專利名稱：神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物組成的藥物和保健品及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物和保健品，具體地說涉及含有神經(jīng)節(jié)苷脂(英文名稱Ganglioside)和銀杏葉提取物(英文名ginkgo biloba extract，簡稱EGB)的藥物和保健品。
背景技術(shù)：
神經(jīng)節(jié)苷脂是一種含唾液酸的糖鞘脂，主要存在于哺乳動(dòng)物腦灰質(zhì)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些神經(jīng)元膜的特征性脂成分，其理化性質(zhì)如下神經(jīng)節(jié)苷脂分子由一個(gè)親水基團(tuán)(唾液酸低聚糖)和一個(gè)親脂基團(tuán)(酰基鞘氨醇)組成。親脂性基團(tuán)嵌入神經(jīng)細(xì)胞膜的雙脂質(zhì)層，親水性基團(tuán)突出于細(xì)胞外液，有助于最大程度上維持細(xì)胞表面負(fù)電荷。這種物理上的不對稱性和化學(xué)結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)與細(xì)胞外各種信息相互作用，并能導(dǎo)致部分細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變。所以，目前認(rèn)為細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂類物質(zhì)的變化對調(diào)節(jié)神經(jīng)元和細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞有重要意義。
在體內(nèi)主要有，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)、一唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GD1a)、二唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GD1b)、三唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GT1b)以及GM3、GD3、GQ1b等形式。熔點(diǎn)190℃，易溶解于水和乙醇。
神經(jīng)節(jié)苷脂的生理學(xué)功能有1.經(jīng)離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和外科神經(jīng)去勢的動(dòng)物模型證實(shí)，外源性神經(jīng)節(jié)苷脂與細(xì)胞膜結(jié)合后能增加神經(jīng)生長因子的功能，促進(jìn)神經(jīng)生長，加速神經(jīng)支配功能的恢復(fù)。增加感覺神經(jīng)、交感神經(jīng)和中樞膽堿能神經(jīng)元軸索生長的營養(yǎng)作用；2.經(jīng)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂促進(jìn)神經(jīng)生長，加速受損神經(jīng)恢復(fù)；3.離體和在體實(shí)驗(yàn)均顯示，外源神經(jīng)節(jié)苷脂能平穩(wěn)進(jìn)入細(xì)胞膜，同時(shí)激活細(xì)胞膜上的鈉-鉀-ATP酶的活性，該酶的活化是信息傳遞的基礎(chǔ)；4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，神經(jīng)節(jié)苷脂具有周圍神經(jīng)鎮(zhèn)痛作用。
神經(jīng)節(jié)苷脂的臨床藥用價(jià)值有1.由于各種原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷的功能恢復(fù)；2.對腦血管意外及創(chuàng)傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥有治療作用；3.對缺血性和出血性的腦病變有治療作用。
目前已有成熟的從動(dòng)物組織中提取神經(jīng)節(jié)苷脂的技術(shù)和進(jìn)一步分離純化的技術(shù)，其中的GM1作為藥品已有市售產(chǎn)品，其商品名為施捷因，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉鹽注射液，進(jìn)口注冊證號(hào)x19990444，x19990445，生產(chǎn)商阿根廷TRB藥廠trb pharma s.a.；專利申請?zhí)?3112578報(bào)道了一種含神經(jīng)節(jié)苷脂為主的腦保健品，中國專利95111569公開了一種含神經(jīng)節(jié)苷脂為主的糖脂類物質(zhì)的生產(chǎn)方法。
銀杏葉提取物(簡稱EGB)主要含黃酮甙(flavonoid glycosides)和銀杏內(nèi)酯(ginkgolides)二類活性成分。黃酮甙又稱黃堿素類，具有C6-C3-C6的基本碳架，易溶于熱水、乙醇、吡啶、乙酸乙酯和稀堿液。銀杏內(nèi)酯為萜類(Terpenes)化合物，其基本結(jié)構(gòu)為異戊二烯，具有(C5H8)n的通式，能完全溶于無水乙醇等有機(jī)溶劑。EGB主要藥理作用如下1.黃酮甙作為一種高效抗氧化物能清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化。
2.銀杏內(nèi)酯可拮抗血小板因子引起的血小板聚集、微血栓的形成。
3.銀杏內(nèi)酯可改變血液流變學(xué)，降低血液粘度，改變微循環(huán)障礙。
4.增加5-羥色胺的傳送，對腦部血液循環(huán)及腦細(xì)胞代謝有改善和促進(jìn)作用。
EGB主要臨床藥用價(jià)值1.用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗死。
2.用于防治腦血栓、腦血管痙攣、腦外傷后遺癥。
3.用于改善老年人記憶力衰退和信息處理速度的降低問題。
4.用于延緩早老性癡呆的發(fā)生。
5.緩解眩暈、耳鳴和因血流減少所致的視力和聽力衰退。
6.減少由于四肢血流不足引起的腳痛的發(fā)生，緩解雷那爾德病。
