專利名稱：供乳變態(tài)反應(yīng)的免疫療法用的經(jīng)修飾的beta乳球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變應(yīng)性(超敏感性)疾病領(lǐng)域，而且具體地涉及用于生成免疫療法中 使用的經(jīng)修飾的變應(yīng)原性多肽(低變應(yīng)原)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
變應(yīng)性疾病(例如哮喘、鼻炎、濕疹和食物變態(tài)反應(yīng))在世界上達(dá)到流行病比例。 這些I型過(guò)敏反應(yīng)基于原則上針對(duì)無(wú)害的抗原，即變應(yīng)原形成免疫球蛋白E(IgE)抗體。免疫球蛋白E分子是由B細(xì)胞生成的。每個(gè)未成熟的B細(xì)胞在其表面上表達(dá)單體 形式的IgM，但是所有這些抗體在氨基酸序列上，而且因此在抗原結(jié)合特異性上是相同的。 通過(guò)結(jié)合IgM抗體，外來(lái)多價(jià)抗原交聯(lián)未成熟的B細(xì)胞表面上的B細(xì)胞(Ig α /Ig β )受體。 這觸發(fā)B細(xì)胞增殖、分化成抗體生成漿細(xì)胞、記憶形成、和向T細(xì)胞的抗原呈遞。T細(xì)胞為B 細(xì)胞成熟提供幫助，這包括同種型轉(zhuǎn)換和激活體細(xì)胞突變兩者以改善分泌性抗體親和力和 選擇性。已經(jīng)觀察到，在變態(tài)反應(yīng)中，T輔助細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞，其生成引起自IgM向IgE 抗體進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換(抗體重鏈類型從μ改變?yōu)棣?；不改變輕鏈類型)的細(xì)胞因子(IL-4 和 IL-13) (Alam 等，2003 ；Chaplin 2003)。然后，成熟的B細(xì)胞能夠分泌IgE抗體，其不僅能夠結(jié)合抗原(變應(yīng)原)，而且結(jié)合 肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞表面上的高親和力Fc ε RI受體。細(xì)胞表面上的Fc ε RI復(fù)合物的交聯(lián) 觸發(fā)引起炎性反應(yīng)的生物學(xué)介導(dǎo)物樣組胺和脂質(zhì)介導(dǎo)物的顆?；?Prussin等，2003)。如先前所描述的，細(xì)胞表面受體的交聯(lián)在兩個(gè)階段中出現(xiàn)。第一，在抗原(變應(yīng) 原)交聯(lián)未成熟B細(xì)胞表面上的Ig α/Ig β受體時(shí)，和第二，在變應(yīng)原交聯(lián)肥大細(xì)胞表面上 的Fc ε RI受體時(shí)。另外，在激活抗原呈遞細(xì)胞(APC)樣樹(shù)突細(xì)胞后發(fā)生類似的交聯(lián)(Gould 等2008)。在這些情況中，交聯(lián)是有可能的，此時(shí)抗原(變應(yīng)原)是多價(jià)的，具有多個(gè)抗體結(jié) 合位點(diǎn)(表位)。最近發(fā)表了變應(yīng)原和IgE抗體的第一個(gè)三維免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu)(Niemi等，2007)。在 此結(jié)構(gòu)中，來(lái)自牛乳的二聚體β-乳球蛋白(BLG) (Bos d 5)結(jié)合兩個(gè)IgE/Fab片段。令人 驚訝地，BLG的IgE結(jié)合表位覆蓋變應(yīng)原表面上不尋常的平面面積，因?yàn)橐勒站w結(jié)構(gòu)，大 多數(shù)已知的IgG表位位于抗原的突出區(qū)域中。IgE/Fab片段位于同一側(cè)上，這原則上使二聚 體BLG能夠連接兩個(gè)相同的IgE抗體，從而導(dǎo)致肥大細(xì)胞顆?；?yōu)榭赡堋＿@關(guān)于二聚化對(duì)于BLG變應(yīng)原性的作用的新觀察引導(dǎo)發(fā)明人進(jìn)一步調(diào)查二聚化 (或其它類型的寡聚化)在變應(yīng)原間多么常見(jiàn)。