專(zhuān)利名稱(chēng)：有活性但不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的活性片段，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。
背景技術(shù)：
細(xì)菌病原體和它們的植物寄主之間的相互作用一般屬于兩類(lèi)(1)親和性互作(病原體-寄主)，導(dǎo)致寄主植物中的胞間細(xì)菌生長(zhǎng)、癥狀發(fā)生和病害發(fā)生；和(2)非親和性互作(病原體-非寄主)，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)，一種特殊類(lèi)型的非親和性互作產(chǎn)生，無(wú)進(jìn)行性病害癥狀。在寄主植物的親和性互作期間，細(xì)菌群體顯著地增加及進(jìn)行性癥狀產(chǎn)生。在非親和性互作期間，細(xì)菌群體不增加，并且進(jìn)行性癥狀不產(chǎn)生。
過(guò)敏反應(yīng)是植物針對(duì)許多病原體的與有效防衛(wèi)相關(guān)的一種快速、局部壞死(Kiraly，Z.，“入侵者觸發(fā)的防衛(wèi)過(guò)敏性，”P(pán)lant DiseaseAnAdvanced Treatise，第5卷，J.G.Horsfall和E.B.Cowling編著，第201-224頁(yè)，Academic Press New York(1980)；Klement，Z.，“過(guò)敏性，”P(pán)hytopathogenic Prokaryotes。第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy編著，第149-177頁(yè)，Academic Press，New York(1982))。如果將高濃度(≥107細(xì)胞/ml)有限寄主范圍的病原體像丁香假單胞菌(Pseudomonassyrngae)或解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)浸潤(rùn)非寄主植物的葉片，則容易觀(guān)察到作為組織崩潰的細(xì)菌誘發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)(在較低水平的接種物下壞死僅在分離的植物細(xì)胞中產(chǎn)生)(Klement，Z.，“致植物病假單胞菌致病性的快速檢測(cè)，”Nature 199299-300；Klement等，“煙草葉片中致植物病細(xì)菌誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，”P(pán)hytopathology 54474-477(1963)；Tumer等，“植物和參與過(guò)敏反應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞之間的數(shù)量關(guān)系，”P(pán)hytopathology 64885-890(1974)；Klement，Z.，“過(guò)敏性，”P(pán)hytopathogenic Prokaryotes→第2卷，M.S.Mount和G.H.Lacy編著，第149-177頁(yè)，Academic Press，New Yorlk(1982))。在非寄主中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的能力以及在寄主中致病的能力看來(lái)是有聯(lián)系的。如Klement，Z.所述(“過(guò)敏性，”P(pán)hytopathogenic Prokaryotes，第2卷，M.S.Mount和GH.Lacy編著，第149-177頁(yè)，Academic Press，New York)，這些病原體在它們與親和性寄主的互作中也引起生理上類(lèi)似的發(fā)生壞死，盡管這種壞死延遲發(fā)生。此外，產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)或致病的能力依賴(lài)于一組命名為hrp的共同基因(Lindgren，P.B.等，“丁香假單胞菌‘phaseolicola’致病變種(Pseudomonas syringae pv.‘phaseolicola’)基因簇控制菜豆植物的致病性以及非寄主植物的過(guò)敏性，”J Bacteriol168512-22(1986)；Willis，D.K.等，“致植物病細(xì)菌的hrp基因，”Mol.Plant-Microbe Interact.4132-138(1991))。因此，過(guò)敏反應(yīng)可能保留植物防衛(wèi)特征細(xì)菌致病性基礎(chǔ)這兩方面的線(xiàn)索。
hrp基因廣泛分布于革蘭氏陰性植物病原體中，其中它們是成簇的、保守的并在某些情況下是可互換的(Willis，D.K.等，“致植物病細(xì)菌的hrp基因，”Mol.Plant-Microbe Interact.4132-138(1991)；Bonas，U.，“致植物病細(xì)菌的hrp基因，”Current Topics in Microbiology andImmunologyBacterial Pathogenesis of Plants and Animals-Molecular andCellular Mechanisms，J.L.Dangl編著，第79-98頁(yè)，Springer-Verlag，Berlin(1994))。幾個(gè)hrp基因編碼類(lèi)似于耶爾森氏菌屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella)和沙門(mén)氏菌(Salmonella spp.)用來(lái)分泌動(dòng)物疾病中必需蛋白的蛋白分泌途徑的組分(Van Gijsegem等，“植物和動(dòng)物致病細(xì)菌中的致病性決定子的進(jìn)化保守性，”Trends Microbiol.1175-180(1993))。在解淀粉歐文氏菌、丁香假單胞菌和茄假單胞菌(P.solanacearum)中，hrp基因已經(jīng)顯示控制過(guò)敏反應(yīng)富含甘氨酸蛋白激發(fā)子的產(chǎn)生和分泌(He，S.Y.等，“丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syrmgae pv.syrmgae)HarpinPss通過(guò)Hrp途徑分泌并誘發(fā)植物中的過(guò)敏反應(yīng)的蛋白，”Cell 731255-1266(1993)，Wei，Z.-H.等，“解淀粉歐文氏菌的HrpI在分泌Harpin中起作用并且HrpI為新蛋白質(zhì)家系的一個(gè)成員，”J Bacterial 1757958-7967(1993)；Arlat，M.等，“通過(guò)茄假單胞菌的Hrp途徑分泌PopAl—在特定矮牽?；蛐蜕险T導(dǎo)過(guò)敏樣反應(yīng)的蛋白”EMBO J.13543-553(1994))。
這些蛋白中的第一個(gè)是在解淀粉歐文氏菌Ea321—引起薔薇科植物火疫病的細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，并命名為harpin(Wei，Z.-M.等，“Harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)的激發(fā)子，”Science25785-88(1992))。編碼hrpN基因中的突變揭示了，解淀粉歐文氏菌在非寄主煙草葉片中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)以及在高度感病的梨果中引起病害癥狀都需要hatpin。茄假單胞菌GMI1000 PopAl蛋白具有相似的物理特性并且在煙草葉片中也誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，而煙草葉片不是該菌株的寄主(Arlat等，“通過(guò)茄假單胞菌Hrp途徑分泌PopAl—在特定矮牽?；蛐蜕险T導(dǎo)過(guò)敏樣反應(yīng)的蛋白，”EMBO J.13543-53(1994))。然而，茄假單胞菌popA突變體還在煙草中誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)并在番茄中引起病害。因此，在革蘭氏陰性植物病原體中，這些富含甘氨酸過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的作用可以大不相同。
已經(jīng)將其它植物病原體的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子分離、克隆并測(cè)序。這些激發(fā)子包括菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等，“菊歐文氏菌HarpinEch軟腐致病作用，”MPMI8(4)484-91(1995))；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等，“胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwinia carotovora subsp.Carotovora)Ecc71菌株的RsmA突變體在煙草葉片中過(guò)量表達(dá)hrpNEcc并誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)樣反應(yīng)，”MPMI 9(7)565-73(1996))；斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)(Ahmad等，“Hatpin對(duì)斯氏歐文氏菌在玉米中的致病性不是必需的，”8th Int’l.Cong.Molec.Plant-Microb.Inter.1996年7月14-19日和Ahmad等，“Harpin對(duì)斯氏歐文氏菌在玉米中的致病性不是必需的，”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.1996年7月27-31日)和丁香假單胞菌丁香致病變種(Comell Research Foundation，Inc.的WO 94/26782)。
本發(fā)明力圖鑒定過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，但如果和植物一起應(yīng)用則是有活性的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及歐文氏菌屬過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的分離的片段，所述片段在植物中不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，但如果和植物一起應(yīng)用則具有其它方面的活性。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這種片段的分離的DNA分子。
按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段如果和植物一起應(yīng)用則具有以下活性賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)。這涉及，在給植物或由所述植物種子培育的植物有效賦予抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下，將所述片段以非感染的形式應(yīng)用于植物或植物種子。
作為將所述片段應(yīng)用于植物或植物種子以給植物賦予抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的替代方法，可以使用轉(zhuǎn)基因植物或植物種子。當(dāng)使用轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，這涉及，提供用按照本發(fā)明的編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，并且在給所述植物或由所述植物種子培育的植物有效賦予抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下，培育所述植物?；蛘撸梢蕴峁┯镁幋a這樣的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子，并將所述種子播種于土壤中。然后在給植物或由所述植物種子培育的植物有效賦予抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下繁殖植物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的截短的蛋白。
圖2顯示一系列用于構(gòu)建截短的harpin蛋白的合成寡核苷酸引物。N代表N末端(5’區(qū))，而C代表C末端(3’區(qū))。所述引物對(duì)應(yīng)于本申請(qǐng)的所示序列識(shí)別號(hào)N1(SEQ.ID.No.1)、N76(SEQ.ID.No.2)、N99(SEQ.ID.No.3)、N105(SEQ.ID.No.4)、N110(SEQ.ID.No.5)、N137(SEQ.ID.No.6)、N150(SEQ.ID.No.7)、N169(SEQ.ID.No.8)、N210(SEQ ID.No.9)、N267(SEQ.ID.No.10)、N343(SEQ.ID.No.11)、C75(SEQ.ID.No.12)、C104(SEQ.ID.No.13)、C168(SEQ.ID.No.14)、C180(SEQ.ID.No.15)、C204(SEQ.ID.No.16)、C209(SEQ.ID.No.17)、C266(SEQ.ID.No.18)、C342(SEQ.ID.No.19)和C403(SEQ.ID.No.20)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的分離的片段，其中所述片段在植物中不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)但具有其它活性。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這種片段的DNA分子以及含有這種分子的表達(dá)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞和植物。本發(fā)明公開(kāi)了所述片段自身的用途以及編碼所述片段的DNA分子的用途。
按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段得自各種各樣的真菌和細(xì)菌病原體的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白。這樣的多肽或蛋白能夠誘發(fā)所述激發(fā)子接觸的植物組織中的局部壞死。多肽或蛋白激發(fā)子的合適細(xì)菌源的實(shí)例包括歐文氏菌屬、假單胞菌屬和黃單胞菌屬(Xanthomonas)的種(例如以下細(xì)菌解淀粉歐文氏菌、菊歐文氏菌、斯氏歐文氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、丁香假單胞菌、茄假單胞菌、野油菜黃單胞菌及它們的混合物)。
過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的真菌源的實(shí)例是疫霉屬(Phytophthora)。合適的疫霉屬菌種包括寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、樟疫霉(Phytophthoracinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大雄疫霉(phytophthoramegasperma)和柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)。
得自菊歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于如下的SEQ ID.No.21的氨基酸序列Met Gln Ile Thr Ile Lys Aia His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Ash Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp A la Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Va1 Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala該過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的分子量為34kDa、熱穩(wěn)定、甘氨酸含量高于16％，而基本上不含半胱氨酸。具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.22的核苷酸序列的DNA分子編碼菊歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于如下的SEQ.ID.No.23的氨基酸序列Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn
340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala該過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的分子量約為39kDa、pI約為4.3并于100℃耐熱至少10分鐘。該過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白基本上不含半胱氨酸。得自解淀粉歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白更全面地描述于Wei，Z.-M.、R.J.Laby、C.H.Zumoff、D.W.Bauer、S.-Y.He、A.Collmer和S.V.Beer，“Harpin—植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)的激發(fā)子，”Science 25785-88(1992)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。編碼該多肽或蛋白的DNA分子具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.24的核苷酸序列AAGCTTCGGC ATGGCACGTT TGACCGTTGG GTCGGCAGGG TACGTTTGAA TTATTCATAA60GAGGAATACG TTATGAGTCT GAATACAAGT GGGCTGGGAG CGTCAACGAT GCAAATTTCT 120ATCGGCGGTG CGGGCGGAAA TAACGGGTTG CTGGGTACCA GTCGCCAGAA TGCTGGGTTG 180GGTGGCAATT CTGCACTGGG GCTGGGCGGC GGTAATCAAA ATGATACCGT CAATCAGCTG 240GCTGGCTTAC TCACCGGCAT GATGATGATG ATGAGCATGA TGGGCGGTGG TGGGCTGATG 300GGCGGTGGCT TAGGCGGTGG CTTAGGTAAT GGCTTGGGTG GCTCAGGTGG CCTGGGCGAA 360GGACTGTCGA ACGCGCTGAA CGATATGTTA GGCGGTTCGC TGAACACGCT GGGCTCGAAA 420GGCGGCAACA ATACCACTTC AACAACAAAT TCCCCGCTGG ACCAGGCGCT GGGTATTAAC 480TCAACGTCCC AAAACGACGA TTCCACCTCC GGCACAGATT CCACCTCAGA CTCCAGCGAC 540CCGATGCAGC AGCTGCTGAA GATGTTCAGC GAGATAATGC AAAGCCTGTT TGGTGATGGG 600CAAGATGGCA CCCAGGGCAG TTCCTCTGGG GGCAAGCAGC CGACCGAAGG CGAGCAGAAC 660GCCTATAAAA AAGGAGTCAC TGATGCGCTG TCGGGCCTGA TGGGTAATGG TCTGAGCCAG 720CTCCTTGGCA AACGGGGACT GGGAGGTGGT CAGGGCGGTA ATGCTGGCAC GGGTCTTGAC 780GGTTCGTCGC TGGGCGGCAA AGGGCTGCAA AACCTGAGCG GGCCGGTGGA CTACCAGCAG 840TTAGGTAACG CCGTGGGTAC CGGTATCGGT ATGAAAGCGG GCATTCAGGC GCTGAATGAT 900ATCGGTACGC ACAGGCACAG TTCAACCCGT TCTTTCGTCA ATAAAGGCGA TCGGGCGATG 960GCGAAGGAAA TCGGTCAGTT CATGGACCAG TATCCTGAGG TGTTTGGCAA GCCGCAGTAC 1020CAGAAAGGCC CGGGTCAGGA GGTGAAAACC GATGACAAAT CATGGGCAAA AGCACTGAGC 1080AAGCCAGATG ACGACGGAAT GACACCAGCC AGTATGGAGC AGTTCAACAA AGCCAAGGGC 1140ATGATCAAAA GGCCCATGGC GGGTGATACC GGCAACGGCA ACCTGCAGGC ACGCGGTGCC 1200GGTGGTTCTT CGCTGGGTAT TGATGCCATG ATGGCCGGTG ATGCCATTAA CAATATGGCA 1260CTTGGCAAGC TGGGCGCGGC TTAAGCTT 1288得自解淀粉歐文氏菌的另一種可能合適的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)09/120,927，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。具有如下SEQ.ID.No.25的核酸序列的DNA分子編碼所述蛋白質(zhì)ATGTCAATTC TTACGCTTAA CAACAATACC TCGTCCTCGC CGGGTCTGTT CCAGTCCGGG60GGGGACAACG GGCTTGGTGG TCATAATGCA AATTCTGCGT TGGGGCAACA ACCCATCGAT 120CGGCAAACCA TTGAGCAAAT GGCTCAATTA TTGGCGGAAC TGTTAAAGTC ACTGCTATCG 180CCACAATCAG GTAATGCGGC AACCGGAGCC GGTGGCAATG ACCAGACTAC AGGAGTTGGT 240AACGCTGGCG GCCTGAACGG ACGAAAAGGC ACAGCAGGAA CCACTCCGCA GTCTGACAGT 300CAGAACATGC TGAGTGAGAT GGGCAACAAC GGGCTGGATC AGGCCATCAC GCCCGATGGC 360CAGGGCGGCG GGCAGATCGG CGATAATCCT TTACTGAAAG CCATGCTGAA GCTTATTGCA 420CGCATGATGG ACGGCCAAAG CGATCAGTTT GGCCAACCTG GTACGGGCAA CAACAGTGCC 480TCTTCCGGTA CTTCTTCATC TGGCGGTTCC CCTTTTAACG ATCTATCAGG GGGGAAGGCC 540CCTTCCGGCA ACTCCCCTTC CGGCAACTAC TCTCCCGTCA GTACCTTCTC ACCCCCATCC 600ACGCCAACGT CCCCTACCTC ACCGCTTGAT TTCCCTTCTT CTCCCACCAA AGCAGCCGGG 660GGCAGCACGC CGGTAACCGA TCATCCTGAC CCTGTTGGTA GCGCGGGCAT CGGGGCCGGA 720AATTCGGTGG CCTTCACCAG CGCCGGCGCT AATCAGACGG TGCTGCATGA CACCATTACC 780GTGAAAGCGG GTCAGGTGTT TGATGGCAAA GGACAAACCT TCACCGCCGG TTCAGAATTA 840GGCGATGGCG GCCAGTCTGA AAACCAGAAA CCGCTGTTTA TACTGGAAGA CGGTGCCAGC 900CTGAAAAACG TCACCATGGG CGACGACGGG GCGGATGGTA TTCATCTTTA CGGTGATGCC 960AAAATAGACA ATCTGCACGT CACCAACGTG GGTGAGGACG CGATTACCGT TAAGCCAAAC 1020AGCGCGGGCA AAAAATCCCA CGTTGAAATC ACTAACAGTT CCTTCGAGCA CGCCTCTGAC 1080AAGATCCTGC AGCTGAATGC CGATACTAAC CTGAGCGTTG ACAACGTGAA GGCCAAAGAC 1140TTTGGTACTT TTGTACGCAC TAACGGCGGT CAACAGGGTA ACTGGGATCT GAATCTGAGC 1200CATATCAGCG CAGAAGACGG TAAGTTCTCG TTCGTTAAAA GCGATAGCGA GCGGCTAAAC 1260GTCAATACCA GTGATATCTC ACTGGGTGAT GTTGAAAACC ACTACAAAGT GCCGATGTCC 1320GCCAACCTGA AGGTGGCTGA ATGA 1344參見(jiàn)GenBank登錄號(hào)U94513。