689-692；10.O′Reilly M.S.，Holmgren L.，Chen C.，et al.，＂Angiostatin induces andSustains domancy of human primary tumors in mice＂，Nature Med.，Vol.2(1996)，pp.689-692；11.O′Reilly M.S.，Boehm J.，Shing Y.，et al.，＂Endosatatinan endogenousinhabitator of angiogenesis and tumor，growth＂，Cell.，Vol.88(1997)，pp.277-285；12.Frank R.E.，Saclarides T.J.，Sue Leurgans，et al.，＂Tumor angiogenesis asa predictor of recurrence and survival in patients with node-negative colon cancer＂，Ann.Surg.，Vol.222(1995))，pp.695-699。
本發(fā)明目的是尋找具有抗腫瘤或/及抗真菌活性的土槿皮酸類新衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供該類衍生物的制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供土槿皮酸類新衍生物在治療腫瘤或抗真菌方面的用途。
(b)R2各自獨立地為H，烷基?；蓟〈耐轷；蓟；s環(huán)基?；?。
(c)R3各自獨立地為COXY，胺基，鹵素；其中X各自獨立地為O或NH，Y各自獨立地為H，NH2，羥基，烷基，環(huán)烷基，雜環(huán)烷基，雜原子取代的烷基，叔胺基取代的季胺鹽烷基，芳基，芳基烷基，多羥基烷基。
如本文所用，除非特別注明，烷基指飽和的和不飽和的、取代的和不取代的直鏈，支鏈的烷烴鏈，優(yōu)選丙基，2-甲基丙基，2，2-二甲基丙基，環(huán)烷基指取代的和非取代的環(huán)烷基，優(yōu)選環(huán)己基；芳基指取代的和非取代的、雜環(huán)的和非雜環(huán)的芳香基團；芳基烷基指芳基上取代的和非取代的芳基烷基；雜環(huán)烷基指取代的和非取代的、芳香的和非芳香的雜環(huán)基烷基，優(yōu)選(α-呋喃)基亞甲基；在本發(fā)明的化合物結構中，R1按活性優(yōu)選酯基；R2按活性優(yōu)選乙?；?；R3按活性優(yōu)選羧基或(間羥基苯胺)基?；?br> 本發(fā)明的化合物可以采用土槿皮乙酸或具有土槿皮酸類化合物的母核的衍生物為原料(原料的制備請參考文獻De-Ji Pan(潘德濟)，Zhu-lian Li(李珠蓮)et al.，“The cytotoxic principles of pseudolarix kaempferiPseudolaricacid-A and-B and related derivatives”，《Plant medica》，Vol.56(1990)，pp.383-385)，經過數步反應制得，反應條件溫和，方法簡便，收率較高；易于擴大工業(yè)化，也可用在抗腫瘤藥物和抗真菌藥物的制備上。
本發(fā)明的化合物可用以下流程中的一個或幾個流程結合制備得到 (a)Rm，R′m可以獨立地為H或各種取代基，如Rm，R′m自獨立地為甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基等；或Rm＝R′m＝-(CH2)n-，其中n＝2-5；(b)有些胺類化合物在反應后R2會失去變成H；(c)酸性催化劑可以選用CH3CO2H或HCl，優(yōu)選CH3CO2H；(d)可用水或液體的胺等做為溶劑，反應溫度為-10-100℃攪拌。 (a)有一些醇類化合物在反應后R2會失去，變成H；(b)堿性催化劑優(yōu)選醇鈉或叔丁醇鉀；(c)反應溶劑為無水的醇類(反應試劑)或無水乙醚等，反應溫度為-4-60℃攪拌，或加熱回流。 (a)酰化時乙酰氯，丙酰氯等可不使用催化劑；(b)催化劑優(yōu)選AgCN；(c)以酰氯本身或無水乙醚等為溶劑，常溫攪拌或加熱回流。 (a)WH獨立地為醇、酚、伯胺、仲胺；(b)醇或胺的水溶性較強時優(yōu)選丙酮—水均相體系；若它們的酯溶性較強時可使用CH2Cl2—水、乙醚—水等兩相體系；(c)反應在常溫攪拌或加熱回流下進行。
