專利名稱：增強基因疫苗輸送的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種疫苗輸送的方法，特別是一種增強基因疫苗輸送的方法，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
當(dāng)前疫苗的給藥方法和途徑主要有以下幾種肌肉注射、靜脈注射、鼻內(nèi)吸入、皮肉注射、皮下注射、腹腔注射等。這些方法能夠把作為抗原的疫苗或DNA疫苗注入到組織內(nèi)，以期誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，但是，在相當(dāng)一些情況下，這此方法在全面激發(fā)免疫系統(tǒng)，提高抗原提呈效率方面往往并不完全有效，而且，對于DNA疫苗，這些方法在有效提高基因的轉(zhuǎn)染效率方面也能力有限。美國專利號為6232113是一種利用微粒轟擊技術(shù)為輸送DNA基因的裝置疫苗。該輸送裝置利用壓縮的氣體來推動表面涂布有DNA基因疫苗的微顆粒進入組織或靶細胞內(nèi)，從而達到輸送的目的。但是，這種技術(shù)本身需要預(yù)先制備涂布有基因的微顆粒，技術(shù)過程復(fù)雜，而且容易使組織受到較大的損傷，在提高基因疫苗抗原提呈效率方面也能力有限。

發(fā)明內(nèi)容
作為疫苗的抗原或DNA疫苗表達的抗原，先經(jīng)過和抗原提呈細胞的作用，被呈遞給淋巴細胞，才能誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的強烈程度與抗原提呈的效率密切相關(guān)。因此，抗原的提呈效率在提高疫苗的防治作用中非常重要。本發(fā)明的方法通過電脈沖、超聲波、電磁波這些物理手段對組織和細胞的刺激，可以從不同層面促進抗原與抗原提呈細胞間的相互作用，提高疫苗的免疫原性。本發(fā)明的方法具體如下(1)先把基因疫苗及其佐劑補入到組織或細胞中；(2)將電脈沖或/和超聲波或/和電磁波的發(fā)生部分插入、貼補或?qū)仕x定的組織或細胞；(3)根據(jù)特征參數(shù)的控制，施加電脈沖或/和超聲波或/和電磁波。
通過上述方法，即可把包括DNA基因疫苗在內(nèi)的各種疫苗輸送到機體。本發(fā)明由于使用的是物理手段，對所要輸送的疫苗沒有生化特性的限制，因此各類疫苗都可以應(yīng)用該方法輸送。這些疫苗的類型包括細胞因子疫苗、乙肝病毒疫苗、丙肝病毒疫苗、艾滋病疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗、瘧疾疫苗、結(jié)核病疫苗、癌癥疫苗、用于抗過敏原誘發(fā)疾病的疫苗、用于自身免疫性疾病的疫苗。所述的疫苗包括病毒及其組成部分、蛋白及基因，也包括對免疫原性有促進作用或相對于特定物理治療系統(tǒng)的佐劑。針對的組織包括腫瘤、肌肉、皮膚(皮下)以及其它組織和臟器。本發(fā)明上述所依據(jù)的特征參數(shù)，具體應(yīng)為所施加的電脈沖的波形包括方波和指數(shù)衰減波形，這兩種波形都可以高效地輸送疫苗，方波電脈沖由于能量集中，更利于DNA疫苗的輸送，電脈沖的極性包括單極性和雙極性。電脈沖的波形還包括高電壓方波和低電壓方波的組合序列，其中，先高后低的電脈沖的組合序列對基因的輸送和表達效率更高一些。因此，選擇電脈沖的組合序列對DNA疫苗的輸送意義更大。電脈沖的脈沖長度是從大約10微秒至99毫秒。這樣的參數(shù)范圍可以在保持組織或細胞不受明顯傷害的情況下實現(xiàn)增強疫苗輸送效率的目的。