本發(fā)明的分離的DNA分子編碼具有如下SEQ.ID.No.26的氨基酸序列的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽Met Ser Ile Leu Thr Leu Asn Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gly Leu1 5 10 15Phe Gln Ser Gly Gly Asp Asn Gly Leu Gly Gly His Asn Ala Asn Ser20 25 30Ala Leu Gly Gln Gln Pro Ile Asp Arg Gln Thr Ile Glu Gln Met Ala35 40 45Gln Leu Leu Ala Glu Leu Leu Lys Ser Leu Leu Ser Pro Gln Ser Gly50 55 60Asn Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly Asn Asp Gln Thr Thr Gly Val Gly65 70 75 80Asn Ala Gly Gly Leu Asn Gly Arg Lys Gly Thr Ala Gly Thr Thr Pro85 90 95Gln Ser Asp Ser Gln Asn Met Leu Ser Glu Met Gly Asn Asn Gly Leu100 105 110Asp Gln Ala Ile Thr Pro Asp Gly Gln Gly Gly Gly Gln Ile Gly Asp115 120 125Asn Pro Leu Leu Lys Ala Met Leu Lys Leu Ile Ala Arg Met Met Asp130 135 140Gly Gln Ser Asp Gln Phe Gly Gln Pro Gly Thr Gly Asn Asn Ser Ala145 150 155 160Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ser Gly Gly Ser Pro Phe Asn Asp Leu Ser165 170 175Gly Gly Lys Ala Pro Ser Gly Asn Ser Pro Ser Gly Asn Tyr Ser Pro180 185 190Val Ser Thr Phe Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr Ser Pro Thr Ser Pro195 200 205Leu Asp Phe Pro Ser Ser Pro Thr Lys Ala Ala Gly Gly Ser Thr Pro210 215 220Val Thr Asp His Pro Asp Pro Val Gly Ser Ala Gly Ile Gly Ala Gly225 230 235 235Asn Ser Val Ala Phe Thr Ser Ala Gly Ala Asn Gln Thr Val Leu His245 250 255Asp Thr Ile Thr Val Lys Ala Gly Gln Val Phe Asp Gly Lys Gly Gln260 265 270Thr Phe Thr Ala Gly Ser Glu Leu Gly Asp Gly Gly Gln Ser Glu Asn275 280 285Gln Lys Pro Leu Phe Ile Leu Glu Asp Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val290 295 300Thr Met Gly Asp Asp Gly Ala Asp Gly Ile His Leu Tyr Gly Asp Ala305 310 315 320Lys Ile Asp Asn Leu His Val Thr Asn Val Gly Glu Asp Ala Ile Thr325 330 335Val Lys Pro Asn Ser Ala Gly Lys Lys Ser His Val Glu Ile Thr Asn340 345 350Ser Ser Phe Glu His Ala Ser Asp Lys lle Leu Gln Leu Asn Ala Asp355 360 365Thr Asn Leu Ser Val Asp Asn Val Lys Ala Lys Asp Phe Gly Thr Phe370 375 380Val Arg Thr Asn Gly Gly Gln Gln Gly Asn Trp Asp Leu Asn Leu Ser385 390 395 400His Ile Ser Ala Glu Asp Gly Lys Phe Ser Phe Val Lys Ser Asp Ser405 410 415Glu Gly Leu Asn Val Asn Thr Ser Asp Ile Ser Leu Gly Asp Val Glu420 425 430Asn His Tyr Lys Val Pro Met Ser Ala Asn Leu Lys Val Ala Glu435 440 445該蛋白或多肽為酸性的、富含甘氨酸和絲氨酸，而缺乏半胱氨酸。它也是熱穩(wěn)定、對(duì)蛋白酶敏感以及受植物新陳代謝抑制劑的抑制。本發(fā)明的蛋白或多肽預(yù)期的分子大小約為4.5kDa。
得自解淀粉歐文氏菌的另一種可能合適的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)09/120,663，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。具有如下SEQ.ID.No.27的核酸序列的DNA分子編碼所述蛋白質(zhì)ATGGAATTAA AATCACTGGG AACTGAACAC AAGGCGGCAG TACACACAGC GGCGCACAAC 60CCTGTGGGGC ATGGTGTTGC CTTACAGCAG GGCAGCAGCA GCAGCAGCCC GCAAAATGCC120GCTGCATCAT TGGCGGCAGA AGGCAAAAAT CGTGGGAAAA TGCCGAGAAT TCACCAGCCA180TCTACTGCGG CTGATGGTAT CAGCGCTGCT CACCAGCAAA AGAAATCCTT CAGTCTCAGG240GGCTGTTTGG GGACGAAAAA ATTTTCCAGA TCGGCACCGC AGGGCCAGCC AGGTACCACC300CACAGCAAAG GGGCAACATT GCGCGATCTG CTGGCGCGGG ACGACGGCGA AACGCAGCAT360GAGGCGGCCG CGCCAGATGC GGCGCGTTTG ACCCGTTCGG GCGGCGTCAA ACGCCGCAAT420ATGGACGACA TGGCCGGGCG GCCAATGGTG AAAGGTGGCA GCGGCGAAGA TAAGGTACCA480ACGCAGCAAA AACGGCATCA GCTGAACAAT TTTGGCCAGA TGCGCCAAAC GATGTTGAGC540AAAATGGCTC ACCCGGCTTC AGCCAACGCC GGCGATCGCC TGCAGCATTC ACCGCCGCAC600ATCCCGGGTA GCCACCACGA AATCAAGGAA GAACCGGTTG GCTCCACCAG CAAGGCAACA660ACGGCCCACG CAGACAGAGT GGAAATCGCT CAGGAAGATG ACGACAGCGA ATTCCAGCAA720CTGCATCAAC AGCGGCTGGC GCGCGAACGG GAAAATCCAC CGCAGCCGCC CAAACTCGGC780GTTGCCACAC CGATTAGCGC CAGGTTTCAG CCCAAACTGA CTGCGGTTGC GGAAAGCGTC840CTTGAGGGGA CAGATACCAC GCAGTCACCC CTTAAGCCGC AATCAATGCT GAAAGGAAGT900GGAGCCGGGG TAACGCCGCT GGCGGTAACG CTGGATAAAG GCAAGTTGCA GCTGGCACCG960GATAATCCAC CCGCGCTCAA TACGTTGTTG AAGCAGACAT TGGGTAAAGA CACCCAGCAC 1020TATCTGGCGC ACCATGCCAG CAGCGACGGT AGCCAGCATC TGCTGCTGGA CAACAAAGGC 1080CACCTGTTTG ATATCAAAAG CACCGCCACC AGCTATAGCG TGCTGCACAA CAGCCACCCC 1140GGTGACATAA AGGGCAAGCT GGCGCAGGCG GGTACTGGCT CCGTCAGCGT AGACGGTAAA 1200AGCGGCAAGA TCTCGCTGGG GAGCGGTACG CAAAGTCACA ACAAAACAAT GCTAAGCCAA 1260CCGGGGGAAG CGCACCGTTC CTTATTAACC GGCATTTGGC AGCATCCTGC TGGCGCAGCG 1320CGGCCGCAGG GCGAGTCAAT CCGCCTGCAT GACGACAAAA TTCATATCCT GCATCCGGAG 1380CTGGGCGTAT GGCAATCTGC GGATAAAGAT ACCCACAGCC AGCTGTCTCG CCAGGCAGAC 1440GGTAAGCTCT ATGCGCTGAA AGACAACCGT ACCCTGCAAA ACCTCTCCGA TAATAAATCC 1500TCAGAAAAGC TGGTCGATAA AATCAAATCG TATTCCGTTG ATCAGCGGGG GCAGGTGGCG 1560ATCCTGACGG ATACTCCCGG CCGCCATAAG ATGAGTATTA TGCCCTCGCT GGATGCTTCC 1620CCGGAGAGCC ATATTTCCCT CAGCCTGCAT TTTGCCGATG CCCACCAGGG GTTATTGCAC 1680GGGAAGTCGG AGCTTGAGGC ACAATCTGTC GCGATCAGCC ATGGGCGACT GGTTGTGGCC 1740GATAGCGAAG GCAAGCTGTT TAGCGCCGCC ATTCCGAAGC AAGGGGATGG AAACGAACTG 1800AAAATGAAAG CCATGCCTCA GCATGCGCTC GATGAACATT TTGGTCATGA CCACCAGATT 1860TCTCGATTTT TCCATGACGA CCACGGCCAG CTTAATGCGC TGGTGAAAAA TAACTTCAGG 1920CAGCAGCATG CCTGCCCGTT GGGTAACGAT CATCAGTTTC ACCCCGGCTG GAACCTGACT 1980GATGCGCTGG TTATCGACAA TCAGCTGGGG CTGCATCATA CCAATCCTGA ACCGCATGAG 2040ATTCTTGATA TGGGGCATTT AGGCAGCCTG GCGTTACAGG AGGGCAAGCT TCACTATTTT 2100GACCAGCTGA CCAAAGGGTG GACTGGCGCG GAGTCAGATT GTAAGCAGCT GAAAAAAGGC 2160CTGGATGGAG CAGCTTATCT ACTGAAAGAC GGTGAAGTGA AACGCCTGAA TATTAATCAG 2220AGCACCTCCT CTATCAAGCA CGGAACGGAA AACGTTTTTT CGCTGCCGCA TGTGCGCAAT 2280AAACCGGAGC CGGGAGATGC CCTGCAAGGG CTGAATAAAG ACGATAAGGC CCAGGCCATG 2340GCGGTGATTG GGGTAAATAA ATACCTGGCG CTGACGGAAA AAGGGGACAT TCGCTCCTTC 2400CAGATAAAAC CCGGCACCCA GCAGTTGGAG CGGCCGGCAC AAACTCTCAG CCGCGAAGGT 2460ATCAGCGGCG AACTGAAAGA CATTCATGTC GACCACAAGC AGAACCTGTA TGCCTTGACC 2520CACGAGGGAG AGGTGTTTCA TCAGCCGCGT GAAGCCTGGC AGAATGGTGC CGAAAGCAGC 2580AGCTGGCACA AACTGGCGTT GCCACAGAGT GAAAGTAAGC TAAAAAGTCT GGACATGAGC 2640CATGAGCACA AACCGATTGC CACCTTTGAA GACGGTAGCC AGCATCAGCT GAAGGCTGGC 2700GGCTGGCACG CCTATGCGGC ACCTGAACGC GGGCCGCTGG CGGTGGGTAC CAGCGGTTCA 2760CAAACCGTCT TTAACCGACT AATGCAGGGG GTGAAAGGCA AGGTGATCCC AGGCAGCGGG 2820TTGACGGTTA AGCTCTCGGC TCAGACGGGG GGAATGACCG GCGCCGAAGG GCGCAAGGTC 2880AGCAGTAAAT TTTCCGAAAG GATCCGCGCC TATGCGTTCA ACCCAACAAT GTCCACGCCG 2940CGACCGATTA AAAATGCTGC TTATGCCACA CAGCACGGCT GGCAGGGGCG TGAGGGGTTG 3000AAGCCGTTGT ACGAGATGCA GGGAGCGCTG ATTAAACAAC TGGATGCGCA TAACGTTCGT 3060CATAACGCGC CACAGCCAGA TTTGCAGAGC AAACTGGAAA CTCTGGATTT AGGCGAACAT 3120GGCGCAGAAT TGCTTAACGA CATGAAGCGC TTCCGCGACG AACTGGAGCA GAGTGCAACC 3180CGTTCGGTGA CCGTTTTAGG TCAACATCAG GGAGTGCTAA AAAGCAACGG TGAAATCAAT 3240AGCGAATTTA AGCCATCGCC CGGCAAGGCG TTGGTCCAGA GCTTTAACGT CAATCGCTCT 3300GGTCAGGATC TAAGCAAGTC ACTGCAACAG GCAGTACATG CCACGCCGCC ATCCGCAGAG 3360AGTAAACTGC AATCCATGCT GGGGCACTTT GTCAGTGCCG GGGTGGATAT GAGTCATCAG 3420AAGGGCGAGA TCCCGCTGGG CCGCCAGCGC GATCCGAATG ATAAAACCGC ACTGACCAAA 3480TCGCGTTTAA TTTTAGATAC CGTGACCATC GGTGAACTGC ATGAACTGGC CGATAAGGCG 3540AAACTGGTAT CTGACCATAA ACCCGATGCC GATCAGATAA AACAGCTGCG CCAGCAGTTC 3600GATACGCTGC GTGAAAAGCG GTATGAGAGC AATCCGGTGA AGCATTACAC CGATATGGGC 3660TTCACCCATA ATAAGGCGCT GGAAGCAAAC TATGATGCGG TCAAAGCCTT TATCAATGCC 3720TTTAAGAAAG AGCACCACGG CGTCAATCTG ACCACGCGTA CCGTACTGGA ATCACAGGGC 3780AGTGCGGAGC TGGCGAAGAA GCTCAAGAAT ACGCTGTTGT CCCTGGACAG TGGTGAAAGT 3840ATGAGCTTCA GCCGGTCATA TGGCGGGGGC GTCAGCACTG TCTTTGTGCC TACCCTTAGC 3900AAGAAGGTGC CAGTTCCGGT GATCCCCGGA GCCGGCATCA CGCTGGATCG CGCCTATAAC 3960CTGAGCTTCA GTCGTACCAG CGGCGGATTG AACGTCAGTT TTGGCCGCGA CGGCGGGGTG 4020AGTGGTAACA TCATGGTCGC TACCGGCCAT GATGTGATGC CCTATATGAC CGGTAAGAAA 4080ACCAGTGCAG GTAACGCCAG TGACTGGTTG AGCGCAAAAC ATAAAATCAG CCCGGACTTG 4140CGTATCGGCG CTGCTGTGAG TGGCACCCTG CAAGGAACGC TACAAAACAG CCTGAAGTTT 4200AAGCTGACAG AGGATGAGCT GCCTGGCTTT ATCCATGGCT TGACGCATGG CACGTTGACC 4260CCGGCAGAAC TGTTGCAAAA GGGGATCGAA CATCAGATGA AGCAGGGCAG CAAACTGACG 4320TTTAGCGTCG ATACCTCGGC AAATCTGGAT CTGCGTGCCG GTATCAATCT GAACGAAGAC 4380GGCAGTAAAC CAAATGGTGT CACTGCCCGT GTTTCTGCCG GGCTAAGTGC ATCGGCAAAC 4440CTGGCCGCCG GCTCGCGTGA ACGCAGCACC ACCTCTGGCC AGTTTGGCAG CACGACTTCG 4500GCCAGCAATA ACCGCCCAAC CTTCCTCAAC GGGGTCGGCG CGGGTGCTAA CCTGACGGCT 4560GCTTTAGGGG TTGCCCATTC ATCTACGCAT GAAGGGAAAC CGGTCGGGAT CTTCCCGGCA 4620TTTACCTCGA CCAATGTTTC GGCAGCGCTG GCGCTGGATA ACCGTACCTC ACAGAGTATC 4680AGCCTGGAAT TGAAGCGCGC GGAGCCGGTG ACCAGCAACG ATATCAGCGA GTTGACCTCC 4740ACGCTGGGAA AACACTTTAA GGATAGCGCC ACAACGAAGA TGCTTGCCGC TCTCAAAGAG 4800TTAGATGACG CTAAGCCCGC TGAACAACTG CATATTTTAC AGCAGCATTT CAGTGCAAAA 4860GATGTCGTCG GTGATGAACG CTACGAGGCG GTGCGCAACC TGAAAAAACT GGTGATACGT 4920CAACAGGCTG CGGACAGCCA CAGCATGGAA TTAGGATCTG CCAGTCACAG CACGACCTAC 4980AATAATCTGT CGAGAATAAA TAATGACGGC ATTGTCGAGC TGCTACACAA ACATTTCGAT 5040GCGGCATTAC CAGCAAGCAG TGCCAAACGT CTTGGTGAAA TGATGAATAA CGATCCGGCA 5100CTGAAAGATA TTATTAAGCA GCTGCAAAGT ACGCCGTTCA GCAGCGCCAG CGTGTCGATG 5160GAGCTGAAAG ATGGTCTGCG TGAGCAGACG GAAAAAGCAA TACTGGACGG TAAGGTCGGT 5220CGTGAAGAAG TGGGAGTACT TTTCCAGGAT CGTAACAACT TGCGTGTTAA ATCGGTCAGC 5280GTCAGTCAGT CCGTCAGCAA AAGCGAAGGC TTCAATACCC CAGCGCTGTT ACTGGGGACG 5340AGCAACAGCG CTGCTATGAG CATGGAGCGC AACATCGGAA CCATTAATTT TAAATACGGC 5400CAGGATCAGA ACACCCCACG GCGATTTACC CTGCAGGGTG GAATAGCTCA GGCTAATCCG 5460CAGGTCGCAT CTGCGCTTAC TGATTTGAAG AAGGAAGGGC TGGAAATGAA GAGCTAA 5517該DNA分子被稱(chēng)為解淀粉歐文氏菌的dspE基因。本發(fā)明的這種分離的DNA分子編碼具有如下SEQ.ID.No.28的氨基酸序列的誘發(fā)植物病原體的過(guò)敏反應(yīng)的蛋白或多肽Met Glu Leu Lys Ser Leu Gly Thr Glu His Lys Ala Ala Val His Thr1 5 10 15Ala Ala His Asn Pro Val Gly His Gly Val Ala Leu Gln Gln Gly Ser20 25 30Ser Ser Ser Ser Pro Gln Asn Ala Ala Ala Ser Leu Ala Ala Glu Gly35 40 45Lys Asn Arg Gly Lys Met Pro Arg Ile His Gln Pro Ser Thr Ala Ala50 55 60Asp Gly Ile Ser Ala Ala His Gln Gln Lys Lys Ser Phe Ser Leu Arg65 70 75 80Gly Cys Leu Gly Thr Lys Lys Phe Ser Arg Ser Ala Pro Gln Gly Gln85 90 95Pro Gly Thr Thr His Ser Lys Gly Ala Thr Leu Arg Asp Leu Leu Ala100 105 110Arg Asp Asp Gly Glu Thr Gln His Glu Ala Ala Ala Pro Asp Ala Ala115 120 125Arg Leu Thr Arg Ser Gly Gly Val Lys Arg Arg Asn Met Asp Asp Met130 135 140Ala Gly Arg Pro Met Val Lys Gly Gly Ser Gly Glu Asp Lys Val Pro145 150 155 160Thr Gln Gln Lys Arg His Gln Leu Asn Asn Phe Gly Gln Met Arg Gln165 170 175Thr Met Leu Ser Lys Met Ala His Pro Ala Ser Ala Asn Ala Gly Asp180 185 190Arg Leu Gln His Ser Pro Pro His Ile Pro Gly Ser His His Glu Ile195 200 205Lys Glu Glu Pro Val Gly Ser Thr Ser Lys Ala Thr Thr Ala His Ala210 215 220Asp Arg Val Glu Ile Ala Gln Glu Asp Asp Asp Ser Glu Phe Gln Gln225 230 235 240Leu His Gln Gln Arg Leu Ala Arg Glu Arg Glu Asn Pro Pro Gln Pro245 250 255Pro Lys Leu Gly Val Ala Thr Pro Ile Ser Ala Arg Phe Gln Pro Lys260 265 270Leu Thr Ala Val Ala Glu Ser Val Leu Glu Gly Thr Asp Thr Thr Gln275 280 285Ser Pro Leu Lys Pro Gln Ser Met Leu Lys Gly Ser Gly Ala Gly Val290 295 300Thr Pro Leu Ala Val Thr Leu Asp Lys Gly Lye Leu Gln Leu Ala Pro305 310 315 320Asp Asn Pro Pro Ala Leu Asn Thr Leu Leu Lys Gln Thr Leu Gly Lys325 330 335Asp Thr Gln His Tyr Leu Ala His His Ala Ser Ser Asp Gly Ser Gln340 345 350His Leu Leu Leu Asp Asn Lys Gly His Leu Phe Asp Ile Lys Ser Thr355 360 365Ala Thr Ser Tyr Ser Val Leu His Asn Ser His Pro Gly Glu Ile Lys370 375 380Gly Lys Leu Ala Gln Ala Gly Thr Gly Ser Val Ser Val Asp Gly Lys385 390 395 400Ser Gly Lys Ile Sar Leu Gly Ser Gly Thr Gln Ser His Asn Lys Thr405 410 415Met Leu Ser Gln Pro Gly Glu Ala His Arg Ser Leu Leu Thr Gly Ile420 425 430Trp Gln His Pro Ala Gly Ala Ala Arg Pro Gln Gly Glu Ser Ile Arg435 440 445Leu His Asp Asp Lys Ile His Ile Leu His Pro Glu Leu Gly Val Trp450 455 460Gln Ser Ala Asp Lys Asp Thr His Ser Gln Leu 5er Arg Gln Ala Asp465 470 475 480Gly Lys Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Asn Arg Thr Leu Gln Asn Leu Ser485 490 495Asp Asn Lys Ser Ser Glu Lys Leu Val Asp Lys Ile Lys Ser Tyr Ser500505 510Val Asp Gln Arg Gly Gln Val Ala Ile Leu Thr Asp Thr Pro Gly Arg515 520 525His Lys Net Ser Ile Met Pro Ser Leu Asp Ala Ser