1、本發(fā)明化合物具體結構如表1所示 表1本發(fā)明的具體化合物

表2本發(fā)明的部分化合物測定的MS和IR數據

表3部分化合物測定的MS和1HNMR數據(附錄表2中的化合物的1HNMR數據在此略去)

本發(fā)明抗腫瘤活性較佳的化合物結構如下


為評價抗腫瘤的藥理活性，本發(fā)明采用P388(小鼠白血病細胞)模型或A549(人肺腺癌細胞)模型，來評價本發(fā)明的化合物對腫瘤細胞的抑制能力；采用HMEC(人微血管內皮細胞)模型，來評價本發(fā)明的化合物抑制血管生成一抗腫瘤的一個較新的靶標的活性。同時以土槿皮乙酸和羥基喜樹堿作為參照化合物，來評價本發(fā)明的化合物。
P388，A549和HMEC細胞增殖抑制篩選方法材料DMEM購自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；磺酰羅單明B(sulforodamine B，SRB)，四氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司；三氯醋酸(TCA)、醋酸和Tris base unbuffer均為國產分析純。
SRB法根據細胞生長速率，將處于對數生長期的腫瘤細胞以90ml/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長24小時再加藥10ml/孔。每個濃度設三復孔。并設相應濃度的生理鹽水溶媒對照及無細胞調零孔。腫瘤細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時，然后傾去培養(yǎng)液，用10％冷TCA固定細胞，4℃放置1小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/ml溶液100ml/孔，室溫中染色15分鐘，去上清液，用1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后加入150ml/孔的Tis溶液，酶標儀520nm波長下測定OD值。
MTT法按不同腫瘤生長速率，將一定數量處于對數生長期的腫瘤細胞90ml/孔接種于96孔微量培養(yǎng)板內，培養(yǎng)24h后加入藥液10ml/孔，對每個細胞株，每個濃度均為三個復孔。另設無細胞調零孔、如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞調零孔。腫瘤細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理鹽水配制20ml/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯液(10％SDS-5％異丁醇-0.01mol/HCl)50ml/孔，于CO2培養(yǎng)箱中過夜。然后在570nm用酶標儀測定OD值。
按下列公式計算被測物對癌細胞生長的抑制率，半數抑制量IC50值采用Logit法計算腫瘤抑制率＝(對照組OD值-治療組OD值/對照組OD值)×100％本發(fā)明中在P388模型上較佳的化合物(具體結構見附錄)

本發(fā)明中在A549模型上較佳的化合物(具體結構見附錄)

本發(fā)明中在HMEC模型上較佳的化合物(具體結構見附錄)

藥理篩選的結果，表明本發(fā)明的許多化合物在P388，A549模型上活性優(yōu)于土槿皮乙酸；在HMEC模型上，不少化合物活性優(yōu)于或相當于羥基喜樹堿；有的化合物在P388，A549和HMEC模型上活性均超過土槿皮乙酸或羥基喜樹堿。它們中的一些化合物是極有希望成為新的抗腫瘤藥物。
抗真菌活性篩選方法白色念珠菌用液體稀釋法測定，觀測最低濃度藥物管無真菌生長即為最低抑菌濃度。
紅色發(fā)癬菌用瓊脂稀釋法測定，觀測最低濃度藥物培養(yǎng)皿無真菌生長即為最低抑菌濃度。具體測定方法見參考文獻張卓然主編，《醫(yī)學微生物實驗學》，科學出版社，1998年，102-103頁。