報(bào)告了一些變應(yīng)原是寡聚體的，但是報(bào)告 了大多數(shù)變應(yīng)原是單體的。不久還認(rèn)識(shí)到，文獻(xiàn)中存在有爭(zhēng)議的數(shù)據(jù)。在相應(yīng)的情況(諸 如考慮樺(birch)變應(yīng)原Bet ν 1的報(bào)告)中，報(bào)告了變應(yīng)原以單體，并且有時(shí)以二聚體存 在。實(shí)際上，BLG是瞬時(shí)二聚體(即一種在溶液中可以以單體或二聚體兩者存在的蛋白質(zhì)) 的一個(gè)充分研究的例子(Nooren等，2003)。Mkurai和Goto (2002)還已經(jīng)研究了 BLG的單 體-二聚體平衡作為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的模型。在熱力學(xué)上，二聚體的解離常數(shù)是 如此之高以至于在溶液中，BLG可以以單體和二聚體兩者存在。在自然情況中，環(huán)境因素如 PH或鹽濃度影響平衡。然而，在身體中的生理學(xué)條件中，BLG幾乎完全是單體的。本發(fā)明的關(guān)鍵要素在于許多情況中的瞬時(shí)二聚化是變應(yīng)原的一項(xiàng)重要特征，而且此瞬時(shí)二聚化可以 通過(guò)定向誘變來(lái)阻礙。瞬時(shí)二聚體難以觀察，這是因?yàn)槎垠w的高解離常數(shù)在正常的細(xì)胞濃度 (IO-IOOnM)將二聚體分?jǐn)?shù)降低到可忽略。然而，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的共定位可以局部提高濃度 (至ImM)，而且單體間的相互作用可以從可忽略提高至實(shí)質(zhì)性(Kuriyan等，2007)。共定位 的一個(gè)例子是未成熟B細(xì)胞或肥大細(xì)胞表面上的抗原(變應(yīng)原)結(jié)合。這會(huì)意味著細(xì)胞表 面上的變應(yīng)原的弱同二聚化對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以是足夠的，導(dǎo)致致敏或變應(yīng)性反應(yīng)。先前很少研究變應(yīng)原二聚化的意義。Sch0ll等已經(jīng)研究了樺花粉變應(yīng)原Bet ν 1 的二聚化對(duì)于交聯(lián)的作用。Bet ν 1-變應(yīng)性小鼠中的皮膚測(cè)試用Bet ν 1 二聚體呈陽(yáng)性， 但是在使用單體時(shí)保持陰性。另外，單體較少能夠激活鼠記憶B細(xì)胞以進(jìn)行體內(nèi)IgE生成。 在此研究中，通過(guò)添加4%甘油來(lái)制備單體形式的Bet ν l(Sch0ll等，2005)。然而，問(wèn)題在 于添加劑的效果僅是暫時(shí)的，因?yàn)楦视褪侵饾u稀釋的，并且達(dá)到正常的單體/ 二聚體平衡。 后來(lái)，依照分子建模分析，提示了 Tl蛋白(即Bet ν 1蛋白家族的一個(gè)成員)的非變應(yīng)原 性可能基于Tl蛋白二聚化受到阻止(Ghosh D等，2008)。Verdino等在2002年提示了破 壞W1I ρ 7變應(yīng)原的二聚體裝配物會(huì)減少交聯(lián)。然而，在Wil ρ 7的情況中，實(shí)際上非常難 以創(chuàng)建穩(wěn)定的單體變體，因?yàn)閮蓷l多肽鏈非常強(qiáng)烈地結(jié)合在一起，形成非常穩(wěn)定的二聚體 (Verdino 等 2002)。還已經(jīng)調(diào)查了四級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)蟑螂變應(yīng)原Per a 3的變應(yīng)原性和免疫原性的影響。六 聚體形式比單體形式誘導(dǎo)更強(qiáng)的自嗜堿細(xì)胞的白三烯釋放。不幸的是，文章中沒(méi)有描述單 體和六聚體形式的Per a 3的制備(Bellinghausen等，2007)。