很多專利公開了以銀杏葉提取物為主要原料或添加劑制成的中藥藥品或保健品及其制備技術(shù)。如《銀杏葉提取物的生產(chǎn)工藝》申請?zhí)?411483，公告號(hào)1116532；《銀杏葉膠囊》申請?zhí)?5110894，公告號(hào)1142379等專利所公開的技術(shù)。
上述專利所披露的分別以神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物為主要成分的藥物和保健品均忽略了這兩種成分聯(lián)用后，在各自用量減少的情況下，呈現(xiàn)的相輔相依的協(xié)同作用，其功效未能充分發(fā)揮。因此提供一種能夠發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)的神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物的組合物是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種含神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物配制的藥物和保健品，以克服現(xiàn)有技術(shù)作用單一的缺陷，使其功效比其任何單一成分的保健品，具有更顯著的抗腦疲勞、抗衰老、增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶等功能；本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是公開上述的藥物和保健品在制備治療和預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之三是公開上述的藥物和保健品在制備治療和預(yù)防帕金森病藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之四是公開上述的藥物和保健品在制備治療和預(yù)防缺血性腦血管病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
神經(jīng)系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦和脊髓)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(腦神經(jīng)、脊神經(jīng)和植物神經(jīng))。人體各系統(tǒng)及其功能均受神經(jīng)系統(tǒng)影響和支配，因此神經(jīng)系統(tǒng)是人體最重要的系統(tǒng)。神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指腦、脊髓、周圍神經(jīng)及骨骼肌由于感染、血管病變、外傷、腫瘤、中毒、免疫障礙、變性、遺傳、營養(yǎng)缺陷、代謝障礙等原因引起的疾病。
臨床最常見的癥狀和疾病有頭痛、頭暈、失眠、健忘等神經(jīng)衰弱癥候群；由于腦血管系統(tǒng)病損引起的缺血性腦血管病(常見有腦動(dòng)脈硬化癥、腦血栓形成和腦梗塞)；由于神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行性退化、變性引起的Parkinson病(PD，帕金森綜合癥)又稱震顫麻痹(Paralysis agitans，Shaking palsy)和老年癡呆(較為典型的為Alzheimer′s癥，又稱阿爾茲海默癥)；由于疾病、外傷或中毒引起的諸如糖尿病性周圍神經(jīng)炎、癲癇、腦中風(fēng)、腦部麻痹和小兒腦水腫等。
對于上述神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是對神經(jīng)衰弱癥候群、腦動(dòng)脈硬化癥、帕金森綜合癥和老年癡呆癥等慢性疾病的預(yù)防和治療，許多臨床醫(yī)生認(rèn)為應(yīng)同時(shí)施于神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)劑、激素、微量元素、抗氧化劑等多種藥物和保健食品。本發(fā)明配方中的神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏提取物具有協(xié)同作用，一方面，銀杏葉提取物是一種高效抗氧化物能清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，能促進(jìn)毛細(xì)血管的血液循環(huán)，可改變血液流變學(xué)，降低血液粘度，改善微循環(huán)障礙使外源性神經(jīng)節(jié)苷脂更易于細(xì)胞膜結(jié)合，從而增加神經(jīng)生長因子的功能。外源神經(jīng)節(jié)苷脂在激活細(xì)胞膜上的鈉-鉀-ATP酶的活性(該酶的活化是信息傳遞的基礎(chǔ))的同時(shí)，銀杏葉提取物增加5-羥色胺的傳送，這兩種功效相互促進(jìn)使腦部血液循環(huán)和腦細(xì)胞代謝得以改善；另一方面，由于大劑量的銀杏制劑中含有酚類等有毒物質(zhì)，在治療中毒副作用較大，而與神經(jīng)節(jié)苷脂配伍后可減少藥物劑量，縮短療程同時(shí)提高療效以減輕毒副作用。
本發(fā)明的藥物和保健品的組分和重量百分含量以神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物的總量計(jì)為神經(jīng)節(jié)苷脂 2～20％銀杏葉提取物80～98％。
優(yōu)選的含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 2～8％銀杏葉提取物92～98％。
較優(yōu)選的含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 8.5～15％銀杏葉提取物95～91.5％。
較優(yōu)選的含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 15.5～20％銀杏葉提取物80～84.5％。
最優(yōu)選的含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 2～5％銀杏葉提取物95～98％。
上述配比中不含添加劑，在實(shí)際使用時(shí)可以添加醫(yī)學(xué)上可以接受的載體，如淀粉或蒸餾水等，采用公知的方法制備成任何一種藥劑學(xué)上的劑型，如口服液或膠囊等。