Pro Glu Ser His530 535 540Ile Ser Leu Ser Leu His Phe Ala Asp Ala His Gln Gly Leu Leu His545 550 555 560Gly Lys Ser Glu Leu Glu Ala Gln Sar Val Ala Ile Ser His Gly ArS565 570 575Leu Val Val Ala Asp Ser Glu Gly Lys Leu Phe Ssr Ala Ala Ile Pro580 585 590Lys Gln Gly Asp Gly Asn Glu Leu Lys Met Lys Ala Met Pro Gln His595 600 605Ala Leu Asp Glu His Phe Gly His Asp His Gln Ile Ser Gly Phe Phe610 615 620His Asp Asp His Gly Gln Leu Asn Ale Leu Val Lys Asn Asn Phe Arg625 630 635 640Gln Gln His Ala Cys Pro Leu Gly Asn Asp His Gln Phe His Pro Gly645 650 655Trp Asn Leu Thr Asp Ala Leu Val Ile Asp Asn Gln Leu Gly Leu His660 665 670His Thr Asn Pro Glu Pro His Glu Ile Leu Asp Met Gly His Leu Gly675 680 585Ser Leu Ala Leu Gln Glu Gly Lys Leu His Tyr Phe Asp Gln Leu Thr690 695 700Lys Gly Trp Thr Gly Ala Glu Ser Asp Cys Lys Gln Leu Lys Lys Gly705 710 715 720Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Leu Leu Lys Asp Gly Glu Val Lys Arg Leu725 730 735Asn Ile Asn Gln Ser Thr Ser Ser Ile Lys His Gly Thr Glu Asn Val740 745 750Phe Ser Leu Pro His Val Arg Asn Lys Pro Glu Pro Gly Asp Ala Leu755 760 765Gln Gly Leu Asn Lys Asp Asp Lys Ala Gln Ala Met Ala Val Ile Gly770 775 780Val Asn Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Asp Ile Arg Ser Phe785 790 795 800Gln Ile Lys Pro Gly Thr Gln Gln Leu Glu Arg Pro Ala Gln Thr Leu805 810 8l5Ser Arg Glu Gly Ile Ser Gly Glu Leu Lys Asp Ile His Val Asp His820 825 830Lys Gln Asn Leu Tyr Ala Leu Thr His Glu Gly Glu Val Phe His Gln835 840 845Pro Arg Glu Ala Trp Gln Asn Gly Ala Glu Ser Ser Ser Trp His Lys850 855 860Leu Ala Leu Pro Gln Ser Glu Ser Lye Leu Lys Ser Leu Asp Met Ser865 870 875 880His Glu His Lys Pro Ile Ala Thr Phe Glu Asp Gly Ser Gln His Gln885 890 895Leu Lys Ala Gly Gly Trp His Ala Tyr Ala Ala Pro Glu Arg Gly Pro900 905 910Leu Ala val Gly Thr Ser Gly Ser Gln Thr Val Phe Asn Arg Leu Met915 920 925Gln Gly Val Lys Gly Lys Val Ile Pro Gly Ser Gly Leu Thr Val Lys930 935 940Leu Ser Ala Gln Thr Gly Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Arg Lys Val945 950 955 960Ser Ser Lys Phe Ser Glu Arg Ile Arg Ala Tyr Ala Phe Asn Pro Thr965 970 975Met Ser Thr Pro Arg Pro Ile Lys Asn Ala Ala Tyr Ala Thr Gln His980 985 990Gly Trp Gln Gly Arg Glu Gly Leu Lys Pro Leu Tyr Glu Met Gln Gly995 10001005Ala Leu Ile Lys Gln Leu Asp Ala His Ash Val Arg His Ash Ala Pro101010151020Gln Pro Asp Leu Gln Ser Lys Leu Glu Thr Leu Asp Leu Gly Glu His1025103010351040Gly Ala Glu Leu Leu Asn Asp Met Lys Arg Phe Atg Asp Glu Leu Glu104510501055Gln Ser Ala Thr Arg Ser Val Thr Val Leu Gly Gln His Gln Gly Val106010651070Leu Lys Ser Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu Phe Lys Pro Ser Pro Gly107510801085Lys Ala Leu Val Gln Ser Phe Asn Val Asn Arg Ser Gly Gln Asp Leu109010951100Ser Lys Ser Leu Gln Gln Ala Val His Ala Thr Pro Pro Ser Ala Glu1105111011151120Ser Lys Leu Gln Ser Met Leu Gly His Phe Vel Ser Ala Gly Val Asp112511301135Met Ser His Gln Lys Gly Glu Ile Pro Leu Gly Arg Gln Arg Asp Pro114011451150Asn Asp Lys Thr Ala Leu Thr Lys Ser Arg Leu Ile Leu Asp Thr Val115511601165Thr Ile Gly Glu Leu His Glu Leu Ale Asp Lys Ala Lys Leu Val Ser117011751180Asp His Lys Pro Asp Ala Asp Gln Ile Lys Gln Leu Arg Gln Gln Phe1185119011951200Asp Thr Leu Arg Glu Lys Arg Tyr Glu Ser Asn Pro Val Lys His Tyr120512101215Thr Asp Met Gly Phe Thr His Asn Lys Ala Leu Glu Ala Asn Tyr Asp122012251230Ala Val Lys Ala Phe Ile Ash Ala Phe Lys Lys Glu His His Gly Val123512401245Asn Leu Thr Thr Arg Thr Val Leu Glu Ser Gln Gly Ser Ala Glu Leu125012551260Ala Lys Lys Leu Lys Asn Thr Leu Leu Ser Leu Asp Ser Gly Glu Ser1265127012751280Met Ser Phe Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Vel Ser Thr Va1 Phe Val128512901295Pro Thr Leu Ser Lys Lys Val Pro Val Pro Val Ile Pro Gly Ala Gly130013051310Ile Thr Leu Asp Arg Ala Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Arg Thr Ser Gly131513201325Gly Leu Asn Val Ser Phe Gly Arg Asp Gly Gly Val Ser Gly Asn Ile133013351340Met Val Ala Thr Gly His Asp Val Met Pro Tyr Met Thr Gly Lys Lys1345135013551360Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Asp Trp Leu Ser Ala Lys His Lys Ile136513701375Ser Pro Asp Leu Arg Ile Gly Ala Ala Val Ser Gly Thr Leu Gln Gly138013851390Thr Leu Gln Asn Ser Leu Lys Phe Lys Leu Thr Glu Asp Glu Leu Pro139514001405Gly Phe Ile His Gly Leu Thr His Gly Thr Leu Thr Pro Ala Glu Leu141014151420Leu Gln Lys Gly Ile Glu His Gln Met Lys Gln Gly Ser Lys Leu Thr1425143014351440Phe Ser Val Asp Thr Ser Ala Asn Leu Asp Leu Arg Ala Gly Ile Asn144514501455Leu Asn Glu Asp Gly Ser Lys Pro Asn Gly Val Thr Ala Arg Val Ser146014651470Ala Gly Leu Ser Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Gly Ser Arg Glu Arg147514801485Ser Thr Thr Ser Gly Gln Phs Gly Ser Thr Thr Ser Ala Ser Asn Asn149014951500Arg Pro Thr Phe Leu Asn Gly Val Gly Ala Gly Ala Asn Leu Thr Ala1505151015151520Ala Leu Gly Val Ala His Ser Ser Thr His Glu Gly Lys Pro Val Gly152515301535Ile Phe Pro Ala Phe Thr Ser Thr Asn Val Ser Ala Ala Leu Ala Leu154015451550Asp Asn Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Leu Glu Leu Lys Arg Ala Glu155515601565Pro Val Thr Ser Asn Asp Ile Ser Glu Leu Thr Ser Thr Leu Gly Lys157015751580His Phe Lys Asp Ser Ala Thr Thr Lys Met Leu Ala Ala Leu Lys Glu1585159015951600Leu Asp Asp Ala Lys Pro Ala Glu Gln Leu His Ile Leu Gln Gln His160516101615Phe Ser Ala Lys Asp Val Val Gly Asp Glu Arg Tyr Glu Ala Val Arg162016251630Asn Leu Lys Lys Leu Val Ils Arg Gln Gln Ala Ala Asp Ser His Ser163516401645Met Glu Leu Gly Ser Ala Ser His Ser Thr Thr Tyr ASn Asn Leu Ser165016551660Arg Ile Asn Asn Asp Gly Ile Val Glu Leu Leu His Lys His Phe Asp1665167016751680Ala Ala Leu Pro Ala Ser Ser Ala Lys Arg Leu Gly Glu Met Met Asn168516901695Asn Asp Pro Ala Leu Lys Asp Ile Ile Lys Gln Leu Gln Ser Thr Pro170017051710Phe Ser Ser Ala Ser Val Ser Met Glu Leu Lys Asp Gly Leu Arg Glu171517201725Gln Thr Glu Lys Ala Ile Leu Asp Gly Lys Val Gly Arg Glu Glu Val173017351740Gly Val Leu Phe Gln Asp Arg Asn Asn Leu Arg Val Lys Ser Val Ser1745175017551760Val Ser Gln Ser Val Ser Lys Ser Glu Gly Phe Asn Thr Pro Ala Leu176517701775Leu Leu Gly Thr Ser Asn Ser Ala Ala Mer Ser Met Glu Arg Asn Ile178017851790Gly Thr Ile Asn Phe Lys Tyr Gly Gln Asp Gln Asn Thr Pro Arg Arg179518001805Phe Thr Leu Glu Gly Gly Ile Ala Gln Ala Asn Pro Gln Val Ala Ser181018151820Ala Leu Thr Asp Leu Lys Lys Glu Gly Leu Glu Met Lys Ser182518301835該蛋白或多肽約為198kDa，而pI為8.98。
本發(fā)明涉及具有如下SEQ.ID.No.29的核苷酸序列的分離的DNA分子ATGACATCGT CACAGCAGCG GGTTGAAAGG TTTTTACAGT ATTTCTCCGC CGGGTGTAAA 60ACGCCCATAC ATCTGAAAGA CGGGGTGTGC GCCCTGTATA ACGAACAAGA TGAGGAGGCG120GCGGTGCTGG AAGTACCGCA ACACAGCGAC AGCCTGTTAC TACACTGCCG AATCATTGAG180GCTGACCCAC AAACTTCAAT AACCCTGTAT TCGATGCTAT TACAGCTGAA TTTTGAAATG240GCGGCCATGC GCGGCTGTTG GCTGGCGCTG GATGAACTGC ACAACGTGCG TTTATGTTTT300CAGCAGTCGC TGGAGCATCT GGATGAAGCA AGTTTTAGCG ATATCGTTAG CGGCTTCATC360GAACATGCGG CAGAAGTGCG TGAGTATATA GCGCAATTAG ACGAGAGTAG CGCGGCATAA420該DNA分子被稱(chēng)為dspF基因。本發(fā)明的這種分離的DNA分子編碼具有如下SEQ.ID.No.30的氨基酸序列的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽Met Thr Ser Ser Gln Gln Arg Val Glu Arg Phe Leu Gln Tyr Phe Serl 5 10 15Ala Gly Cys Lys Thr Pro Ile His Leu Lys Asp Gly Val Cys Ala Leu20 25 30Tyr Asn Glu Gln Asp Glu Glu Ala Ala Val Leu Glu Val Pro Gln His35 40 45Ser Asp Ser Leu Leu Leu His Cys Arg Ile Ile Glu Ala Asp Pro Gln50 55 60Thr Ser Ile Thr Leu Tyr Ser Met Leu Leu Gln Leu Asn Phe Glu Met65 70 75 80Ala Ala Met Arg Gly Cys Trp Leu Ala Leu Asp Glu Leu His Asn Val85 90 95Arg Leu Cys Phe Gln Gln Ser Leu Glu His Leu Asp Glu Ala Ser Phe100 105 110Ser Asp Ile Val Ser Gly Phe Ile Glu His Ala Ala Glu Val Arg Glu115 120 125Tyr Ile Ala Gln Leu Asp Glu Ser Ser Ala Ala130 135該蛋白或多肽約為16kDa，而pI為4.45。
得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.31的氨基酸序列Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Metl 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175LGu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ilo180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340該過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的分子量為34-35kDa。它富含甘氨酸(約13.5％)，而缺乏半胱氨酸和酪氨酸。關(guān)于得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的進(jìn)一步信息見(jiàn)于He，S.Y.，H.C.Huang和A.Collmer，“丁香假單胞菌丁香致病變種Harpinpss通過(guò)Hrp途徑分泌并誘發(fā)植物過(guò)敏反應(yīng)的蛋白，”Cell 731255-1266(1993)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。編碼得自丁香假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的DNA分子具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.32的核苷酸序列ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG 60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCACGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020GCCTGA 1026得自丁香假單胞菌的另一種可能合適的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)09/120,817，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。所述蛋白具有如下SEQ.ID.No.33的核苷酸序列TCCACTTCGC TGATTTTGAA ATTGGCAGAT TCATAGAAAC GTTCAGGTGT GGAAATCAGG 60CTGAGTGCGC AGATTTCGTT GATAAGGGTG TGGTACTGGT CATTGTTGGT CATTTCAAGG120CCTCTGAGTG CGGTGCGGAG CAATACCAGT CTTCCTGCTG GCGTGTGCAC ACTGAGTCGC180AGGCATAGGC ATTTCAGTTC CTTGCGTTGG TTGGGCATAT AAAAAAAGGA ACTTTTAAAA240ACAGTGCAAT GAGATGCCGG CAAAACGGGA ACCGGTCGCT GCGCTTTGCC ACTCACTTCG300AGCAAGCTCA ACCCCAAACA TCCACATCCC TATCGAACGG ACAGCGATAC GGCCACTTGC360TCTGGTAAAC CCTGGAGCTG GCGTCGGTCC AATTGCCCAC TTAGCGAGGT AACGCAGCAT420GAGCATCGGC ATCACACCCC GGCCGCAACA GACCACCACG CCACTCGATT TTTCGGCGCT480AAGCGGCAAG AGTCCTCAAC CAAACACGTT CGGCCAGCAG AACACTCAGC AAGCGATCGA540CCCGAGTGCA CTGTTGTTCG GCAGCGACAC ACAGAAAGAC GTCAACTTCG GCACGCCCGA600CAGCACCGTC CAGAATCCGC AGGACGCCAG CAAGCCCAAC GACAGCCAGT CCAACATCGC660TAAATTGATC AGTGCATTGA TCATGTCGTT GCTGCAGATG CTCACCAACT CCAATAAAAA720GCAGGACACC AATCAGGAAC AGCCTGATAG CCAGGCTCCT TTCCAGAACA ACGGCGGGCT780CGGTACACCG TCGGCCGATA GCGGGGGCGG CGGTACACCG GATGCGACAG GTGGCGGCGG 840CGGTGATACG CCAAGCGCAA CAGGCGGTGG CGGCGGTGAT ACTCCGACCG CAACAGGCGG 900TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCACACCCAC TGCAACAGGT GGCGGCAGCG GTGGCACACC 960CACTGCAACA GGCGGTGGCG AGGGTCGCGT AACACCGCAA ATCACTCCGC AGTTGGCCAA1020CCCTAACCGT ACCTCAGGTA CTGGCTCGGT GTCGGACACC GCAGGTTCTA CCGAGCAAGC1080CGGCAAGATC AATGTGGTGA AAGACACCAT CAAGGTCGGC GCTGGCGAAG TCTTTGACGG1140CCACGGCGCA ACCTTCACTG CCGACAAATC TATGGGTAAC GGAGACCAGG GCGAAAATCA1200GAAGCCCATG TTCGAGCTGG CTGAAGGCGC TACGTTGAAG AATGTGAACC TGGGTGAGAA1260CGAGGTCGAT GGCATCCACG TGAAAGCCAA AAACGCTCAG GAAGTCACCA TTGACAACGT1320GCATGCCCAG AACGTCGGTG AAGACCTGAT TACGGTCAAA GGCGAGGGAG GCGCAGCGGT1380CACTAATCTG AACATCAAGA ACAGCAGTGC CAAAGGTGCA GACGACAAGG TTGTCCAGCT1440CAACGCCAAC ACTCACTTGA AAATCGACAA CTTCAAGGCC GACGATTTCG GCACGATGGT1500TCGCACCAAC GGTGGCAAGC AGTTTGATGA CATGAGCATC GAGCTGAACG GCATCGAAGC1560TAACCACGGC AAGTTCGCCC TGGTGAAAAG CGACAGTGAC GATCTGAAGC TGGCAACGGG1620CAACATCGCC ATGACCGACG TCAAACACGC CTACGATAAA ACCCAGGCAT CGACCCAACA1680CACCGAGCTT TGAATCCAGA CAAGTAGCTT GAAAAAAGGG GGTGGACTC 1729該DNA分子被稱(chēng)為丁香假單胞菌的dspE基因。本發(fā)明的這種分離的DNA分子編碼具有如下SEQ.ID.No.34的氨基酸序列的誘發(fā)植物病原體的過(guò)敏反應(yīng)的蛋白或多肽Met Ser Ile Gly Ile Thr Pro Arg Pro Gln Gln Thr Thr Thr Pro Leu1 5 10 15Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Gln Pro Asn Thr Phe Gly20 25 30Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ala Ile Asp Pro Ser Ala Leu Leu Phe Gly35 40 45Ser Asp Thr Gln Lys Asp Val Asn Phe Gly Thr Pro Asp Ser Thr Val50 55 60Gln Asn Pro Gln Asp Ala Ser Lys Pro Asn Asp Ser Gln Ser Asn Ile65 70 75 80Ala Lys Leu Ile Ser Ala Leu Ile Met Ser Leu Leu Gln Met Leu Thr85 90 95Asn Ser Asn Lys Lys Gln Asp Thr Asn Gln Glu Gln Pro Asp Ser Gln100 105 110Ala Pro Phe Gln Asn Asn Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ala Asp Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr130 135 140Pro Ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Gly145 150 155 160Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly165 170 175Ser Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly Glu Gly Gly Val Thr180 185 190Pro Gln Ile Thr Pro Gln Lau Ala Asn Pro Asn Arg Thr Ser Gly Thr195 200 205Gly Ser Val Ser Asp Thr Ala Gly Ser Thr Glu Gln Ala Gly Lys Ile210 215 220Asn Val Val Lys Asp Thr Ile Lys Val Gly Ala Gly Glu Val Phe Asp225 230 235 240Gly His Gly Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Met Gly Asn Gly Asp245 250 255Gln Gly Glu Asn Gln Lys Pro Met Phe Glu Leu Ala Glu Gly Ala Thr260 265 270Leu Lys Asn Val Asn Leu Gly Glu Asn Glu Vai Asp Gly Ile His Val275 280 285Lys Ala Lys Asn Ala Gln Glu Val Thr Ile Asp Asn Val His Ala Gln290 295 300Asn Val Gly Glu Asp Leu Ile Thr Val Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ala305 310 315 320Val Thr Asn Leu Asn Ile Lys Asn Ser Ser Ala Lys Gly Ala Asp Asp325 330 335Lys Val Val Gln Leu Asn Ala Asn Thr His Leu Lys Ile Asp Asn Phe340 345 350Lys Ala Asp Asp Phe Gly Thr Met Val Arg Thr Asn Gly Gly Lys Gln355 360 365Phe Asp Asp Met Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ile Glu Ala Asn His Gly370 375 380Lys Phe Ala Leu Val Lys Ser Asp Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Thr385 390 395 400Gly Asn Ile Ala Met Thr Asp Val Lys His Ala Tyr Asp Lys Thr Gln405 410 415Ala Ser Thr Gln His Thr Glu Leu420該蛋白或多肽約為42.9kDa。