本發(fā)明中抗真菌活性較佳的化合物(以土槿皮乙酸為參照化合物，R1為CO2R′，R2為乙酰基，R3為羧基)

抗真菌藥理篩選的結果，表明本發(fā)明的一些化合物活性優(yōu)于土槿皮乙酸，它們有希望成為新的抗真菌藥物。
具體實施例下面結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但對本發(fā)明不作任何限制。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.25(t，3H，J＝7.13Hz)，1.56(S，3H)，1.91(S，3H)，4.12(m，2H)，6.18(d，1H，J＝15.11Hz)，6.52(dd，1H，J＝15.11、11.24Hz)，7.13(m，1H)，7.22(d，1H，J＝11.24Hz)。
步驟2在裝有上述粗品的反應瓶中，加入乙酰氯10ml，開啟電磁攪拌器，密封反應瓶，每隔1小時用TLC跟蹤反應一次，5小時后，反應結束。在旋轉蒸發(fā)儀上蒸去低沸物，加入水10ml，然后用乙酸乙酯提取水層三次，合并酯層，減壓蒸干后，殘留物用石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝3∶1∶0.1在硅膠柱(H60)上分出白色固體0.0535g(總收率86.4％)，得標題化合物(PEX-4Y)。同法還可制得PEX-1Y至PEX-31Y，PBX-1Y至PBX-17Y等衍生物。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.27(t，3H，7.23Hz)，1.59(S，3H)，1.95(S，3H)，2.11(S，3H)，4.15(m，2H)，5.91(d，1H，J＝15.02Hz)，6.54(dd，1H，J＝15.02，11.42Hz)，7.18(m，1H)，7.25(d，1H，J＝11.42Hz)。
IR(KBr)(cm-1)3434.7，1741.4，1706.7，1643.1。
實施例2制備 PAM-8Y將0.432g(1mmol)土槿皮乙酸懸浮在40ml蒸餾水中，加入含有1.5mmol的甲胺水溶液中，攪拌5分鐘后，加入0.5mmol的乙酸。反應在常溫常壓下攪拌6小時，TLC表明反應完全。加入60ml水稀釋反應液，以乙酸乙酯提取5次，酯層以無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，濾液蒸干后，在硅膠柱上以氯仿∶甲醇＝15∶1分得淡黃色固體0.400g(總收率92.8％)，得標題化合物(PAM-8Y)。同法還可制得PAM-1Y至PAM-8Y等衍生物。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.57(s，3H)，1.94(s，3H)，2.10(s，3H)，2.81(d，3H，J＝4.11Hz)，5.89(d，1H，J＝15.08Hz)，5.91(brs，1H)，6.42(m，1H)，6.52(dd，1H，J＝15.08，11.57Hz)，7.23(d，1H，J＝11.57Hz)。
IR(KBr)(cm-1)3390.3，1712.5，1654.7，1612.2。
實施例3制備 PEX-19 PEX-19Y步驟1將0.050g土槿皮乙酸(0.116mmol)，3ml分析純丙酮，投入反應瓶中，在攪拌下，分批加入叔丁醇鉀固體，至PH＝13，密封反應瓶，室溫下攪拌反應24小時，用TLC檢測表明反應完全，滴加無水乙酸至PH＝6，在旋轉蒸發(fā)儀上蒸去低沸物，得標題化合物(PEX-19)的粗品(進一步層柱可得到純品ESI-MS 419(M+H+))，其結構由下一步反應產物得到了進一步驗證，不經純化可直接用于下一步反應。
