60h備用，以接入ImL無菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對(duì)照，取以上培養(yǎng)不同時(shí)間的菌液樣品及對(duì)照液各lml，9000r/min，4°C下 離心10min，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醛法測(cè)定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 O . Iml于相應(yīng)的試管中，加冰醋酸O . 3ml，lmg/ml的鄰苯二甲醛O . 15ml，緩緩加入濃硫酸 I.Oml，混合均勻。室溫靜置IOmin，于550nm下測(cè)吸光值）。每一處理3個(gè)重復(fù)，以同樣方法制 作膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見表1?？芍?，CGMCCNO. 11763 對(duì)膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時(shí)后，降解率可達(dá)到64.76%。
[0056]表1對(duì)膽固醇的降解情況。
[0058] 植物乳桿菌CGMCC NO. 11763菌株的耐膽鹽試驗(yàn)：
[0059] 取CGMCCNO. 11763菌液ImL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、1%)的1011^]\?5液體培養(yǎng)基(？!1=6.4)，置于37°(：下分別培養(yǎng)0、2、411， 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各取Iml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄計(jì)算平 板上的菌數(shù)個(gè)數(shù)。結(jié)果見表2。可知該菌在膽鹽濃度為1 %處理4h后菌的生長量依然達(dá)到 0· 59±0·92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0060] 表2耐膽鹽能力檢測(cè)[(土s) X 107cfu/ml]
[0062] 植物乳桿菌CGMCC NO. 11763菌株的耐酸試驗(yàn)
[0063] 取HLX37母液按Iml接種菌種于不同pH值(pH梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的 IOmLMRS液體培養(yǎng)基，置于37 °C下分別培養(yǎng)0、2、4h，每一處理3個(gè)重復(fù)。各取Iml樣品菌液于 9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0 . Iml稀釋液于MRS中涂布，于37 °C生化培養(yǎng)箱中倒 置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄平板上的菌落個(gè)數(shù)。結(jié)果見表3。說明該菌具有 很強(qiáng)的耐酸能力。
[0064] 表3耐酸能力檢測(cè)[(土s) X 107cfu/ml]
[0066] 植物乳桿菌CGMCC NO. 11763的黏附能力測(cè)定
[0067] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌DH5a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離心10min，收集菌泥，分別用pH = 7.0的無菌磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離心 IOmin，收集菌體）。自凝集率（％ :用無菌的I3BS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長600nm處 的吸光值為〇. 4±0.1 (AO)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測(cè)定吸光值A(chǔ)24，自凝集率（％ ) 公式為(A0-A24)/A0。；他凝集率（％ :將CGMCC NO. 11763和大腸桿菌DH5a的懸菌液調(diào)節(jié)成 在波長600nm處的吸光值為0.6 ± 0.1 (AO)的混合懸浮菌液。靜置24H后測(cè)定吸光值A(chǔ)24，他凝 集率（％ )公式為（A0-A24)/A0。測(cè)定結(jié)果見表5,可知CGMCC NO. 11763的自凝集率為 95.71%，有很強(qiáng)的黏附能力。
[0068] 表4黏附能力表
[0071] 植物乳桿菌CGMCC NO. 11763的菌株生理特性