得自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.35的氨基酸序列Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lye Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ila Mat Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.36的核苷酸序列的DNA分子編碼上述多肽或蛋白ATGTCAGTCG GAAACATCCA GACCCGTCGAACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC 120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC 180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC 240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC 300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGGGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA1035關(guān)于得自茄假單胞菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的進(jìn)一步信息敘述于Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet和CA.Boucher，“通過(guò)茄假單胞菌的Hrp途徑分泌PopAl—在特定矮牽牛基因型上誘導(dǎo)過(guò)敏樣反應(yīng)的蛋白，”EMBO J.13543-533(1994)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
得自野油菜黃單胞菌大豆致病變種(Xanthomonas campestris pv.glycines)的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.37的氨基酸序列Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25該序列為得自野油菜黃單胞菌大豆致病變種的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的僅具有26個(gè)殘基的氨基端序列。它與在其它野油菜黃單胞菌致病變種中所確定的fimbrial亞基蛋白相匹配。
得自野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.pelargonii)的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白為熱穩(wěn)定、對(duì)蛋白酶敏感，并且分子量為20kDa。它包括對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.38的氨基酸序列Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln1 5 10 15Leu Leu Ala Met20Cui等，“胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種Ecc71菌株的RsInA突變體在煙草葉片中過(guò)量表達(dá)hrpNEcc并誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)樣反應(yīng)，”MPMI9(7)565-73(1996)中描述了胡蘿卜軟腐歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的分離，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Ahmad等，“Harpin對(duì)斯氏歐文氏菌在玉米中的致病性不是必需的，”8thInt’l.Cong.Molec.Plant-Microb.Inter.1996年7月14-19日和Ahmad等，“Harpin對(duì)斯氏歐文氏菌在玉米中的致病性不是必需的，”Ann Mtg.Am.Phytopath.Soc.1996年7月27-31日中陳述了斯氏歐文氏菌的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
Kaman等，“來(lái)自疫霉屬的胞外蛋白激發(fā)子對(duì)細(xì)菌和真菌植物病原體最具特異性(most specificity)并誘導(dǎo)抗性，”Molec.Plant-MicrobeInteract.，6(1)15-25(1993)；Ricci等，“得自病原體真菌疫霉屬、在煙草中誘發(fā)壞死和獲得抗性的蛋白的結(jié)構(gòu)及活性，”Eur.J.Biochem.，183555-63(1989)；Ricci等，“寄生疫霉的分離菌在煙草中差別產(chǎn)生parasiticein及壞死和抗性的激發(fā)子，”P(pán)lant Path.41298-307(1992)；Baillreul等，“煙草中過(guò)敏反應(yīng)的一種新的激發(fā)子真菌糖蛋白誘發(fā)細(xì)胞死亡、防衛(wèi)基因的表達(dá)、水楊酸的產(chǎn)生及誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得抗性，”P(pán)lantJ.8(4)551-60(1995)和Bonnet等，“煙草和其它植物中的激發(fā)子觸發(fā)的獲得抗性，”Eur.J.PlantPath.，102181-92(1996)，描述了得自寄生疫霉、隱地疫霉、樟疫霉、辣椒疫霉、大雄疫霉和柑橘褐腐疫霉的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽，這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
按照本發(fā)明的另一種過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子是來(lái)自美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)09/136,625中全面描述的密執(zhí)安棍狀桿菌壞腐亞種(Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus)的激發(fā)子，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
上述激發(fā)子為典型的激發(fā)子。通過(guò)在表達(dá)編碼激發(fā)子的基因的條件下，培養(yǎng)誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的真菌或細(xì)菌，可以鑒定出其它激發(fā)子?？梢酝ㄟ^(guò)使用得自培養(yǎng)上清液的無(wú)細(xì)胞制備物的浸潤(rùn)合適的植物組織，測(cè)試其激發(fā)子活性(即局部壞死)。
本發(fā)明包括上述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段以及來(lái)自其它病原體的全長(zhǎng)激發(fā)子的片段。
通過(guò)幾種方法可以產(chǎn)生合適的片段。在第一種方法中，按照常規(guī)分子遺傳學(xué)操作，通過(guò)亞克隆基因片段產(chǎn)生編碼已知激發(fā)子蛋白的基因的亞克隆。然后在體外或體內(nèi)將這些亞克隆在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生較小的蛋白或肽，可以按照以下所述方法測(cè)試所述蛋白或多肽的激發(fā)子活性。
作為一種可采用的方法，可以通過(guò)用蛋白水解酶像胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌A蛋白酶或胰蛋白酶消化全長(zhǎng)激發(fā)子蛋白，產(chǎn)生激發(fā)子蛋白的片段。不同的蛋白水解酶可能基于激發(fā)子蛋白的氨基酸序列在不同的位點(diǎn)剪切激發(fā)子蛋白。從蛋白酶解中產(chǎn)生的有些片段可以是活性的抗性激發(fā)子。
在另一個(gè)方案中，根據(jù)對(duì)所述蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，經(jīng)采用PCR技術(shù)和選擇代表所述蛋白特定部分的多組特異性引物，可以合成所述激發(fā)子蛋白基因的片段。然后將這些片段克隆到合適的載體中以表達(dá)截短的肽或蛋白。
化學(xué)合成也可用來(lái)制備合適的片段。采用待產(chǎn)生的激發(fā)子的已知氨基酸序列進(jìn)行這樣的合成。或者，使全長(zhǎng)激發(fā)子經(jīng)受高溫高壓產(chǎn)生片段。然后經(jīng)常規(guī)方法(例如層析、SDS-PAGE)可以將這些片段分離。
不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子合適的片段的實(shí)例包括解淀粉歐文氏菌過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段。合適的片段包括SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段或SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的內(nèi)部片段。SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的C端片段可以覆蓋(span)以下序列的氨基酸SEQ.ID.No.23169和403、210和403、267和403、或343和403。SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的內(nèi)部片段可以覆蓋以下序列的氨基酸SEQ.ID.No.23105和179、137和166、121和150、或137和156。按照本發(fā)明可以鑒定出其它合適的片段。
過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的有用片段(所述片段本身不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng))的另一個(gè)實(shí)例是含有丁香假單胞菌丁香致病變種過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的氨基酸序列(SEQ.ID.No.31)的氨基酸190-294的蛋白片段。該片段可用來(lái)賦予抗病性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的有用片段的再一實(shí)例是具有對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.39的氨基酸序列的肽。該肽得自誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的大雄疫霉糖蛋白，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。
例如，通過(guò)缺失或添加對(duì)所述多肽的特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水特性方面的影響最小的氨基酸，可以產(chǎn)生變異體。例如，可以將多肽連接到共翻譯或翻譯引導(dǎo)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白N-末端的信號(hào)(或前導(dǎo))序列上。也可以將所述多肽連接到接頭或其它序列上以便于合成、純化或鑒定所述多肽。
本發(fā)明的所述片段優(yōu)選為分離的形式(即從其宿主生物中分離的)，而更優(yōu)選通過(guò)常規(guī)技術(shù)，以純化的形式(優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選80％，純度)產(chǎn)生。通常，產(chǎn)生本發(fā)明的所述片段但不分泌到重組宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。或者，將本發(fā)明的蛋白或多肽分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在非分泌蛋白的情況下，為了分離所述蛋白片段，將攜帶重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)繁殖、經(jīng)超聲處理、熱處理或化學(xué)處理裂解，然后將勻漿離心以去除細(xì)菌碎片。然后將所述上清液加熱處理并通過(guò)離心分離所述片段。將含有所述片段的上清液部分在合適大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾以分離所述片段。必要時(shí)，可以經(jīng)離子交換或HPLC進(jìn)一步純化所述蛋白部分。
采用常規(guī)重組DNA技術(shù)，可以將編碼所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的所述片段的DNA分子摻入到細(xì)胞中。一般而言，這涉及將所述DNA分子插入到所述DNA分子為異源的(即通常不存在)表達(dá)系統(tǒng)中。將所述異源DNA分子適當(dāng)?shù)挠辛x方向和正確的讀框插入到所述表達(dá)系統(tǒng)或載體中。所述載體含有所述插入的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件。
Cohen和Boyer的美國(guó)專(zhuān)利第4,237,224號(hào)(該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，描述了采用限制酶切割并用DNA連接酶連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒形式的表達(dá)系統(tǒng)。然后采用多種轉(zhuǎn)化方法將這些重組質(zhì)粒引入，并在包括組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的原核生物和真核細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制。
也可以將重組基因引入到病毒，諸如痘苗病毒中?？梢酝ㄟ^(guò)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到用病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生重組病毒。
合適的載體包括但不限于以下的病毒載體諸如λ載體系統(tǒng)gt11、gtWES.tB、卡隆4(Charon 4)和質(zhì)粒載體諸如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(參見(jiàn)“Stratagene Cloning Systems”Catalog(1993)from Stratagene，LaJolla，Calif，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見(jiàn)F.W.Studier等，“采用T7 RNA聚合酶直接表達(dá)克隆的基因”GeneExpression Technology第185卷(1990)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)及其任何衍生物。通過(guò)轉(zhuǎn)化尤其是轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、帶動(dòng)轉(zhuǎn)移(mobilization)或電穿孔，可以將重組分子引入到細(xì)胞中。采用如Sambrook等，Molecular CloningA Laborotoruy Manual，Cold Springs Laboratory，ColdSprings Harbor，New Yodk(1989)所描述的本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法，將所述DNA序列克隆到所述載體中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
可以利用各種宿主-載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)所述蛋白編碼序列。首先，所述載體系統(tǒng)必須與所用的宿主細(xì)胞相匹配。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于以下所述宿主-載體系統(tǒng)用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；微生物諸如含有酵母載體的酵母；用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；和被細(xì)菌感染的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性方面不同。根據(jù)所采用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用許多合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種。
不同遺傳信號(hào)和加工事件控制多種水平的基因表達(dá)(例如DNA的轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)的翻譯)。
DNA轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合并因此啟動(dòng)mRNA合成的一段DNA序列的啟動(dòng)子的存在。真核啟動(dòng)子的DNA序列與原核啟動(dòng)子的DNA序列有差異。此外，真核啟動(dòng)子及伴隨的遺傳信號(hào)可能不被原核系統(tǒng)識(shí)別或可能在原核系統(tǒng)中不起作用，而原核啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中也不被識(shí)別和不起作用。
同樣，原核生物中的mRNA翻譯依賴(lài)于與真核生物的那些信號(hào)不同的適當(dāng)?shù)脑松镄盘?hào)的存在。原核生物中的mRNA有效翻譯需要mRNA上稱(chēng)為Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該序列是一段位于編碼所述蛋白質(zhì)氨基端的甲硫氨酸的起始密碼子，通常是AUG之前的短的mRNA核苷酸序列。SD序列與16S rRNA(核糖體RNA)的3’-末端互補(bǔ)，然后可能通過(guò)與所述rRNA形成雙鏈體啟動(dòng)mRNA結(jié)合到核糖體上，以便正確定位該核糖體。關(guān)于使基因表達(dá)最大化的綜述，參見(jiàn)Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68473(1979)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
啟動(dòng)子在其“強(qiáng)度”(即它們啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力)方面不同。為了表達(dá)克隆的基因，最好是采用強(qiáng)啟動(dòng)子以獲得高水平轉(zhuǎn)錄，并因此表達(dá)所述基因。基于所采用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用許多合適啟動(dòng)子中的任何一種。例如，當(dāng)在大腸桿菌中克隆其噬菌體或質(zhì)粒時(shí)，可以將啟動(dòng)子諸如T7噬菌體啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、rec啟動(dòng)子、核糖體RNA啟動(dòng)子、大腸桿菌噬菌體λ的PR和PL啟動(dòng)子和其它啟動(dòng)子包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等，用來(lái)引導(dǎo)高水平轉(zhuǎn)錄相鄰的DNA區(qū)段。此外，可以將通過(guò)重組DNA或其它合成DNA技術(shù)產(chǎn)生的雜種trp-lacUV5(tac)啟動(dòng)子或其它大腸桿菌啟動(dòng)子用來(lái)提供插入的基因轉(zhuǎn)錄。
可以選擇若非特異性誘導(dǎo)則抑制啟動(dòng)子作用的細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株和表達(dá)載體。在某些操作中，為了有效轉(zhuǎn)錄插入的DNA，必需加入特異性的誘導(dǎo)物。例如，加入乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)lac操縱子。各種其它操縱子諸如trp、pro等是處于不同的控制之下。
在原核細(xì)胞中基因的有效轉(zhuǎn)錄和翻譯，也需要特定的起始信號(hào)。根據(jù)基因特異性的信使RNA和所合成的蛋白質(zhì)的量分別測(cè)量，這些轉(zhuǎn)錄和翻譯起始信號(hào)在“強(qiáng)度”方面可以不同。含有啟動(dòng)子的DNA表達(dá)載體，也可以包括任何各種“強(qiáng)”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號(hào)的組合物。例如，大腸桿菌中的有效翻譯需要起始密碼子(“ATG”)5’約7-9個(gè)堿基的SD序列以提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，可以采用可以由宿主細(xì)胞核糖體使用的任何SD-ATG組合。這樣的組合包括但不限于來(lái)自大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因或來(lái)自大腸桿菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG組合。此外，可以使用涉及摻入合成的核苷酸的重組DNA或其它技術(shù)產(chǎn)生的任何SD-ATG組合。
