專(zhuān)利名稱(chēng)：用于皮下施用的基于神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不添加任何其它佐劑用于皮下施用的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含神經(jīng)節(jié)苷脂，用于免疫學(xué)治療自身免疫疾病、感染疾病和腫瘤。
現(xiàn)有技術(shù)狀況很久以來(lái)已知將神經(jīng)節(jié)苷脂用于免疫學(xué)治療自身免疫疾病和癌癥的意圖，例如USA-A-4965198專(zhuān)利描述了神經(jīng)節(jié)苷脂GM2在預(yù)防和治療這類(lèi)疾病中的用途。在提交的專(zhuān)利EP-A-661061和在專(zhuān)利US-A-6149921中描述了用以刺激或增加對(duì)抗存在于免疫原和免疫學(xué)佐劑中的神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體的疫苗組合物。
所描述的免疫原是由N-AcetylGM3和N-GlycolylGM3神經(jīng)節(jié)苷脂(現(xiàn)用(N-AcGM3)和(N-GcGM3)表示)與來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白復(fù)合物(OMP)結(jié)合構(gòu)成的VSSP(尺寸非常小的蛋白脂質(zhì)體)。
這類(lèi)免疫原現(xiàn)稱(chēng)為N-AcGM3/VSSP和N-GcGM3/VSSP；其尺寸特別小并且甚至在電子結(jié)顯微鏡下也看不見(jiàn)，其是水溶性的并且具有增強(qiáng)的浮動(dòng)能力。
對(duì)于描述于EP-A-661061和US-A-6149921中的疫苗組合物，需要使用佐劑，例如非常熟悉的弗氏不完全佐劑。
在提交的專(zhuān)利WO-A-02145746中描述了疫苗組合物，所述疫苗組合物含有(A)一種或更多種具有低免疫原性的抗原；(B)具有整合的神經(jīng)節(jié)苷脂(主要為N-AcGM3/VSSP和N-GcGM3/VSSP)的VSSP；和(C)最后一種或更多種佐劑。
在Carr A.等人公布于Melanoma Research，2001，Vol.11，pp219-227的論文中描述了含有N-AcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的疫苗在帶有黑素瘤B16的小鼠中的抗腫瘤活性。
在該論文中也研究了免疫學(xué)佐劑特別是弗氏完全佐劑或弗氏不完全類(lèi)佐劑如佐劑Montanide ISA 51存在的影響。所述疫苗通過(guò)肌內(nèi)施用并且所得的結(jié)論是用N-AcGM3/VSSP和弗氏或Montanide ISA 51中任何一種佐劑免疫的小鼠都在第八周顯示IgM和IgG抗N-AcGM3的應(yīng)答(表1)。相反地，不含任何佐劑的N-AcGM3/VSSP不顯示任何免疫原性的應(yīng)答(223頁(yè)，右欄)。
因此本領(lǐng)域教導(dǎo)含有綴合有神經(jīng)節(jié)苷脂的VSSP的疫苗應(yīng)該與佐劑主要是弗氏(完全或不完全)或Montanide ISA 51一起配制。
然而，眾所周知當(dāng)其通過(guò)腸胃外施用時(shí)，這類(lèi)佐劑，特別是弗氏完全佐劑，會(huì)引起某些不適的副作用例如在注射位置的慢性炎癥，最終導(dǎo)致組織肉芽腫和無(wú)菌膿腫或潰爛性壞死。Montanide ISA 51沒(méi)有那樣強(qiáng)烈刺激(aggressive)但也能引起某些炎癥。
從其在免疫學(xué)治療自身免疫、感染和腫瘤疾病的應(yīng)用上看，擁有在注射部位較少刺激和可更容易更方便地應(yīng)用于病人的新的神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗組合物是非常想要的。
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)基于神經(jīng)節(jié)苷脂的與VSSP一起配制的疫苗，當(dāng)其皮下施用時(shí)可不加任何佐劑使用而同時(shí)仍然存在相關(guān)的免疫學(xué)性質(zhì)。
本發(fā)明的目的是包含于VSSP中的新的疫苗組合物，優(yōu)選地N--AcGM3/VSSP和N-GcGM3/VSSP，所述疫苗組合物不含有任何免疫學(xué)佐劑并且通過(guò)皮下施用。
用于治療需要增強(qiáng)其免疫學(xué)應(yīng)答的病人的方法也是本發(fā)明的目的，所述方法包括皮下施用神經(jīng)節(jié)苷脂疫苗組合物，所述疫苗組合物優(yōu)選地為N-AcGM3/VSSP和N-GcGM3/VSSP，并且不含任何免疫學(xué)佐劑。