步驟2在(PEX-19)粗品的反應瓶中，加入乙酰氯3ml，密封反應瓶，室溫反應24小時后，TLC檢測表明反應完全，蒸去低沸物，殘留物用氯仿∶丙酮＝13∶1，在硅膠柱(H60)上進行層析，分到淺黃色固體0.015g(兩步總收率28.2％)得標題化合物(PEX-19Y)。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)0.94(t，3H，J＝7.43Hz)，1.58(s，3H)，1.66(m，2H)，1.94(s，3H)，2.08(s，3H)，4.05(m，2H)，5.90(d，1H，J＝15.03Hz)，6.54(dd，1H，J＝15.03，11.45Hz)，7.18(m，1H)，7.25(d，1H，J＝11.45Hz)。
IR(KBr)(cm-1)3434.7，1741.4，1706.7，1645.0。
實施例4制備 PEX-31Y在反應瓶中加入土槿皮乙酸0.05g(0.116mmol)和干燥的環(huán)已基甲醇3ml，在室溫攪拌下，分批加入叔丁醇鉀粉末，至PH＝13，馬上密封反應瓶，室內溫攪拌24小時后，TLC檢測表明反應完全，用無水乙酸中和至PH＝6，減壓蒸餾，蒸去環(huán)已基甲醇及乙醇，殘留物直接在硅膠柱上進行層析(石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇＝3∶1∶0.1)，分出0.032g淡黃色固體(總收率55.0％)，得標題化合物(PEX-31Y)。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.55(s，3H)，1.94(s，3H)，2.10(s，3H)，3.89(m，2H)，5.89(d，1H，J＝15.01Hz)，6.52(dd，1H，J＝15.01，11.35Hz)，7.19(m，1H)，7.26(d，1H，J＝11.35Hz)。
IR(KBr)(cm-1)3444，1743.4，1704.8，1635.0。
實施例5制備 PEX-25Y
在10ml反應瓶中，投入土槿皮乙酸0.050g(0.116mmol)，干燥的α-呋喃甲醇2ml，室溫攪拌下，分批加入叔丁醇鉀粉末，至PH＝11，裝上回流冷凝管和氯化鈣干燥管。室溫下攪拌3小時，然后升溫至80-90℃反應過夜，以無水乙酸中和至PH＝6，減壓蒸餾，蒸去糠醇和乙醇，殘留物用石油醚∶乙酸乙酯∶水＝3∶1∶0.1，進行硅膠柱層析，得一棕色固體，然后在RP-18柱上以甲醇∶水＝7∶3分得一個淺黃色固體0.045g(總收率78.1％)，得標題化合物(PEX-25Y)。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.59(s，3H)，1.91(s，3H)，2.13(s，3H)，5.04(d，1H，J＝13.2Hz)，5.15(d，1H，J＝13.2Hz)，5.91(d，1H，J＝14.8Hz)，6.38(d，1H)，6.55(dd，1H，J＝14.8，11.6Hz)，7.21-7.27(m，4H)。
IR(KBr)(cm-1)3434.7，1739.5，1708.6，1643.1，1600.0，1500.0。
實施例6制備 PEX-24Y在反應瓶中，加入土槿皮丙酸0.050g(0.129mmol)，AgCN0.172g(1.28mmol)，再加入無水乙醚0.5ml使土槿皮丙酸完全溶解后，在攪拌下，滴加對氯苯乙酰氯3ml，加完后，在室溫下劇烈攪拌反應24小時。濾去AgCN，并用無水乙醚洗滌AgCN固體幾次，濾液先在常壓下蒸去乙醚，然后減壓蒸餾，蒸去對氯苯乙酰氯，殘留物用石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝3∶1∶0.1，在硅膠柱(H60)上進行層析，分得0.030g標題化合物(PEX-24Y)，(收率43.0％)。
1HNMR(CDCl3)δ(ppm)1.56(s，3H)，1.94(s，3H)，3.64(s，2H)，3.72(s，3H)，5.87(d，1H，J＝15.6Hz)，6.52(dd，1H，J＝15.6，11.2Hz)，7.21-7.36(m，6H)。
IR(KBr)(cm-1)3434.7，1737.6，1708.6，1643.1，1492.7，1438.7，810.0，771.4。
實施例7制備 PEX-15Y步驟1在反應瓶中，加入土槿皮乙酸0.030g(0.069mmol)和1ml無水乙醚，攪拌使其溶解。然后在室溫下滴加0.5ml SOCl2，裝上回流冷凝管和CaCl2干燥管，室溫攪拌1小時，升溫至40-50℃，并反應3小時。減壓蒸去低沸物，殘留物用絕對乙醚1ml溶解，制成溶液A。