一旦已經(jīng)將編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段的分離的DNA分子克隆到表達(dá)系統(tǒng)中，就隨時(shí)可以將其摻入到宿主細(xì)胞中?；谒鲚d體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，通過(guò)以上所述的各種形式的轉(zhuǎn)化可以進(jìn)行這樣的摻入。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)、植物等。
本發(fā)明還涉及賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或?qū)崿F(xiàn)防治植物害蟲(chóng)的方法。這些方法涉及，在給所述片段有效賦予抗病性、促進(jìn)生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下，將在非感染形式的不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段應(yīng)用于整株植物或植物部分或植物種子。或者，可以將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的這些片段應(yīng)用于植物，以便從這種植物自身收獲的種子能夠賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或?qū)崿F(xiàn)防治害蟲(chóng)。
作為將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段應(yīng)用于植物或植物種子以便給植物或由所述植物種子培育的植物賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的替代方法，可以使用轉(zhuǎn)基因植物或植物種子。如果使用轉(zhuǎn)基因植物，這種方法涉及提供用編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，并在有效允許那種DNA分子賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下培育所述植物?；蛘?，可以提供用編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)；并將所述種子播種于土壤中。然后在有效允許那種DNA分子賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下，從播種的種子繁殖植物。
可以以許多方式，包括1)應(yīng)用一種分離的片段或2)應(yīng)用不引起病害并用編碼所述片段的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，實(shí)施將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白應(yīng)用于所述植物或植物種子的本發(fā)明的實(shí)施方案。在后面的實(shí)施方案中，通過(guò)應(yīng)用含有編碼所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段(所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng))的DNA分子的細(xì)菌，可以將所述片段應(yīng)用于植物或植物種子。這樣的細(xì)菌必須能夠分泌或輸出所述片段，以便所述片可以接觸植物或植物種子細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)在植物中或種子或正好在將所述細(xì)菌引入所述植物或植物種子之前，由細(xì)菌產(chǎn)生所述片段。
可以使用本發(fā)明的所述方法處理各種各樣的植物或它們的種子以賦予抗病性、促進(jìn)生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)。合適的植物包括雙子葉植物和單子葉植物，更具體地講，有用的作物可以包括苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、青花椰菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆(pumpkin)、西葫蘆(zucchini)、黃瓜、蘋(píng)果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。合適的觀(guān)賞植物的實(shí)例為擬南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲紫羅蘭屬(Saintpaulia)、碧冬茄、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
關(guān)于本發(fā)明過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段在賦予抗病性方面的用途，不可以賦予抵抗感染的絕對(duì)免疫性，但降低所述病害的嚴(yán)重程度，并使癥狀發(fā)生延遲。病斑數(shù)目、病斑大小和真菌病原菌孢子形成的數(shù)量都減少了。這種賦予抗病性的方法具有治療先前不可治療的病害、系統(tǒng)性治療由于費(fèi)用的原因不可能分別治療的病害，并避免了使用感染性因子或環(huán)境上有害的物質(zhì)的潛力。
按照本發(fā)明賦予植物病原體抗性的方法可用于賦予針對(duì)各種各樣的病原體包括病毒、細(xì)菌和真菌的抗性。通過(guò)本發(fā)明的方法獲得尤其是對(duì)以下病毒煙草花葉病毒和番茄花葉病毒的抗病性。按照本發(fā)明也可以賦予植物尤其是對(duì)以下細(xì)菌的抗病性茄假單胞菌、丁香假單胞菌煙草致病變種(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種。通過(guò)采用本發(fā)明的方法，植物可獲得尤其是對(duì)以下真菌的抗病性尖鐮孢(Fusarium oxysporum)和致病疫霉(Phytophthorainfestans)。
就使用本發(fā)明過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)而論，可以獲得各種形式的植物生長(zhǎng)增強(qiáng)或促進(jìn)。早在植物生長(zhǎng)從種子開(kāi)始時(shí)或后來(lái)在植物的生命中，這種作用均可以產(chǎn)生。例如，按照本發(fā)明的植物生長(zhǎng)包括更高的產(chǎn)量、所生產(chǎn)的種子品質(zhì)提高、種子發(fā)芽百分率提高、植株大小增加、更高的生物量、更多更大的果實(shí)、果實(shí)更早著色以及更早結(jié)果和植物成熟。因此，本發(fā)明給生產(chǎn)者提供顯著的經(jīng)濟(jì)效益。例如，早發(fā)芽和早熟使得作物可以于在其它情況下短生長(zhǎng)季節(jié)使作物不能生長(zhǎng)的地區(qū)生長(zhǎng)。種子發(fā)芽率的提高導(dǎo)致改善作物植株密度而更有效利用種子。較高的產(chǎn)量、增加的大小和提高的生物量產(chǎn)量使從給定的小塊土地產(chǎn)生更高的收益。
本發(fā)明再一方面涉及實(shí)現(xiàn)任何形式的植物害蟲(chóng)防治。例如，按照本發(fā)明的害蟲(chóng)防治包括防止害蟲(chóng)接觸已經(jīng)應(yīng)用過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的植物、防止通過(guò)對(duì)植物攝食損傷引起的直接害蟲(chóng)損害、使害蟲(chóng)遠(yuǎn)離這樣的植物、殺死接近這樣的植物的害蟲(chóng)、干擾攝食這樣的植物的害蟲(chóng)的幼蟲(chóng)、防止害蟲(chóng)定居寄主植物、防止定居的害蟲(chóng)釋放植物毒素等。本發(fā)明也防止由害蟲(chóng)侵染引起的對(duì)植物后來(lái)的病害損害。
針對(duì)各種各樣的害蟲(chóng)本發(fā)明是有效的。歐洲玉米螟是玉米(臼齒形甜玉米)的一種主要的害蟲(chóng)，但它還在超過(guò)200種植物物種上攝食，包括嫩莢菜豆、黃莢種菜豆和利馬豆以及食用大豆、胡椒、馬鈴薯和番茄及許多雜草物種。其它的損害各種各樣的蔬菜作物的害蟲(chóng)幼蟲(chóng)的攝食害蟲(chóng)包括以下的害蟲(chóng)甜菜夜蛾、粉紋夜蛾、谷實(shí)夜蛾、秋夜蛾、小菜蛾、甘藍(lán)根種蠅(cabbage root maggot)、蔥蠅、玉術(shù)種蠅、瓜野螟(甜瓜野螟)、胡椒帶實(shí)蠅、番茄蠹蛾和蛆?？偲饋?lái)說(shuō)，該類(lèi)群害蟲(chóng)代表了在世界范圍內(nèi)蔬菜生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)上最重要的害蟲(chóng)類(lèi)群。
如果處理整株或部分所述植物，包括葉、莖、根、繁殖體(例如插條)等時(shí)，通過(guò)種種方法可以實(shí)施包括應(yīng)用過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段(所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng))的本發(fā)明的方法。這種方法可以(但不必)涉及將所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段浸潤(rùn)所述植物。合適的應(yīng)用方法包括高壓或低壓噴灑、注射和接近激發(fā)子應(yīng)用發(fā)生時(shí)的葉片磨損。當(dāng)按照本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施方案處理植物種子或繁殖體(例如插條)時(shí)，可以通過(guò)高壓或低壓噴灑、包膜、浸泡或注射應(yīng)用按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)想其它合適的應(yīng)用方法，前提是他們能夠?qū)崿F(xiàn)將所述片段與所述植物或植物種子的細(xì)胞接觸。一旦用本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段處理后，就將所述種子播種于自然或人工土壤中，并采用常規(guī)方法栽培以產(chǎn)生植株。在將植株已從用按照本發(fā)明處理的種子繁殖出來(lái)后，可以一次或多次應(yīng)用所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段或完整的激發(fā)子處理所述植物，以賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治所述植物的害蟲(chóng)。
可以將按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段，單獨(dú)地或與其它物質(zhì)的混合物應(yīng)用于植物或植物種子。或者，可以將所述片段單獨(dú)地應(yīng)用于植物，而在不同時(shí)間應(yīng)用其它物質(zhì)。
適合于按照本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)施方案處理植物或植物種子的組合物在載體中含有過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子多肽或蛋白的片段，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。合適的載體包括水、水溶液、漿液或干粉。在該實(shí)施方案中，所述組合物含有高于500nM的所述片段。
盡管不是必需的，該組合物可以含有其它添加劑，包括肥料、殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺線(xiàn)蟲(chóng)劑及其混合物。合適的肥料包括(NH4)2NO3。合適的殺蟲(chóng)劑的實(shí)例為馬拉硫磷。有效殺真菌劑包括克菌丹。
其它合適的添加劑包括緩沖劑、潤(rùn)濕劑、包膜劑和磨蝕劑。這些物質(zhì)可用來(lái)有利于本發(fā)明的方法。此外，可以將所述誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的片段與其它常規(guī)種子制劑和處理材料(包括粘土和多糖)一起應(yīng)用于植物種子。
在涉及使用轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子的本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，通常不需要將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段應(yīng)用于所述植物或種子。而是，按照本領(lǐng)域眾所周知的方法，產(chǎn)生用編碼這樣的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
通過(guò)采用微量加液器機(jī)械轉(zhuǎn)移所述重組DNA，可以將上面所述的載體直接微注射到植物細(xì)胞中。Crossway，Mol.Gen.Genetics，202179-85(1985)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。采用聚乙二醇，也可以將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到所述植物細(xì)胞中。Krens等，Nature，29672-74(1982)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
用賦予病原體抗性的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的另一種方案是所述宿主細(xì)胞的粒子轟擊(也稱(chēng)為biolistic轉(zhuǎn)化)?？梢砸詭追N方法中的一種實(shí)現(xiàn)該方案。首先涉及將惰性粒子或生物活性粒子推進(jìn)細(xì)胞。全部為Sanford等的美國(guó)專(zhuān)利第4,945,050、5,036,006和5,100,792號(hào)公開(kāi)了該技術(shù)，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中?？偟膩?lái)講，該方法涉及，在有效穿透所述細(xì)胞外表面并被摻入其內(nèi)部的條件下，將惰性粒子或生物活性粒子推進(jìn)所述細(xì)胞。如果使用惰性粒子，則可以通過(guò)用含有所述異源DNA的載體包被所述粒子，將所述載體引入所述細(xì)胞中?；蛘撸鲚d體可以包圍所述靶細(xì)胞以便通過(guò)所述粒子的尾流(wake)將所述載體帶入所述細(xì)胞中。也可以將生物活性粒子(例如含有所述載體和異源DNA的干的細(xì)菌細(xì)胞)推進(jìn)植物細(xì)胞。
引入的再一種方法是原生質(zhì)體與其它實(shí)體融合，所述其它實(shí)體為或者小細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體或者其它可融合的脂質(zhì)表面的小體(fusiblelipid-surfaced bodies)的。Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
通過(guò)電穿孔也可將所述DNA分子引入所述植物細(xì)胞。Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825824(1985)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在該技術(shù)中，在含有表達(dá)盒的質(zhì)粒存在下，將植物原生質(zhì)體電穿孔。高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖可逆地使生物膜透化而引入質(zhì)粒。電穿孔的植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁、分裂并再生。
將所述DNA分子引入植物細(xì)胞的另一種方法是用預(yù)先用所述基因轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)感染植物細(xì)胞。在本領(lǐng)域已知的合適條件下，培育所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以形成芽或根，然后進(jìn)一步發(fā)育成植株。一般而言，該方法涉及用細(xì)菌懸浮液接種所述植物組織，然后于25-28℃在不含抗生素的再生培養(yǎng)基上將所述組織培育48-72小時(shí)。
農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)是革蘭氏陰性根瘤菌科的一個(gè)代表性屬。其菌種引起冠癭病(根癌農(nóng)桿菌)和發(fā)根病(發(fā)根農(nóng)桿菌)。將冠癭腫瘤和發(fā)根中的植物細(xì)胞誘導(dǎo)以產(chǎn)生稱(chēng)為冠癭堿的氨基酸衍生物，冠癭堿只由所述細(xì)菌分解代謝。引起冠癭堿表達(dá)的細(xì)菌基因是嵌合表達(dá)盒的控制元件的便利來(lái)源。此外，測(cè)定冠癭堿的存在可用來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化的組織。
用根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?；虬l(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，可以將異源遺傳序列引入合適的植物細(xì)胞。通過(guò)農(nóng)桿菌感染，將Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒傳遞到植物細(xì)胞，并穩(wěn)定地整合到所述植物基因組中。J.Schell，Science，2371176-83(1987)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
轉(zhuǎn)化后，必須將所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。
在Evans等，Handbook of Plant Cell Cultures.第1卷(MacMillanPublishing Co.，New York，1983)和Vasil I.R.(編著)，Cell Culture andSomatic Cell Genetics ofPlants，Acad.Press，Odando，第1卷，1984和第III卷(1986)中描述了從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植株，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
已經(jīng)知道，實(shí)際上所有植物都可以從培養(yǎng)的細(xì)胞或組織再生，包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、果樹(shù)和豆科植物的所有主要物種。
再生的方法在植物種與種之間不同，但一般首先提供轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的懸浮液或含有轉(zhuǎn)化的外植體的培養(yǎng)皿。形成愈傷組織，然后從愈傷組織誘導(dǎo)長(zhǎng)芽，并隨后長(zhǎng)根?；蛘?，可以在愈傷組織中誘導(dǎo)胚形成。這些胚如天然胚一樣萌發(fā)以形成植株。所述培養(yǎng)基一般含有各種氨基酸和激素諸如植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。最好是也將谷氨酸和脯氨酸加入到所述培養(yǎng)基中，尤其是對(duì)像玉米和苜蓿這樣的物種。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)史。如果控制好了這三種可變因素，那么再生通常是能再現(xiàn)的和可重復(fù)的。
將表達(dá)盒穩(wěn)定地?fù)饺氲睫D(zhuǎn)基因植物后，它可以通過(guò)有性雜交轉(zhuǎn)移到其它植物。根據(jù)所雜交的物種，可以采用許多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任何一種。
一旦產(chǎn)生出該類(lèi)型的轉(zhuǎn)基因植株，就可按照常規(guī)方法將所述植株自身栽培，編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段的基因的存在導(dǎo)致抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治植物害蟲(chóng)，?；蛘?，從轉(zhuǎn)基因植物回收轉(zhuǎn)基因種子或繁殖體(例如插條)。然后將所述種子播種于土壤中，并采用常規(guī)方法栽培以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在有效賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下，從播種的轉(zhuǎn)基因種子繁殖轉(zhuǎn)基因植物。盡管不希望受理論的限制，但這樣的抗病性、生長(zhǎng)促進(jìn)和/或害蟲(chóng)防治可由RNA介導(dǎo)或可以因所述多肽或蛋白片段的表達(dá)產(chǎn)生。
如果按照本發(fā)明使用轉(zhuǎn)基因植物和植物種子，則它們還可以用與用來(lái)處理應(yīng)用按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子片段的所述植物和種子相同的材料處理?？梢酝ㄟ^(guò)包括高壓或低壓噴灑、注射、包膜和浸泡的上述方法，將包括按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子片段的這些其它的材料應(yīng)用于所述轉(zhuǎn)基因植物和植物種子。同樣，在從所述轉(zhuǎn)基因植物種子繁殖植株后，可以將所述植株用按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子片段的一種或多種應(yīng)用方法處理，以賦予抗病性、促進(jìn)生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)。也可用常規(guī)植物處理劑(例如殺蟲(chóng)劑、肥料等)處理這種植物。