[0072] 所述植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC NO. 11763,保藏地 址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。 [0073]該菌株特點(diǎn)如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛， 不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0074] 理化特征為:過氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實(shí)驗(yàn)( + )，運(yùn)動(dòng)性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (_)，亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。經(jīng)過 生理生化鑒定為為植物乳桿菌（Lactobaci Ilus plantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0075] 菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0076] 本發(fā)明植物乳桿菌由采集人李建樹，從新疆維吾爾族老鄉(xiāng)家中酸奶中分離得到， 采集時(shí)間2015年6月2日。
[0077]本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC NO. 11763經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠在pH為1.50的條件下存活，在 1 %膽鹽培養(yǎng)4小時(shí)后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC NO. 11763降解亞硝酸鹽速度快， 分解能力達(dá)到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃度在4.8mg/ kg以下；CGMCCN0.11763在發(fā)酵60h小時(shí)后，對(duì)膽固醇降解率可達(dá)到64.76 % XGMCC NO. 11763黏附能力測(cè)定的自凝集率為95.71 %，菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能 力為 275g/L。
[0078] 有益效果：
[0079] 本發(fā)明以蜂蜜為主要原料，首先以部分蜂蜜、麥芽提取物和韭花、益生菌粉劑為原 料，經(jīng)低溫酶解、高壓脈沖電場(chǎng)殺菌、變溫發(fā)酵、分次益生菌接種、超濾濃縮等工藝，制備出 酸甜適宜、益生菌含量及其功能性代謝物含量高的蜂蜜益生菌發(fā)酵濃縮液，其益生菌含量 可達(dá)8.12 X 1012-9.58 X 1012CFU/ml，益生性極強(qiáng)，然后與剩余蜂蜜、麥芽提取物和生姜提取 物及功能性輔料制備出一種蜂蜜含量高、口感酸甜適宜、長期保存(36-48個(gè)月）不結(jié)晶、保 健效果顯著的蜂蜜產(chǎn)品。具體技術(shù)效果見實(shí)施例七至九;具體技術(shù)原理如下：
[0080] 1.本發(fā)明的益生菌劑科學(xué)復(fù)配多種乳酸菌劑，種類多，功能全，益生性強(qiáng)，特別是 植物乳桿菌CGMCC NO. 11763經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠在pH為1.50的條件下存活，在1 %膽鹽培養(yǎng)4小 時(shí)后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC NO. 11763降解亞硝酸鹽速度快，分解能力達(dá)到 10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃度在4.8mg/kg以下;CGMCC NO. 11763在發(fā)酵60h小時(shí)后，對(duì)膽固醇降解率可達(dá)到64.76 %。CGMCC NO. 11763黏附能力測(cè) 定的自凝集率為95.71 %。
[0081] 需要說明的是本發(fā)明蜂蜜產(chǎn)品中含有大量的功能性益生菌代謝物和死菌體，雖為 死菌體，但死菌體、細(xì)胞碎片與代謝產(chǎn)物與活菌一樣，可抑制病原菌對(duì)腸壁的粘附和侵襲、 有機(jī)調(diào)節(jié)人體整體免疫力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、抑制腫瘤生長、提高自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)的活性、改善粘膜表面病菌和溶菌酶平衡等，其效果同死菌體數(shù)量成正比例，滅活的 蜂蜜益生菌發(fā)酵濃縮液同樣具備其益生菌的較強(qiáng)的益生性。
[0082] 2.本發(fā)明在制備植物乳桿菌粉劑時(shí)采用的冷凍保護(hù)劑將含有抗凍蛋白較高的冬 黑麥、沙冬青和鯊魚皮膠原蛋白科學(xué)復(fù)配，經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)提取、超聲波輔助微波提取和生 物酶解而制得，全程低溫提取，抗凍蛋白提取率高，損失少，得到的保護(hù)劑抗凍多肽含量高、 種類全、功能性強(qiáng)、抗凍效果好，提高了植物乳桿菌粉劑中的活菌含量。