不含其它不同于神經(jīng)節(jié)苷脂的抗原性組份或任何其它免疫學(xué)佐劑的N-AcGM3/VSSP和/或N-GcGM3/VSSP疫苗組合物也是本發(fā)明的目的，并且所述疫苗組合物通過(guò)皮下施用。
發(fā)明詳述本發(fā)明疫苗組合物的目的在于將一種或更多種神經(jīng)節(jié)苷脂溶解或在水中分散并且將其納入腦膜炎奈瑟球菌的OMP中(VSSP)，所述組合物能在不加任何另外的免疫學(xué)佐劑的情況下通過(guò)皮下施用刺激免疫學(xué)應(yīng)答。
VSSP是高度穩(wěn)定的神經(jīng)節(jié)苷脂與腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白復(fù)合體形成(不必是共價(jià)連接)的疏水連接體。在專(zhuān)利EP-A-661061和US-A-6149921以及不同出版物例如，Estévez等人的Vaccine，1999；Vol.18(1-2)pp 190-197中詳細(xì)地描述了這類(lèi)神經(jīng)節(jié)苷脂-蛋白質(zhì)系統(tǒng)。這些文獻(xiàn)也描述了獲得它們的方法。
在包含于VSSP的神經(jīng)節(jié)苷脂中，本發(fā)明優(yōu)選的是N-AcGM3和N-GcGM3，特別優(yōu)選的是N-AcGM3。
可在上述文獻(xiàn)和綜述論文Bitton R.E等人的OncologyReports(2002)，Vol 9，267-276，和最近的通訊和科學(xué)會(huì)議例如于2002年12月9日在Havana舉行的第6屆拉丁美洲免疫學(xué)會(huì)議、Sáurez G等人的通訊“Phase 1 clinical trial of the gangliosidecancer vaccine N-AcetilGM3/VSSP/Montanide ISA 51 in advancedbreast cancer patients”中找到對(duì)兩種綴合神經(jīng)節(jié)苷脂的免疫原性以及其作為抗癌藥物和獲得性免疫力的刺激物的應(yīng)用的詳細(xì)描述。
除了神經(jīng)節(jié)苷脂不含其它抗原性組份的疫苗組合物是本發(fā)明優(yōu)選的目的，特別優(yōu)選的是那些含有單一性免疫原性組份N-AcGM3(N--AcGM3/VSSP)和/或N-GcGM3(N-GcGM3/VSSP)的組合物，更優(yōu)選是那些只含有N-AcGM3/VSSP的組合物。
本發(fā)明的疫苗組合物是最終可含有其它無(wú)毒性、非刺激性水相容性溶劑的VSSP溶液或水性分散體，所述溶劑通常在藥物學(xué)上用于腸胃外使用，例如可以是聚乙二醇。
在所述溶液或水性分散體中綴合神經(jīng)節(jié)苷脂的濃度不是至關(guān)重要的并且其變化范圍可以是0.03％-3％(w/v)，優(yōu)選地在0.04％和2.5％(w/v)之間。用于本發(fā)明涉及的疫苗皮下施用的劑量范圍是50μg和2.4mg之間，優(yōu)選地在200μg和2mg之間。
所述疫苗組合物的基本特征(本發(fā)明的目的)在于其設(shè)計(jì)出來(lái)在不加任何額外免疫學(xué)佐劑的情況下可進(jìn)行皮下施用。
免疫學(xué)佐劑經(jīng)常用于疫苗制劑中。這類(lèi)佐劑以不同方式促進(jìn)免疫原性作用-在注射部分產(chǎn)生抗原沉積以系統(tǒng)性形式放出或釋放抗原。
-通過(guò)形成易于被巨噬細(xì)胞捕獲的油性微滴幫助抗原到達(dá)脾和淋巴結(jié)-直接或間接地激活參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞-大部分已知的免疫學(xué)佐劑是完全和不完全的弗氏佐劑、Montanide ISA、Ribi佐劑、Hunter’s TiterMax、鋁鹽、Gerbu佐劑、QS-21等。
令人驚奇和意外的是本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)當(dāng)神經(jīng)節(jié)苷脂/VSSP疫苗通過(guò)皮下施用時(shí)可完全消除佐劑。而在本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于肌內(nèi)施用該現(xiàn)象幾乎被完全排除。
因此當(dāng)考慮到佐劑使用引起的局部的炎癥問(wèn)題時(shí)，本發(fā)明在幾乎所有方面展示了無(wú)可置疑的優(yōu)勢(shì)。這就是使用神經(jīng)節(jié)苷脂接種疫苗的簡(jiǎn)單方法，所述接種疫苗的方法對(duì)病人具有功效并且較少有刺激。
在下面的實(shí)施例中包括了比較實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)以說(shuō)明在不含免疫學(xué)佐劑的情況下所述疫苗組合物的免疫學(xué)功效。
