專利名稱：在制備多肽的方法中有效的真菌轉(zhuǎn)錄激活因子的制作方法
背景技術(shù)：
相關(guān)技術(shù)描述近年來，重組宿主細(xì)胞在異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用大大簡(jiǎn)化了商品化蛋白的大量制備，否則只有通過從其天然來源中純化才能獲得所述的蛋白。目前，可以選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)，包括細(xì)菌和真核宿主，從所述的系統(tǒng)中選擇用于制備任何特定蛋白。對(duì)適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)的選擇通常不僅有賴于宿主細(xì)胞在活躍狀態(tài)產(chǎn)生足夠產(chǎn)量蛋白的能力，而且在很大程度上也可能由所述蛋白預(yù)期的最終用途決定。
經(jīng)常遇到的一個(gè)問題是由特定宿主細(xì)胞產(chǎn)生的或存在于培養(yǎng)基中的高水平的蛋白水解酶。一個(gè)建議是提供失去了產(chǎn)生特異性蛋白水解化合物能力的宿主生物體。例如，WO90/00192(Genencor，Inc.)描述了不能分泌有酶活性的天冬氨酸蛋白酶的絲狀真菌宿主。EP574347(Ciba Geigy AG)描述了枯草桿菌蛋白酶型的絲氨酸蛋白酶缺陷的曲霉宿主。WO98/12300(NovoNordisk A/S)描述了金屬蛋白酶以及堿性蛋白酶缺陷的宿主。WO97/12045(Genencor，Inc.)描述了由于參與蛋白酶基因調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子序列的破壞而導(dǎo)致造成蛋白酶缺陷的酵母和細(xì)菌宿主系統(tǒng)。
Mattern，I.E.等，(1992.分子和普通遺傳學(xué)(Mol Gen Genet)234332-336)描述了黑曲霉的一個(gè)突變株，其被表明僅僅具有親代菌株1％到2％的細(xì)胞外蛋白酶活性，這顯然是由于至少兩種蛋白酶曲霉胃蛋白酶A(aspergillopepsinA)和曲霉胃蛋白酶B(aspergillopepsin B)的缺陷。提示蛋白酶缺陷表型可能由影響編碼兩種蛋白酶基因表達(dá)的調(diào)控性突變?cè)斐伞?br> 真核轉(zhuǎn)錄在一個(gè)特定啟動(dòng)子或一組啟動(dòng)子處的啟始需要一種真核轉(zhuǎn)錄激活因子，其為一種多肽，但其本身不是RNA聚合酶的一部分。許多轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合至啟動(dòng)子上的特定位點(diǎn)形成啟始該多肽編碼序列的轉(zhuǎn)錄所需的一種功能性啟動(dòng)子。然而，只有在其他多肽存在下，轉(zhuǎn)錄激活因子也可以被并入一種轉(zhuǎn)錄啟始復(fù)合物。對(duì)真菌中具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽已經(jīng)進(jìn)行了描述，而且已公開了此類多肽的名單(Dhawale，S.S.，和Lane，A.C.1993.核酸研究(Nucleic Acid Research)215537-5546)。
本發(fā)明建議的解決方法本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改進(jìn)的方法用于在宿主細(xì)胞中增加多肽的產(chǎn)生，在所述的宿主細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)蛋白酶產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄激活因子的活性被改變。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種分離的編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列，其選自(a)與SEQ ID NO1的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％的同一性。
(c)在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，或者(ii)其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列，其中將低嚴(yán)謹(jǐn)度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有SEQID NO3的氨基酸序列的多肽。
在另一方面，本發(fā)明還涉及包括所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及由所述核酸序列編碼的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及可用于制備多肽的宿主細(xì)胞，在所述的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活因子的產(chǎn)生或功能被改變，本發(fā)明還涉及用于制備所述多肽的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示質(zhì)粒pPAP的限制性圖譜，其構(gòu)建過程在實(shí)施例1中描述。
圖2顯示質(zhì)粒pAopyrGcosArpl的限制性圖譜，其構(gòu)建過程在實(shí)施例1中描述。
圖3顯示質(zhì)粒pEESl的限制性圖譜，其構(gòu)建過程在實(shí)施例1中描述。
圖4顯示質(zhì)粒pDprt的限制性圖譜，其構(gòu)建過程在實(shí)施例3中描述。
圖5顯示質(zhì)粒pGPprt的限制性圖譜，其構(gòu)建過程在實(shí)施例4中描述。
發(fā)明詳述編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列本發(fā)明一方面涉及一種分離的編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列，其選自(a)與SEQ ID NO1的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列具有與SEQ IDNO2的氨基酸序列有至少50％同一性。
(c)在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，或者(ii)其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列，其中將低嚴(yán)謹(jǐn)度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄激活因子”指能激活一個(gè)特定啟動(dòng)子或一組啟動(dòng)子的多肽，所述的啟動(dòng)子是其連接的多肽編碼序列轉(zhuǎn)錄啟始所必需的。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“分離的核酸序列”指一種基本上沒有其他核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖電泳測(cè)定純度為至少大約20％，優(yōu)選至少大約40％，更優(yōu)選至少大約60％，甚至更優(yōu)選至少大約80％，最優(yōu)選至少大約90％。例如，分離的核酸序列可以通過在遺傳工程中用來將核酸序列從其天然位置重新定位至其將被復(fù)制的另一位點(diǎn)處的標(biāo)準(zhǔn)克隆過程來獲得。所述的克隆過程可以包括切割和分離含編碼該多肽的核酸序列的目的核酸片段，將該片段插入到一種載體分子中，并將該重組載體引入到一種宿主細(xì)胞中，在所述的宿主細(xì)胞中該核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆將被復(fù)制。所述的核酸序列可以是基因組序列、cDNA、RNA、半合成、合成來源的或者其任何組合。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列與在SEQ ID NO1中所列的核酸序列具有至少大約70％，優(yōu)選至少大約80％，更優(yōu)選至少大約85％，甚至更優(yōu)選至少大約90％，最優(yōu)選至少大約95％，甚至最優(yōu)選至少大約97％的同一性，其編碼一種有活性的多肽。為了本發(fā)明的目的，通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)以一個(gè)同一性表，裂隙罰分為10以及裂隙長(zhǎng)度罰分為10對(duì)兩種核酸序列之間同一性的程度進(jìn)行測(cè)定。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列具有在SEQ IDNO1中所列的核酸序列。
對(duì)編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的修飾可能是合成與該多肽基本上相似的多肽所需的。術(shù)語(yǔ)與該多肽“基本上相似”指該多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能在一些設(shè)計(jì)方面上與從其天然來源分離的多肽不同。例如，需要用定點(diǎn)誘變等來合成該多肽的變體，其中變體在比活性、結(jié)合特異性和/或親和力等方面不同。根據(jù)作為SEQ ID NO1的多肽編碼部分給出的核酸序列，例如其一個(gè)子序列，和/或通過引入核苷酸置換可以構(gòu)建相似的序列，其中所述的核苷酸置換不產(chǎn)生由該核酸序列所編碼的多肽的另一種氨基酸序列，但其與待用于制備該酶的宿主生物體的密碼子應(yīng)用相應(yīng)，或者所述的核苷酸置換產(chǎn)生不同的氨基酸序列。對(duì)于核苷酸置換的一般描述見，例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Protein Expression and Purification)295-107。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與在SEQ ID NO2中所列的氨基酸序列具有至少大約50％，優(yōu)選至少大約60％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少大約80％，甚至更優(yōu)選至少大約90％，最優(yōu)選至少大約95％，甚至最優(yōu)選至少大約97％的同一性程度，其在性質(zhì)上保留有所述多肽的轉(zhuǎn)錄激活活性(此后為“同源性多肽”)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，同源性多肽具有與SEQ ID NO2中所列氨基酸序列有5個(gè)氨基酸，優(yōu)選4個(gè)氨基酸，更優(yōu)選3個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選2個(gè)氨基酸，最優(yōu)選1個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。為了本發(fā)明的目的，通過Clustal方法(Higgins，1989，同上)以一個(gè)同一性表，裂隙罰分為10以及裂隙長(zhǎng)度罰分為10對(duì)兩種氨基酸序列之間的同一性程度進(jìn)行測(cè)定。
雜交表明通過標(biāo)準(zhǔn)的SOUTHERN印跡方法，在低到高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下(即，于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA以及相對(duì)于低、中等和高嚴(yán)謹(jǐn)度分別為25、35或50％的甲酰胺中預(yù)雜交和雜交)，該核酸序列與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1中所示核酸序列的多肽編碼部分的寡核苷酸探針雜交。為鑒定同源于SEQ ID NO1的克隆或DNA，將雜交反應(yīng)液用2X SSC，0.2％SDS洗三次，每次30分鐘，溫度優(yōu)選為至少50℃，更優(yōu)選至少55℃，更優(yōu)選至少60℃，更優(yōu)選至少65℃，甚至更優(yōu)選至少70℃，最優(yōu)選至少75℃。
SEQ ID NO1的核酸序列或者其子序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或者其部分序列，或者SEQ ID NO3的氨基酸序列可被用來設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法鑒定并分離或者克隆任何屬或種的同源基因。
具體為，為了鑒定并分離目的屬或種中相應(yīng)的基因，按照標(biāo)準(zhǔn)的SOUTHERN印跡方法，可將上述探針用來與目的屬或種的基因組或cDNA雜交。上述探針可以大大短于完整序列，但長(zhǎng)度應(yīng)該為至少15個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，而且更優(yōu)選至少40個(gè)核苷酸。更長(zhǎng)的探針也可以使用。DNA和RNA探針都可以使用。為了檢測(cè)相應(yīng)的基因，通常對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記(例如，用32P、3H、35S、生物素或親和素)。例如，與32P-、3H-或35S-標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交的分子可以通過利用X線膠片檢測(cè)到。
因此，可以對(duì)由上述其他生物體制備的基因組、cDNA或組合化學(xué)文庫(kù)篩選與上述探針雜交并編碼具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽的DNA。通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或者其他分離技術(shù)可以對(duì)來自上述其他生物體的基因組或其他DNA進(jìn)行分離。來自文庫(kù)的DNA或者分離的DNA可以被轉(zhuǎn)移并固定于硝酸纖維素或其他適當(dāng)?shù)妮d體材料上。然后按照標(biāo)準(zhǔn)的SOUTHERN印跡方法可以對(duì)與SEQ ID NO1同源的克隆或DNA進(jìn)行鑒定。
一個(gè)等位基因變體指占據(jù)相同染色體位點(diǎn)的一個(gè)基因的兩個(gè)或多個(gè)可選形式中任何一個(gè)。等位基因變異通過突變自然發(fā)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)表型的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊蛔?即，在所編碼的多肽中沒有改變)或者可以編碼氨基酸序列發(fā)生改變的多肽。
術(shù)語(yǔ)“多肽的等位基因變體”是由基因的一個(gè)等位基因變體所編碼的多肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列為選自下述核酸序列中的一種核酸序列變體(a)與SEQ ID NO1的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列，(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％同一性，(c)在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID NO1的核酸序列，或者其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列，以及(d)編碼一種具有SEQ ID NO3氨基酸序列的多肽的核酸序列。
本發(fā)明還包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與SEQ ID NO1不同的核酸序列。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1的子序列，其中SEQ ID NO1的一個(gè)子序列為除了從5’和/或3’末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸被刪除外，由SEQ ID NO1所包含的核酸序列。優(yōu)選SEQ ID NO1的一個(gè)子序列編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID NO1的一個(gè)子序列含有至少一種編碼在SEQ ID NO3中所示多肽序列的核酸序列。
用于對(duì)編碼一種多肽的核酸序列進(jìn)行分離或克隆的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，而且包括從基因組DNA分離、從cDNA制備或者將它們聯(lián)合。例如通過利用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或者對(duì)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行抗體篩選以檢測(cè)具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆化DNA片段的方法，從上述基因組DNA中對(duì)本發(fā)明核酸序列進(jìn)行克隆是可以實(shí)現(xiàn)的(見，例如Innis等，1990，PCR方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCRA Guideto Methods and Application)，Academic Press，紐約)。其他核酸擴(kuò)增方法也可以利用，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(ligated activated transcription)(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。所述的核酸序列可以克隆自一種微生物或者另一種或相關(guān)生物體，因此，例如其可能為所述核酸序列多肽編碼區(qū)的等位基因變體或物種變體。
由與寡核苷酸探針雜交的核酸序列編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子可以獲自任何屬的微生物，所述的寡核苷酸探針與SEQ ID NO1的核酸序列、其互補(bǔ)鏈，或SEQ ID NO1的等位基因變體和子序列，或者轉(zhuǎn)錄激活因子的等位基因變體和片段雜交。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄激活因子可以獲自真菌細(xì)胞。本文中所用的“真菌”包括子囊菌(Ascomycota)門、擔(dān)子菌(Basidiomycota)門、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(由Hawksworth等定義，在Ainsworth和Bisby真菌詞典，第8版，1995，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK中)以及卵菌門(Oomycota)(在Hawksworth等，1995，同上，171頁(yè)中列舉)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌來源為一種絲狀真菌菌株。“絲狀真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌亞門的所有絲狀形式(由Hawksworth等，1995，同上，所定義)。絲狀真菌以由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、幾丁聚糖、甘露聚糖和其他復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁為特征。生長(zhǎng)是通過菌絲延長(zhǎng)進(jìn)行的，碳分解代謝是專性需氧的。絲狀真菌菌株包括，但不限于，枝頂孢屬、曲霉屬、桃木屬、隱球菌屬、Filibasidium、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、Neocallimastix、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、Piromyces、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、熱子囊菌屬、草根霉屬、Tolypocladium和木霉屬的菌株。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明一種轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列獲自曲霉屬菌株，例如泡盛曲霉或構(gòu)巢曲霉。優(yōu)選所述的核酸序列獲自黑曲霉或米曲霉菌株。甚至更優(yōu)選所述的核酸序列獲自黑曲霉菌株DSM 12298的分離株；例如，在SEQ ID NO1中所列的核酸序列。