步驟2在冰鹽浴下，在反應瓶中加入3ml丙酮，1ml水，0.10g(1.2mmol)NaHCO3和0.10g(0.92mmol)對羥基苯胺并快速攪拌。待溫度降至-2℃時滴加溶液A(期間溫度絕對不超過0℃)，用TLC檢測反應。待反應完全后，酸化至PH＝6(用CH3CO2H)減壓蒸去丙酮。水相用乙醚提取三次，將乙醚液合并后蒸干，殘留物用氯仿∶甲醇＝10∶1，進行硅膠層析，分出0.030g產品(總收率82.6％)，得標題化合物(PEX-15Y)。
1HNMR(DMCO)δ(ppm)1.61(s，3H)，2.02(s，3H)，2.17(s，3H)，3.69(s，3H)，6.12(d，1H，J＝15.2Hz)，6.52-6.58(m，2H)，6.99(d，1H，J＝11.0Hz)，7.06-7.12(m，3H)。
IR(KBr)(cm-1)3390.3，1739.5，1716.4，1648.9，1602.6，1500.0，1444.4，775.3，690.4。
權利要求
1.一類具有如下結構的土槿皮酸類衍生物 式中(a)R1各自獨立地為腈基，雜環(huán)基，COXR′或CON(R″)2；其中X獨立地為O或NH，R′各自獨立地為H，環(huán)烷基，烷基，雜環(huán)烷基，芳基烷基；R″各自獨立地為烷基，環(huán)烷基，雜環(huán)烷基；(b)R2各自獨立地為H，烷基?；蓟〈耐轷；?，芳基?；?，雜環(huán)基?；?；(c)R3各自獨立地為COXY，胺基，鹵素；其中X各自獨立地為O或NH，Y各自獨立地為H，NH2，羥基，烷基，環(huán)烷基，雜環(huán)烷基，雜原子取代的烷基，叔胺基取代的季胺鹽烷基，芳基，芳基烷基，多羥基烷基。
2.根據權利要求1所述一類土槿皮酸類衍生物其特征在于當R1為CONHR′或CON(R＂)2時，則R2各自獨立地為H或乙?；琑3為-COOH。
3.根據權利要求1所述一類土槿皮酸類衍生物其特征在于當R1為COOR′時，則R2為H(乙?；?、烷?；⒎蓟轷；?、芳基?；?、雜環(huán)基?；?，R3為-COOH。
4.根據權利要求1所述一類土槿皮酸類衍生物其特征在于當R3為COXY時，則R1為COOR′，R2為H(乙?；?、烷酰基、芳基烷酰基、芳基?；㈦s環(huán)基酰基。
5.如權利要求1所述一類土槿皮酸類衍生物的制備方法是當R1為CONHR或CON(R′)2時，由土槿皮乙酸或權利要求1所述的化合物在胺的水溶液中以鹽酸或乙酸為催化劑進行胺解制得。反應溫度為-10℃至100℃，pH為1至6，土槿皮酸類化合物∶胺＝1∶1至1∶300。
6.如權利要求1所述一類土槿皮酸類衍生物的制備方法是a.當R1為COOR′時，由土槿皮乙酸或權利要求1所述化合物在無水條件下，在過量的醇溶液或醇的四氫呋喃，或醇的叔丁醇溶液中，以醇鈉或醇鉀為催化劑，通過醇解制得，反應溫度為0至120℃，pH值為9至14，土槿皮酸類化合物∶醇＝1∶1.1至1∶500；b.當R2為烷基酰基，芳基取代的烷?；?，芳基酰基，雜環(huán)基?；鶗r，由權利要求1所述化合物(R2＝H)為原料?；频?，反應溫度為0℃至80℃，催化劑為AgCN，摩爾比為權利要求1所述化合物(R2＝H)∶酰氯類化合物∶AgCN＝1∶5∶1至1∶500∶10；c.當R3為COXY時，由土槿皮乙酸或權利要求1所述化合物(R3＝COOH)為原料在過量的SOCl2作用下先生成酰氯，然后在乙醚-水兩相體系或丙酮-水均相體系中，以K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、KOH或NaOH為縛酸劑，與醇或胺反應獲得，反應溫度低于30℃。
7.根據權利要求1所述的一類土槿皮酸類衍生物其特征在于可在制備抗腫瘤或抑制真菌的藥物中應用。
全文摘要
提供了一種式(I)的化合物，其中(a)R
文檔編號A61P31/10GK1405164SQ01126479
公開日2003年3月26日 申請日期2001年8月14日 優(yōu)先權日2001年8月14日
發(fā)明者岳建民, 楊升平, 丁健, 肖東, 袁勝濤, 吳艷, 董蕾, 童云廣 申請人:中國科學院上海藥物研究所