上述的神經(jīng)節(jié)苷脂可采用專利《一種分離純化制備神經(jīng)節(jié)脂工藝》申請?zhí)?5102590公開的技術(shù)進(jìn)行制備，或采用市售產(chǎn)品，如寶智生物制品有限公司生產(chǎn)的規(guī)格為10公斤的型號(hào)為Y/G2001-5的產(chǎn)品；上述的銀杏葉提取物可采用《優(yōu)化銀杏葉提取工藝提取》(王若谷等，浙江康恩貝制藥股份有限公司，蘭溪，中圖分類號(hào)R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)A文章編號(hào)1006-0111(2000)00-0294-03)文獻(xiàn)公開的技術(shù)進(jìn)行制備，或采用市售產(chǎn)品，如上海信誼百路達(dá)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的規(guī)格為25公斤/桶的型號(hào)為FOLIUM GINKGO的產(chǎn)品。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，以下將用該保健品的配制、食品安全性毒理試驗(yàn)、與其單一成分的多種功效臨床比較試驗(yàn)及結(jié)果來說明本發(fā)明的內(nèi)容。
本發(fā)明采用的含神經(jīng)節(jié)苷脂由寶智生物制品有限公司提供。
本發(fā)明采用的銀杏葉提取物根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的《優(yōu)化銀杏葉提取工藝提取》(王若谷等，浙江康恩貝制藥股份有限公司，蘭溪)，具體工藝如下粉碎銀杏葉，用70％(v/v)乙醇以5倍和4倍量加熱回流提取2小時(shí)，回收乙醇后調(diào)整適當(dāng)比例，加入7％的2％的甲殼素絮凝劑，過濾，濾液上DM130大孔吸附柱，梯度洗脫，洗脫液分別濃縮、干燥，備用。用上海市食品監(jiān)督檢驗(yàn)所提供的間苯二酚法測定神經(jīng)節(jié)苷脂的含量；用高效液相色譜(HPLC)法測定銀杏葉有效成分含量。
采用常規(guī)方法將上述兩種成分配比制成口服液和膠囊，其中口服液型其中含神經(jīng)節(jié)苷脂2mg/10ml/支，銀杏葉提取物30mg/10ml/支；膠囊型神經(jīng)節(jié)苷脂含量2mg/囊，銀杏葉提取物含量30mg/囊。
實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果分述如下一.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一)食品安全性毒理實(shí)驗(yàn)40只22月齡雄性Wistar大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)，體重(455±30)g，平均分成4組，按90ml/kg(其中神經(jīng)節(jié)苷脂約含8.2mg，銀杏提取物約含122.8mg)、60ml/kg(神經(jīng)節(jié)苷脂約含5.5mg，銀杏提取物約含81.9mg)、30ml/kg(神經(jīng)節(jié)苷脂約含2.7mg，銀杏提取物約含40.9mg)口服液劑型分三組，連續(xù)喂養(yǎng)60天。
結(jié)果服用該保健品組大鼠無死亡，另一組用蒸餾水作對照；比較各組體重情況、血液學(xué)和生化檢測、臟器重量和組織學(xué)檢查均正常，結(jié)果顯示服用組與對照組無顯著差異。臟器組織學(xué)病理切片檢查由上海第二醫(yī)科大學(xué)病理教研組完成。
結(jié)果說明，上述神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物的組合物無毒性，臨床服用安全。
二)與單一成分在延緩衰老、抗疲勞、增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功效方面的比較1.材料1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于延緩衰老的衰老模型小鼠60只，體重150～200克；用于抗疲勞和改善記憶的大白鼠60只，體重272±62克。
2)藥物本發(fā)明的口服液含神經(jīng)節(jié)苷脂2mg和銀杏葉提取物30mg/10ml；神經(jīng)節(jié)苷脂口服液含神經(jīng)節(jié)苷脂2.5mg/10ml；銀杏葉提取物口服液含有效成分40mg/10ml；2.方法與給藥劑量1)衰老模型小鼠60只隨機(jī)平均分成4組，分別用復(fù)合保健品1支/天；神經(jīng)節(jié)苷脂口服液2支/天；銀杏葉提取物2支/天連續(xù)服用30天，對照組以蒸餾水代替。測定血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力和血清過氧化脂質(zhì)(LPO)含量。
2)抗疲勞和改善記憶的大白鼠60只隨機(jī)平均分成4組，分別用本發(fā)明的藥物和保健品1支/天；神經(jīng)節(jié)苷脂口服液2支/天；銀杏葉提取物2支/天先連續(xù)服用20天，對照組以蒸餾水代替，進(jìn)行負(fù)重游泳和爬桿時(shí)間測定以考核抗疲勞功效；再連續(xù)服用40天，然后在小鼠穿梭箱內(nèi)進(jìn)行主動(dòng)回避條件性反射訓(xùn)練，10次測定中有9次出現(xiàn)條件性反應(yīng)定為學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。達(dá)到學(xué)會(huì)后，停止訓(xùn)練1個(gè)月后再進(jìn)行記憶保持檢查。
3.結(jié)果(1)各實(shí)驗(yàn)組衰老模型血清SOD活力升高、血清LPO數(shù)值下降，與對照組數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01；服用復(fù)合保健品實(shí)驗(yàn)組血清SOD活力升高、血清LPO數(shù)值下降最為明顯，與服用單組分保健品實(shí)驗(yàn)組數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01，單組分保健品實(shí)驗(yàn)組之間數(shù)值無顯著差異。結(jié)果見表1。
表1.SOD活性和LPO含量測定