在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的一種轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列獲自鐮刀菌屬菌株，例如尖孢鐮刀菌。優(yōu)選所述的菌株為Fusariumvenenatum的菌株(Nirenberg sp.nov.)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明一種轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列獲自一種酵母菌株，例如念珠菌屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia的菌株。優(yōu)選所述的菌株為漢森酵母屬、畢赤酵母屬或酵母屬的菌株。
不言而喻，對(duì)于前面提到的物種，不論它們已知的物種名稱為何，本發(fā)明包括其完整和不完整的名稱以及其他分類學(xué)等同物，例如無性型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易識(shí)別相應(yīng)等同物的本體。例如，所述的多肽可以獲自為Raper，K.D.和Fennel，D.I.(1965.曲霉屬(The Genus Aspergillus)，The WilkinsCompany，Baltimore MD)所定義的曲霉屬分類學(xué)等同物，而不論其已知的物種名稱為何。曲霉菌為產(chǎn)有絲分裂孢子的真菌，其特征為由分生孢子柄組成噴灑器狀，泡囊末端不帶有已知的有性形式，泡囊本身帶有一或兩層同步形成的分別稱為小梗或瓶梗的特化細(xì)胞，以及被稱為分生孢子的無性孢子。曲霉屬已知的有性型包括Eurotium、新縫匠菌和裸孢殼屬。曲霉屬的菌株及其有性型由多個(gè)培養(yǎng)物保藏中心向公眾開放，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)以及農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection)、北方區(qū)域研究中心(Northem Regional Research Center，NRRL)。
此外，利用上述的探針可以從其他來源中對(duì)此類轉(zhuǎn)錄激活因子進(jìn)行鑒定和分離，所述的來源包括自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物。用于從天然生長(zhǎng)環(huán)境中分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域所眾所周知的。然后類似地通過篩選另一種微生物的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)可以得到核酸序列。一旦用探針檢測(cè)到編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列，那么用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以對(duì)該序列進(jìn)行分離或克隆(見，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港，紐約)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸序列編碼一種包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其一個(gè)片段的多肽，所述的多肽具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸序列編碼一種包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還涉及分離的編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列，例如利用上述標(biāo)準(zhǔn)的SOUTHERN印跡方法(參看，Sambrook等，1989，同上)，所述的核酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，而最優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與一種寡核苷酸探針雜交，所述的寡核苷酸探針在相同的條件下與在SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈，或者SEQ ID NO1的編碼真菌轉(zhuǎn)錄激活因子的等位基因變體和子序列雜交。
在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核酸序列編碼一種包含在質(zhì)粒pEES中具有DNA結(jié)合活性的多肽，所述的質(zhì)粒包含于大腸桿菌DSM 12294中。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述的核酸序列可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中控制該轉(zhuǎn)錄激活因子產(chǎn)生的調(diào)控序列。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核酸序列編碼一種多肽，其包含在質(zhì)粒pEES中，所述的質(zhì)粒pEES包容于大腸桿菌DSM 12294內(nèi)。
不言而喻，表達(dá)包括多肽產(chǎn)生所涉及的任何步驟，其包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。根據(jù)表達(dá)載體的不同對(duì)編碼多肽的核酸序列在其插入到該載體之前進(jìn)行操作可以是優(yōu)選的或必須的。利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
本文中將“核酸構(gòu)建體”定義為一種單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在的基因或者其被修飾后含有以自然界不存在的方式聯(lián)合和并置的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含編碼序列的表達(dá)所需的所有調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒意思相同。本文中所定義的術(shù)語(yǔ)“編碼序列”可被轉(zhuǎn)錄成mRNA并被翻譯成本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子。編碼序列的界限通常由在mRNA5’末端的ATG啟始密碼子和mRNA 3’末端緊鄰開放閱讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止序列來確定。編碼序列可以包括，但不限于，DNA、eDNA和重組核酸序列。
本文中將術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”定義為包括多肽表達(dá)所必需的或有利的所有元件。每個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核酸序列可以是固有的或者外源的。此類調(diào)控序列包括，但不限于，引導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。調(diào)控序列至少包括一個(gè)啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。為了引入特異性限制性位點(diǎn)，以將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接，可以為調(diào)控序列提供連接子。本文中將術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”定義為一種布局，其中將調(diào)控序列放置在相對(duì)于DNA序列中編碼序列的適當(dāng)位置上以便該調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。
調(diào)控序列可以為適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，一種為了核酸序列的表達(dá)而被宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，其介導(dǎo)所述多肽的表達(dá)。啟動(dòng)子可以為在所述細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截?cái)嗟暮碗s合的啟動(dòng)子，而且可以獲自編碼與所述細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的任何基因。
調(diào)控序列還可以為適宜的轉(zhuǎn)錄終止子序列，一種被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別來終止轉(zhuǎn)錄的序列。將終止子序列可操作地連接于編碼所述多肽的核酸序列的3’末端。任何在所述細(xì)胞中有功能的終止子在本發(fā)明中均可以使用。
對(duì)于絲狀真菌細(xì)胞優(yōu)選的終止子獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶以及尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
調(diào)控序列還可以為適宜的引導(dǎo)序列，即mRNA的一個(gè)非翻譯區(qū)，其對(duì)于由絲狀真菌細(xì)胞進(jìn)行的翻譯至關(guān)重要。將引導(dǎo)序列可操作地連接于編碼所述多肽的核酸序列的5’末端。任何在所述細(xì)胞中有功能的引導(dǎo)序列在本發(fā)明中均可以使用。
對(duì)于絲狀真菌細(xì)胞優(yōu)選的引導(dǎo)序列獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。
調(diào)控序列還可以為多聚腺苷酸化序列，其被可操作地連接于所述核酸序列3’末端的序列而且在轉(zhuǎn)錄時(shí)其被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別為一個(gè)信號(hào)來向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷酸。任何在所述細(xì)胞中有功能的多聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中均可以使用。
對(duì)于絲狀真菌細(xì)胞優(yōu)選的多聚腺苷酸化序列獲自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶以及黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
調(diào)控序列還可以為信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼連接于多肽氨基末端的氨基酸序列，其能夠引導(dǎo)所編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。所述核酸序列中編碼序列的5’末端可以固有地含有一個(gè)信號(hào)肽編碼區(qū)，其與編碼分泌型多肽的編碼區(qū)片段天然相連于翻譯閱讀框內(nèi)?；蛘?，編碼序列的5’末端可以含有一個(gè)信號(hào)肽編碼區(qū)，其對(duì)于該編碼序列是外源的。編碼序列通常不含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)可能需要外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。或者，為了提高所述多肽的分泌，可以簡(jiǎn)單地用外源的信號(hào)肽編碼區(qū)置換固有的信號(hào)肽編碼區(qū)。信號(hào)肽編碼區(qū)可以獲自曲霉種的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，或者根毛霉(Rhizomucor)種的脂肪酶或蛋白酶基因。然而，引導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入絲狀真菌細(xì)胞分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼區(qū)在本發(fā)明中均可使用。
對(duì)于絲狀真菌細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼區(qū)為獲自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因或者Humicola lanuginosa纖維素酶基因的信號(hào)肽編碼區(qū)。
調(diào)控序列還可以為前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得的多肽被稱為原酶或前多肽(或者在某些情況下為酶原)。前多肽通常無活性，而且通過從前多肽中對(duì)前肽的催化性或自身催化性切割，可以將其轉(zhuǎn)化為成熟的有活性的多肽。前肽編碼區(qū)可以獲自米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因或者嗜熱毀絲霉的漆酶基因(WO 95/33836)。
信號(hào)肽和前肽區(qū)均存在于多肽的氨基末端，前肽區(qū)緊鄰多肽的氨基末端而信號(hào)肽區(qū)緊鄰前肽區(qū)的氨基末端。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，其包括本發(fā)明的核酸序列、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)?？梢詫⑸鲜龅母鞣N核酸和調(diào)控序列連接起來，形成重組表達(dá)載體，其可能包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)以使編碼所述多肽的核酸序列可以在這些位點(diǎn)處插入或置換?；蛘?，編碼所述多肽的核酸序列可以通過將該序列或包括該序列的核酸構(gòu)建體插入到用于表達(dá)的適當(dāng)載體中進(jìn)行表達(dá)。在制備表達(dá)載體的過程中，編碼序列位于載體中，以便將該編碼序列可操作地與用于表達(dá)并且可能用于分泌的適當(dāng)調(diào)控序列相連。
重組表達(dá)載體可以為任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其可以很方便地進(jìn)行重組DNA操作，而且可以使編碼所述多肽的核酸序列表達(dá)。所述載體的選擇通常取決于載體與待引入所述載體的絲狀真菌細(xì)胞的相容性。所述的載體可以為線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。所述的載體可以為一種自我復(fù)制載體，即以一種染色體外單元形式存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、極微染色體或人工染色體。所述的載體可以包括用于保證自我復(fù)制的任何方式?；蛘咚龅妮d體可以為下述載體，在將其引入到絲狀真菌細(xì)胞中時(shí)整合到基因組中并與將其整合進(jìn)來的染色體一起復(fù)制。載體系統(tǒng)可以為一個(gè)單個(gè)載體或質(zhì)粒，或者兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，所述的載體或質(zhì)粒含有待引入到絲狀真菌細(xì)胞基因組中的完整DNA或者一個(gè)轉(zhuǎn)座子。
載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)可篩選標(biāo)志物，其使得可以很容易地對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行篩選。可篩選標(biāo)志物為一種基因，其產(chǎn)物提供生物殺滅劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、原養(yǎng)型變成營(yíng)養(yǎng)缺陷型等等。用于在絲狀真菌細(xì)胞中使用的可篩選標(biāo)志可以選自，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，以及來自其他物種的等同物。優(yōu)選用于在曲霉細(xì)胞中使用的為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。
載體優(yōu)選含有使所述載體可以穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中或者可以在細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞的基因組而自我復(fù)制的元件。
宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包括本發(fā)明的一個(gè)核酸構(gòu)建體或一種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的方法中對(duì)宿主細(xì)胞的選擇范圍很大，這取決于編碼目的多肽的核酸序列的來源。
表達(dá)載體或核酸構(gòu)建體向絲狀真菌細(xì)胞中的引入可以包括下述過程原生質(zhì)體的形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁以本質(zhì)上已知的一種方式再生。用于轉(zhuǎn)化曲霉細(xì)胞的適當(dāng)?shù)姆椒枋鲇贓P238023和Yelton等，1984，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)811470-1474中。轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬的適當(dāng)?shù)姆椒枋鲇贛alardier等，1989，基因(Gene)78147-156或在WO 96/00787中。
“引入”意指將包括編碼所述多肽的核酸序列的載體引入到絲狀真菌細(xì)胞中，以便將載體保持為染色體的一個(gè)組成部分或一種自我復(fù)制的染色體外載體。整合通常被認(rèn)為是一種優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楹怂嵝蛄袑⒏锌赡芊€(wěn)定地保持在細(xì)胞中。通過同源重組、非同源重組或轉(zhuǎn)位使載體發(fā)生向染色體中的整合。
為了向宿主細(xì)胞基因組中整合，所述的載體可以依賴編碼所述多肽的核酸序列或所述的載體中用于通過同源或非同源重組將該載體向基因組中穩(wěn)定整合的任何其他元件?；蛘?，所述的載體可以含有額外的指導(dǎo)通過同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中的核酸序列。額外的核酸序列使該載體能整合到宿主細(xì)胞基因組中染色體的精確位置上。為了提高在精確位置上整合的可能性，整合元件優(yōu)選應(yīng)該含有足夠數(shù)量的核酸，例如100到1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400到1,500個(gè)堿基對(duì)，而最優(yōu)選800到1,500個(gè)堿基對(duì)，其與相應(yīng)的靶序列高度同源以提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。這些核酸序列可以是任何與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的序列，并且可以是非編碼或編碼序列。