實(shí)施例1通過(guò)使用描述于US-A-6149921專(zhuān)利中實(shí)施例3的方法制備含有2.4mg/mL N-AcGM3/VSSP的水性疫苗組合物(緩沖液Tris-HCl)。向這種免疫原組合物等份中加入等體積的Montanide ISA 51佐劑(Seppic Paris，F(xiàn)rance)。同時(shí)在另一等份中加入相同體積的Tris-HCl緩沖液。
獲得兩種疫苗組合物A含有1.2mg/mL N-AcGM3/VSSP的水性溶液。
B含有1.2mg/mL N-AcGM3/VSSP的W/O乳液。
選擇50只體重在18-20g之間的C57BL/6雌性小鼠并將其分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)組10只動(dòng)物。
第1組(對(duì)照)動(dòng)物在第0、14、28和42天時(shí)用0.1mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行肌內(nèi)接種疫苗。
第2組動(dòng)物在第0、14、28和42天時(shí)用0.1mL疫苗組合物B(120μg N-AcGM3/VSSP)進(jìn)行肌內(nèi)接種疫苗。
第3組(對(duì)照)動(dòng)物在第0、14、28和42天時(shí)用0.1mL(PBS)進(jìn)行皮下接種疫苗。
第4組動(dòng)物在第0、14、28和42天時(shí)用0.1mL疫苗組合物B(120μg N-AcGM3/VSSP)進(jìn)行皮下接種疫苗。
第5組動(dòng)物在第0、14、28和42天時(shí)用0.1mL疫苗組合物A(120μg N-AcGM3/VSSP)進(jìn)行皮下接種疫苗。
在第63天時(shí)對(duì)所有組中的小鼠用5×103個(gè)黑素瘤MB16F10細(xì)胞(0.2mL)皮下進(jìn)行攻擊。
自第0天開(kāi)始對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行單個(gè)考察并且每星期兩次確定下列參數(shù)腫瘤體積、存活和進(jìn)展時(shí)間。
獲得的結(jié)果如下腫瘤體積

圖1顯示來(lái)自各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線。使用Mann-Whitney(two-tailed)U測(cè)試法評(píng)估成對(duì)組群的腫瘤體積值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，所述腫瘤體積值來(lái)自用腫瘤攻擊后第33天的單個(gè)動(dòng)物。
該統(tǒng)計(jì)學(xué)方法特別適合于對(duì)這類(lèi)具有涉及生物學(xué)事件的數(shù)據(jù)天然離散的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。
P值表示與從樣品中計(jì)算而來(lái)的實(shí)際值相關(guān)的概率并且允許確定通過(guò)stadigraph和確證零假設(shè)(p＞0.05)的實(shí)際數(shù)據(jù)計(jì)算而來(lái)的α值的近似程度(顯著性)。
結(jié)果顯示于圖1和表1表1.-疫苗接種對(duì)腫瘤體積的效果

a作為第2組與第1組對(duì)比結(jié)果的p值b作為第4組與第3組對(duì)比結(jié)果的p值c作為第5組與第3組對(duì)比結(jié)果的p值從圖1和表1中可看出，相對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的其它組群和相應(yīng)的對(duì)照，皮下接種本發(fā)明組合物的第5組小鼠顯示腫瘤體積顯著減少。
存活該參數(shù)用以評(píng)估在受到如MB16般致命腫瘤攻擊時(shí)，接種疫苗增加受免疫動(dòng)物的壽命的能力。以天數(shù)測(cè)量所述參數(shù)，與非處理組動(dòng)物存活天數(shù)相比較。使用Log-Rank測(cè)試法確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖2和表2顯示獲得的值。表2中短語(yǔ)參照組X表示被用來(lái)與各組進(jìn)行比較的組。
表2.根據(jù)Log-Rank測(cè)試法的存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)

這些結(jié)果表明在接種腫瘤后，第5組內(nèi)用本發(fā)明制劑進(jìn)行皮下接種疫苗的小鼠顯示最長(zhǎng)的存活時(shí)間。