P*＜0.01(與對照組比較)；①P＜0.01(與②、③實(shí)驗(yàn)組比較)；②、③實(shí)驗(yàn)組P＞0.5(2)負(fù)重游泳和爬桿時(shí)間測定結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組時(shí)間長于對照組P＜0.01；服用復(fù)合保健品實(shí)驗(yàn)組負(fù)重游泳和爬桿時(shí)間明顯長于其它各組，與服用單組分保健品實(shí)驗(yàn)組數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01，單組分保健品實(shí)驗(yàn)組之間數(shù)值無顯著差異。結(jié)果見表2。
表2.負(fù)重游泳時(shí)間和爬桿時(shí)間測定

P*＜0.01(與對照組比較)；①P＜0.01(與②、③實(shí)驗(yàn)組比較)；②、③實(shí)驗(yàn)組P＞0.5(3)小鼠穿梭箱內(nèi)進(jìn)行主動(dòng)回避條件性反射訓(xùn)練(1)學(xué)習(xí)情況對照組小鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練次數(shù)為32.1±3.3，各實(shí)驗(yàn)組所需次數(shù)均少于該數(shù)值，統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01；服用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組學(xué)會(huì)所需次數(shù)明顯少于其它各組，與服用單組分的實(shí)驗(yàn)組數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01，單組分的實(shí)驗(yàn)組之間數(shù)值無顯著差異。結(jié)果見表3。(2)記憶保持情況停止訓(xùn)練1個(gè)月后，對照組小鼠正確反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)為32.1±8.3；實(shí)驗(yàn)組正確反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)均高于對照組，統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01；服用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組正確反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)明顯高于其它各組，與服用單組分的實(shí)驗(yàn)組數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析P＜0.01，單組分的實(shí)驗(yàn)組之間數(shù)值無顯著差異。結(jié)果見表3。
表3.學(xué)會(huì)次數(shù)和正確反應(yīng)百分?jǐn)?shù)

P*＜0.01(與對照組比較)；①P＜0.01(與②、③實(shí)驗(yàn)組比較)；②、③實(shí)驗(yàn)組P＞0.5(4)結(jié)論神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，比其任何單一成分的具有更明顯的延緩小鼠衰老、增強(qiáng)小鼠抗疲勞和學(xué)習(xí)記憶的功能。
三)本發(fā)明成分不同配比對老齡大鼠急性低壓缺氧腦損害的防治作用1.材料1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只22月齡Wistar大鼠
2)本發(fā)明的藥物和保健品(用生理鹽水稀釋成液體)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物不同配比。
3)測定試劑內(nèi)皮素(endothelin，ET)放射免疫試劑盒和一氧化氮(nitric oxide，NO)亞硝酸鹽試劑盒，購自解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所。
2.方法與給藥劑量1)40只22月齡Wistar大鼠隨機(jī)分成④生理鹽水對照組5只；⑤生理鹽水缺氧組5只和不同配比給藥實(shí)驗(yàn)組分別10只，共5組。實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。
2)缺氧模型的建立將缺氧組大鼠放入低壓艙內(nèi)，以30m/s速度上升至8000m高度，停留30min，造成大鼠體內(nèi)重度缺氧，然后以30m/s速度下降至地面。對照組同時(shí)放入另一實(shí)驗(yàn)條件完全相同的低壓艙內(nèi)，停留在地面而不上升。急性低壓缺氧(8000m，30min)前4h各組均腹腔注射相同體積的生理鹽水或本發(fā)明產(chǎn)品，測定各組大腦皮質(zhì)和丘腦勻漿中內(nèi)皮素(endothelin，ET)和一氧化氮(nitricoxide，NO)的含量。
3)不同配比給藥實(shí)驗(yàn)組①組含神經(jīng)節(jié)苷脂2mg和銀杏葉提取物30mg/10ml②組含神經(jīng)節(jié)苷脂10mg和銀杏葉提取物60mg/10ml；③組含神經(jīng)節(jié)苷脂20mg和銀杏葉提取物80mg/10ml。
4)標(biāo)本處理各組大鼠均在出艙后立即開顱，1min內(nèi)取出適量的大腦皮質(zhì)和丘腦組織。按試劑盒說明書處理標(biāo)本并測定ET、NO含量。ET含量用放射免疫法直接測定，結(jié)果以pg/100mg組織濕重表示；NO含量用亞硝酸鹽比色法間接測定，結(jié)果以nmol/100mg組織濕重表示。
3.結(jié)果1)急性缺氧對大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中ET含量的影響及給藥組療效。急性低壓缺氧30min后，大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中ET含量較生理鹽水對照組明顯升高(t丘腦＝2.879，P＜0.01；t大腦＝2.410，P＜0.05)；各給藥缺氧組大腦皮質(zhì)和丘腦ET含量較生理鹽水缺氧組明顯下降(t大腦＝2.262，P＜0.05；t丘腦＝2.509，P＜0.05)，與生理鹽水對照組相比無明顯差異(t大腦＝1.142，P＞0.05；t丘腦＝1.256，P＞0.05)；不同配比各給藥缺氧組之間大腦皮質(zhì)和丘腦ET含量無明顯差異，見表4。
表4.大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中ET含量(x±s，pg/100mg)

與第④組數(shù)據(jù)比較，ET含量明顯升高，⑤P＜0.01；①組～③組與第④組數(shù)據(jù)比較P＞0.05。