為了自我復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包括一個(gè)使載體能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。
用于連接上述的元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見，例如Sambrook，等，同上)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞為，但不限于，枝頂孢屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、鏈孢霉屬、青霉屬、草根霉屬、Tolypocladium或木霉屬的一種細(xì)胞。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為曲霉屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為枝頂孢屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為鐮刀菌屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為腐質(zhì)霉屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為毛霉屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為毀絲霉屬屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為鏈孢霉屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為青霉屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為草根霉屬屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為Tolypocladium屬的細(xì)胞。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為木霉屬的細(xì)胞。
在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為桿孢狀鐮刀菌、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮刀菌、異孢鐮刀菌、合歡木鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、多枝鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、接骨木鐮刀菌、膚色鐮刀菌、硫色鐮刀菌、Fusarium tomloseum、Fusarium trichothecioides或Fusariumvenenatum細(xì)胞。在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為Humicola insolens或Humicola lanuginosa細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為米赫毛霉。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為嗜熱毀絲霉細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為粗糙鏈孢霉細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為產(chǎn)紫青霉細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌細(xì)胞為Thielavia terrestris細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述木霉屬細(xì)胞為Trichoderma harzianum、康寧氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞。
具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種分離的多肽，其選自(a)一種多肽，在一種核酸序列中對(duì)其進(jìn)行編碼，所述的核酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列；(ii)其互補(bǔ)鏈，或(iii)編碼具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽片段的SEQ ID NO1的子序列雜交，其中將低嚴(yán)謹(jǐn)度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘(b)一種多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％的同一性；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)(a)、(b)或(c)的一個(gè)片段，其中所述的片段具有轉(zhuǎn)錄激活活性；以及(e)包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的一種多肽或者其等位基因變體。
利用本文中所述的技術(shù)可以對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子進(jìn)行分離。如本文中所定義的，一種“分離”的多肽為一種基本上沒有其他多肽的多肽，例如通過SDS-PAGE測(cè)定的純度為至少大約20％，優(yōu)選至少大約40％，更優(yōu)選大約60％，甚至更優(yōu)選大約80％，最優(yōu)選大約90％，而且還最優(yōu)選大約95％。
本發(fā)明還涉及下述分離的多肽，其氨基酸序列與具有轉(zhuǎn)錄激活活性的SEQ ID NO2氨基酸序列的同一性至少大約50％，優(yōu)選至少大約55％，優(yōu)選至少大約60％，優(yōu)選至少大約65％，優(yōu)選至少大約70％，優(yōu)選至少大約75％，優(yōu)選至少大約80％，更優(yōu)選至少大約85％，甚至更優(yōu)選至少大約90％，最優(yōu)選至少大約95％，而且還最優(yōu)選至少大約97％。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子包括SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者其一個(gè)片段，其中所述的片段保留有轉(zhuǎn)錄激活活性。在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的多肽具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。SEQ IDNO2的一個(gè)片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。優(yōu)選，SEQ ID NO2的一個(gè)片段至少含有在SEQ ID NO3中所示的多肽序列。
同源多肽的氨基酸序列可因一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或被不同氨基酸殘基置換而與SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的氨基酸序列不同。優(yōu)選，氨基酸的改變屬于一種次要的特性，其為不會(huì)顯著影響所述蛋白折疊和/或活性的保守性氨基酸置換；通常1至大約30個(gè)氨基酸的小的缺失；小的氨基或羧基末端延伸(extension)，例如氨基末端的蛋氨酸殘基；多達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小的連接肽；或者通過改變凈電荷或其他功能而有利于純化的小的延伸，例如多聚組氨酸域、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守性置換的實(shí)例在堿性氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(例如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸)內(nèi)。通常不改變比活性的氨基酸置換在本領(lǐng)域中是已知的，而且由例如H.Neurath和R.L.Hill(1979，蛋白質(zhì)(The Proteins)，Academic Press，紐約)所描述。最常見的交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Als/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Glv，以及這些反過來進(jìn)行交換。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子獲自黑曲霉菌株，更優(yōu)選獲自黑曲霉AB4.1(van Haringsveldt，W.，等，1987，分子和普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)20671-75)，而且最優(yōu)選獲自已在DSM保藏為DSM 12298的黑曲霉13PAP2，或其突變株，它們攜有例如具有SEQ ID NO2或SEQ IDNO3氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子為由在質(zhì)粒pEES中所含的核酸序列編碼的多肽，而質(zhì)粒pEES包含于大腸桿菌DSM 12294中。
本發(fā)明還涉及用于制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子的方法，其包括(a)將包容有核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所述的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列；并(b)回收該多肽。
具有改變的轉(zhuǎn)錄激活活性的宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及一種對(duì)多肽制備有效的宿主細(xì)胞，其為親代真菌細(xì)胞的突變體，其中親代細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)編碼一種蛋白酶的核酸序列，所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄由本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子激活，而且在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，突變細(xì)胞產(chǎn)生少于親代細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子和蛋白酶。
利用本領(lǐng)域中眾所周知的方法可以構(gòu)建突變細(xì)胞；例如通過在編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入或缺失。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突變細(xì)胞通過使細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子所必需的核酸序列得到修飾或滅活而獲得。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核酸序列選自(a)與SEQ ID NO1的核酸序列有至少70％同一性的核酸序列；(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％同一性；(c)在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NOl的核酸序列，或者(ii)其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄激活因子在突變細(xì)胞中降低的表達(dá)是通過對(duì)該轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)所需的調(diào)控序列的修飾或滅活而獲得的。如上，在標(biāo)題為“核酸構(gòu)建體”的章節(jié)中對(duì)術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”進(jìn)行了定義。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變細(xì)胞中的調(diào)控序列為啟動(dòng)子序列或其功能性部分，即足以影響所述核酸序列表達(dá)的一個(gè)部分。其他可能進(jìn)行修飾的調(diào)控序列包括，但不限于，引導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子。
通過將親代細(xì)胞用于誘變并篩選產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活因子的能力已被降低的突變細(xì)胞可以進(jìn)行基因的修飾或滅活。誘變，其可以為特異的或隨機(jī)的，例如可以通過利用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑、通過利用適當(dāng)?shù)墓押塑账幔蛘咄ㄟ^將該DNA序列用于PCR產(chǎn)生的誘變來進(jìn)行。另外，可以通過利用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。
適于本目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、鄰甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(ethylmethane sulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸以及核苷酸類似物。
當(dāng)利用此類試劑時(shí)，誘變通常是通過下述步驟進(jìn)行在所選誘變劑的存在下將待誘變的親代細(xì)胞于適當(dāng)?shù)臈l件下溫育，并篩選表現(xiàn)出所述基因表達(dá)降低的突變細(xì)胞。
通過在基因的核酸序列或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)性元件中引入、置換或去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以完成對(duì)該基因的修飾或滅活。例如，可以將核苷酸插入或去除以便造成終止密碼子的引入、啟始密碼子的去除或者開放閱讀框的改變。此類修飾或滅活可以按照本領(lǐng)域已知的方法通過定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來完成。雖然原則上修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)待修飾基因的真菌細(xì)胞上進(jìn)行，但如下面所舉例說明的優(yōu)選在體外進(jìn)行修飾。
滅活或降低目的真菌細(xì)胞中所述基因表達(dá)的一種方便方法的實(shí)例是以基因置換或基因阻斷技術(shù)為基礎(chǔ)。例如，在基因阻斷方法中，在體外將與內(nèi)源性基因或目的基因片段相應(yīng)的核酸序列進(jìn)行誘變以產(chǎn)生一種缺陷的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化到親代細(xì)胞中以產(chǎn)生一種缺陷的基因。通過同源重組，缺陷的核酸序列取代內(nèi)源性基因或基因片段。理想的是缺陷的基因或基因片段還編碼一種標(biāo)志物，所述的標(biāo)志物可以用于對(duì)其中核酸序列已經(jīng)被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。
或者，所述基因的修飾或滅活可以通過已建立的反義技術(shù)利用與該基因的核酸序列互補(bǔ)的一種核苷酸序列來進(jìn)行。更具體為，通過引入一種核苷酸序列可以降低或清除絲狀真菌細(xì)胞對(duì)所述基因的表達(dá)，所述的核苷酸序列與在該細(xì)胞中可被轉(zhuǎn)錄的核酸序列互補(bǔ)而且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。因此，在允許互補(bǔ)反義核苷酸序列與所述mRNA雜交的條件下，降低或清除了所翻譯的蛋白質(zhì)的數(shù)量。
與SEQ ID NO1的核酸序列互補(bǔ)的一種核苷酸序列可以獲自任何微生物來源。優(yōu)選的來源為真菌，例如，如上所述的酵母和絲狀真菌。優(yōu)選的絲狀真菌來源包括，但不限于，枝頂孢屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、鏈孢菌屬、青霉屬、Phanerochaete、草根霉屬、Tolypocladium和木霉屬。優(yōu)選的酵母來源包括，但不限于，念珠菌屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬和Yarrowia屬。此外，所述的核酸序列可以是絲狀真菌細(xì)胞固有的。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代細(xì)胞包容有一種基因，所述的基因具有編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少50％的同一性。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代細(xì)胞包容有一種基因，所述基因的核酸序列與SEQ ID NO1的核酸序列具有至少70％的同一性。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變細(xì)胞包容有一種核酸序列，所述的核酸序列已經(jīng)被上述方法中的任何方法修飾或滅活，而且在相同條件下培養(yǎng)時(shí)突變細(xì)胞產(chǎn)生少于親代細(xì)胞的蛋白酶或蛋白酶組合。在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，突變細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白酶或蛋白酶組合優(yōu)選比親代細(xì)胞少至少大約25％，更優(yōu)選少至少大約50％，甚至更優(yōu)選約75％，而且還更優(yōu)選約95％。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，突變細(xì)胞與親代細(xì)胞比產(chǎn)生基本上無法檢測(cè)到的蛋白酶或蛋白酶的組合。
利用已知的方法可以對(duì)蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)這樣的方法中，將一份取自培養(yǎng)48小時(shí)的培養(yǎng)基在pH4.0下與3H-標(biāo)記的抹香鯨肌球蛋白溫育，并對(duì)TCA-可溶性組分中的放射活性進(jìn)行檢測(cè)(van Noort，J.M.，等，1991.分析生物化學(xué)(Anal.Biochem)198385-390)。已對(duì)其它鑒定方法進(jìn)行了描述，它們用于鑒定例如黑曲霉的天冬氨酸蛋白酶A(Takahashi，K.，1991.酶學(xué)方法(Meth.In Enzymo1.)248146-155)、內(nèi)肽酶(Morihara，K.，1995.酶學(xué)方法248242-253)、羧肽酶(Reminton，J.，和Breddam，K.，1994.酶學(xué)方法244231-248)、二肽酶(Ikehara，Y，等，244515-227)以及氨肽酶(Little，G.，等，1976.酶學(xué)方法45495-503)。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變細(xì)胞包容有編碼目的多肽的核酸序列的至少一個(gè)拷貝。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種對(duì)多肽制備有效的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為親代真菌細(xì)胞的突變體，其中突變體(a)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)與親代細(xì)胞相比產(chǎn)生更多的本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子；而且(b)包括編碼所述多肽的DNA序列，其轉(zhuǎn)錄被所述的轉(zhuǎn)錄激活因子激活。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過向親代細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)拷貝的(i)編碼一種轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列、(ii)包括編碼一種轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列的核酸構(gòu)建體或者(iii)如上在“表達(dá)載體”部分中所定義的表達(dá)載體，當(dāng)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)宿主細(xì)胞產(chǎn)生比親代細(xì)胞多的轉(zhuǎn)錄激活因子。