進(jìn)展時(shí)間進(jìn)展時(shí)間是用以估計(jì)各個(gè)體動(dòng)物中的腫瘤變得明顯所需時(shí)間的參數(shù)，從接種的時(shí)刻開(kāi)始測(cè)量。結(jié)果顯示于表3中表3.根據(jù)Log-Rank測(cè)試法的進(jìn)展時(shí)間統(tǒng)計(jì)

對(duì)于在結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生任何腫瘤的小鼠，其進(jìn)展時(shí)間被認(rèn)為是60天。
延長(zhǎng)進(jìn)展時(shí)間的效果很明顯是非常想要的衡量疫苗對(duì)抗癌癥方面顯著差異的參數(shù)，并且根據(jù)表3中的觀察結(jié)果，用本發(fā)明VSSP組合物皮下接種的第5組動(dòng)物表現(xiàn)更為相關(guān)的正結(jié)果。
腫瘤消退在對(duì)應(yīng)于使用和不使用佐劑皮下接種疫苗的第4和第5組中，觀察到具有腫瘤消退的動(dòng)物。第4組中的動(dòng)物在接種后第19天便可測(cè)量到腫瘤并且腫瘤實(shí)際上保持無(wú)任何增長(zhǎng)直至第35天發(fā)現(xiàn)減小。第5組的小鼠在接種后第26天通過(guò)觸診發(fā)現(xiàn)有腫瘤存在并且據(jù)報(bào)道在第29天開(kāi)始變小。
總體評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的疫苗組合物延長(zhǎng)了存活時(shí)間和進(jìn)展時(shí)間，同時(shí)相對(duì)于使用PBS的對(duì)照組顯著地降低了腫瘤生長(zhǎng)速度。
另一方面含有Montanide ISA 51佐劑的疫苗組合物在肌內(nèi)施用時(shí)只顯示保護(hù)作用，而在皮下施用時(shí)完全無(wú)效。
總之相對(duì)于用含有Montanide類(lèi)型佐劑的疫苗組合物通過(guò)肌內(nèi)方式獲得的結(jié)果，用本發(fā)明疫苗組合物進(jìn)行皮下接種疫苗顯示更優(yōu)的結(jié)果。
附圖簡(jiǎn)述圖1展示的圖表表示在5組接受不同疫苗處理和惡性腫瘤攻擊的動(dòng)物中腫瘤體積的演變。
圖2展示的圖表允許評(píng)估5組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活參數(shù)。
權(quán)利要求
1.疫苗組合物，所述疫苗組合物含有一種或更多種包含于VSSP中的神經(jīng)節(jié)苷脂的溶液或水性分散體，所述疫苗組合物不含任何另加的免疫學(xué)佐劑通過(guò)皮下施用能刺激免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中包含于VSSP的神經(jīng)節(jié)苷脂選自N-AcGM3和N-GcGM3。
3.權(quán)利要求2的疫苗組合物，其中包含于VSSP的神經(jīng)節(jié)苷脂是N-AcGM3。
4.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述組合物不含其它不同于神經(jīng)節(jié)苷脂的抗原。
5.權(quán)利要求2和4的疫苗組合物，其中所述組合物含有N--AcGM3/VSSP和/或N-GcGM3/VSSP作為獨(dú)特的免疫學(xué)組份。
6.權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中所述組合物含有N-AcGM3/VSSP作為獨(dú)特的組份。
7.用于治療需要增強(qiáng)其免疫應(yīng)答的病人的方法，所述方法包括皮下施用權(quán)利要求1到6中描述的疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及疫苗組合物，所述疫苗組合物結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂與腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)以形成用于皮下施用的尺寸非常小的蛋白脂質(zhì)體(VSSP)。本發(fā)明組合物不需要使用另加的佐劑。所述組合物能使用神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是N－AcGM3/VSSP和N－GcGM3/VSSP來(lái)進(jìn)行免疫學(xué)治療，由于所述組合物對(duì)注射部位具有較小的刺激性因而其具有優(yōu)勢(shì)并且可更容易地使用而使病人的不適感減少。
文檔編號(hào)A61K39/095GK1753691SQ200480005201
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者L·E·費(fèi)爾南德斯莫利納, C·梅薩帕迪羅 申請(qǐng)人:分子免疫中心