2)急性缺氧對大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中NO含量的影響及給藥組療效。急性低壓缺氧30min后，大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中NO含量較生理鹽水對照組也明顯升高(t大腦＝5.405，P＜0.01；t丘腦＝5.404，P＜0.01)；各給藥缺氧組大腦皮質(zhì)和丘腦NO含量較生理鹽水缺氧組明顯下降(t大腦＝2.139，P＜0.05；t丘腦＝2.109，P＜0.05)，與生理鹽水對照組比較(t大腦＝腦＝1.252，P＞0.05；t丘腦＝1.269，P＞0.05)無明顯差異；不同配比各給藥缺氧組之間大腦皮質(zhì)和丘腦NO含量無明顯差異，見表5。
表5.對缺氧大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中NO含量的影響(x±s，nmol/100mg)

與第④組數(shù)據(jù)比較，ET含量明顯升高，⑤P＜0.01；①組～③組與第④組數(shù)據(jù)比較P＞0.05。
4.結(jié)論(1)急性低壓缺氧可引起老齡大鼠大腦皮質(zhì)和丘腦中ET、NO含量明顯升高(ET、NO可能參與了缺氧性腦損害的病理過程)。本發(fā)明產(chǎn)品對老齡大鼠缺氧性腦損害有一定的早期防治作用。
(2)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，其不同配比均對老齡大鼠缺氧性腦損害有一定的早期防治作用，其中①組含神經(jīng)節(jié)苷脂2mg和銀杏葉提取物30mg已經(jīng)達(dá)到很好療效；由于低濃度配比已經(jīng)使受損恢復(fù)，因此本實(shí)驗(yàn)中高濃度的配比無優(yōu)勢。
(3)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，由于具有協(xié)同作用其各組分含量可比單一組分用量減少。
二、臨床實(shí)驗(yàn)一)對老年性癡呆的防治效果1.病例應(yīng)用阿爾茨海默氏病評估表(ADAS-Cog)、相對等級測量老年病學(xué)評估(GERRI)及臨床綜合印象變化(CGIC)，在多個(gè)研究中心和護(hù)理醫(yī)院對患有老年癡呆的病人進(jìn)行篩選測定，根據(jù)患者的認(rèn)識(shí)能力、日?；顒?dòng)和社交行為的得分情況，最終選定48例評分相當(dāng)?shù)睦夏臧V呆患者作為實(shí)驗(yàn)對象。
2.實(shí)驗(yàn)方法48例老年癡呆患者平行分成4組，采用盲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別給予本發(fā)明3支/天共含神經(jīng)節(jié)苷脂6mg和銀杏葉提取物90mg；神經(jīng)節(jié)苷脂口服液，含神經(jīng)節(jié)苷脂15mg/天；銀杏葉提取物口服液，含有效成分240mg/天和安慰劑，連續(xù)服用26周。
3.觀察指標(biāo)用ADAS-Cog和GERRI，進(jìn)行評價(jià)測定。(該方法來源于文獻(xiàn)《美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》和《癡呆癥和老年認(rèn)知疾病》推薦方法)4.結(jié)果用本發(fā)明組40.9％±12.2患者ADAS-Cog得分改善4分，GERRI改善51.3％±10.2；單服神經(jīng)節(jié)苷脂口服液組23.6％±16.9患者ADAS-Cog得分改善4分，GERRI改善25.8％±20.6，含神經(jīng)節(jié)苷脂15mg/天；單用銀杏葉提取物口服液組26.0％±13.3患者ADAS-Cog得分改善4分，GERRI改善30.0％±15.6。安慰劑組此兩數(shù)據(jù)顯示明顯惡化。結(jié)果見表6。
表6.老年癡呆患者ADAS-Cog和GERRI評估

P*＜0.001(與對照組比較)；①P＜0.001(與②、③實(shí)驗(yàn)組比較)；②、③實(shí)驗(yàn)組P＞0.55.結(jié)論神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，應(yīng)用治療劑量26周后，比任何單一成分的在治療和預(yù)防老年性癡呆的功效上更顯著。
二)對帕金森病的療效1.病例在多個(gè)研究中心和護(hù)理醫(yī)院應(yīng)用Hoehn&Yahr量表(帕金森病臨床病情程度量表)對患有帕金森病的病人進(jìn)行篩選，最終選定40例評分相當(dāng)?shù)呐两鹕』颊咦鳛閷?shí)驗(yàn)對象。
2.實(shí)驗(yàn)方法40例老年癡呆患者平行分成4組，采用盲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別給予本發(fā)明的藥物和保健品3支/天共含神經(jīng)節(jié)苷脂6mg和銀杏葉提取物90mg；神經(jīng)節(jié)苷脂口服液，含神經(jīng)節(jié)苷脂15mg/天；銀杏葉提取物口服液，含有效成分240mg/天和安慰劑，連續(xù)服用3個(gè)月。
3.觀察指標(biāo)用Hoehn&Yahr量表進(jìn)行評價(jià)測定。
4.結(jié)果用本發(fā)明的組30.9％±19.2患者Hoehn&Yahr量表得分改善5分；單服神經(jīng)節(jié)苷脂口服液組19.1％±16.9患者Hoehn&Yahr量表得分改善5分；單用銀杏葉提取物口服液組17.8％±15.3患者Hoehn&Yahr量表得分改善5分。安慰劑組此數(shù)據(jù)顯示明顯惡化。結(jié)果見表7。
表7 帕金森病的Hoehn&Yahr量表評估得分改善情況

P*＜0.01(與對照組比較)；①P＜0.01(與②、③實(shí)驗(yàn)組比較)；②、③實(shí)驗(yàn)組P＞0.56.結(jié)論神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，應(yīng)用治療劑量3個(gè)月后，比其任何單一成分的在防治帕金森病的功效上更顯著。
三)對缺血性腦血管病的療效1.病例缺血性腦血管病，在多個(gè)醫(yī)院應(yīng)用CT對臨床患有腦缺血病人的病變性質(zhì)、部位、程度進(jìn)行篩選，最終選定40例缺血性腦血管病患者作為實(shí)驗(yàn)對象。