包括編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列的核酸構(gòu)建體還可以包括一個(gè)或多個(gè)核酸序列，所述的核酸序列編碼一個(gè)或多個(gè)有利于指導(dǎo)所述多肽表達(dá)的因子，例如轉(zhuǎn)錄激活因子(如，反式作用因子)、分子伴娘和加工蛋白酶。在目的絲狀真菌細(xì)胞中有功能的任何因子均可以用于本發(fā)明中。編碼這些因子中的一個(gè)或多個(gè)的核酸不必與編碼所述多肽的核酸序列串聯(lián)。
激活因子為一種蛋白，其激活編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄(Kudla等，1990，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO Journal)91355-1364；Jarai和Buxton，1994，當(dāng)代遺傳學(xué)(Current Genetics)262238-244；Verdier，1990，酵母(Yeast)6271-297)。編碼激活因子的核酸序列可以獲自編碼釀酒酵母血紅素活化蛋白l(hapl)、釀酒酵母半乳糖代謝蛋白4(gal4)、構(gòu)巢曲霉氨調(diào)節(jié)蛋白(areA)以及米曲霉α-淀粉酶激活因子(amyR)的基因。其他實(shí)例見Verdier，1990，同上以及MacKenzie等，1993，普通微生物學(xué)雜志(Journal of GeneralMicrobiology)1392295-2307。
分子伴娘為一種蛋白，其協(xié)助另一種多肽正確地折疊(Hartl等，1994，TIBS 1920-25；Bergeron等，1994，TIBS 19124-128；Demolder等，1994，生物技術(shù)雜志(Journal of Biotechnology)32179-189；Craig，1993，科學(xué)(Science)2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然(Nature)35533-45；Puig和Gilbert，1994，生物化學(xué)雜志(Joumal of BiologicalChemistry)2697764-7771；Wang和Tsou，1993，The FASEB Journal71515-11157；Robinson等，1994，生物技術(shù)(Bio/Technology)l381-384；Jacobs等，1993，分子微生物學(xué)(Molecular Microbiology)8957-966)。編碼分子伴娘的核酸序列可以獲自編碼米曲霉蛋白二硫化物異構(gòu)酶或者釀酒酵母calnexin、釀酒酵母BiP/GRP78以及釀酒酵母Hsp70的基因。其他實(shí)例見Gething和Sambrook，1992，同上以及Hartl等，1994，同上。
加工蛋白酶為一種蛋白酶，其切割前肽產(chǎn)生成熟的有生物化學(xué)活性的多肽(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母1067-79；Fuller等，1989，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊861434-1438；Julius等，1984，細(xì)胞(Cell)371075-1089；Julius等，1983，細(xì)胞32839-852；美國(guó)專利第5,702,934號(hào))。編碼加工蛋白酶的核酸序列可以獲自編碼釀酒酵母二肽基氨肽酶、釀酒酵母Kex2、Yarrowialipolytica二元加工型內(nèi)切蛋白酶(xpr6)以及尖孢鐮刀菌金屬蛋白酶(p45基因)的基因。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列可操作地與一個(gè)啟動(dòng)子或其功能性部分連接，所述的啟動(dòng)子比親代細(xì)胞的相應(yīng)啟動(dòng)子強(qiáng)。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子或其功能性部分介導(dǎo)編碼細(xì)胞外蛋白酶的基因表達(dá)，例如米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉中性金屬蛋白酶、黑曲霉曲霉胃蛋白酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶或者Fusarium venenatum胰蛋白酶。
本發(fā)明還涉及一種有效用于多肽制備的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為親代真菌細(xì)胞的突變體，其中突變體包括(a)對(duì)本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子或其調(diào)控序列的修飾或滅活，以及(b)(i)一個(gè)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，其可操作地與編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列相連，和(ii)所述轉(zhuǎn)錄激活因子可以結(jié)合的一個(gè)啟動(dòng)子序列，其可操作地與編碼所述多肽的核酸序列相連，其中可以將(i)和(ii)同時(shí)或順序引入。
按照上面所公開的任何方法，通過對(duì)存在于細(xì)胞中并且是固有轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)所需的核酸序列進(jìn)行滅活或修飾可以獲得上面(a)中轉(zhuǎn)錄激活因子的無活性形式。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過下述方法獲得所述的滅活或修飾，所述的方法包括，但不限于，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、缺失或置換、特異性或隨機(jī)誘變、基因置換或基因阻斷以及利用與所述轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行的反義技術(shù)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過對(duì)所述轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)所需的調(diào)控序列進(jìn)行滅活或修飾獲得固有轉(zhuǎn)錄激活因子的無活性形式。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼固有轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列具有在SEQ ID NO1中所列的序列。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子包括具有SEQ ID NO3中氨基酸序列的多肽。
上面(b)中的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子可以為任何啟動(dòng)子序列或其功能性部分，其中根據(jù)發(fā)酵條件，可以對(duì)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄啟始活性進(jìn)行誘導(dǎo)。優(yōu)選，該誘導(dǎo)是由一種碳或氮的分解代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS啟動(dòng)子；構(gòu)巢曲霉、米曲霉或黑曲霉的niaD啟動(dòng)子；曲霉屬的niiA啟動(dòng)子、曲霉屬的堿性磷酸酶啟動(dòng)子、曲霉屬的酸性磷酸酶啟動(dòng)子或者黑曲霉的alcA啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞還包括一個(gè)啟動(dòng)子序列，其中所述的啟動(dòng)子序列可以被所述轉(zhuǎn)錄激活因子激活而且它可操作地連接于編碼所述多肽的核酸序列。
被本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子激活的啟動(dòng)子序列可以為任何啟動(dòng)子序列或其功能性部分，其選自，但不限于，下述編碼基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、NA2-tpi啟動(dòng)子(黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因啟動(dòng)子的一種雜合體)以及它們突變的、截?cái)嗟暮碗s合的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選用于絲狀真菌細(xì)胞中的啟動(dòng)子為蛋白酶基因的啟動(dòng)子或其功能性部分，例如尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶基因(美國(guó)專利4,288,627)、米曲霉堿性蛋白酶基因(alp)、黑曲霉pacA基因、米曲霉堿性蛋白酶基因、米曲霉中性金屬蛋白酶基因、黑曲霉曲霉胃蛋白酶基因或者Fusarium venenatum胰蛋白酶基因。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包容有至少一個(gè)拷貝的編碼多肽的核酸序列。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)表達(dá)本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子的宿主細(xì)胞比親代細(xì)胞在產(chǎn)生一種或多種固有蛋白酶時(shí)產(chǎn)量減少。利用上述的任何方法可以對(duì)所述的蛋白酶進(jìn)行檢測(cè)。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一份取自培養(yǎng)48小時(shí)的培養(yǎng)基在pH4.0下與3H-標(biāo)記的抹香鯨肌球蛋白溫育，并對(duì)TCA-可溶性組分中的放射活性進(jìn)行檢測(cè)(van Noort，J.M.，等，同上)。
按照上面在“宿主細(xì)胞”部分所述的任何方法可以將本文中所述的核酸構(gòu)建體引入親代真菌細(xì)胞，以獲得一種可有效產(chǎn)生多肽的宿主細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體被整合到細(xì)胞染色體中。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體保持為一種自我復(fù)制的染色體外載體。
不言而喻，對(duì)于獲得突變的真菌細(xì)胞，本發(fā)明的方法不限于一個(gè)具體的順序。在構(gòu)建產(chǎn)生多肽的細(xì)胞的過程中，可以在任何步驟處將對(duì)第二個(gè)核酸序列的修飾引入親代細(xì)胞。
制備多肽本發(fā)明的另一方面涉及在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中制備多肽的方法，其包括(a)在適于所述多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中對(duì)包容有編碼該多肽的基因的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；并(b)從宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為親代真菌細(xì)胞的一個(gè)突變體，其中親代細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白酶的基因，所述基因的轉(zhuǎn)錄由本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄激活因子激活，而且在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，突變細(xì)胞產(chǎn)生少于親代細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子和蛋白酶。
在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為親代真菌細(xì)胞的一個(gè)突變體，其中該突變體(a)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)與親代細(xì)胞相比產(chǎn)生更多的本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子；而且(b)包括編碼所述多肽的DNA序列，其轉(zhuǎn)錄被所述的轉(zhuǎn)錄激活因子激活。
在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為親代真菌細(xì)胞的一個(gè)突變體，其中該突變體包括(a)對(duì)本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子或其調(diào)控序列的修飾或滅活，以及(b)可操作地與編碼本發(fā)明轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列相連的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子和所述轉(zhuǎn)錄激活因子可以結(jié)合的啟動(dòng)子序列，其中可以將(i)和(ii)同時(shí)或順序引入。
利用本領(lǐng)域已知的方法將本發(fā)明的宿主細(xì)胞培養(yǎng)于適于制備目的多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，通過在適當(dāng)培養(yǎng)基中并在允許對(duì)所述多肽進(jìn)行表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批給料或固態(tài)發(fā)酵)可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。利用本領(lǐng)域已知的方法(見，例如Bennett，J.W.和LaSure，L.編，更多在真菌中的基因操作(More Gene Manipulations in Fungi)，Academic Press，CA，1991)，在包括碳和氮源以及無機(jī)鹽的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可從供應(yīng)商處獲得，或者可以利用公開的組合物來制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中的)。如果所述的多肽被分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可以從培養(yǎng)基中直接回收該多肽。如果所述的多肽不被分泌，則從細(xì)胞裂解液中將其回收。
通過本領(lǐng)域已知的方法可以對(duì)所獲的多肽進(jìn)行分離。例如，通過傳統(tǒng)方法可以從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中對(duì)所述的多肽進(jìn)行分離，所述的傳統(tǒng)方法包括，但不限于，離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后通過本領(lǐng)域已知的多種方法可以對(duì)分離的多肽進(jìn)行進(jìn)一步純化，所述的方法包括，但不限于，層析法(例如，離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦以及分子篩層析)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差異溶解法(例如，硫酸銨沉淀)或者抽提(見，例如蛋白質(zhì)純化(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，紐約，1989)。
利用本領(lǐng)域已知的特別針對(duì)所述多肽的方法可以對(duì)該多肽進(jìn)行檢測(cè)。這些檢測(cè)方法包括特異性抗體的利用、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或者SDS-PAGE。例如，可用酶檢測(cè)法測(cè)定所述多肽的活性。很多酶的酶活性測(cè)定法在本領(lǐng)域是已知的。
在本發(fā)明的方法中，當(dāng)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，宿主細(xì)胞產(chǎn)生的所述多肽比相應(yīng)的親代細(xì)胞至少多大約20％，優(yōu)選至少多大約50％，更優(yōu)選至少多大約100％，甚至更優(yōu)選至少多大約200％，最優(yōu)選至少多大約300％。
所述的多肽可以為任何多肽，不論對(duì)突變體絲狀真菌細(xì)胞是固有的還是異源的。本文中將術(shù)語(yǔ)“異源多肽”定義為一種并非由細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。本文中術(shù)語(yǔ)“多肽”并非意指一種特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因而包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。所述的多肽還可以為細(xì)胞固有多肽的重組多肽，其由一個(gè)核酸序列編碼，所述的核酸序列包括一個(gè)或多個(gè)與該核酸序列不同來源的調(diào)控序列，所述的調(diào)控序列參與所述多肽的制備。所述的多肽可以為野生型多肽或其變體。所述的多肽還可以為一種雜合多肽，其包括對(duì)獲自至少兩種不同多肽的部分或整個(gè)多肽序列的聯(lián)合，其中所述多肽中的一個(gè)或多個(gè)對(duì)于所述的細(xì)胞可以是異源的。多肽進(jìn)一步包括上述多肽的天然等位基因變體和工程化變體。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的多肽為抗體或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素變體、受體或其部分、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)告蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。
在一還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的酶為氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶(cutinase)、脫氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶(glucoamylase)、α-糖苷酶、β-糖苷酶、鹵過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果膠裂解酶(pectinolytic enzyme)、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶。