對于超聲波來說，可以選用一般的診斷強度或治療強度的超聲，也可以選擇高強度聚焦超聲。超聲波的技術(shù)參數(shù)范圍是頻率是從大約1MHz至7.5MHz，聲場強度是從0.5瓦/平方厘米。強度較低的超聲波，可以有效地刺激機體的免疫功能高強度聚焦的超聲波，可以有效地改變生物組織和細胞的物理性質(zhì)，用于DNA疫苗的輸送更為合適。
所使用的電磁波有相對電脈沖較弱的電學(xué)參數(shù)，弱的電磁波也可以使細胞產(chǎn)生物理性質(zhì)的改變，這也是一種比較利于DNA疫苗的輸送的手段。電磁波的技術(shù)參數(shù)是脈沖幅度是從20V/cm至200V/cm，電磁波的脈沖寬度是從2ns至20ns，重復(fù)頻率是從30Hz至100KHz。
本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進步，可以有效地提高疫苗的輸送效率，促成抗原提呈和增強免疫原性，在應(yīng)用上優(yōu)勢明顯。本發(fā)明對各類疫苗都可應(yīng)用，適用范圍廣，應(yīng)用于輸送DNA疫苗時，無需特殊的制備過程，操作簡便，同時又可以高效地增強基因的表達效率，因此在DNA疫苗的輸送方面，本方法具有獨特的優(yōu)勢。
具體實施例方式實施例1應(yīng)用電脈沖輸送乙肝表面抗原DNA疫苗并增加其免疫原性的小鼠實驗一個實驗過程包括以下步驟把HBsAg-DNA疫苗注射入小鼠脛前肌肉(每次注射量為50微升水中含10微克HBV基因設(shè)苗)，20秒到1分鐘后，利用電脈沖發(fā)生裝置和電極施加器，施加6個方波脈沖。其電學(xué)參數(shù)是額定電場強度為200伏特/厘米，8個20毫米的脈沖，頻率為1赫茲。
兩周后的檢測結(jié)果顯示，施加了電脈沖的小鼠血清中的抗體的ELISA檢測結(jié)果陽性率很高，而在該實驗所用的DNA劑量上，對照組(即未施加電脈沖)的小鼠的檢測結(jié)果則沒有陽性(表中數(shù)值大于等于0.105時，該結(jié)果為陽性)。
表1應(yīng)用電脈沖輸送HBsAg-DNA疫苗后的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的HbsAg抗體的ELISA檢測結(jié)果(抗體滴定率)

應(yīng)用電脈沖輸送乙肝表面抗原DNA疫苗并增加其免疫原性的家兔實驗一個治療過程包括以下步驟把HBsAg-DNA苗注射入家兔脛前肌肉(每次注射量見表2)，20秒到1分鐘后，利用如本發(fā)明中所描述的電脈沖發(fā)生裝置和電極施加器，施加6個方波脈沖。其電學(xué)參數(shù)是額定電場強度為300和200伏特/厘米，6個50毫秒的脈沖，頻率為1赫茲。
結(jié)果顯示，施加了電脈沖的家兔的血清中的抗體的ELISA檢測結(jié)果陽性率很高(表中數(shù)值大于等于0.105時，該結(jié)果為陽性)。
表2應(yīng)用電脈沖輸送HBsAg-DNA疫苗后的家兔體內(nèi)產(chǎn)生的HbsAg抗體的ELISA檢測結(jié)果(抗體滴定率)

實施例2應(yīng)用高強度聚焦超聲波和電磁波對腫瘤細胞的基因轉(zhuǎn)染的實驗1)采用的超聲波的參數(shù)是頻率2MHz，聲場強度0.5瓦每平方厘米。超聲波照射細胞的時間是90秒。
實驗結(jié)果含有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒與陽離子脂質(zhì)體的復(fù)合物被輸送到細胞內(nèi)并得到表達。平均轉(zhuǎn)染率達到32.7％，而對照組的平均轉(zhuǎn)染率只有7.4％，可見超聲波能高效地將基因輸送到腫瘤細胞內(nèi)。
2)采用的電磁波參數(shù)是頻率100KHz，幅度80～100V，脈沖寬度2.4ns照射時間3小時。