2.材料抗心磷脂抗體(ACL)ELISA試劑盒，組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)活性試劑盒由上海醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室提供。放射免疫法測定血漿血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)，藥盒由蘇州醫(yī)學(xué)院血栓研究室提供。
3.實(shí)驗(yàn)方法40例缺血性腦血管病患者平行分成4組，采用盲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別給予本發(fā)明的藥物和保健品3支/天共含神經(jīng)節(jié)苷脂6mg和銀杏葉提取物90mg；神經(jīng)節(jié)苷脂口服液，含神經(jīng)節(jié)苷脂15mg/天；銀杏葉提取物口服液，含有效成分240mg/天和安慰劑，連續(xù)服用3個(gè)月。
4.觀察指標(biāo)治療前后測定缺血性腦血管病患者血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)；組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；抗心磷脂抗體(ACL)以及血漿血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)；并應(yīng)用顱多普勒診斷儀觀察結(jié)果。
5.結(jié)果(1)與對照組和單一成分組比較，采用本發(fā)明的組缺血性腦血管病患者的血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和血漿TXB2水平顯著下降P＜0.01；6-K-PGFIa水平顯著上升(P＜0.01＝，血清HDL-C明顯上升P＜0.01；t-PA活性顯著上升P＜0.01； ACL陰性；顱多普勒診斷儀觀察患者顱內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)的變化，采用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組可使患者原顱內(nèi)血流增快者有減慢趨勢，原血流速度減慢有增快趨勢，表現(xiàn)出對血流速度的良好的雙向性調(diào)整作用。
(2)單服神經(jīng)節(jié)苷脂口服液組與對照組比較，TC、TG雖有所下降但仍高于正常值、血清HDL-C明顯上升、LDL-C水平顯著下降P＜0.05；t-PA活性和6-K-PGFIa水平略有上升(P＞0.1)；ACL弱陽性；顱多普勒診斷儀觀察患者顱內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)的變化，雙向性調(diào)整作用不明顯。
(3)單用銀杏葉提取物口服液組與對照組比較，CT、TG、LDL水平顯著下降P＜0.01血漿TXB2，6-K-PGFIa水平略有上升(P＞0.1)，ACL陰性，血清HDL明顯上升P＜0.01。結(jié)果見表8。
表8.缺血性腦血管病患者系列觀察指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

ACL**(ELISA法) 強(qiáng)陽性 陰性 弱陽性 陰性*t-PA是一種纖溶蛋白溶解劑，能抑制和裂解血小板聚集，有利于血栓的消除。**ACL能使血栓素作用加強(qiáng)，引起血管收縮和血小板的聚集。應(yīng)用酶聯(lián)夾心檢測法(ELISA檢測)。
某些指標(biāo)正常值TC2.80～5.85mmol/l；TG＜1.80mmol/l；LDL1.30～4.90mmol/l。
6.結(jié)論神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，應(yīng)用治療劑量3個(gè)月后，比其任何單一成分的在防治缺血性腦血管病的功效上更顯著。
由上述公開的食品安全性毒理試驗(yàn)以及與其單一成分多種功效比較的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)可見1)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，比其任何單一成分的具有更明顯的延緩小鼠衰老、增強(qiáng)小鼠抗疲勞和學(xué)習(xí)記憶的功能。
2)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，其不同配比濃度對急性低壓缺氧引起的老齡大鼠缺氧性腦損害(大腦皮質(zhì)和丘腦中ET、NO含量升高)有一定的早期防治作用；其中低濃度的含神經(jīng)節(jié)苷脂2mg和銀杏葉提取物30mg已經(jīng)達(dá)到很好療效。
3)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，應(yīng)用治療劑量26周后，比其任何單一成分的在治療和預(yù)防老年性癡呆的功效上更顯著。
4)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，應(yīng)用治療劑量3個(gè)月后，比其任何單一成分的在預(yù)防帕金森病的功效上更顯著。
5)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品，具有協(xié)同增效作用，應(yīng)用治療劑量3個(gè)月后，比其任何單一成分的在治療和防治缺血性腦血管病的功效上更顯著。
6)神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物的藥物和保健品無毒性，臨床服用安全。
附各組分含量的測定方法一、神經(jīng)節(jié)苷脂的測定神經(jīng)節(jié)苷脂的測定方法參照Biochim Biophys Acta 1957 Vol.24 p604的方法和國際上同行實(shí)驗(yàn)室的分析方法加以改良而制定，經(jīng)實(shí)踐證明完全適用于在科研分析和商品檢驗(yàn)中對神經(jīng)節(jié)苷脂含量的正確測定，經(jīng)上海技術(shù)監(jiān)督局審核批準(zhǔn)，已列入“企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”。
1.材料(1)間苯二酚儲(chǔ)液2克間苯二酚溶于100毫升蒸餾水中，冰箱放置。
(2)對照工作液(A液)80毫升鹽酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、19.75毫升蒸餾水。