實(shí)施例實(shí)施例1-細(xì)菌菌株和質(zhì)粒以下實(shí)施例中所用的大腸桿菌菌株包括分別從Gibco BRL(GrandIsland，N.Y.)和Stratagene(La Jolla，CA)購(gòu)買(mǎi)的DH5α和BL21(DE3)。從Novagen(Madison，WI)購(gòu)買(mǎi)pET28(b)載體。Eco DH5α/2139含有完整的hrpN基因。2139構(gòu)成物由Comeil大學(xué)的D.Bauer生產(chǎn)。用HindIII經(jīng)限制酶酶切消化，將hrpN基因從2139質(zhì)粒中切下，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠純化以用作PCR合成截短的hrpN克隆的DNA模板。隨后將這些克隆插入到含有Kanr基因的(His)6載體pET28(b)中用于選擇轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例2-DNA操作從Boeringer Mannheim(Indianapolis，IN)或Gibco BRL獲得限制酶。從Gibco BRL獲得T4 DNA連接酶、小牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)和PCR SupemixTM。從Qiagen(Hilden，德國(guó))購(gòu)買(mǎi)QIAprep旋轉(zhuǎn)(spin)小量制備試劑盒、Qiagen質(zhì)粒小量制備試劑盒和QIAquick PCR純化試劑盒。由Lofstrand Labs有限公司(Gaithersburg，MD)合成PCR引物。由Bio-SynthesisInc.(LewisVille，TX)合成寡肽。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等，Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))或根據(jù)制造商提供的方案，進(jìn)行所有的DNA操作，諸如質(zhì)粒分離、限制酶酶切消化、DNA連接和PCR。實(shí)施例3-hrpN基因的片段化經(jīng)PCR產(chǎn)生一系列的N端和C端截短的hrpN基因以及內(nèi)部片段(圖1)。將全長(zhǎng)hrpN基因用作DNA模板，設(shè)計(jì)用于每個(gè)截短的克隆的3’引物和5’引物(圖2)。3’引物包含一個(gè)含有起始密碼子ATG(甲硫氨酸)的NdeI酶切割位點(diǎn)，而5’引物包含終止密碼子TAA和一個(gè)用于連接到pET28(b)載體中的HindIII酶切割位點(diǎn)。在GeneAmpTM9700(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City CA)、0.5ml管中進(jìn)行PCR。將45μlSupermixTM(Life Technology，Gaithersburg，MD)與20pmoles每對(duì)DNA引物、10ng全長(zhǎng)harpin DNA和去離子H2O混合至終體積50μl。將混合物于95℃加熱2分鐘后，于94℃持續(xù)1分鐘、58℃持續(xù)1分鐘和72℃持續(xù)1.5分鐘，進(jìn)行PCR30次循環(huán)(cycles)。在6％TBE凝膠(Novex，San Diego，CA)上證實(shí)該P(yáng)CR產(chǎn)物。將擴(kuò)增的DNA用QIAquick PCR純化試劑盒純化，于37℃用Nde I和Hind III消化5小時(shí)，用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶25∶1)抽提一次然后用乙醇沉淀。將5μg pET28(b)載體DNA用15單位的Nde I和20單位的Hind III于37℃消化3小時(shí)，然后用CIAP處理以減少由不完全單個(gè)酶消化所產(chǎn)生的背景。將消化的載體DNA用QIAquick PCR純化試劑盒純化，然后直接用于連接。在含有約200ng消化的pET28(b)、30ng定向(targeted)PCR片段和1單位T4DNA連接酶的15ul混合物中、于14-16℃進(jìn)行5-12小時(shí)的連接反應(yīng)。將5-7.5μl連接溶液加入到15ml Falcon管中的100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后于冰上培育30分鐘。于42℃熱激45秒后，將0.9mlSOC溶液或0.45ml LB培養(yǎng)基加入到每支管中，然后于37℃溫育1小時(shí)。將20ul、100μl和200μl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞加到含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上，然后于37℃溫育過(guò)夜。將單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到3ml LB培養(yǎng)基上，然后于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用QIAprep小量制備試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany)從2ml培養(yǎng)物中制備質(zhì)粒DNA。將得自所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA經(jīng)限制酶消化分析或部分測(cè)序以證實(shí)所述成功轉(zhuǎn)化。采用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，將含有目的DNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到BL21菌株中。產(chǎn)生作為陽(yáng)性對(duì)照的pET28(b)載體中的含有全長(zhǎng)harpin蛋白的克隆，而產(chǎn)生作為陰性對(duì)照的僅含有pET28(b)載體的克隆。實(shí)施例4-過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的表達(dá)將含有所述hrpN克隆的大腸桿菌BL21(DE3)菌株在含有30μg/ml卡那霉素的Luria肉湯培養(yǎng)基(5g/L Difco酵母提取物、10g/L Difco胰蛋白胨、5g/L NaCl和1mM NaOH)中，于37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。然后將所述細(xì)菌接種到100倍體積的相同培養(yǎng)基中，于37℃生長(zhǎng)至0.6-0.8的OD620。然后將所述細(xì)菌接種到250倍體積的相同培養(yǎng)基中，于37℃生長(zhǎng)至約0.3或0.6-0.8的OD620。然后加入1mM IPTG，并將培養(yǎng)物于19℃生長(zhǎng)過(guò)夜(約18小時(shí))。采用該策略不能將所有的所述克隆成功地表達(dá)。有幾個(gè)克隆不得不生長(zhǎng)于Temfic肉湯(12g/L細(xì)菌用胰蛋白胨、24g/L細(xì)菌用酵母、0.4％甘油、0.17M KH2PO4、0.72K2HPO4)中，和/或IPTG誘導(dǎo)后于37℃生長(zhǎng)，和/或早于過(guò)夜時(shí)收獲(表1)。
表1過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的表達(dá)
實(shí)施例5-過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的小規(guī)模純化(證實(shí)表達(dá))將50ml hrpN克隆的培養(yǎng)物如上生長(zhǎng)以誘導(dǎo)表達(dá)所述截短的蛋白。在收獲所述培養(yǎng)物后，將1.5ml所述細(xì)胞懸浮液于14,000rpm離心5分鐘，再次懸浮于尿素裂解緩沖液(8M尿素、0.1M Na2HPO4和0.01M Tris-pH8.0)中，于室溫下溫育10分鐘，然后再次于14,000rpm離心10分鐘，然后保存所述上清液。將平衡的(His)6-結(jié)合鎳瓊脂糖樹(shù)脂的50％漿液的50μl等份樣品加入到所述上清液中，于4℃混合1小時(shí)。然后將鎳瓊脂糖用尿素洗滌緩沖液(8M尿素、0.1M Na2HPO4和0.01M Tris--pH6.3)洗滌三次，在洗滌之間于5,000rpm離心5分鐘。用50μl尿素洗脫緩沖液(8M尿素、0.1M Na2HPO4、0.01M Tris和0.1M EDTA--pH6.3)，將所述蛋白從該樹(shù)脂中洗脫下來(lái)。根據(jù)所述截短的蛋白的大小，將所述洗脫物在4-20％、16％或10-20％Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠上電泳，以證實(shí)所述表達(dá)。實(shí)施例6-煙草HR的誘導(dǎo)將生長(zhǎng)用于小規(guī)模純化所述截短的蛋白的50ml培養(yǎng)物中的1.5ml等份樣品，于14,000rpm離心4分鐘，再次懸浮于等體積的5mM、pH6.8的磷酸鉀緩沖液中。將所述細(xì)胞懸浮液超聲處理約30秒，然后用磷酸鉀緩沖液以1∶2和1∶10稀釋。通過(guò)在單個(gè)葉片中磨一個(gè)洞，將兩種稀釋物加凈細(xì)胞裂解物浸潤(rùn)10-15片葉的煙草植株的第4至第9片葉，并采用無(wú)針頭的注射器將所述細(xì)菌裂解物浸潤(rùn)到葉片胞間隙中。浸潤(rùn)后24-48小時(shí)，記錄HR反應(yīng)。將煙草(Nicotiana tabacum v.Xanthi)幼苗于20-25℃的環(huán)境溫度、光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗和約40％RH下生長(zhǎng)。因?yàn)樾∫?guī)模尿素純化產(chǎn)生非常少的由于純化過(guò)程引起的變性的蛋白，所以將細(xì)胞裂解物用于最初HR測(cè)定(以篩選HR活性的截短的蛋白)。實(shí)施例7-用于綜合生物活性測(cè)定的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的大規(guī)模天然純化如先前所述，培育6瓶500ml hrpN克隆的培養(yǎng)物以誘導(dǎo)表達(dá)所述截短的蛋白。在收獲所述培養(yǎng)物后，將所述細(xì)胞于7,000rpm離心5分鐘，再次懸浮于咪唑裂解緩沖液(5mM咪唑、0.5MNaCl和20mMTris)加0.05％Triton X-100和0.1mg/ml溶菌酶中，于30℃溫育10分鐘，超聲處理2分鐘，再次于15,000rpm離心20分鐘，然后保存所述上清液。將平衡的(His)6-結(jié)合鎳瓊脂糖樹(shù)脂的50％液漿的4ml等份樣品加入到所述上清液中，于4℃混合約4小時(shí)。然后將鎳瓊脂糖用咪唑洗滌緩沖液(20mM咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris)洗滌三次，在洗滌之間于5,000rpm離心5分鐘，然后置于一次性層析柱中。將所述層析柱于1100rpm離心1分鐘以去除任何殘余的洗滌緩沖液，然后經(jīng)將所述柱和洗脫緩沖液一起于室溫下溫育10分鐘，然后于1100rpm將所述柱離心1分鐘，用4ml咪唑洗脫緩沖液(1M咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris)，將所述蛋白從該樹(shù)脂中洗脫下來(lái)。根據(jù)所述截短的蛋白的大小，將所述洗脫物在4-20％、16％或10-20％Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠上電泳，以證實(shí)所述表達(dá)。經(jīng)將所述蛋白條帶與Mark 12分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比較，確定所述蛋白的濃度。實(shí)施例8-用于綜合生物活性測(cè)定的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的大規(guī)模尿素純化本方法與上述大規(guī)模天然純化的方法相同，只是使用尿素裂解液、尿素洗滌緩沖液和尿素洗脫緩沖液，并且所述細(xì)胞不像上述天然純化一樣超聲處理。純化后，先經(jīng)8小時(shí)內(nèi)對(duì)越來(lái)越低濃度的尿素透析，然后經(jīng)對(duì)10mM Tris/20mM NaCl透析過(guò)夜，將所述蛋白復(fù)性。所述復(fù)性過(guò)程引起N端蛋白沉淀。將所述沉淀的1-168蛋白經(jīng)加入100mM Tris-HCl、pH10.4溶解，然后于30℃將所述蛋白加熱約1小時(shí)。經(jīng)將所述蛋白條帶與Mark 12分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶相比較，確定所述蛋白的濃度。采用該策略，沒(méi)有成功地溶解1-75和1-104蛋白片段，所以將它們?cè)?00mM Tris-HCl、pH10.4中超聲處理以盡可能地溶解多的所述蛋白，并暴露所述蛋白的活性位點(diǎn)用于生物活性測(cè)定。實(shí)施例9-生長(zhǎng)促進(jìn)作用(GE)的誘導(dǎo)將60粒番茄(Lycopersicon spp.cv.Marglobe)種子在用5mM磷酸鉀緩沖液、pH6.8稀釋的10μg/ml和20μg/ml所述截短的蛋白中浸泡過(guò)夜。第二天早上，將所述60粒種子播種于3個(gè)盆中，12-15天后以及18-20天后，測(cè)量每盆10株最高番茄植株的高度，并與只用磷酸鹽緩沖液處理的對(duì)照植株的高度相比較。在高度方面進(jìn)行分析以確定用所述截短的蛋白處理的植株的高度與所述緩沖液對(duì)照的植株的高度相比是否存在顯著的差異，從而確定是否所述蛋白誘導(dǎo)生長(zhǎng)促進(jìn)作用。實(shí)施例10-系統(tǒng)獲得抗性(SAR)的誘導(dǎo)將具有8-12片葉的3株煙草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)植株(約75天的植株)用于所述測(cè)定。將所述煙草植株的其中一片葉蓋住，其余的葉片用約50ml的5mM磷酸鉀緩沖液稀釋的20μg/ml所述截短的蛋白溶液噴灑。5-7天后，將2片葉(未噴灑的葉片以及與之相反的剛好在噴灑的葉片上面的噴灑葉片)用1.8μg/ml TMV的20μl溶液及一撮硅藻土接種，即通過(guò)用所述混合物沿所述葉片的上表面磨擦來(lái)接種。TMV通過(guò)硅藻土形成的極微小的損傷進(jìn)入該植株中。TMV接種后約3-4天，將該兩片葉子上的病斑數(shù)目與陰性對(duì)照緩中液的處理葉片上的病斑數(shù)目相比較，計(jì)數(shù)TMV病斑的數(shù)目。通過(guò)與所述緩沖液對(duì)照相比較，進(jìn)行分析以確定由該蛋白片段減少TMV病斑數(shù)目的效能。計(jì)算效能的百分率為T(mén)MV病斑減少(％效能)＝100×(1-處理葉片上病斑的平均數(shù)/緩沖液對(duì)照葉片上病斑的平均數(shù))。實(shí)施例11-過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的表達(dá)進(jìn)行所述片段蛋白的小規(guī)模表達(dá)和純化以篩選表達(dá)和HR活性(表2)。
表2過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的表達(dá)和HR活性(小規(guī)模篩選)
所有的所述克隆的片段蛋白都以變化的水平表達(dá)，只是三條小片段(氨基酸169-209、150-209和150-180)除外。片段210-403和267-403表達(dá)得非常好，從小規(guī)模純化中產(chǎn)生高濃度的蛋白，在SDS凝膠電泳上出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。其它片段(諸如氨基酸1-168和1-104)產(chǎn)生少得多的蛋白，在電泳上出現(xiàn)模糊的蛋白條帶。難以確定是否表達(dá)片段343-403，即最小的C端蛋白，因?yàn)樵谒瞿z上除懷疑的343-403蛋白之外有幾種明顯的背景蛋白。，測(cè)試分別包含所述全長(zhǎng)過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白及僅包含背景蛋白的陽(yáng)性對(duì)照蛋白和陰性對(duì)照蛋白的表達(dá)以及HR活性。
進(jìn)行所述片段蛋白的大規(guī)模表達(dá)和純化以確定表達(dá)水平和HR活性的效價(jià)(表3)。
表3過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子截短的蛋白的表達(dá)水平和HR效價(jià)(大規(guī)模純化)
選擇在鑒定過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子中認(rèn)為是最重要的所述截短的蛋白用于大規(guī)模表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照(全長(zhǎng)過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子)以3.7mg/ml相對(duì)高水平表達(dá)。所有所述C端蛋白以2-5mg/ml相對(duì)高水平表達(dá)，只是如先前所討論的片段343-403除外。所述N端片段也表達(dá)得非常好；然而，在純化過(guò)程期間，所述蛋白沉淀并且很少再溶解。表3中的所述濃度只反映了所述溶解的蛋白。所述內(nèi)部片段在2-3.6mg/ml的范圍內(nèi)表達(dá)。極難以確定片段105-168的濃度(據(jù)估計(jì)所述濃度可能比所示的高得多)，因?yàn)镾DS凝膠上的蛋白條帶為大片段，但染色很淺。所述陰性對(duì)照包含如預(yù)期的幾種背景蛋白，但沒(méi)有明顯地誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)蛋白。實(shí)施例12-煙草HR的誘導(dǎo)所述全長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照蛋白少至僅5-7μg/ml的就誘發(fā)HR。只包含背景蛋白的所述陰性對(duì)照(pET28)咪唑純化“蛋白”少至1∶2稀釋度誘發(fā)HR反應(yīng)，將該測(cè)定的敏感性降低為1∶1和1∶2稀釋度，不能使用該蛋白。這種假HR可能由于純化過(guò)程中所用的咪唑結(jié)合一種或幾種背景蛋白的親和性、從而不完全被透析出引起。約60mM濃度的咪唑就誘發(fā)假HR反應(yīng)。
包括來(lái)自氨基酸137-180(SEQ.ID.No.23)，僅僅44個(gè)氨基酸蛋白的小的內(nèi)部區(qū)域的一個(gè)決定性結(jié)構(gòu)域(definitive domain)鑒定為最小的HR結(jié)構(gòu)域。其它潛在的結(jié)構(gòu)域認(rèn)為是位于來(lái)自氨基酸1-104(可能氨基酸1-75)(SEQ.ID.No.23)的該蛋白的N端。由于在純化這些片段蛋白中遇到的困難引起的，難以證實(shí)或縮小N端HR結(jié)構(gòu)域。因?yàn)楫?dāng)采用天然純化過(guò)程時(shí)沒(méi)有回收到蛋白，所述N端片段蛋白不得不用尿素純化。因此，這些蛋白在復(fù)性過(guò)程期間沉淀，難以或幾乎不可能再溶于溶液，從而使該蛋白難以通過(guò)HR測(cè)定，因?yàn)橹挥锌扇艿牡鞍啄苷T發(fā)HR?？s小N端HR結(jié)構(gòu)域的困難只是由于以下事實(shí)構(gòu)成陰性對(duì)照在低稀釋水平時(shí)誘發(fā)假HR，從而降低了所述測(cè)定的敏感性。
意料不到的是，如果在氨基酸168和169(片段76-168和105-168)(SEQ.ID.No.23)之間，將所述內(nèi)部HR結(jié)構(gòu)域切割，則所述片段喪失其HR活性。這表明，片段1-168(SEQ.ID.No.23)的HR活性不應(yīng)歸因于所述內(nèi)部HR結(jié)構(gòu)域，而是歸因于某些其它結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致設(shè)想可能在所述蛋白的N端區(qū)域發(fā)現(xiàn)第二個(gè)HR結(jié)構(gòu)域。然而，如先前所討論的，難以證實(shí)該設(shè)想。
過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子C端(氨基酸210-403(SEQ.ID.No.23))不含有HR結(jié)構(gòu)域。采用目前的HR測(cè)定，在可檢測(cè)水平上它不誘發(fā)HR。甚至大的得自氨基酸169-403(SEQ.ID.No.23)的C端片段也不誘發(fā)HR，盡管它包含部分內(nèi)部HR結(jié)構(gòu)域。如上所述，在氨基酸168和169(SEQ.ID.No.23)之間切割蛋白引起HR活性的喪失。
因?yàn)槟承┚哂?1個(gè)氨基酸或更少的小的克隆的蛋白不表達(dá)，合成具有30個(gè)氨基酸的幾種寡肽以縮小內(nèi)部HR結(jié)構(gòu)域的功能區(qū)域。在氨基酸121-179(SEQ.ID.No.23)范圍內(nèi)合成所述寡肽。然而，這些寡肽不誘發(fā)HR。預(yù)期寡肽137-166、121-150和137-156(SEQ.ID.No.23)可能誘發(fā)HR，因?yàn)檫@些片段不包含必不可少的氨基酸168和169(SEQ.ID.No.23)。預(yù)期寡肽150-179(SEQ.ID.No.23)可能誘發(fā)HR?？赡苁?0個(gè)氨基酸對(duì)于所述蛋白而言太小，以致不能誘發(fā)任何活性，因?yàn)槿狈φ郫B并因此缺乏結(jié)合；或者可能是在合成所述肽期間，失去了重要的氨基酸(或者在所述過(guò)程中或者僅因?yàn)檫x擇哪30個(gè)氨基酸進(jìn)行合成)，因此，所述片段將不能誘發(fā)HR。實(shí)施例13-植物生長(zhǎng)促進(jìn)作用(PGE)的誘導(dǎo)所述C端片段將番茄生長(zhǎng)增強(qiáng)9％至21％。所述N端片段將番茄生長(zhǎng)增強(qiáng)4％至13％。所述內(nèi)部片段將生長(zhǎng)增強(qiáng)9％至20％。76-209片段在濃度60μg/ml下將生長(zhǎng)增強(qiáng)18％，但在通常20μg/ml下不促進(jìn)生長(zhǎng)。這歸因于所述定量過(guò)程的不精確性(表4)。
表4
*高于所述緩沖液對(duì)照10％以上的株高必需通過(guò)PGE測(cè)定所述寡肽將生長(zhǎng)增強(qiáng)從7.4％至17.3％(表5)。
表5
所述數(shù)據(jù)表明，有超過(guò)一個(gè)的PGE結(jié)構(gòu)域存在，盡管所述C端結(jié)構(gòu)域和內(nèi)部結(jié)構(gòu)域看來(lái)比所述N端結(jié)構(gòu)域占優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鯪端片段最低數(shù)量促進(jìn)生長(zhǎng)。實(shí)施例14-系統(tǒng)獲得抗性(SAR)的誘導(dǎo)迄今所測(cè)試的所有所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子片段看來(lái)都具有60％效能或更高，只是寡肽137-156除外(表5和6)。
表6
這些數(shù)據(jù)表明在所述蛋白內(nèi)有多個(gè)SAR結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例15-HR、PGE和SAR之間的關(guān)系顯然，所述過(guò)敏反應(yīng)活性可與所述植物生長(zhǎng)促進(jìn)活性分離。所述C端片段在濃度只有20μg/ml時(shí)就明顯地促進(jìn)番茄生長(zhǎng)約20％，但這些相同片段甚至在高于200μg/ml濃度也不能誘發(fā)煙草HR。SAR活性也看來(lái)可與HR活性分離。該發(fā)現(xiàn)對(duì)將來(lái)在過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子技術(shù)的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用方面的工作是非常重要的。誘導(dǎo)PGE和/或SAR但不誘發(fā)HR的所述片段對(duì)該技術(shù)是必不可少的，因?yàn)榧词沟退紿R激發(fā)子的組成型表達(dá)也可能殺傷植物。實(shí)施例16-得自丁香假單胞菌丁香致病變種的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子不誘發(fā)HR的片段在煙草中誘導(dǎo)對(duì)TMV的抗病性以及促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)為了測(cè)試得自HrpZ—來(lái)自丁香假單胞菌丁香致病變種的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的不誘發(fā)HR的片段是否能夠誘導(dǎo)抗病性，制備幾種片段構(gòu)成物并測(cè)試表達(dá)的片段蛋白在煙草中的HR誘發(fā)和抗病性誘導(dǎo)以及番茄中的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。
采用Pfu Turbo(Stratagene)，經(jīng)PCR擴(kuò)增hrpZ—編碼來(lái)自丁香假單胞菌丁香致病變種過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的基因的以下區(qū)段編碼氨基酸152-190、氨基酸152-294、氨基酸190-294、氨基酸301-341和全長(zhǎng)HrpZ(氨基酸1-341)的區(qū)域。將所述DNA片段克隆到pCAL-n(Stratagene)中以產(chǎn)生鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽的C端融合蛋白。選擇pCAL-n，因?yàn)樗鋈诤系鞍啄軌蛉菀椎睾驮阝}調(diào)蛋白樹(shù)脂上溫和純化。將所述DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，并鑒定出正確克隆。然后將所述克隆轉(zhuǎn)移到大腸桿菌BLR DE3中用于蛋白表達(dá)。將所述細(xì)菌生長(zhǎng)于Terrific肉湯中至0.8-1.0的OD620。然后用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并將所述細(xì)菌再培育3小時(shí)。所有的HrpZ片段都能以這種方法表達(dá)。
挑選氨基酸片段152-294和190-294用于進(jìn)一步的分析和鑒定。預(yù)期片段152-294包含一個(gè)誘發(fā)HR的結(jié)構(gòu)域，而片段190-294不含誘發(fā)HR的結(jié)構(gòu)域。將所述培養(yǎng)物離心，然后將所述細(xì)菌再懸浮于40ml、10mM Tris pH8.0中。加入20μl消泡劑和40μl、200mM PMSF，并將所述細(xì)菌超聲處理以破碎細(xì)胞。經(jīng)離心去除細(xì)菌碎片，然后將所述上清液在沸水浴中放置10分鐘。經(jīng)離心去除所述沉淀，并保留所述上清液—一種粗蛋白制劑用于測(cè)試。
15μl每種上清液于凝膠上電泳并染色以確定所述蛋白是否存在。據(jù)估計(jì)152-294片段比190-294片段存在的量約多5倍。將每種制劑的幾種稀釋液浸潤(rùn)兩株煙草植株的葉片用于HR測(cè)試(表7)。如表7中所示，152-294片段誘發(fā)HR，而190-294片段不誘發(fā)HR。
表7HrpZ片段的HR測(cè)試結(jié)果HrDZ片段 片段制劑的稀釋度a1∶21∶51∶251∶125152-294 +，+b+，++，+ -，-190-294 -，--，--，- -，-a用MilliQ水稀釋所述制劑。b結(jié)果表示兩株植物的每株。+，HR；-，無(wú)HR.