蟑螂變應(yīng)原Bla g 2的另 一項(xiàng)研究顯示了二聚體野生型Bla g 2比單體Bla g 2突變體誘導(dǎo)更多的自肥大細(xì)胞的 β-氨基己糖苷酶釋放(Li等2008)。然而，作者推斷Bla g 2在生理學(xué)條件下會(huì)以二聚體 存在。在de Halleux等，2006中，披露了預(yù)期單體形式的Der ρ 1在對(duì)致敏患者注射后 會(huì)較少傾向于觸發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)。然而，沒(méi)有披露顯示此類結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了以相同比例繪制的晶體結(jié)構(gòu)中找到的對(duì)稱變應(yīng)原二聚體的例子。一個(gè) 單體顯示為淺灰色帶模型，第二單體顯示為深灰色帶模型。以兩種取向顯示二聚體變應(yīng)原。 在左側(cè)照片中，對(duì)稱的二重軸朝向觀察者，在右側(cè)照片中，軸在同一平面而不是紙中。左上 角的照片顯示了 BLG-Dl/IgE(Fab) (Bos d 5)免疫復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，其中IgE片段顯示為 灰色表面模型。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得變應(yīng)原的坐標(biāo)，并用PISA服務(wù)器創(chuàng)建二聚體的坐標(biāo)。 通過(guò)PYMOL程序(DeLano 2002)來(lái)創(chuàng)建該圖。Che a 3含有四條多肽鏈。多肽鏈之兩條形 成專性二聚體(兩個(gè)單體共同形成緊密的結(jié)構(gòu)；單體不能單獨(dú)形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(Nooren等， 2003))。兩個(gè)專性二聚體形成瞬時(shí)二聚體。Api m 4含有八條多肽鏈。它們中的四條形成 穩(wěn)定的專性四聚體。兩個(gè)四聚體形成瞬時(shí)結(jié)構(gòu)。其它例子代表瞬時(shí)二聚體結(jié)構(gòu)，其中單體 單元由單條多肽鏈組成。圖2顯示了設(shè)計(jì)的突變體在二聚體Bos d 5 ( β -乳球蛋白)和Bet ν 1變應(yīng)原的 單體-單體界面上的位置。用PYMOL程序創(chuàng)建該圖。圖312種對(duì)稱變應(yīng)原二聚體的單體-單體界面上建議的突變體的一個(gè)例子。
圖4顯示了用于構(gòu)建和生成單體BLG突變體的細(xì)菌表達(dá)載體的示意圖。圖5顯示了自對(duì)固定化的、生物素化的β-乳球蛋白的結(jié)合已經(jīng)受到可溶性天然 β-乳球蛋白以及單體H146P、R148P和S150P BLG突變體抑制的具有人IgGl亞型的Dl IgE Fab片段的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA獲得的抑制結(jié)果。圖6顯示了可溶性天然β-乳球蛋白以及單體H146P、R148P和S150P BLG突變體 的CD譜。圖7顯示了對(duì)照樣品㈧和變應(yīng)原(BLG及其突變體)(B)衍生的自剝離的且致敏 的嗜堿細(xì)胞的組胺釋放。依照制造商的方案，自發(fā)釋放應(yīng)當(dāng)給出小于5%總組胺釋放的數(shù) 值，而陽(yáng)性對(duì)照樣品給出大于5%總組胺釋放的數(shù)值。圖8顯示了通過(guò)ELISA分析的Dl Fab和Dl scFv對(duì)二聚體BLG及其單體突變體 的結(jié)合。圖9顯示了搜索單體-單體界面和設(shè)計(jì)能夠阻止二聚體形成的低變應(yīng)原突變體的 作業(yè)流程圖?？