實驗結(jié)果經(jīng)過電磁波照射的細胞對標記物的攝取明顯高于對照組(p＜0.01)?？梢?，電磁波照射增強了細胞膜的通透性，利于蛋白質(zhì)和基因等分子進入細胞。
實施例3應(yīng)用電脈沖，超聲波和電磁波的方法實現(xiàn)蛋白質(zhì)或DNA疫苗的體外細胞裝載實驗的電脈沖是高低兩個不同脈沖的組合，第一個脈沖為6KV/cm，持續(xù)時間10微秒；第二個脈沖為0.2KV/cm，持續(xù)時間為10毫秒；兩個脈沖之間的時間間隔為0.1ms。實驗所用細胞為Cos細胞系。把含有LacZ基因的質(zhì)粒和細胞混合，之后施加如上所述的電脈沖。
實驗所用的超聲波頻率為1.0，1.68，2.25，3.3，5.3T和7.15MHz，聲場強度約8瓦每平方厘米。照射細胞30秒左右。
實驗采用的電磁波的輸出信號為高斯脈沖，樣品處脈沖峰值為20V/cm，脈沖寬度100ns，重復(fù)頻率300Hz。取樣品，在超寬頻帶橫電磁波傳輸內(nèi)進行照射，照射時間為80～100分鐘。
實驗結(jié)果顯示電脈沖、超聲波和電磁波都可以明顯增加細胞膜的通透性，使疫苗分子能夠進入。對DNA疫苗(基因)來說，這些物理手段對細胞的刺激還明顯地促進其進入細胞并高效表達。
權(quán)利要求
1.一種增強基因疫苗輸送的方法，其特征在于具體如下(1)先把基因疫苗及其佐劑補入到組織或細胞中；(2)將電脈沖或/和超聲波或/和電磁波的發(fā)生部分插入、貼補或?qū)仕x定的組織或細胞；(3)根據(jù)特征參數(shù)的控制，施加電脈沖或/和超聲波或/和電磁波。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種增強基因疫苗輸送的方法，其特征還在于所施加的電脈沖的波形包括方波和指數(shù)衰減波形，還包括高電壓方波和低電壓方波的組合序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的這種增強基因疫苗輸送的方法，其特征還在于電脈沖的極性包括單極性和雙極性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的這種增強基因疫苗輸送的方法，其特征還在于電脈沖的脈沖長度是從大約10微秒至99毫秒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種增強基因疫苗輸送的方法，其特征還在于超聲波的技術(shù)參數(shù)范圍是頻率是從大約1MHz至7.5MHz，聲場強度是從0.5瓦/平方厘米。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的這種增強基因疫苗輸送的方法，其特征還在于電磁波的技術(shù)參數(shù)是脈沖幅度是從20V/cm至200V/cm，電磁波的脈沖寬度是從2ns至20ns，重復(fù)頻率是從30Hz至100KHz。
全文摘要
增強基因疫苗輸送的方法具體如下:(1)先把基因疫苗及其佐劑補入到組織或細胞中;(2)將電脈沖或/和超聲波或/和電磁波的發(fā)生部分插入、貼補或?qū)仕x定的組織或細胞;(3)根據(jù)特征參數(shù)的控制,施加電脈沖或/和超聲波或/和電磁波。本發(fā)明對各類疫苗都可應(yīng)用,適用范圍廣,應(yīng)用于輸送DNA疫苗時,無需特殊的制備過程,操作簡便,同時又可以高效地增強基因的表達效率,因此在DNA疫苗的輸送方面,本方法具有獨特的優(yōu)勢。
文檔編號A61K48/00GK1335183SQ0112637
公開日2002年2月13日 申請日期2001年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月31日
發(fā)明者趙勇剛, 徐宇虹 申請人:上海交通大學(xué)