在另一還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的多肽為人胰島素或其類似物、人生長(zhǎng)激素、紅細(xì)胞生成素或促胰島素激素。
編碼異源多肽的核酸序列可以獲自任何原核的、真核的、或其他來源。為了本發(fā)明的目的，本文中與給定來源連用的術(shù)語(yǔ)“獲自”意指所述的多肽由該來源產(chǎn)生或者由其中已經(jīng)插入了來自該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。
在本發(fā)明的方法中，突變體絲狀真菌細(xì)胞還可以用于細(xì)胞固有多肽的重組制備。對(duì)固有多肽重組制備可通過將編碼該多肽的基因置于另一個(gè)啟動(dòng)子的控制下以提高該多肽的表達(dá)，通過利用信號(hào)序列以加速目的固有多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，以及增加由細(xì)胞正常產(chǎn)生的多肽編碼基因的拷貝數(shù)。在術(shù)語(yǔ)“異源多肽”的范圍內(nèi)，本發(fā)明還包括細(xì)胞固有多肽的此類重組制備，在這個(gè)意義上此類表達(dá)涉及非細(xì)胞固有的遺傳元件的利用，或者固有元件的利用，所述的固有元件經(jīng)過處理以一種正常在絲狀真菌細(xì)胞中不存在的方式發(fā)揮作用。用于分離或克隆異源多肽的核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括從基因組DNA分離、從cDNA制備或者兩者結(jié)合。例如通過利用眾所周知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可以實(shí)現(xiàn)從此類基因組DNA克隆所述核酸序列。見，例如，Innis等，1990，PCR方案方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCR ProtocolsA Guideto Methods and Application)，Academic Press，紐約?？寺》椒赡苌婕皩?duì)包括編碼所述多肽的核酸序列的目的核酸片段進(jìn)行切除和分離、所述片段向載體分子中的插入以及重組載體向突變體真菌細(xì)胞中的摻入，在所述的真菌細(xì)胞中所述核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆將被復(fù)制。所述的核酸序列可以為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或者它們的任何組合。
在本發(fā)明的方法中，異源多肽還可以包括融合的或雜合的多肽，其中將另一種多肽融合于所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通過將編碼一種多肽的核酸序列(或其一部分)融合于編碼另一種多肽的核酸序列(或其一部分)可對(duì)融合多肽進(jìn)行制備。用于制備融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，將所述多肽的編碼序列連接以便它們閱讀框一致而且融合多肽的表達(dá)處于相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。雜合多肽可以包括對(duì)獲自至少兩種不同多肽的部分或整個(gè)多肽序列的聯(lián)合，其中所述多肽中的一個(gè)或多個(gè)對(duì)于所述的突變體真菌細(xì)胞可以是異源的。對(duì)分離的編碼目的異源多肽的核酸序列可以以多種方式進(jìn)行處理以用于所述多肽的表達(dá)。表達(dá)應(yīng)被理解為包括參與所述多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。根據(jù)表達(dá)載體，對(duì)編碼多肽的核酸序列在其插入到載體中之前進(jìn)行的處理是理想的或必需的。用于通過利用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
通過下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，不應(yīng)將實(shí)施例認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)制品為至少試劑級(jí)的商品化的產(chǎn)品。
菌株AB4.1黑曲霉的一個(gè)菌株，其為菌株ATTC 9029的一個(gè)cspAl pyrGl衍生株(van Hartingsveldt，W.，等，1987.分子和普通遺傳學(xué)20671-75；Bos，C.J.，等，當(dāng)代遺傳學(xué)14437-443)。
AB1.13黑曲霉的一個(gè)蛋白酶缺陷菌株，其源自AB4.1的UV誘變(Mattern，I.E.等，1992.分子和普通遺傳學(xué)234332-336)。
13PAP2AB1.13的一個(gè)衍生株，其含有黑曲霉的pepA啟動(dòng)子(Jarai G.和Buxton F.1994.當(dāng)代遺傳學(xué)26238-244)控制下的多個(gè)拷貝構(gòu)巢曲霉amdS基因(Corrick，R.A.，等，1987.基因(Gene)5363-71)。該菌株具有蛋白酶缺陷表型而且在含有乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)。菌株13PAP2已經(jīng)以DSM NO.12298的名稱保藏于DSM。
4PAP6AB4.1的一個(gè)衍生株，其含有黑曲霉的pepA啟動(dòng)子控制下的多個(gè)拷貝構(gòu)巢曲霉amdS基因。該菌株不具有蛋白酶缺陷表型，而且在含有乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)。
N402黑曲霉的一個(gè)菌株，其以ATCC號(hào)64974保藏于ATCC(ManassasVA，美國(guó))。
MC1046大腸桿菌的一個(gè)菌株，其以ATCC號(hào)35467保藏于ATCC。
質(zhì)粒pPAP如下在實(shí)施例1中所述進(jìn)行構(gòu)建并示于圖1中oAopyrGcosArpl如下在實(shí)施例1中所述進(jìn)行構(gòu)建并示于圖2中pEESl如下在實(shí)施例1中所述進(jìn)行構(gòu)建并示于圖3中p3SR2如由C.M.Corrick，A.P.Twomey和M.J.Hynes(1987.基因5363-71)所述，含有構(gòu)巢曲霉amdS基因pABPYRG*-Not如由Verdoes，J.C.，等(1994.基因145179-187)所述，含有被滅活的pyrG基因pHelpl含有來自米曲霉的pyrG基因作為篩選標(biāo)志物，并含有使其可以在黑曲霉中自我復(fù)制的AMAl序列，如由Gems，D.，等(1991.基因9861-67)所述，它們被克隆到大腸桿菌載體pIC20R中pAnscosl如由Osiewacz，H.D.(1994.當(dāng)代遺傳學(xué)2687-90)所述，含有兩個(gè)cos位點(diǎn)pAO4-2如由De Ruiter-Jacobs，Y.M.J.T，等(1989.當(dāng)代遺傳學(xué)16159-163)所述，含有米曲霉pyrG基因pAO4-13如由De Ruiter-Jacobs，Y.M.J.T，等(1989.當(dāng)代遺傳學(xué)16159-163)所述，含有米曲霉pyrG基因pUC19如由Yanisch-Perron，C.，Vieira，J.，和Messig，J.(1985.基因33103-119)所述實(shí)施例1從黑曲霉中克隆prtT轉(zhuǎn)錄激活因子prtT克隆自13PAP2，一種黑曲霉突變株，所述的菌株無法表達(dá)由pepA蛋白酶基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的amdS基因，具有蛋白酶缺陷表型(prt-)。
黑曲霉13PAP2報(bào)告菌株的構(gòu)建通過連接下面的三個(gè)片段對(duì)質(zhì)粒pPA1進(jìn)行構(gòu)建
1)經(jīng)EcoRI和KpnI消化的大腸桿菌載體pBlueScript II SK(StratageneCloning System，La Jolla CA，美國(guó))；2)一個(gè)1.4kb的EcoRI/BamHI限制性片段，其包括1.2kb的pepA基因啟動(dòng)子區(qū)和與之相連的從啟始密碼子到一內(nèi)部BamHI位點(diǎn)的大約130bp的amdS編碼序列，通過PCR擴(kuò)增獲得；以及3)來自p3SR2的一個(gè)2.1kb的BamHI/KpnI片段，其含有構(gòu)巢曲霉amdS基因的大部分片段2是通過兩個(gè)步驟來構(gòu)建的。在第一步中，以如下在“粘粒文庫(kù)的構(gòu)建”部分中所述從原生質(zhì)體中制備的來自黑曲霉N402的基因組DNA用作模板，將下面所示的兩條寡核苷酸，pepApr和pepA/amdS，用作引物pepAprCGG AAT TCG CAT GCT GGA GGT GCT TCT AApepA/amdSTTC CCA GGA TTG AGG CAT TTT GAC CAC GAG AAT然后，將獲自該反應(yīng)的1200bp的PCR產(chǎn)物與下面所示的寡核苷酸MBL1213一起，在第二個(gè)PCR反應(yīng)中用作引物，并以質(zhì)粒p3SR2作為模板。
MBL1213TAA CTT CCA CCG AGG TC隨后將上述的3個(gè)片段連接，所獲產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH5α中。
在最后的構(gòu)建步驟中，將pPA1用NotI進(jìn)行消化，并連接于來自pABPYRG*-Not的一個(gè)3.8kb的NotI片段，獲得示于圖1中的質(zhì)粒pPAP。將pPAP轉(zhuǎn)化到黑曲霉AB1.13中，并對(duì)pPAP以多個(gè)拷貝整合到pyrG位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分離。將該轉(zhuǎn)化子的一個(gè)自發(fā)的5 flourotic acid(FOA)抗性、需尿苷的突變體命名為13PAP2，其可以用pyrG基因補(bǔ)足。
pAopyrGcosArpl的構(gòu)建通過將下面的3個(gè)片段連接隨后轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH5α中來對(duì)質(zhì)粒pAopyrGcosArpl進(jìn)行構(gòu)建1)經(jīng)Acc65I和BamHI切割的大腸桿菌載體pHelpl2)來自pAnscosl的一個(gè)3.0kb的BamHI/HindIII片段，其含有2個(gè)cos位點(diǎn)3)來自pAO4-2的一個(gè)3.2 kb的Acc65I/HindIII片段，其含有米曲霉pyrG基因所獲的質(zhì)粒pAopyrGcosArpl在曲霉中可以自我復(fù)制，并且可以通過在缺少尿苷的培養(yǎng)基上培養(yǎng)來對(duì)其進(jìn)行篩選。在圖2中對(duì)pAopyrGcosArpl進(jìn)行了描述。
粘粒文庫(kù)的構(gòu)建利用“SuperCosl粘粒載體試劑盒”(Stratagene Cloning Systems，La JollaCA，美國(guó))按照供應(yīng)商的說明構(gòu)建一個(gè)黑曲霉的粘粒文庫(kù)。
從通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備的原生質(zhì)體中制備黑曲霉N402的基因組DNA。
分離后，通過在Beckman GS-6R中于2000rpm離心10分鐘使原生質(zhì)體沉淀，然后將沉淀懸于含有22.5mM三異萘磺酸(tri-isonaphtalene sulphonicacid)、275 mM對(duì)氨基水楊酸、0.2M Tris-HCl(pH8.5)、0.25M NaCl和50mMEDTA的緩沖液中，隨后立即加入1個(gè)體積的苯酚/氯仿(1∶1)。小心混合并于3000rpm離心20分鐘后，輕輕傾出水相并利用標(biāo)準(zhǔn)的方法沉淀DNA。
通過在0.3％的瓊脂糖凝膠上以30伏電壓于4℃電泳20個(gè)小時(shí)來對(duì)基因組DNA的大小進(jìn)行分析。溴化乙錠染色的凝膠顯示所獲DNA的大小從50kb到大于100kb。利用MboI對(duì)所述DNA進(jìn)行部分消化。通過與上面相同類型的凝膠分析所確定的，消化后DNA的大小為30到50kb。將利用QIAGEN(Venlo，荷蘭)的試劑盒按照說明書純化的pAopyrGcosArpl載體用BamHI消化、去磷酸化并凝膠純化。按照標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行連接和組裝。
在測(cè)定文庫(kù)的滴度后，將一次連接和組裝的所有組裝混合物轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞MC1046中，并于50μg/ml氨芐青霉素LB平板上鋪板。獲得了大約40,000個(gè)菌落。來自10個(gè)菌落的粘粒制備物顯示它們都有預(yù)期大小的插入子。然后將40,000個(gè)菌落浸泡于LB培養(yǎng)基中并從平板上刮下，然后分裝，在15％甘油中儲(chǔ)藏于-80℃。這代表對(duì)黑曲霉基因組大約40倍的擴(kuò)增。
prtT克隆的篩選從所述的文庫(kù)中制備粘粒DNA并按照由P.J.Punt和C.A.M.J.J.Van DenHondel(1992.酶學(xué)方法216447-457)所描述的轉(zhuǎn)化方法將其引入13PAP2。反復(fù)盡力對(duì)pyrG標(biāo)志物進(jìn)行篩選只導(dǎo)致回收了4000到30,000個(gè)轉(zhuǎn)化子。對(duì)pyrG標(biāo)志物和在含乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)所進(jìn)行的雙重篩選，從5個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生一共65個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化子。
對(duì)每個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化子篩選蛋白酶活性、在含乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)以及這兩個(gè)特征的不穩(wěn)定性。通過在含乙酰胺的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而篩選的乙酰胺酶+表型是因報(bào)告物表達(dá)盒內(nèi)pepA啟動(dòng)子的激活而導(dǎo)致的乙酰胺酶活性的一個(gè)指示，在所述的表達(dá)盒中pepA啟動(dòng)子連接于amdS編碼序列。利用含透析過的脫脂奶作為唯一氮源的基本培養(yǎng)基平板對(duì)蛋白酶+表型進(jìn)行篩選(Mattern，I.E.，等，1992.分子和普通遺傳學(xué)234332-336)。在這些平板上，野生型的AB4.1菌株產(chǎn)生透明環(huán)，而AB1.13突變體則產(chǎn)生很小的環(huán)。這種差別并非由于pepA活性的不同，因?yàn)閜epA缺失的菌株在這些平板上也可以產(chǎn)生大的環(huán)。因此，在牛奶平板上形成大的環(huán)表示其他細(xì)胞外蛋白酶的激活。
通過在含尿苷的培養(yǎng)基上培養(yǎng)稀釋的孢子原種來對(duì)不穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。從這些平板種挑取單個(gè)孢子衍生的菌落，并對(duì)其檢測(cè)蛋白酶活性和在乙酰胺上的生長(zhǎng)。篩選結(jié)果揭示在超過70％的菌落中這兩種特征均已喪失。因此，所述的兩個(gè)表型或者一同喪失，或者一同保留，表明pepA啟動(dòng)子和其他蛋白酶啟動(dòng)子的激活被協(xié)同調(diào)節(jié)，并且與pyrG標(biāo)志物的存在相關(guān)聯(lián)。負(fù)責(zé)該表型的基因被稱為prtT。然后分離了12個(gè)乙酰胺酶+、蛋白酶+轉(zhuǎn)化子。
prtT基因的分離為了從13PAP2的乙酰胺酶+、蛋白酶+轉(zhuǎn)化子中挽救prtT基因，如前所述，從生長(zhǎng)于基本培養(yǎng)基中的菌絲體中制備DNA。將該DNA用于嘗試轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。獲得數(shù)百株氨芐青霉素抗性菌落。DNA分析顯示它們均含有源自pHelpl質(zhì)粒的序列。然后將從大腸桿菌菌落中分離的粘粒DNA重新轉(zhuǎn)化到13PAP2中。兩個(gè)DNA樣品產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子，所述的轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出在含有乙酰胺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)以及增高的蛋白酶活性。然后用幾種限制性酶對(duì)來自粘粒之一，ACRl的DNA進(jìn)行消化。然后將所獲的片段與pAopyrGcosArpl一起共轉(zhuǎn)化到菌株13PAP2中。EcoRJ、PstI、BamHI和KpnI對(duì)ACRl的消化產(chǎn)生了能夠在乙酰胺上生長(zhǎng)并具有高蛋白酶活性的轉(zhuǎn)化子，而SalI和HindIII消化則未產(chǎn)生。因?yàn)镋coRI消化產(chǎn)生最簡(jiǎn)單的模式，所以對(duì)單個(gè)EcoRI片段利用凝膠進(jìn)行分離并與pAopyrGcosArpl一起用于共轉(zhuǎn)化13PAP2。只有一個(gè)15kb的EcoRI片段產(chǎn)生了能夠在含乙酰胺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。為了從粘粒中亞克隆prtT，將該片段亞克隆到pBluescript II SK中。由于該克隆的插入片段仍相當(dāng)大，所以對(duì)分離的PstI條帶通過凝膠進(jìn)行分離并將每個(gè)與pAopyrGcosArpl一起共轉(zhuǎn)化到13PAP2中。只有一個(gè)2.5kb的PstI片段產(chǎn)生了能夠在含乙酰胺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。將該片段亞克隆到pBluescriptII SK中?；谙拗菩詧D譜，由該質(zhì)粒構(gòu)建4個(gè)亞克隆，ClE0.7、ClE1.8、NcE1.1和NcE1.4。此外，對(duì)一個(gè)6.5kb的SstI/EcoRJ片段進(jìn)行了亞克隆，得到了pEES1(示于圖3中)，所述的SstI/EcoRI片段包括2.5kb的PstI片段。
對(duì)來自AB4.1的基因組DNA進(jìn)行的SOUTHERN印跡分析表明只存在一個(gè)拷貝的prtT。
實(shí)施例2對(duì)prtT基因的測(cè)序以及序列分析利用來自Perkin-Elmer公司(Branchburg NJ，美國(guó))的羅丹明終止劑循環(huán)測(cè)序試劑盒或BigDyeTM終止劑循環(huán)測(cè)序試劑盒制備所有的測(cè)序反應(yīng)。將反應(yīng)在ABI PRISM377 DNA測(cè)序儀(Perkin-Elmer公司)上按照制造商的說明來運(yùn)行。