[0083] 3.本發(fā)明制備的麥芽提取物中不僅含有豐富的植物蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、 酯酶、氧化還原酶等多種植物酶而且含有植物多糖和單糖、植物淀粉、植物蛋白、可溶性纖 維等營養(yǎng)物質(zhì)，不僅可為蜂蜜產(chǎn)品提供全面、天然的植物酶，還可為益生菌提供全面、豐富 的營養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)將其與生姜提取物科學(xué)復(fù)配，可協(xié)同增強(qiáng)蜂蜜的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，進(jìn)而可防止 蜂蜜重結(jié)晶，經(jīng)超聲清洗、微波輔助超聲提取和高壓脈沖電場(chǎng)提取、減壓濃縮等低溫提取 后，其效果更加顯著，并且有效提高了原料利用率、植物酶活性和產(chǎn)率;有效保證了麥芽提 取物的食品安全性。
[0084] 4.本發(fā)明制備的生姜提取物是將黃姜和生姜科學(xué)復(fù)配，經(jīng)超聲清洗、冷凍破碎后 經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)提取和微波提取，最后經(jīng)生物酶解而制得的，在本發(fā)明中，其獨(dú)特作用是可 有效提高高含量蜂蜜蜂蜜產(chǎn)品在儲(chǔ)存過程的穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品的外觀質(zhì)量，防止蜂蜜產(chǎn)品 在溫度、水分、微生物污染等環(huán)境條件下發(fā)生局部、分散性重結(jié)晶，延長蜂蜜產(chǎn)品的貨架期， 提高蜂蜜產(chǎn)品的商品價(jià)值，并且還會(huì)協(xié)同提升純天然蜂蜜的香氣，增強(qiáng)消費(fèi)者食欲，與麥芽 提取物科學(xué)復(fù)配，協(xié)同作用更強(qiáng)；當(dāng)然，同時(shí)還具備黃姜和生姜有效成分的功能特性。
[0085] 5.本發(fā)明將韭花科學(xué)復(fù)配于蜂蜜產(chǎn)品中，突破了傳統(tǒng)的韭花與蜂蜜不可同食的理 論，將少量韭花與蜂蜜、麥芽提取物科學(xué)復(fù)配，并經(jīng)益生菌發(fā)酵，不但不會(huì)產(chǎn)生腹痛、腹瀉等 癥狀，而且還會(huì)促進(jìn)蜂蜜消化、吸收，防止胃腸脹氣，特別適合因食用蜂蜜而胃酸、胃脹、腹 瀉消費(fèi)者，拓展了蜂蜜產(chǎn)品的消費(fèi)群體。
[0086] 6.本發(fā)明科學(xué)復(fù)配了諾麗果粉、芒果粉、雪梨粉、沙棘粉、瑪咖粉等水果粉;雨生紅 球藻、鹽藻、鈍頂螺旋藻等藻類;庫拉索蘆薈凝膠;芝麻花粉、油菜花粉等蜂花粉;低聚木糖； 殼寡糖;海洋魚骨膠原低聚肽粉;百合、金銀花、薄荷、羅漢果、阿膠、紅棗、火麻仁、蓮子、酸 棗仁、黃精、枸杞、玉竹、白芷、人參、荷葉、決明子、枳犋子等中草藥提取物;蛹蟲草；以上述 原料中的一種或幾種作為輔料，更加增強(qiáng)了蜂蜜產(chǎn)品的功能特性及保健效果，可制備出多 種功能性保健系列蜂蜜產(chǎn)品。
[0087] 需要說明的是本發(fā)明蜂蜜產(chǎn)品的技術(shù)效果是各組分技術(shù)特征相互協(xié)同、相互作用 的結(jié)果，并非簡(jiǎn)單的技術(shù)特征(組分功能）的疊加，各組分技術(shù)特征的有機(jī)結(jié)合和協(xié)同產(chǎn)生 的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過各單一技術(shù)特征功能和效果的疊加，具有較好的先進(jìn)性和實(shí)用性。
【具體實(shí)施方式】
[0088] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0089] 實(shí)施例一：
[0090] 原料制備
[0091] 1、麥芽提取物的制備
[0092]其制備方法為：
[0093]將大麥芽和小麥芽按質(zhì)量比9:2均勻混合，粉碎至粒度0.8mm，得粉碎麥芽;然后將 木瓜、菠蘿、無花果分別于裝有0.4%碳酸氫鈉溶液的超聲波清洗機(jī)中在功率200W、頻率 30KHz條件下超聲清洗8min，瀝干，室溫下破碎至粒度0.8mm，并按質(zhì)量比8:2:1.5均勾混合， 加入混合物質(zhì)量4倍的粉碎麥芽得原料混合物，加入原料混合物質(zhì)量2倍的水，用檸檬酸調(diào) 節(jié)pH值為3.5,在功率225W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波輻照總時(shí)間 70s，進(jìn)行間隔式輻照：福照IOs，間隔IOs，控制溫度28°C，如此輻照10次，同時(shí)在功率250W， 頻率35KHz條件下進(jìn)行超聲波輔助提取;保溫2h，然后，在功率300W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行 微波提取，其中，每次微波輻照總時(shí)間95s，進(jìn)行間隔式輻照:輻照15s，間隔10s