然后將所述片段制劑測(cè)試誘導(dǎo)TMV抗病性以及生長(zhǎng)促進(jìn)作用。由于HrpZ片段濃度方面的差異，將152-294制劑稀釋40倍，而將190-294制劑稀釋8倍。結(jié)果顯示，與緩沖液對(duì)照相比，190-294氨基酸片段將TMV病斑的數(shù)目減少了85％(表8)。相比之下，152-294氨基酸片段將TMV病斑的數(shù)目只減少了55％。也如表8中所示，用152-294氨基酸片段處理的植物比用緩沖液處理的植物生長(zhǎng)多4.64％，而用190-294氨基酸片段處理的植物比用緩沖液處理的植物生長(zhǎng)多2.62％。
表8HR試驗(yàn)、TMV和PGE試驗(yàn)結(jié)果HrpZ片段 HR誘發(fā)作用aTMV(％效能)bPGE(％＞緩沖液ht)c152-294 + 54.64 4.64190-294 - 85.25 2.62a+，煙草葉片中誘發(fā)HR；-，煙草葉片中無(wú)HR。b未噴灑的煙草葉片中的TMV病斑減少的％。c比緩沖液噴灑的植物高度多的％。
這些試驗(yàn)結(jié)果顯示，氨基酸152-294看來(lái)參與HR誘發(fā)作用，因?yàn)樗鼈兊娜コ苏T發(fā)HR的能力。這兩種片段制劑實(shí)現(xiàn)病害防治和生長(zhǎng)促進(jìn)作用。因此，誘發(fā)HR的能力不是TMV感染減弱和生長(zhǎng)促進(jìn)作用的決定性因素。實(shí)施例17-使用得自大雄疫霉的13個(gè)氨基酸的肽刺激番茄幼苗生長(zhǎng)歐芹葉片針對(duì)大豆病原體大雄疫霉產(chǎn)生一種典型的抗病反應(yīng)，包括過(guò)敏性細(xì)胞死亡、防衛(wèi)相關(guān)基因活化和植物保衛(wèi)素生成。幾年以前，將42kDa糖蛋白激發(fā)子從大雄疫霉真菌培養(yǎng)物濾液中純化(Parker等，“得自大雄疫霉大豆小種(Phytophthora megasperma f.sp.glycinea)的胞外糖蛋白誘發(fā)培養(yǎng)的歐芹細(xì)胞和原生質(zhì)體中的植物保衛(wèi)素合成，”Mol.Plant Microbe Interact.419-27(1991)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。然后，13個(gè)氨基酸的寡肽鑒定為包含在42kDa糖蛋白內(nèi)。這13個(gè)氨基酸的肽看來(lái)具有與全長(zhǎng)糖蛋白(42kDa)相似的生物活性。在歐芹細(xì)胞中它足夠誘發(fā)復(fù)雜的防衛(wèi)反應(yīng)，包括H＋/Ca2＋流入、K＋/Cl-流出、活性氧產(chǎn)生、SAR基因誘導(dǎo)和植物保衛(wèi)素化合物累積(Nurnberger等，“真菌寡肽激發(fā)子對(duì)歐芹質(zhì)膜的高親和性結(jié)合觸發(fā)多種防衛(wèi)反應(yīng)，”Cell 78449-460(1994)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。
為了測(cè)試得自42kDa蛋白的13個(gè)氨基酸的肽是否也促進(jìn)植物生長(zhǎng)，由Biosynthesis公司合成20mg所述寡肽。該合成的肽序列為NH2-Val-Trp-Asn-Gln-Pro-Val-Arg-Gly-Phe-Lys-Val-Tyr-Glu-COOH(SEQ.ID.No.39)。將所合成的肽重新懸浮于10ml、5mM磷酸鉀緩沖液中，然后用相同的緩沖液稀釋至1ng/ml和100ng/ml。將100粒番茄種子(品種，Marglobe)在20ml肽溶液中浸泡過(guò)夜。將浸泡過(guò)的種子播種于裝有人工土壤的8英寸盆中。將浸泡在沒(méi)有所述肽的緩沖液中的種子用作對(duì)照。在幼苗出土和首先兩片真葉完全擴(kuò)展開(kāi)后，記錄番茄幼苗的高度。在煙草和其它試驗(yàn)的植物中，所述肽不能誘發(fā)HR。然而，它對(duì)植物生長(zhǎng)促進(jìn)作用具有很大影響。表9顯示，用所述肽處理的番茄幼苗在高度方面增加了12.6％，表明得自42kDa糖蛋白的真菌肽可以促進(jìn)番茄幼苗生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究表明，所述肽在其它作物包括煙草中也具有相似的生長(zhǎng)效應(yīng)。用所述肽溶液噴灑植物獲得相似的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。
表9處理 幼苗高度(cm) 平均(cm)變化％緩沖液 6.0 6.0 6.0 5.5 5.5 5.55 -5.5 5.5 5.0 5.0 5.5肽溶液(100ng/ml)6.5 6.0 6.5 6.5 6.5 6.25 12.66.0 6.0 6.0 6.0 6.5盡管為了說(shuō)明在細(xì)節(jié)上已經(jīng)描述了本發(fā)明，不用說(shuō)這種細(xì)節(jié)僅為了該目的，而在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在其中進(jìn)行變化，本發(fā)明的精神和范圍由以下權(quán)利要求書(shū)限定。
序列表<110>Eden Bioscienoe Corporation<120>有活性但不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子片段<130>21829/34<140><141><150>60/103,050<151>1998-10-05<160>39<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>1gggaattcat atgagtctga atacaagtgg g 31<210>2<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>2gggaattcat atgggcggtg gcttaggcggt31<210>3<211>29<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>3ggcatatgtc gaacgcgctg aacgatatg 29<210>4<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>4gggaattcat atgttaggcg gttcgctgaa c31<210>5<211>29<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>5ggcatatgct gaacacgctg ggctcgaaa 29<210>6<211>29<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>6ggcatatgtc aacgtcccaa aacgacgat 29<210>7<211>27<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>7ggcatatgtc cacctcagac tccagcg 27<210>8<211>34<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>8gggaattcat atgcaaagcc tgtttggtga tggg 34<210>9<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>9gggaattcat atgggtaatg gtctgagcaa g31<210>10<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>10gggaattcat atgaaagcgg gcattcaggc g31<210>11<211>34<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>11gggaattcat atgacaccag ccagtatgga gcag 34<210>12<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>12gcaagcttaa cagcccacca ccgcccatca t31<210>13<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>13gcaagcttaa atcgttcagc gcgttcgaca g31<210>14<211>34<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>14gcaagcttaa tatctcgctg aacatcttca gcag 34<210>15<211>30<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>15gcaagcttaa ggtgccatct tgcccatcac 30<210>16<211>34<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>16gcaagcttaa atcagtgact ccttttttat aggc 34<210>17<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>17gcaagcttaa caggcccgac agcgcatcag t31<210>18<211>31<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>18gcaagcttaa accgataccg gtacccacgg c31<210>19<211>34<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>19gcaagcttaa tccgtcgtca tctggcttgc tcag 34<210>20<211>25<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>20gcaagcttaa gccgcgccca gcttg 25<210>21<211>338<212>PRT<213>菊歐文氏菌<400>21Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser15 10 15Gly Leu Gly Ala Gin Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala<210>22<21l>2l 4l<212>DNA<213>菊歐文氏菌<400>22cgattttacc cgggtgaacg tgctatgacc gacagcatca cggtattcga caccgttacg60gcgtttatgg ccgcgatgaa ccggcatcag gcggcgcgct ggtcgccgca atccggcgtc 120gatctggtat ttcagtttgg ggacaccggg cgtgaactca tgatgcagat tcagccgggg 180cagcaatatc ccggcatgtt gcgcacgctg ctcgctcgtc gttatcagca ggcggcagag 240tgcgatggct gccatctgtg cctgaacggc agcgatgtat tgatcctctg gtggccgctg 300ccgtcggatc ccggcagtta tccgcaggtg atcgaacgtt tgtttgaact ggcgggaatg 360acgttgccgt cgctatccat agcaccgacg gcgcgtccgc agacagggaa cggacgcgcc 420cgatcattaa gataaaggcg gcttttttta ttgcaaaacg gtaacggtga ggaaccgttt 480caccgtcggc gtcactcagt aacaagtatc catcatgatg cctacatcgg gatcggcgtg 540ggcatccgtt gcagatactt ttgcgaacac ctgacatgaa tgaggaaacg aaattatgca 600aattacgatc aaagcgcaca tcggcggtga tttgggcgtc tccggtctgg ggctgggtgc 660tcagggactg aaaggactga attccgcggc ttcatcgctg ggttccagcg tggataaact 720gagcagcacc atcgataagt tgacctccgc gctgacttcg atgatgtttg gcggcgcgct 780ggcgcagggg ctgggcgcca gctcgaaggg gctggggatg agcaatcaac tgggccagtc 840tttcggcaat ggcgcgcagg gtgcgagcaa cctgctatcc gtaccgaaat ccggcggcga 900tgcgttgtca aaaatgtttg ataaagcgct ggacgatctg ctgggtcatg acaccgtgac 960caagctgact aaccagagca accaactggc taattcaatg ctgaacgcca gccagatgac 1020ccagggtaat atgaatgcgt tcggcagcgg tgtgaacaac gcactgtcgt ccattctcgg 1080caacggtctc ggccagtcga tgagtggctt ctctcagcct tctctggggg caggcggctt 1140gcagggcctg agcggcgcgg gtgcattcaa ccagttgggt aatgccatcg gcatgggcgt 1200ggggcagaat gctgcgctga gtgcgttgag taacgtcagc acccacgtag acggtaacaa 1260ccgccacttt gtagataaag aagatcgcgg catggcgaaa gagatcggcc agtttatgga 1320tcagtatccg gaaatattcg gtaaaccgga ataccagaaa gatggctgga gttcgccgaa 1380gacggacgac aaatcctggg ctaaagcgct gagtaaaccg gatgatgacg gtatgaccgg 1440cgccagcatg gacaaattcc gtcaggcgat gggtatgatc aaaagcgcgg tggcgggtga 1500taccggcaat accaacctga acctgcgtgg cgcgggcggt gcatcgctgg gtatcgatgc 1560ggctgtcgtc ggcgataaaa tagccaacat gtcgctgggt aagctggcca acgcctgata 1620atctgtgctg gcctgataaa gcggaaacga aaaaagagac ggggaagcct gtctcttttc 1680ttattatgcg gtttatgcgg ttacctggac cggttaatca tcgtcatcga tctggtacaa 1740acgcacattt tcccgttcat tcgcgtcgtt acgcgccaca atcgcgatgg catcttcctc 1800gtcgctcaga ttgcgcggct gatggggaac gccgggtgga atatagagaa actcgccggc 1860cagatggaga cacgtctgcg ataaatctgt gccgtaacgt gtttctatcc gcccctttag 1920cagatagatt gcggtttcgt aatcaacatg gtaatgcggt tccgcctgtg cgccggccgg 1980gatcaccaca atattcatag aaagctgtct tgcacctacc gtatcgcggg agataccgac 2040aaaatagggc agtttttgcg tggtatccgt ggggtgttcc ggcctgacaa tcttgagttg 2100gttcgtcatc atctttctcc atctgggcga cctgatcggt t 2141<210>23<21l>403<212>PRT<213>解淀粉歐文氏菌<400>23Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gin Ala Arg Gly Ala Gly Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asp370 375 380Ala Met Met Ala Gly Asp Ala Ile Asn Asn Met Ala Leu Gly Lys Leu385 390 395 400Gly Ala Ala<210>24<211>1288<212>DNA<213>解淀粉歐文氏菌<400>24aagcttcggc atggcacgtt tgaccgttgg gtcggcaggg tacgtttgaa ttattcataa 60gaggaatacg ttatgagtct gaatacaagt gggctgggag cgtcaacgat gcaaatttct 120atcggcggtg cgggcggaaa taacgggttg ctgggtacca gtcgccagaa tgctgggttg 180ggtggcaatt 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aatcattgag 180gctgacccac aaacttcaat aaccctgtat tcgatgctat tacagotgaa ttttgaaatg 240gcggccatgc goggctgttg gctggcgctg gatgaactgc acaacgtgcg tttatgtttt 300cagcagtcgc tggagcatct ggatgaagca agttttagcg atatcgttag cggcttcatc 360gaacatgcgg cagaagtgcg tgagtatata gcgcaattag acgagagtag cgcggcataa 420<210>30<211>139<212>PRT<213>解淀粉歐文氏菌<400>30Met Thr Ser Ser Gln Gln Arg Val Glu Arg Phe Leu Gln Tyr Phe Ser1 5 10 15Ala Gly Cys Lys Thr Pro Ile His Leu Lys Asp Gly Val Cys Ala Leu20 25 30Tyr Asn Glu Gln Asp Glu Glu Ala Ala Val Leu Glu Val Pro Gln His35 40 45Ser Asp Ser Leu Leu Leu His Cys Arg Ile Ile Glu Ala Asp Pro Gln50 55 60Thr Ser Ile Thr Leu Tyr Ser Met Leu Leu Gln Leu Asn Phe Glu Met65 70 75 80Ala Ala Met Arg Gly Cys Trp Leu Ala Leu Asp Glu Leu His Asn Val85 90 95Arg Leu Cys Phe Gln Gln Ser Leu Glu His Leu Asp Glu Ala Ser Phe100 105 110Ser Asp Ile Val Ser Gly Phe Ile Glu His Ala Ala Glu Val Arg Glu115 120 125Tyr Ile Ala Gln Leu Asp Glu Ser Ser Ala Ala130 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Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Va1 Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340<210>32<211>1026<212>DNA<213>丁香假單胞菌<400>32atgcagagtc tcagtcttaa cagcagctcg ctgcaaaccc cggcaatggc ccttgtcctg 60gtacgtcctg aagccgagac gactggcagt acgtcgagca aggcgcttca ggaagttgtc 120gtgaagctgg ccgaggaact gatgcgcaat ggtcaactcg acgacagctc gccattggga 180aaactgttgg ccaagtcgat ggccgcagat ggcaaggcgg gcggcggtat tgaggatgtc 240atcgctgcgc tggacaagct gatccatgaa aagctcggtg acaacttcgg cgcgtctgcg 300gacagcgcct cgggtaccgg acagcaggac ctgatgactc aggtgctcaa tggcctggcc 360aagtcgatgc tcgatgatct tctgaccaag caggatggcg ggacaagctt ctccgaagac 420gatatgccga tgctgaacaa gatcgcgcag ttcatggatg acaatcccgc acagtttccc 480aagccggact cgggctcctg ggtgaacgaa ctcaaggaag acaacttcct tgatggcgac 540gaaacggctg cgttccgttc ggcactcgac atcattggcc agcaactggg taatcagcag 600agtgacgctg gcagtctggc agggacgggt ggaggtctgg gcactccgag cagtttttcc 660aacaactcgt ccgtgatggg tgatccgctg atcgacgcca ataccggtcc cggtgacagc 720ggcaataccc gtggtgaagc ggggcaactg atcggcgagc ttatcgaccg tggcctgcaa 780tcggtattgg ccggtggtgg actgggcaca cccgtaaaca ccccgcagac cggtacgtcg 840gcgaatggcg gacagtccgc tcaggatctt gatcagttgc tgggcggctt gctgctcaag 900ggcctggagg caacgctcaa ggatgccggg caaacaggca ccgacgtgca gtcgagcgct 960gcgcaaatcg ccaccttgct ggtcagtacg ctgctgcaag gcacccgcaa tcaggctgca 1020gcctga1026<210>33<211>1729<212>DNA<213>丁香假單胞菌<400>33tccacttcgc tgattttgaa attggcagat tcatagaaac gttcaggtgt ggaaatcagg 60ctgagtgcgc agatttcgtt gataagggtg tggtactggt cattgttggt catttcaagg 120cctetgagtg cggtgcggag caataccagt cttcctgctg gcgtgtgcac actgagtcgc 180aggcataggc atttcagttc cttgcgttgg ttgggcatat aaaaaaagga acttttaaaa 240acagtgcaat gagatgecgg caaaacggga accggtcgct gcgctttgcc actcacttcg 300agcaagctca accccaaaca tccacatccc tatcgaacgg acagcgatac ggccacttgc 360tctggtaaac cctggagctg gcgtcggtcc aattgcccac ttagcgaggt aacgcagcat 420gagcatcggc atcacacccc ggccgcaaca gaccaccacg ccactcgatt tttcggcgct 480aagcggcaag agtcctcaac caaacacgtt cggcgagcag aacactcagc aagcgatcga 540cccgagtgca ctgttgttcg gcagcgacac acagaaagac gtcaacttcg gcacgcccga 600cageaccgtc cagaatccgc aggacgccag caagcccaac gacagccagt ccaacatcgc 660taaattgatc agtgcattga tcatgtcgtt gctgcagatg ctcaccaact ccaataaaaa 720gcaggacacc aatcaggaac agcctgatag ccaggctcct ttccagaaca acggcgggct 780cggtacaccg tcggccgata gcgggggcgg cggtacaccg gatgcgacag gtggcggcgg 840cggtgatacg ccaagcgcaa caggcggtgg cggcggtgat actccgaccg caacaggcgg 900tggcggcagc ggtggcggcg gcacacccac tgcaacaggt ggcggcagcg gtggcacacc 960cactgcaaca ggcggtggcg