從基因組克隆ClE0.7、ClE1.8、NcE1.1、NcE 1.4和pEES1中對(duì)prtT基因進(jìn)行測(cè)序。將所用的序列特異性引物列舉如下122958CGA TCG ATG ACT GCC TGT122956AGA GAC ACA TAG TGC CTT122959GCT TAT AGT CGA TAG CGC122960CCT CTC TCC AGC GAT GGT122962ATG GAA TAC ATA CTG CTT122961ATG AAA CCC ACT GTA GCT122963TGC TCG ATA AGC GGG TCC122964AAT CTT ATG GAC CCG CTT124289CCC CGG GAA ACA AGA ACA GG124290GTT GGC GGA CCT TGA CTA TG125112ACA GCT ACA GTG GGT TTC ATC T125111AGT CAA CGG GGG AAG TCT C128330CTA GCA GCG TAT CGG TCA GC130887CTT GGA AAA GAA ACG ATA G130888AAC GTA CGC TTT CCT CCT T134135GGG TCC GTC CAG TCC GTT CTT-48反向AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-40通用GTT TTC CCA GTC ACG AC利用下述引物，通過對(duì)分離自突變株AB1.13的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了該基因的一個(gè)突變的等位基因PstITC ATC CCT GGT GTT ACT GCPstIIC ATG GAT TGG CTG GCC GprtT基因的完整DNA序列示于SEQ ID NO1中。所述突變的等位基因的PCR片段的序列示于SEQ ID NO4中。
利用計(jì)算機(jī)軟件Netgene2(S.M.Hebsgaard，P.G.Korning，N.Tolstrup，J.Engelbrecht，P.Rouze，S.Brunak，1996.核酸研究243439-3452)對(duì)DNA序列SEQ ID NO1的分析表明存在5個(gè)外顯子(見SEQ ID NO1的注釋)prtT cDNA的分析利用市售的多聚(A)+RNA分離試劑盒(Pharmacia，Uppsala SE)從來自黑曲霉培養(yǎng)物的總RNA中純化mRNA，所述的黑曲霉培養(yǎng)物在有利于蛋白酶產(chǎn)生的條件下生長(zhǎng)(J.P.T.N.Van Den Hombergh，等，1997.歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)247605-613)。利用標(biāo)準(zhǔn)的方法制備雙鏈cDNA并將其用于利用下列引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)寡聚-dT引物T20Nprt270n TACTCTCCAGATTGCCTGprt1420r TGAGATACCACTCAGCAGprt1350n TGCACTTCTCTGTCTCTGprt2365r GACTTCTGGCATCAGTTGprt2320n CTCATGGATGGCATGATC利用引物Prt270n和Prtl420r進(jìn)行的PCR反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)大約1.0kb的片段。將該片段克隆到pGEM-T載體(Promega公司，Madison WI，美國(guó))中，并利用引物122958、122960、-40通用和-48反向?qū)λ@質(zhì)粒中的插入序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果證實(shí)在所述基因的該部分存在2個(gè)內(nèi)含子。
利用引物Prt1350n和Prt2365r進(jìn)行的第二個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)生大約0.9kb的片段。將該片段也克隆到一個(gè)pGEM-T載體中，并利用引物124289、124290、-40通用和-48反向?qū)λ@質(zhì)粒中的插入序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果證實(shí)在所述基因的該部分存在1個(gè)內(nèi)含子。
利用寡聚-dT引物和引物Prt2320n進(jìn)行的另一個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)生大約350bp的片段。將該片段也克隆到一個(gè)pGEM-T載體中。利用引物-40通用和-48反向?qū)Σ迦胄蛄羞M(jìn)行的測(cè)序表明該片段含有prtT基因的3’部分并證實(shí)存在另一個(gè)內(nèi)含子。
對(duì)所翻譯的prtT基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID NO2中。對(duì)所翻譯的突變等位基因prt13推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列示于SEQ ID NO5中。SEQ IDNO2和SEQ ID NO5的比較表明兩者之間唯一的差別在第112位上，在該位點(diǎn)上，所翻譯的prtT基因中的亮氨酸殘基在所翻譯的prt13基因中被脯氨酸取代。
對(duì)所推導(dǎo)prtT蛋白序列的分析顯示存在一個(gè)Zinc(II)2Cys6雙核簇(binuclear cluster)DNA結(jié)合基元(SEQ ID NO2，47-81位殘基)。該基元對(duì)GAL4類真菌轉(zhuǎn)錄激活因子進(jìn)行了界定(Reece，M.J.，和Ptashne，M.1993.科學(xué)261909-911)。所述基元在prtT基因中的存在強(qiáng)烈表明prtT為一種轉(zhuǎn)錄激活因子。
實(shí)施例3在野生型黑曲霉菌株中對(duì)prtT基因的阻斷構(gòu)建了一種質(zhì)粒，其中由米曲霉的pryG基因?qū)rtT基因的上游和下游序列分隔開。將質(zhì)粒pEES1用MunI和NheI消化，去除一個(gè)含有prtT大部分編碼序列的2.1kb片段。將來自pAO4-13的一個(gè)含有米曲霉pyrG基因的2.3kb EcoRI/NheI片段克隆到pEES1的MunI和NheI位點(diǎn)中。所獲的質(zhì)粒被稱為pDprt，其示于圖4中。然后將該構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株AB4.1使之變成尿苷原養(yǎng)型。然后在含脫脂奶的平板上對(duì)大約150個(gè)尿苷原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化子分析蛋白酶的活性。這些轉(zhuǎn)化子中有5個(gè)在這些平板上不形成暈環(huán)，表明蛋白酶活性非常低。prtT基因被阻斷的菌株與突變的AB1.13菌株相比在蛋白酶活性或表型上未顯示出任何差別。
實(shí)施例4PrtT的過表達(dá)對(duì)一種質(zhì)粒pGPprt(圖5)進(jìn)行構(gòu)建，其含有與黑曲霉gpd基因啟動(dòng)子融合的prtT的編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)。gpd基因編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶，其為參與基本代謝的一種組成型表達(dá)酶。所用的啟動(dòng)子為編碼區(qū)上游的一個(gè)片段。將所述的質(zhì)粒與pyrG篩選質(zhì)粒pAO4-13共轉(zhuǎn)化到黑曲霉AB4.1中。對(duì)通過SOUTHERN印跡分析確定prtT轉(zhuǎn)錄增加的轉(zhuǎn)化子分析其增高的蛋白酶表達(dá)。
生物材料的保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約，已將下述生物材料保藏于德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德國(guó))，并給予了下列登記號(hào)保藏 登記號(hào) 保藏日大腸桿菌，pEES DSM 122941998-07-14黑曲霉13PAP2DSM 122981998-07-14
菌株保藏的條件是，在本專利申請(qǐng)懸而待決期間，保證可獲取培養(yǎng)物。該保藏物代表相當(dāng)于所保藏菌株的純培養(yǎng)。本專利申請(qǐng)的副本或后續(xù)申請(qǐng)進(jìn)入其它國(guó)家時(shí)，根據(jù)所在國(guó)專利法的要求可提供上述保藏物。但應(yīng)理解，保藏物的可提供性并非許可在侵犯政府所授予的專利權(quán)利的條件下實(shí)施本發(fā)明。
在此所描述并要求專利保護(hù)的發(fā)明并不限于本文中所公開的特定實(shí)施方案的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意圖作為對(duì)本發(fā)明幾個(gè)方面的說明。任何等同的實(shí)施方案均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，除了那些在此所示并描述的修改外，本領(lǐng)域的技術(shù)人很容易根據(jù)前面的描述對(duì)本發(fā)明作各種修改。這些修改也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文中引用了各種參考文獻(xiàn)，其公開內(nèi)容整個(gè)被引入作為參考。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵編(ZIP)2880(G)電話+45 4444 8888(ii)發(fā)明標(biāo)題在制備多肽的方法中有效的真菌轉(zhuǎn)錄激活因子(iii)序列數(shù)1(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EP0)(2)SEQ ID NOl的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4098堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(B)菌株DSM 12294(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置978..1204(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1317..1718(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1777..2202(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置2253..3116(ix)FEATURE(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置3173..3248
(xi)序列描述SEQ ID NO1TTGGTGCTGG AAAGCCCATT TAAGGGATCT TATAAGGTAA TTGCCAATGT TCAGTCGCCT 60ATGGTCTTTG TCGAGAGAAA CTCTTTCTCG TTAAGATCTA CATGATCGCT TTTGATTTTC120TCTGGGTTCA CGCGGTACTT TCTCCCCGTC AATCCCCAAC CGCTGTTGTG CCTGACCATC180AATGTGGAAC GGATAAGGGG ACAAGAGAAA TTGAAGGAGC GATCATAAAA AGCTAATTTT240GGTTTATTAT TTTTTTTTCT TATAAAACTC AAAAAAGAAA ACGAAAACGA AAAAGGAAAA300AAGAAAAGGT AAAATGGAAA AAGAAAGGCG GTCATCACTT CCAATAACCA TCAGCCAAAG360ATACAGACGA GTTACTGACC TTCTTATCCT GGACTTCCGC CCGATCCATA TCTTCATGAT420AAGCAGGGAA CCGAACAAAT CAACGCCAAC TTCAGCGGCA GTTCCTCACT AATTTCCCAC480TTCCCACCGG CGTCATTTTG GTCCCAACCC CCTCCCTGGA AGCAGCGGGA TTTAGTTACG540ATCCGGTTTA CATCGGAGAC TCGGAAAATA CCATAGCGCA TGCCAATCAA AACCCCTCCC600AGGGTGACTG GCCAGTATCA CGACCCATTG TTTCTATCTT TCTAGAAGAC CTGCAGGGAC660ATGGATTGGC TGGCCGCCGT GCTGCCGTCC ATTAGCGTCT ACCCCAGGTC AAGAACGGAC720TGGACGGACC CATAACCAAT CTAACCAAAG CCAATTTCGT CAATTCCCAG CTGGCGAGCA780CAATCCCATT CCCAGGGTTG GCCGCCAACT GTTAAAAGGC ACTATGTGTC TCTCCACCTG840CCCGCCCCCC TCGATGGCCT GCGCGTAATA ACTATTCTAC TGCTTTTTGC CTCTTACTTG900CCTCATTATT AGTATTTTAC TCTACTCTCC AGATTGCCTG CCAGCAATTG GTCCAAAGTG960GACTTTGTTT GATGACATGA CTCGAACCGT GGACGAGATC AAATACGAAA CGCCTTCTTC 1020ATGGGAGCAC AAGAGCTTGG ACGTTGCCGA GGATGGCAGG CGACTAGCTC CCCATTCCGA 1080CACTGCTCGT CCGAAAGGCC GCATACGACG ATCGATGACT GCCTGTCACA CATGTCGGAA 1140GCTTAAAACT AGATGTGATC TAGATCCGCG CGGTCATGCG TGCCGTCGCT GTCTATCTCT 1200AAGGTCAGAG GCACTACCTA CCTGCCAGTT GAAGCTTTGT CCTTCTGAAC GCGACATGAT 1260ACTAGTCGTG GAATATAACT GTCCCAACTT TGCTGACAGT CCACAATATC TTTAGAATCG 1320ATTGTAAGCT GCCTGAAACG ACCGACCGCT TCCAAGACAG TGCTGCGATG TGGCCAGACG 1380CCACCTCGGC AATTCCCTCC ATCGAGGAGC GCCTCACCTC CCTAGAAAGA TGCATGAGGG 1440AGATGACGGG CATGATGCGA CAGATGCTAG ATCACTCCCC AGGTTTCGCA AATGCCTCGG 1500TTCCGCATTT GACCAAAAGC ATCATCACGG ATGAAACCGC CTCGATGGAG GGAAGCCCGT 1560CGTCCCCCTT CCTGCCTAAG CCCGTTCGCC TCATTCAGGA CCTCCAGTCC GACTTCTTCG 1620GAGAAGCAGA GACTTCCCCC GTTGACTCCC CTCTCTCCAG CGATGGTAAC CCCAAGGGCG1680CTATCGACTC TAAGCTATCC CTCAAATTGT TGCAAACGTA TGGGTATACC TGATTGACAA1740TTACCAAAAA GCTGCTAATC CTTGGCGCAA ATCAGGTTTG TCGATCACTT TGGCGCTTGC1800GTTTCCATTT ACAATCTCTC CGACATCCAC AACGACATGA AAGCCCCCGA CTCTTTACTG1860TATAATACTG CATGCCTTCT AGCTTCACGC TATGTACCGG GGATACCGAC ATCTACCGTG1920CATGCTATAT ACCTTCAAGT GCGACATGCA GTAGTCAATA TTTTGTGGGA AAAACCACCC1980CTGAAGTATG AGACCCTCCA AGCACTTGCA CTTCTCTGTC TCTGGCCAGC AACCGCCCAG2040AAAGAGCCAC CCATGGACAG CTGGCTGCTG AGTGGTATCT CAATTAACCA TGCAATTATC2100GCGCTCGATT TCCTAAACTA TGCGCCCTCG GAAGTCATGG TGGACAATGA AACGGCTGCG2160CAGCTGCGGC TATGGAATAC ATATTGCTTG ACACAGCTAC AGTGGGTTTC ATCTAAGATC2220TCCCGTCCAG AAGATAGCTA ACAAGCTTTA GTTTTGCGGT CGGGAATGCG CGTCCTTTCC2280ATATCCAGCA AAGATACCTT GACCACTGCC CACGGATACT GGAGCACCCA GCAGCAACTC2340TGGAGGACGC AAGGGTTGTA GCAGAAATAC AGTTGTATTT GATGACATTG CGGCTCCAGA2400GCAATAGCAG TCGAATGCGG TTGGCGGACC TTGACTATGA GGAAATAGAG CGATGGAAGA2460GGGAGTGGGC TCACCTTTTC TGTAAGAAGC CTGTTCTTGT TTCCCGGGGA CTACCACTGA2520CGAGAGCAAC AGCTGGGGAA AGTTCCACAT TGGAGCTGAG CCTTTGGTTC TGCCAGACAC2580TCCTTCACCG CACAGCAATG AGGCTTCAGC CCAGATCCGA CAGGCTCGCA TCTGAGGTTC2640TGCAAACCTC ACGTCTGATA ATATCGCGGT TCCTCCAGAT CCGGTACTCT ACCGCATTAA2700GCCTTGTCGA CCAAGTCTAT TTCATTGTCG GCTACGCTGC ACTGAATCTG TGCGATTTCA2760ATCTTATGGA CCCGCTTATC GAGCAAGTGC AGATGTTCCT GCTGCATCTC TCCCCGAACG2820AAGACCACAT CGCCTACCGG TTTTCGTGCA TGGTCGCCGA GTTCAAGCGG CGATGTGGCA2880GTGCGGAATG CAATGACCCA TCATCCACTG TCAAGGGGTC TCCGTTATCA TCCTACGGCG2940ACAGTCGTAA GATGAGCATG GGGCAAGCAC CGTTCATGCC ACCGCTCATG GATGGCATGA3000TCGAGGGGTA CGGCTTCGAG CAACTGATGC CAGAAGTCAT GCCGAGTTCC TTTCCGGATG3060GGATACTCAA CGGAATGCCT GTGACTGGGC TAGCAGCGTA TCGGTCAGCG ACGCTGTAAG3120TAATCGAGAT CGGGTTGGAA AGGACATGAG TGGGGGTGGT GGTGGTAGTA GCAGTAACAC3180CAGGGATGAT AACCTGCAGC GGTGGTTTAG TTCCTGCCCA TGGGCTGAAC TAAAACCCCG3240AACCTAGCAT GATGACGTGC AACGAAAGGA TCATAACCAA GGCCAAGTAA ATACTAAAAT3300AAAATAATAT AATTCCACAC GATCCACTAC CACCACCACC ACCGGATCCA TCAGGTTGCC3360TTCCTGCACA GGCCTATTTA GTTAGAGGGC CCGTGCCACG AAACATCACG TAATTGAGCG3420CTTTTGCTTC CTTGCAACTT AAACAACCCC ATAGACACTC TCACATTCAC ATGCCAAACT3480ACTAACTCCT ACTGACCACC AGCTGCAGGA AGCCAGCCAG CCACCATTTC CTAATCGGAT3540ATATCTCCGA AACGTACGCT TTCCTCCTTT GTTCGGACCG TTCCGTGCCT CCGCGGAGAG3600TTGAACGAGT CAGAACACAT TCTTTTCGTT TCTATCGTTT CTTTTCCAAG GCAGCAGAGA3660GACGAACAAG TCAGTGCTTG CTAACTAACT TACCCCTCAG CATTTTAGTA AACTACTATT3720TAGGAAAGAG TAATCATTCA TCGAAGACAA GATGTTTATT TCTCCGATCG ACCAAACAAA3780AACGTTCAGG TAGACTAAGT AGTAGTAGTA GTATGTCTTT GACCCCTTTA CTCCACTATC3840CGTTGACTGC ACATAGTAGT AAGTAACTAT CTAACCAGTT GCCGAGGAGA GGAAAGTGAG3900TGGGTGGGAG CCGGAGGATG CCGCCGAGAA TTATTAAGTC GATCATTGCT AGTTAGTTAT3960CTTTTCATGA TGAGGAGAGG AAGGAGAGGG GGGACGGGAT TAGAGAAATA AACTTTTCTC4020TCCAATTAAT TATCTGGATT AATTAAAACT TGGAGAGGAG GGTAGGGGAG TTGGGTATTG4080GTATGTTGCT GTGAATGT 4098(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度666氨基酸s(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Arg Thr Val Asp Glu Ile Lys Tyr Glu Thr Pro Ser Ser Trp15 10 15Glu His Lys Ser Leu Asp Val Ala Glu Asp Gly Arg Arg Leu Ala Pro20 25 30His Ser Asp Thr Ala Arg Pro Lys Gly Arg Ile Arg Arg Ser Met Thr35 40 45Ala Cys His Thr Cys Arg Lys Leu Lys Thr Arg Cys Asp Leu Asp Pro50 55 60Arg Gly His Ala Cys Arg Arg Cys Leu Ser Leu Arg Ile Asp Cys Lys65 70 75 80Leu Pro Glu Thr Thr Asp Arg Phe Gin Asp Ser Ala Ala Met Trp Pro