(3)間苯二酚工作液(B液)10毫升間苯二酚儲(chǔ)液、80毫升鹽酸、0.25毫升0.1M CuSO4溶液、9.75毫升蒸餾水。此工作液至少在使用前的4小時(shí)配制，冰箱放置。
(4)正戊醇(C液)。
(5)紫外分光光度計(jì)2.方法電子天平精確稱取5毫克標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于5毫升蒸餾水中，即為毫克/毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)液，由上述標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)液配成10微克，20微克，30微克，40微克，50微克(系500微升中的濃度)儲(chǔ)液，冰箱放置。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作a.取具塞試管5支，分別準(zhǔn)確加入500微升已配制的5種濃度標(biāo)樣，然后加入蒸餾水1.5毫升。
b.邊振蕩，邊加入2毫升B液；空白對照加500微升上述任意一種濃度的標(biāo)樣，加1.5毫升水后，加2毫升A液。
c.100攝氏度水浴加熱15分鐘，然后在冷流動(dòng)水中冷卻10分鐘。
d.邊振蕩，邊加入4毫升C液，冰浴中冷卻15分鐘。
e.離心5分鐘(3000轉(zhuǎn)/分)，吸取上清液，在OD580測定吸收值，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(在OD580讀數(shù)為縱軸，濃度為橫軸)。
樣品的測定取三支具塞試管，分別加入搖勻樣品200微升。以下操作方法均按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法進(jìn)行。樣品中神經(jīng)節(jié)苷脂含量的計(jì)算 斜率斜率從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得。稀釋倍數(shù)指測定是標(biāo)準(zhǔn)溶液總體積500微升與加入的被測樣品體積比。5.82系校正因子。
二.銀杏葉提取物有效成分的測定，即黃酮甙和銀杏內(nèi)酯二類活性成分的測定(一)黃酮甙的測定1.材料(主要儀器)(1)高效液相色譜LC-3A型，日本產(chǎn)(Liquid Chromatograph LC-3A，Shimadzu，Japan)(2)紫外檢測器SPD-1型，日本產(chǎn)(Spectrophotometric Detector SPD-1，Shimadzu，Japan)(3)色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)3390A型，美國產(chǎn)(3390A Integrator，HewlettPackard，USA)(4)高級恒溫器PB-85型，日本(TB-85 Thermo Bath，Shimadzu，Japan)(5)密封水解管(特制)硬質(zhì)玻璃15ml螺口試管，帶聚四氟乙烯膠墊螺口管蓋。
(6)柱溫箱(Column Oven CTO-2A，Shimadzu，Japan)2.方法取銀杏葉提取物(GBE)20mg，加入水解密封管內(nèi)，加入10ml水解液，擰緊帶聚四氟乙烯膠墊的管蓋，振搖水解管，使提取物溶解在水解管內(nèi)，放入68℃(控溫精度在1℃以內(nèi))的水浴鍋內(nèi)，水解3小時(shí)，水解過程中應(yīng)避光。水解后的溶液移入50ml的容量瓶中，用60％甲醇洗水解管并定容，待HPLC分析。HPLC測定條件分離預(yù)柱Zorbax ODS柱(5cm×4.6mm ID，5μm)；色譜柱Hypersil BDS C18柱(25cm×4.6mm ID，5μm)；主泵壓力90kg/cm2；流動(dòng)相流速1ml/mim；檢測器紫外檢測儀，波長360nm，0.04A.U.柱溫50℃；結(jié)果計(jì)算進(jìn)樣閥體積10μl(固定)。
結(jié)果計(jì)算數(shù)據(jù)處理由色譜處理機(jī)完成，輸入標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)液濃度、保留時(shí)間、樣品質(zhì)量等參數(shù)，測定時(shí)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算。自動(dòng)計(jì)算出樣品黃酮甙含量。具體操作方法參照色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)說明書。
(二)銀杏內(nèi)酯的測定銀杏葉含有多種二萜內(nèi)酯和倍半內(nèi)酯，總稱為銀杏萜內(nèi)酯，主要的二萜內(nèi)酯有銀杏內(nèi)酯A、B、C等，倍半萜內(nèi)酯有白果內(nèi)酯。本法采用反相色譜分離萜內(nèi)酯，用示差檢測器測定其含量，此法干擾物少，操作較簡便，準(zhǔn)確度高。
1.儀器與試劑(1)高效液相色譜儀(日本島津制作所LC-3A型)，其中包括恒溫箱、RI檢測器、數(shù)據(jù)處理機(jī)各一臺(tái)；15mL螺塞試管帶聚四乙烯密封墊；恒溫水熱鍋。
(2)銀杏內(nèi)酯A(Sigma公司)，1mg/mL；白果內(nèi)酯(Sigma公司)，1mg/mL；銀杏內(nèi)酯B(Sigma公司)，1mg/mL。
(3)分析純濃鹽酸和甲醇；洗脫液300mL甲醇加入蒸餾水700mL，混勻；酸笥氧化鋁預(yù)處理柱。
2.方法樣品制備樣品0.5g置入15mL的螺塞試管中，加入甲醇5mL，用螺塞密封，放入55-60℃恒溫水浴中，保溫4h。取出冷卻至室溫，加入10mL蒸餾水，充分混勻后，過酸性氧化鋁預(yù)處理柱，待上機(jī)分析測定。
HPLC測定條件色譜柱C18柱(直徑25cm×4mm)，7μm；主泵壓力150kg/cm2；洗脫液流速0.8mL/min；RI檢測器靈敏度0.5；柱溫室溫；進(jìn)樣閥體積10μL。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別取1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液2、4、6、10、15、20μL，上機(jī)分析，以標(biāo)準(zhǔn)物量和峰面積(峰高)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