agggtggcgt aacaccgcaa atcactccgc agttggccaa 1020ccctaaccgt acctcaggta ctggctcggt gtcggacacc gcaggttcta ccgagcaagc 1080cggcaagatc aatgtggtga aagacaccat caaggtcggc gctggcgaag tctttgacgg 1140ccacggcgca accttcactg ccgacaaatc tatgggtaac ggagaccagg gcgaaaatca 1200gaagcccatg ttcgagctgg ctgaaggcgc tacgttgaag aatgtgaacc tgggtgagaa 1260cgaggtcgat ggcatccacg tgaaagccaa aaacgctcag gaagtcacca ttgacaacgt 1320gcatgcccag aacgtcggtg aagacctgat tacggtcaaa ggcgagggag gcgcagcggt 1380cactaatctg aacatcaaga acagcagtge caaaggtgca gacgacaagg ttgtccagct 1440caacgccaac actcacttga aaatcgacaa cttcaaggcc gacgatttcg gcacgatggt 1500tcgcaccaac ggtggcaagc agtttgatga catgagcatc gagctgaacg gcatcgaagc 1560taaccacggc aagttcgccc tggtgaaaag cgacagtgac gatctgaagc tggcaacggg 1620caacatcgcc atgaccgacg tcaaacacgc ctacgataaa acccaggcat cgacccaaca 1680caccgagctt tgaatccaga caagtagctt gaaaaaaggg ggtggactc 1729<210>34<211>424<212>PRT<213>丁香假單胞菌<400>34Met Ser Ile Gly Ile Thr Pro Arg Pro Gln Gln Thr Thr Thr Pro Leu1 5 10 15Asp Phe Ser Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Gln Pro Asn Thr Phe Gly20 25 30Glu Gln Asn Thr Gln Gln Ala Ile Asp Pro Ser Ala Leu Leu Phe Gly35 40 45Ser Asp Thr Gln Lys Asp Val Asn Phe Gly Thr Pro Asp Ser Thr Val50 55 60Gln Asn Pro Gln Asp Ala Ser Lys Pro Asn Asp Ser Gln Ser Asn Ile65 70 75 80Ala Lys Leu Ile Ser Ala Leu Ile Met Ser Leu Leu Gln Met Leu Thr85 90 95Asn Ser Asn Lys Lys Gln Asp Thr Asn Gln Glu Gln Pro Asp Ser Gln100 105 110Ala Pro Phe Gln Asn Asn Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ala Asp Ser115 120 125Gly Gly Gly Gly Thr Pro Asp Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr130 135 140Pro Ser Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Asp Thr Pro Thr Ala Thr Gly145 150 155 160Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly165 170 175Ser Gly Gly Thr Pro Thr Ala Thr Gly Gly Gly Glu Gly Gly Val Thr180 185 190Pro Gln Ile Thr Pro Gln Leu Ala Ash Pro Asn Arg Thr Ser Gly Thr195 200 205Gly Ser Val Ser Asp Thr Ala Gly Ser Thr Glu Gln Ala Gly Lys Ile210 215 220Asn Val Val Lys Asp Thr Ile Lys Val Gly Ala Gly Glu Val Phe Asp225230 235 240Gly His Gly Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Met Gly Asn Gly Asp245 250 255Gln Gly Glu Asn Gln Lys Pro Met Phe Glu Leu Ala Glu Gly Ala Thr260 265 270Leu Lys Asn Val Asn Leu Gly Glu Asn Glu Val Asp Gly Ile His Val275 280 285Lys Ala Lys Asn Ala Gln Glu Val Thr Ile Asp Asn Val His Ala Gln290 295 300Asn Val Gly Glu Asp Leu Ile Thr Val Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ala305 310 315 320Val Thr Asn Leu Asn Ile Lys Asn Ser Ser Ala Lys Gly Ala Asp Asp325 330 335Lys Val Val Gln Leu Asn Ala Asn Thr His Leu Lys Ile Asp Asn Phe340 345 350Lys Ala Asp Asp Phe Gly Thr Met Val Arg Thr Asn Gly Gly Lys Gln355 360 365Phe Asp Asp Met Ser Ile Glu Leu Asn Gly Ile Glu Ala Asn His Gly370 375 380Lys Phe Ala Leu Val Lys Ser Asp Ser Asp Asp Leu Lys Leu Ala Thr385 390 395 400Gly Asn Ile Ala Met Thr Asp Val Lys His Ala Tyr Asp Lys Thr Gln405 410 415Ala Ser Thr Gln His Thr Glu Leu420<210>35<211>344<212>PRT<213>茄假單胞菌<220><223>未知生物體的描述茄假單胞菌<400>35Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly
50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val205 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340<210>36<211>1035<212>DNA<213>茄假單胞菌<400>36atgtcagtcg gaaacatcca gagcccgtcg aacctcccgg gtctgcagaa cctgaacctc 60aacaccaaca ccaacagcca gcaatcgggc cagtccgtgc aagacctgat caagcaggtc 120gagaaggaca tcctcaacat catcgcagcc ctcgtgcaga aggccgcaca gtcggcgggc 180ggcaacaccg gtaacaccgg caacgcgccg gcgaaggacg gcaatgccaa cgcgggcgcc 240aacgacccga gcaagaacga cccgagcaag agccaggctc cgcagtcggc caacaagacc 300ggcaacgtcg acgacgccaa caaccaggat ccgatgcaag cgctgatgca gctgctggaa 360gacctggtga agctgctgaa ggoggccctg cacatgcagc agcccggcgg caatgacaag 420ggcaacggcg tgggcggtgc caacggcgcc aagggtgccg gcggccaggg cggcctggcc 480gaagcgctgc aggagatcga gcagatcctc gcccagctcg gcggcggcgg tgctggcgcc 540ggcggcgcgg gtggcggtgt cggcggtgct ggtggcgcgg atggcggctc cggtgcgggt 600ggcgcaggcg gtgcgaacgg cgccgacggc ggcaatggcg tgaacggcaa ccaggcgaac 660ggcccgcaga acgcaggcga tgtcaacggt gccaacggcg cggatgacgg cagcgaagac 720cagggcggcc tcaccggcgt gctgcaaaag ctgatgaaga tcctgaacgc gctggtgcag 780atgatgcagc aaggcggcct cggcggcggc aaccaggcgc agggcggctc gaagggtgcc 840ggcaacgcct cgccggcttc cggcgcgaac ccgggcgcga accagcccgg ttcggcggat 900gatcaatcgt ccggccagaa caatctgcaa tcccagatca tggatgtggt gaaggaggtc 960gtccagatcc tgcagcagat gctggcggcg cagaacggcg gcagccagca gtccacctcg 1020acgcagccga tgtaa 1035<210>37<211>26<212>PRT<213>野油菜黃單胞菌大豆致病變種<400>37Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25<210>38<211>20<212>PRT<213>野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種<400>38Ser Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Glnl 5 10 15Leu Leu Ala Met20<210>39<211>13<212>PRT<213>大雄疫霉<400>39Val Trp Asn Gln Pro Val Arg Gly Phe Lys Val Tyr Glul 5 10
權(quán)利要求
1.過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的分離的片段，其中所述片段在植物中不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，但具有其它活性。
2.按照權(quán)利要求1的分離的片段，其中所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽得自歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬或疫霉屬。
3.按照權(quán)利要求2的分離的片段，其中所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽得自解淀粉歐文氏菌。
4.按照權(quán)利要求3的分離的片段，其中所述片段選自SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段和SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的內(nèi)部片段。
5.按照權(quán)利要求4的分離的片段，其中所述片段為SEQ.ID.No.23的氨基酸序列中覆蓋SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的C端片段169和403、210和403、267和403、或343和403。
6.按照權(quán)利要求4的分離的片段，其中所述片段為SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段。
7.按照權(quán)利要求4的分離的片段，其中所述片段為SEQ.ID.No.23的氨基酸序列中覆蓋SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的內(nèi)部片段105和179、137和166、121和150、或137和156。
8.按照權(quán)利要求2的分離的片段，其中所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子得自丁香假單胞菌。
9.按照權(quán)利要求8的分離的片段，其中所述片段包含SEQ.ID.No.31的氨基酸190-294。
10.分離的DNA分子，編碼按照權(quán)利要求1的片段。
11.按照權(quán)利要求10的分離的DNA分子，其中所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽得自歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬或疫霉屬。
12.按照權(quán)利要求11的分離的DNA分子，其中所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽得自解淀粉歐文氏菌。
13.按照權(quán)利要求12的分離的DNA分子，其中所述片段選自SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的C端片段、SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段和SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的內(nèi)部片段。
14.按照權(quán)利要求12的分離的DNA分子，其中所述片段為SEQ.ID.No.23的氨基酸序列中覆蓋SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的C端片段169和403、210和403、267和403、或343和403。
15.按照權(quán)利要求12的分離的DNA分子，其中所述片段為SEQ.ID.No.23的氨基酸序列的N端片段。
16.按照權(quán)利要求12的分離的DNA分子，其中所述片段為SEQ.ID.No.23的氨基酸序列中覆蓋SEQ.ID.No.23的以下氨基酸的內(nèi)部片段105和179、137和166、121和150、或137和156。
17.按照權(quán)利要求11的分離的DNA分子，其中所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子得自丁香假單胞菌。
18.按照權(quán)利要求18的分離的DNA分子，其中所述片段包含SEQ.ID.No.31的氨基酸190-294。
19.用按照權(quán)利要求10的DNA分子轉(zhuǎn)化的表達(dá)系統(tǒng)。
20.按照權(quán)利要求19的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述DNA分子以適當(dāng)?shù)挠辛x方向和并在正確的讀框內(nèi)。
21.用按照權(quán)利要求10的DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
22.按照權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自植物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
23.按照權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述DNA分子用表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化。
24.用權(quán)利要求10的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
25.按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、青花椰菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆(pumpkin)、西葫蘆(zucchini)、黃瓜、蘋(píng)果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
26.按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自擬南芥、非洲紫羅蘭屬、碧冬茄、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
27.用權(quán)利要求10的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子。
28.按照權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述植物種子選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、青花椰菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆(pumpkin)、西葫蘆(zucchini)、黃瓜、蘋(píng)果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、菠蘿、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
29.按照權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述植物種子選自擬南芥、非洲紫羅蘭屬、碧冬茄、天竺葵、一品紅、菊花、康乃馨和百日草。
30.賦予植物抗病性的方法，所述方法包括在有效賦予抗病性的條件下，以非感染的形式將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段應(yīng)用到植物或植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。
31.按照權(quán)利要求30的方法，其中在所述應(yīng)用期間將植物處理。
32.按照權(quán)利要求30的方法，其中在所述應(yīng)用期間將植物種子處理，所述方法還包括在自然土壤或人工土壤中，播種用所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段處理的種子以及從在所述土壤中播種的種子繁殖植物。
33.促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括在有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下，以非感染的形式將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段應(yīng)用到植物或植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。
34.按照權(quán)利要求33的方法，其中在所述應(yīng)用期間將植物處理。
35.按照權(quán)利要求33的方法，其中在所述應(yīng)用期間將植物種子處理，所述方法還包括在自然土壤或人工土壤中，播種用所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段處理的種子以及從在所述土壤中播種的種子繁殖植物。
36.植物害蟲(chóng)防治的方法，所述方法包括在有效防治害蟲(chóng)的條件下，以非感染的形式將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段應(yīng)用到植物或植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其中在所述應(yīng)用期間將植物處理。38.按照權(quán)利要求36的方法，其中在所述應(yīng)用期間將植物種子處理，所述方法還包括在自然土壤或人工土壤中，播種用所述過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段處理的種子以及從在所述土壤中播種的種子繁殖植物。
39.賦予植物抗病性的方法，所述方法包括提供用編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，然后在有效賦予抗病性的條件下，培育所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
40.按照權(quán)利要求39的方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物。
41.按照權(quán)利要求39的方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物種子。
42.促進(jìn)植物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括提供用編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，然后在有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下，培育所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
43.按照權(quán)利要求42的方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物。
44.按照權(quán)利要求42的方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物種子。
45.植物害蟲(chóng)防治的方法，所述方法包括提供用編碼過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，所述片段不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，然后在有效防治害蟲(chóng)的條件下，培育所述轉(zhuǎn)基因植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物種子所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
46.按照權(quán)利要求45的方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物。
47.按照權(quán)利要求45的方法，其中提供轉(zhuǎn)基因植物種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的分離的活性片段,所述片段在植物中不誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這種片段的分離的DNA分子。按照本發(fā)明的過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子蛋白或多肽的分離的片段以及編碼它們的分離的DNA分子具有以下活性:賦予植物抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治植物害蟲(chóng)。在給植物或由所述植物種子培育的植物有效賦予抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下,以非感染的形式將過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子的片段應(yīng)用到植物或植物種子,可以達(dá)到該目的?；蛘?可以提供用編碼所述片段的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子,并在給植物或由所述植物種子培育的植物有效賦予抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或防治害蟲(chóng)的條件下,培育所述轉(zhuǎn)基因植物或從轉(zhuǎn)基因植物種子產(chǎn)生的植物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1329619SQ99814028
公開(kāi)日2002年1月2日 申請(qǐng)日期1999年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月5日
發(fā)明者Z·－M·魏, H·范, J·L·尼格梅耶 申請(qǐng)人:伊登生物科學(xué)有限公司