85 90 95Asp Ala Thr Ser Ala Ile Pro Ser IIe Glu Glu Arg Leu Thr Ser Leu100 105 110Glu Arg Cys Met Arg Glu Met Thr Gly Met Met Arg Gln Met Leu Asp115 120 125His Ser Pro Gly Phe Ala Asn Ala Ser Val Pro His Leu Thr Lys Ser130 135 140Ile Ile Thr Asp Glu Thr Ala Ser Met Glu Gly Ser Pro Ser Ser Pro145 150 155 160Phe Leu Pro Lys Pro Val Arg Leu Ile Gln Asp Leu Gln Ser Asp Phe165 170 175Phe Gly Glu Ala Glu Thr Ser Pro Val Asp Ser Pro Leu Ser Ser Asp180 185 190Gly Ash Ala Lys Gly Ala Ile Asp Ser Lys Leu Ser Leu Lys Leu Leu195 200 205Gln Thr Phe Val Asp His Phe Gly Ala Cys Val Ser Ile Tyr Asn Leu210 215 220Ser Asp Ile His Asn Asp Met Lys Ala Pro Asp Ser Leu Leu Tyr Asn225 230 235 240Thr Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Tyr Val Pro Gly Ile Pro Thr Ser245 250 255Thr Val His Ala Ile Tyr Leu Gln Val Arg His Ala Val Val Ash Ile260 265 270Leu Trp Glu Lys Pro Pro Leu Lys Tyr Glu Thr Leu Gln Ala Leu Ala275 280 285Leu Leu Cys Leu Trp Pro Ala Thr Ala Gln Lys Glu Pro Pro Met Asp290 295 300Ser Trp Leu Leu Ser Gly Ile Ser Ile Ash His Ala Ile Ile Ala Leu305 310 315 320Asp Phe Leu Asn Tyr Ala Pro Ser Glu Val Met Val Asp Asn Glu Thr325 330 335Ala Ala Gln Leu Arg Leu Trp Asn Thr Tyr Cys Leu Thr Gln Leu His340 345 350Phe Ala Val Gly Asn Ala Arg Pro Phe His Ile Gln Gln Arg Tyr Leu355 360 365Asp His Cys Pro Arg Ile Leu Glu His Pro Ala Ala Thr Leu Glu Asp370 375 380Ala Arg Val Val Ala Glu Ile Gln Leu Tyr Leu Met Thr Leu Arg Leu385 390 395 400Gln Ser Asn Ser Ser Arg Met Arg Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Glu Glu405 410 415Ile Glu Arg Trp Lys Arg Glu Trp Ala His Leu Phe Cys Lys Lys Pro420 425 430Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gly Glu435 440 445Ser Ser Thr Leu Glu Leu Ser Leu Trp Phe Cys Gln Thr Leu Leu His450 455 460Arg Thr Ala Met Arg Leu Gln Pro Arg Ser Asp Arg Leu Ala Ser Glu465 470 475 480Val Leu Gln Thr Ser Arg Leu Ile Ile Ser Arg Phe Leu Gln Ile Arg485 490 495Tyr Ser Thr Ala Leu Ser Leu Val Asp Gln Val Tyr Phe Ile Val Gly500 505 510Tyr Ala Ala Leu Asn Leu Cys Asp Phe Asn Leu Met Asp Pro Leu Ile515 520 525Glu Gln Val Gln Met Phe Leu Leu His Leu Ser Pro Asn Glu Asp His530 535 540Ile Ala Tyr Arg Phe Ser Cys Met Val Ala Glu Phe Lys Arg Arg Cys545 550 555 560Gly Ser Ala Glu Cys Asn Asp Pro Ser Ser Thr Val Lys Gly Ser Pro565 570 575Leu Ser Ser Tyr Gly Asp Ser Arg Lys Met Ser Met Gly Gln Ala Pro580 585 590Phe Met Pro Pro Leu Met Asp Gly Met Ile Glu Gly Tyr Gly Phe Glu595 600 605Gin Leu Met Pro Glu Val Met Pro Ser Ser Phe Pro Asp Gly Ile Leu610 615 620Ash Gly Met Pro Val Thr Gly Leu Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Thr Leu625 630 635 640Ser Ser Ash Thr Arg Asp Asp Asn Leu Gln Arg Trp Phe Ser Ser Cys645 650 655Pro Trp Ala Glu Leu Lys Pro Arg Thr Pro660 665(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度35氨基酸s(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Thr Ala Cys His Thr Cys Arg Lys Leu Lys Thr Arg Cys Asp Leu1 5 10 15Asp Pro Arg Gly His Ala Cys Arg Arg Cys Leu Ser Leu Arg Ile Asp20 25 30Cys Lys Leu35(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2542堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝″PCR片段″(vi)來源(B)菌株prt13等位基因變體(xi)序列描述SEQ ID NO4GACATGGATT GGCTGGCCGC CGTGCTGCCG TCCATTAGCG TCTACCCCAG GTCAAGAACG60GACTGGACGG ACCCATAACC AATCTAACCA AAGCCAATTT CGTCAATTCC CAGCTGGCGA 120GCACAATCCC ATTCCCAGGG TTGGCCGCCA ACTGTTAAAA GGCACTATGT GTCTCTCCAC 180CTGCCCGCCC CCCTCGATGG CCTGCGCGTA ATAACTATTC TACTGCTTTT TGCCTCTTAC 240TTGCCTCATT ATTAGTATTT TACTCTACTC TCCAGATTGC CTGCCAGCAA TTGGTCCAAA 300GTGGACTTTG TTTGATGACA TGACTCGAAC CGTGGACGAG ATCAAATACG AAACGCCTTC 360TTCATGGGAG CACAAGAGCT TGGACGTTGC CGAGGATGGC AGGCGACTAG CTCCCCATTC 420CGACACTGCT CGTCCGAAAG GCCGCATACG ACGATCGATG ACTGCCTGTC ACACATGTCG 480GAAGCTTAAA ACTAGATGTG ATCTAGATCC GCGCGGTCAT GCGTGCCGTC GCTGTCTATC 540TCTAAGGTCA GAGGCACTAC CTACCTGCCA GTTGAAGCTT TGTCCTTCTG AACGCGACAT 600GATACTAGTC GTGGAATATA ACTGTCCCAA CTTTGCTGAC AGTCCACAAT ATCTTTAGAA 660TCGATTGTAA GCTGCCTGAA ACGACCGACC GCTTCCAAGA CAGTGCTGCG ATGTGGCCAG 720ACGCCACCTC GGCAATTCCC TCCATCGAGG AGCGCCTCAC CTCCCTAGAA AGATGCATGA 780GGGAGATGAC GGGCATGATG CGACAGATGC TAGATCACTC CCCAGGTTTC GCAAATGCCT 840CGGTTCCGCA TTTGACCAAA AGCATCATCA CGGATGAAAC CGCCTCGATG GAGGGAAGCC 900CGTCGTCCCC CTTCCTGCCT AAGCCCGTTC GCCTCATTCA GGACCTCCAG TCCGACTTCT 960TCGGAGAAGC AGAGACTTCC CCCGTTGACT CCCCTCTCTC CAGCGATGGT AACGCCAAGG1020GCGCTATCGA CTCTAAGCTA TCCCTCAAAT TGTTGCAAAC GTATGGGTAT ACCTGATTGA1080CAATTACCAA AAAGCTGCTA ATCCTTGGCG CAAATCAGGT TTGTCGATCA CTTTGGCGCT1140TGCGTTTCCA TTTACAATCT CTCCGACATC CACAACGACA TGAAAGCCCC CGACTCTTTA1200CTGTATAATA CTGCATGCCT TCTAGCTTCA CGCTATGTAC CGGGGATACC GACATCTACC1260GTGCATGCTA TATACCTTCA AGTGCGACAT GCAGTAGTCA ATATTTTGTG GGAAAAACCA1320CCCCTGAAGT ATGAGACCCT CCAAGCACTT GCACTTCTCT GTCTCTGGCC AGCAACCGCC1380CAGAAAGAGC CACCCATGGA CAGCTGGCTG CTGAGTGGTA TCTCAATTAA CCATGCAATT1440ATCGCGCTCG ATTTCCTAAA CTATGCGCCC TCGGAAGTCA TGGTGGACAA TGAAACGGCT1500GCGCAGCTGC GGCTATGGAA TACATATTGC TTGACACAGC TACAGTGGGT TTCATCTAAG1560ATCTCCCGTC CAGAAGATAG CTAACAAGCT TTAGTTTTGC GGTCGGGAAT GCGCGTCCTT1620TCCATATCCA GCAAAGATAC CTTGACCACT GCCCACGGAT ACTGGAGCAC CCAGCAGCAA1680CTCTGGAGGA CGCAAGGGTT GTAGCAGAAA TACAGTTGTA TTTGATGACA TTGCGGCTCC1740AGAGCAATAG CAGTCGAATG CGGTTGGCGG ACCTTGACTA TGAGGAAATA GAGCGATGGA1800AGAGGGAGTG GGCTCACCTT TTCTGTAAGA AGCCTGTTCT TGTTTCCCGG GGACTACCAC1860TGACGAGAGC AACAGCTGGG GAAAGTTCCA CATTGGAGCT GAGCCTTTGG TTCTGCCAGA1920CACTCCTTCA CCGCACAGCA ATGAGGCTTC AGCCCAGATC CGACAGGCTC GCATCTGAGG1980TTCTGCAAAC CTCACGTCTG ATAATATCGC GGTTCCTCCA GATCCGGTAC TCTACCGCAT2040TAAGCCTTGT CGACCAAGTC TATTTCATTG TCGGCTACGC TGCACTGAAT CTGTGCGATT2100TCAATCTTAT GGACCCGCTT ATCGAGCAAG TGCAGATGTT CCTGCTGCAT CTCTCCCCGA2160ACGAAGACCA CATCGCCTAC CGGTTTTCGT GCATGGTCGC CGAGTTCAAG CGGCGATGTG2220GCAGTGCGGA ATGCAATGAC CCATCATCCA CTGTCAAGGG GTCTCCGTTA TCATCCTACG2280GCGACAGTCG TAAGATGAGC ATGGGGCAAG CACCGTTCAT GCCACCGCTC ATGGATGGCA 2340TGATCGAGGG GTACGGCTTC GAGCAACTGA TGCCAGAAGT CATGCCGAGT TCCTTTCCGG 2400ATGGGATACT CAACGGAATG CCTGTGACTG GGCTAGCAGC GTATCGGTCA GCGACGCTGT 2460AAGTAATCGA GATCGGGTTG GAAAGGACAT GAGTGGGGGT GGTGGTGGTA GTAGCAGTAA 2520CACCAGGGAT GATAACCTGC AG 2542(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度665氨基酸s(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型肽(vi)來源(B)菌株prtl3基因產(chǎn)物(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Thr Arg Thr Val Asp Glu Ile Lys Tyr Glu Thr Pro Ser Ser Trp1 5 10 15Glu His Lys Ser Leu Asp Val Ala Glu Asp Gly Arg Arg Leu Ala Pro20 25 30His Ser Asp Thr Ala Arg Pro Lys Gly Arg Ile Arg Arg Ser Met Thr35 40 45Ala Cys His Thr Cys Arg Lys Leu Lys Thr Arg Cys Asp Leu Asp Pro50 55 60Arg Gly His Ala Cys Arg Arg Cys Leu Ser Leu Arg Ile Asp Cys Lys65 70 75 80Leu Pro Glu Thr Thr Asp Arg Phe Gln Asp Ser Ala Ala Met Trp Pro85 90 95Asp Ala Thr Ser Ala Ile Pro Ser Ile Glu Glu Arg Leu Thr Ser Pro100 105 110Glu Arg Cys Met Arg Glu Met Thr Gly Met Met Arg Gln Met Leu Asp115 120 125His Ser Pro Gly Phe Ala Asn Ala Ser Val Pro His Leu Thr Lys Ser130 135 140Ile Ile Thr Asp Glu Thr Ala Ser Met Glu Gly Ser Pro Ser Ser Pro145 150 155 160Phe Leu Pro Lys Pro Val Arg Leu Ile Gln Asp Leu Gln Ser Asp Phe165 170 175Phe Gly Glu Ala Glu Thr Ser Pro Val Asp Ser Pro Leu Ser Ser Asp180 185 190Gly Asn Ala Lys Gly Ala Ile Asp Ser Lys Leu Ser Leu Lys Leu Leu195 200 205Gln Thr Phe Val Asp His Phe Gly Ala Cys Val Ser Ile Tyr Asn Leu210 215 220Ser Asp Ile His Asn Asp Met Lys Ala Pro Asp Ser Leu Leu Tyr Ash225 230 235 240Thr Ala Cys Leu Leu Ala Ser Arg Tyr Val Pro Gly Ile Pro Thr Ser245 250 255Thr Val His Ala Ile Tyr Leu Gln Val Arg His Ala Val Val Asn Ile260 265 270Leu Trp Glu Lys Pro Pro Leu Lys Tyr Glu Thr Leu Gln Ala Leu Ala275 280 285Leu Leu Cys Leu Trp Pro Ala Thr Ala Gln Lys Glu Pro Pro Met Asp290 295 300Ser Trp Leu Leu Ser Gly Ile Ser Ile Asn His Ala Ile Ile Ala Leu305 310 315 320Asp Phe Leu Ash Tyr Ala Pro Ser Glu Val Met Val Asp Asn Glu Thr325 330 335Ala Ala Gln Leu Arg Leu Trp Ash Thr Tyr Cys Leu Thr Gln Leu His340 345 350Phe Ala Val Gly Ash Ala Arg Pro Phe His Ile Gln Gln Arg Tyr Leu355 360 365Asp His Cys Pro Arg Ile Leu Glu His Pro Ala Ala Thr Leu Glu Asp370 375 380Ala Arg Val Val Ala Glu Ile Gln Leu Tyr Leu Met Thr Leu Arg Leu385 390 395 400Gln Ser Asn Ser Ser Arg Met Arg Leu Ala Asp Leu Asp Tyr Glu Glu405 410 415Ile Glu Arg Trp Lys Arg Glu Trp Ala His Leu Phe Cys Lys Lys Pro420 425 430Val Leu Val Ser Arg Gly Leu Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gly Glu435 440 445Ser Ser Thr Leu Glu Leu Ser Leu Trp Phe Cys Gln Thr Leu Leu His