結(jié)果計(jì)算數(shù)據(jù)處理由色譜處理機(jī)完成，輸入標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)液濃度、保留時(shí)間、樣品質(zhì)量等參數(shù)，自動(dòng)計(jì)算出樣品萜內(nèi)酯總含量。具體操作方法參照色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)說明書。
實(shí)施例1采用含神經(jīng)節(jié)苷脂的動(dòng)物臟器提取物為主要原料(由寶智生物制品有限公司提供)，-18℃保存；銀杏葉提取工藝粉碎銀杏葉，用70％(v/v)乙醇以5倍和4倍量加熱回流提取2小時(shí)，回收乙醇后調(diào)整適當(dāng)比例，加入7％的2％的甲殼素絮凝劑，過濾，濾液上DM130大孔吸附柱，梯度洗脫，洗脫液分別濃縮、干燥，備用。用上海市食品監(jiān)督檢驗(yàn)所提供的間苯二酚法測定含神經(jīng)節(jié)苷脂的原料中神經(jīng)節(jié)苷脂的含量；用HPLC法測定銀杏葉提取物中有效成分含量。
實(shí)施例2按本技術(shù)領(lǐng)域人員公知的方法將實(shí)施例1的神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制備膠囊，以淀粉為填充劑，8％淀粉漿為黏合劑，制成顆粒，然后裝膠囊。制成膠囊的規(guī)格為100mg/囊。其中含神經(jīng)節(jié)苷脂含量2mg/囊，銀杏葉提取物含量30mg/囊。
含神經(jīng)節(jié)苷脂原料2克銀杏葉提取物原料30克淀粉60克8％淀粉漿 8克實(shí)施例3按本技術(shù)領(lǐng)域人員公知的方法將實(shí)施例1的神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制備口服液，以檸檬酸和甘露糖作為添加劑制成口服液。制成口服液規(guī)格為10ml/支。其中含神經(jīng)節(jié)苷脂含量2mg/支，銀杏葉提取物含量30mg/支。含神經(jīng)節(jié)苷脂液體原料 2克純凈水10升銀杏葉提取物原料 30克 甘露糖5克檸檬酸10克。
實(shí)施例4按本技術(shù)領(lǐng)域人員公知的方法將實(shí)施例1的神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制備膠囊，以淀粉為填充劑，8％淀粉漿為黏合劑，制成顆粒，然后裝膠囊。制成膠囊的規(guī)格為100mg/囊。其中含神經(jīng)節(jié)苷脂含量6mg/囊，銀杏葉提取物含量80mg/囊。含神經(jīng)節(jié)苷脂原料 6克銀杏葉提取物原料 80克淀粉 6克8％淀粉漿8克。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物組成的藥物和保健品，其特征在于，該藥物和保健品的組分和重量百分含量以神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物的總量計(jì)為神經(jīng)節(jié)苷脂 2～20％銀杏葉提取物80～98％。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物和保健品，其特征在于，含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 2～8％銀杏葉提取物92～98％。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物和保健品，其特征在于，含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 8.5～15％銀杏葉提取物95～91.5％。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物和保健品，其特征在于，含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 15.5～20％銀杏葉提取物80～84.5％。
5.如權(quán)利要求2所述的藥物和保健品，其特征在于，含量為神經(jīng)節(jié)苷脂 2～5％銀杏葉提取物95～98％。
6.如權(quán)利要求1～5任一所述的藥物和保健品在制備治療和預(yù)防老年性癡呆藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1～5任一所述的藥物和保健品在在制備治療和預(yù)防帕金森病藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1～5任一所述的藥物和保健品在制備治療和預(yù)防缺血性腦血管病藥物中的應(yīng)用。
9.一種用于治療和預(yù)防老年性癡呆、治療和預(yù)防帕金森病或治療和預(yù)防缺血性腦血管病的藥物和保健品，其特征在于，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1～5任一所述的藥物和保健品以及醫(yī)學(xué)上可以接受的載體。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物和保健品，其特征在于，所述的載體包括淀粉或蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物組成的藥物和保健品及其在治療和預(yù)防老年性癡呆、治療和預(yù)防帕金森病和治療和預(yù)防缺血性腦血管病應(yīng)用。由毒理試驗(yàn)以及與其單一成分多種功效比較的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)證明:神經(jīng)節(jié)苷脂和銀杏葉提取物制成的藥物和保健品,具有協(xié)同增效作用,比其任何單一成分的具有更明顯的延緩衰老、增強(qiáng)抗疲勞和學(xué)習(xí)記憶的功能,對急性低壓缺氧引起的缺氧性腦損害有一定的早期防治作用,在治療和預(yù)防老年性癡呆的功效上更為顯著,對預(yù)防帕金森病和治療和預(yù)防缺血性腦血管病也具有十分明顯的功效。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1341434SQ0112646
公開日2002年3月27日 申請日期2001年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月14日
發(fā)明者吳同新, 潘怡 申請人:上海綠谷偉業(yè)生態(tài)工程有限公司