450 455 460Arg Thr Ala Met Arg Leu Gln Pro Arg Ser Asp Arg Leu Ala Ser Glu465 470 475 480Val Leu Gln Thr Ser Arg Leu Ile Ile Ser Arg Phe Leu Gln Ile Arg485 490 495Tyr Ser Thr Ala Leu Ser Leu Val Asp Gln Val Tyr Phe Ile Val Gly500 505 510Tyr Ala Ala Leu Asn Leu Cys Asp Phe Ash Leu Met Asp Pro Leu Ile515 520 525Glu Gln Val Gln Met Phe Leu Leu His Leu Ser Pro Asn Glu Asp His530 535 540Ile Ala Tyr Arg Phe Ser Cys Met Val Ala Glu Phe Lys Arg Arg Cys545 550 555 560Gly Ser Ala Glu Cys Asn Asp Pro Ser Ser Thr Val Lys Gly Ser Pro565 570 575Leu Ser Ser Tyr Gly Asp Ser Arg Lys Met Ser Met Gly Gln Ala Pro580 585 590Phe Met Pro Pro Leu Met Asp Gly Met Ile Glu Gly Tyr Gly Phe Glu595 600 605Gin Leu Met Pro Glu Val Met Pro Ser Ser Phe Pro Asp Gly Ile Leu610 615 620Asn Gly Met Pro Val Thr Gly Leu Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Thr Leu625 630 635 640Ser Ser Asn Thr Arg Asp Asp Asn Leu Gln Arg Trp Phe Ser Ser Cys645 650 655Pro Trp Ala Glu Leu Lys Pro Arg Thr660 66權(quán)利要求
1.分離的核酸序列，其編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽，其選自(a)與SEQ ID NO1的核酸序列有至少70％的同一性的核酸序列；(b)編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％的同一性。(c)在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，或者(ii)其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列，其中將低嚴(yán)謹(jǐn)度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因變體；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽片段；以及(f)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列，其中該子序列編碼一種具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽。
2.權(quán)利要求1的核酸序列，其與SEQ ID NO1的核酸序列具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，甚至最優(yōu)選至少97％的同一性。
3.權(quán)利要求1的核酸序列，其具有SEQ ID NO1的核酸序列。
4.權(quán)利要求1至3中任何一個(gè)的核酸序列，其編碼一種多肽，所述多肽包括的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少50％，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％的同一性。
5.權(quán)利要求1至4中任何一個(gè)的核酸序列，其中所述的核酸序列獲自真菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的核酸序列，其中所述的真菌細(xì)胞為絲狀真菌細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的核酸序列，其中所述的絲狀真菌細(xì)胞為曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬或木霉屬細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的核酸序列，其中所述的曲霉屬細(xì)胞為黑曲霉或米曲霉的菌株，或者它們的同物異名或有性型。
9.權(quán)利要求8的核酸序列，其中所述的曲霉細(xì)胞為黑曲霉DSM 12298菌株。
10.權(quán)利要求7的核酸序列，其中所述的鐮刀菌屬細(xì)胞為Fusariumvenenatum的菌株，或者其同物異名或有性型。
11.權(quán)利要求5的核酸序列，其中所述的酵母細(xì)胞為漢森酵母屬、畢赤酵母屬或酵母屬細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1至11中任何一個(gè)的核酸序列，其編碼一種多肽，所述多肽包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或其一個(gè)片段，其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
13.權(quán)利要求1至11中任何一個(gè)的核酸序列，其編碼一種多肽，所述多肽包括SEQ ID NO3的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1至13中任何一個(gè)的核酸序列，其在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)在SEQ IDNO1中所列的核酸序列或者(ii)相應(yīng)的互補(bǔ)鏈或其子序列雜交。
15.權(quán)利要求14的核酸序列，其中將低嚴(yán)謹(jǐn)度定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200mg/m1剪切并變性的鮭魚精DNA以及25％的甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；將中等嚴(yán)謹(jǐn)度定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA以及35％的甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于60℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；而將高嚴(yán)謹(jǐn)度定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200mg/ml剪切并變性的鮭魚精DNA以及50％的甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于70℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘。
16.權(quán)利要求1至15中任何一個(gè)核酸序列，其包括編碼一種包含在質(zhì)粒pEES中具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽的核酸序列，所述的質(zhì)粒pEES位于大腸桿菌DSM 12294內(nèi)。
17.核酸構(gòu)建體，其包括權(quán)利要求1至16中任何一個(gè)的核酸序列，所述的核酸序列可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中指導(dǎo)所述多肽的產(chǎn)生的調(diào)控序列。
18.表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求17的核酸序列、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
19.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求18的表達(dá)載體。
20.分離的多肽，其選自(a)一種多肽，在一種核酸序列中對(duì)其進(jìn)行編碼，所述的核酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQID NO1的核酸序列；(ii)其互補(bǔ)鏈，或(iii)SEQ ID NO1中編碼具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽片段的子序列雜交，其中將低嚴(yán)謹(jǐn)度條件定義為于42℃在5×SSPE、0.3％SDS、200μg/mi剪切并變性的鮭魚精DNA和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交，并將洗滌條件定義為于50℃在2×SSC、0.2％SDS中洗滌30分鐘；(b)一種多肽，其氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少50％的同一性；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)(a)、(b)或(c)的片段，其中所述的片段具有轉(zhuǎn)錄激活活性；以及(e)一種包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽或者其等位基因變體。
21.權(quán)利要求20的多肽，其包括的氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少50％，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少90％，而最優(yōu)選至少95％的同一性。
22.權(quán)利要求20或21的多肽，其包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或其一個(gè)片段，其中所述的片段保留有轉(zhuǎn)錄激活活性。
23.權(quán)利要求20至22中任何一個(gè)的多肽，在包含于質(zhì)粒pEES內(nèi)的核酸序列中對(duì)其進(jìn)行編碼，所述的質(zhì)粒pEES包含于大腸桿菌DSM12294內(nèi)。
24.權(quán)利要求20至23中任何一個(gè)的多肽，其包括SEQ ID NO3的氨基酸序列。
25.用于制備權(quán)利要求20至24中任何一個(gè)多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽制備的條件下對(duì)權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；和(b)回收該多肽。
26.有效制備多肽的真菌宿主細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞(a)為親代真菌細(xì)胞的突變體，其中親代細(xì)胞包括一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白酶的DNA序列，所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄由權(quán)利要求1至16中任一核酸序列所編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子激活；而且(b)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，突變細(xì)胞產(chǎn)生少于親代細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子和蛋白酶。
27.權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄激活因子產(chǎn)量的降低是通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)存在的而且是該轉(zhuǎn)錄激活因子表達(dá)所必需的核酸序列進(jìn)行修飾或滅活來獲得的。
28.權(quán)利要求26或27的宿主細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄激活因子產(chǎn)量的降低是通過對(duì)所述多肽表達(dá)所需的調(diào)控序列進(jìn)行修飾或滅活來獲得的。
29.權(quán)利要求28的宿主細(xì)胞，其中所述的調(diào)控序列為啟動(dòng)子序列或其功能性部分。
30.權(quán)利要求26至29中任何一個(gè)的宿主細(xì)胞，其中待修飾或滅活的核酸序列為在權(quán)利要求1至16任何一個(gè)中所定義的序列。
31.權(quán)利要求26至30中任何一個(gè)的宿主細(xì)胞，其中所述的修飾或滅活是通過特異性誘變或隨機(jī)誘變、定點(diǎn)誘變、PCR產(chǎn)生的誘變、核苷酸插入和/或置換、基因阻斷或基因置換技術(shù)、反義技術(shù)或它們的組合來進(jìn)行的。
32.有效用于制備多肽的真菌宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞為親代細(xì)胞的突變體，其中該突變體(a)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生比親代細(xì)胞多的由權(quán)利要求1至16中任一核酸序列所編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子；而且(b)包括編碼所述多肽的DNA序列，其轉(zhuǎn)錄被所述的轉(zhuǎn)錄激活因子激活。
33.權(quán)利要求32的宿主細(xì)胞，其中通過向親代細(xì)胞中引入一個(gè)或多個(gè)拷貝的(i)權(quán)利要求1至16中任何一個(gè)的核酸序列，(ii)權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體或者(iii)權(quán)利要求18的表達(dá)載體，使所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生比親代細(xì)胞多的轉(zhuǎn)錄激活因子，由此當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的所述多肽比親代細(xì)胞多。
34.權(quán)利要求32或33的宿主細(xì)胞，其中將編碼轉(zhuǎn)錄激活因子的核酸序列可操作地與一啟動(dòng)子相連，所述的啟動(dòng)子比親代細(xì)胞的相應(yīng)啟動(dòng)子強(qiáng)。
35.權(quán)利要求34的宿主細(xì)胞，其中所述的啟動(dòng)子介導(dǎo)一種細(xì)胞外蛋白酶的編碼基因表達(dá)，優(yōu)選為米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉中性金屬蛋白酶、黑曲霉曲霉胃蛋白酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶或者Fusarium venenatum胰蛋白酶。
36.有效用于制備多肽的真菌宿主細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞為親代細(xì)胞的突變體，其中該突變體包括(a)對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子或其調(diào)控序列的修飾或滅活，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子由權(quán)利要求1至16中任一固有的核酸序列編碼，以及(b)(i)可操作地與權(quán)利要求1至16中任一核酸序列相連的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，和(ii)由權(quán)利要求1至16中任一核酸序列所編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子可以結(jié)合的啟動(dòng)子序列，其可操作地與編碼所述多肽的核酸序列相連，其中(i)和(ii)可以被同時(shí)或先后引入。
37.權(quán)利要求36的宿主細(xì)胞，其中通過特異性誘變或隨機(jī)誘變、定點(diǎn)誘變、PCR產(chǎn)生的誘變、核苷酸插入和/或置換、基因阻斷或基因置換技術(shù)、反義技術(shù)或它們的組合來對(duì)所述的固有核酸序列或其調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾或滅活。
38.權(quán)利要求36或37的宿主細(xì)胞，其中所述的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子選自由碳或氮的分解代謝產(chǎn)物來介導(dǎo)其誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
39.權(quán)利要求33至38中任一個(gè)的宿主細(xì)胞，其還包括一個(gè)啟動(dòng)子序列，其中所述的啟動(dòng)子序列可以被所述轉(zhuǎn)錄激活因子激活，而且該序列可操作地與編碼所述多肽的核酸序列相連。
40.權(quán)利要求33至39中任何一個(gè)的宿主細(xì)胞，其中所述的啟動(dòng)子序列或其功能性部分來自一種蛋白酶基因。
41.權(quán)利要求33至40中任何一個(gè)宿主細(xì)胞，其中所述的蛋白酶基因?yàn)榧怄哏牭毒鹊鞍酌笜拥鞍酌富?、米曲霉堿性蛋白酶基因、黑曲霉pacA基因、米曲霉堿性蛋白酶基因、米曲霉中性金屬蛋白酶基因、黑曲霉曲霉胃蛋白酶基因或者Fusarium venenatum胰蛋白酶基因。
42.權(quán)利要求26至41中任何一個(gè)的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞包括至少一個(gè)拷貝的編碼所述多肽的核酸序列。
43.權(quán)利要求26至42中任何一個(gè)宿主細(xì)胞，其中在相同條件下培養(yǎng)時(shí)所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生比親代細(xì)胞少的固有蛋白酶或固有蛋白酶組合。
44.權(quán)利要求26至43中任何一個(gè)宿主細(xì)胞，其中通過在pH4下對(duì)3H-標(biāo)記的抹香鯨肌球蛋白的降解對(duì)所述蛋白酶的活性進(jìn)行檢測(cè)。
45.制備多肽的方法，其包括(a)在適于所述多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中對(duì)權(quán)利要求26至44中任何一個(gè)的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述的宿主細(xì)胞攜有編碼所述多肽的基因；和(b)從突變細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收所述的多肽。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述的多肽對(duì)所述親代細(xì)胞是固有的。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述的多肽對(duì)所述親代細(xì)胞是異源的。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述的多肽為抗體或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素變體、受體或其部分、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)告蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述的酶為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述的酶為氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、鹵過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的核酸序列,其編碼具有轉(zhuǎn)錄激活活性的多肽,同時(shí)本發(fā)明涉及所述的多肽。本發(fā)明還涉及包括所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及有效用于制備所述多肽的宿主細(xì)胞,在所述的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄激活因子的產(chǎn)生或功能被改變,本發(fā)明還涉及用于制備所述多肽的方法。
文檔編號(hào)C12R1/685GK1329667SQ99814016
公開日2002年1月2日 申請(qǐng)日期1999年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月5日
發(fā)明者卡斯滕·約爾特, 西斯·A·M·J·J·范德亨德爾, 彼得·J·龐特, 弗蘭克·H·J·舒?zhèn)?申請(qǐng)人:諾維信公司