s寫(xiě)B(tài)LG β-乳球蛋白cDNA 互補(bǔ)脫氧核糖核酸 DNA 脫氧核糖核酸E.coli 大腸桿菌(Escherichia coli)EIA 酶免疫測(cè)定法ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法Fab 具有特異性抗原結(jié)合的片段IgG 免疫球蛋白GIgE免疫球蛋白EIgM免疫球蛋白MNMR核磁共振PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)明詳述如上文所描述的，形成二聚體或寡聚物的能力似乎對(duì)變應(yīng)原的免疫原性(B細(xì)胞 活化)和變應(yīng)原性(肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞觸發(fā))具有顯著的作用。如果穩(wěn)定的或者即使瞬 時(shí)的對(duì)稱同二聚體的形成得到降低，而且變應(yīng)原僅會(huì)以單體形式存在，那么這會(huì)為開(kāi)發(fā)新 一代的低變應(yīng)原單體變應(yīng)原提供基礎(chǔ)。在考慮特定的免疫療法時(shí)，單體變體會(huì)具有有利的 特性。單體變應(yīng)原不會(huì)觸發(fā)肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞脫粒。另外，單體變體會(huì)結(jié)合變應(yīng)原特異 性IgE抗體，這阻止結(jié)合天然的變應(yīng)原。這會(huì)使得有可能使用較大量的單體變體作為變態(tài) 反應(yīng)疫苗來(lái)誘導(dǎo)生成保護(hù)性IgG抗體，或者與天然變應(yīng)原競(jìng)爭(zhēng)。它還會(huì)使得有可能通過(guò)基 于較高濃度的不引起交聯(lián)的FceRI復(fù)合物形成的低變應(yīng)性單體變應(yīng)原的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)降低天然 二聚體變應(yīng)原對(duì)肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞的結(jié)合。因此，基于此發(fā)現(xiàn)，即二聚化，特別地瞬時(shí)二聚化在變應(yīng)原性中的意義，本發(fā)明的 目的是提供一種用于制備供免疫療法用的低變應(yīng)原的方法。該方法包括下列步驟a)對(duì)已知的變應(yīng)原性多肽檢查與二聚體或寡聚物形成有關(guān)的表面結(jié)構(gòu)，即單體-單體界面，或者若用于二聚體或寡聚物形成的表面積是已經(jīng)知道的，那么直接采用步 驟(b)；b)改變所述多肽中發(fā)現(xiàn)或懷疑與二聚體或寡聚物形成有關(guān)的表面積以滅活或降 低所述多肽的形成二聚體或寡聚物的天然能力；并c)對(duì)自步驟b)獲得的經(jīng)改變的多肽測(cè)試激活自人細(xì)胞釋放變應(yīng)性反應(yīng)的組胺或 其它介導(dǎo)物的能力，其中認(rèn)為那些不激活組胺釋放或所述其它介導(dǎo)物或者比親本多肽更少 地激活組胺釋放或所述其它介導(dǎo)物的經(jīng)改變的多肽是供免疫療法用的低變應(yīng)原候選物。方法可以進(jìn)一步包括以下步驟，即檢查對(duì)所述變應(yīng)原性多肽特異性的IgE抗體是 否仍結(jié)合自步驟b)或c)獲得的所述經(jīng)改變的多肽以確認(rèn)所述變應(yīng)原性多肽具有天然樣結(jié) 構(gòu)，封閉IgE抗體的能力和形成保護(hù)性IgG分子的免疫原性潛力。方法還可以包括以下步驟，即對(duì)罹患變態(tài)反應(yīng)的患者施用藥學(xué)有效量的自步驟b) 或c)獲得的所述經(jīng)改變的多肽。經(jīng)改變的多肽可以與變態(tài)反應(yīng)的免疫療法中使用的藥學(xué) 可接受載體和稀釋劑混合。如此，本發(fā)明還涉及變應(yīng)原的單體變體(諸如具有選自SEQ ID NO :1_4的序列的 經(jīng)修飾的乳球蛋白)在免疫療法中的用途。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)免疫療法定義至 少三種治療模式a)脫敏療法，其通過(guò)隨時(shí)間使用多劑低濃度的變應(yīng)原單體變體來(lái)進(jìn)行；b)使用幾劑相對(duì)較高濃度的單體變體來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)天然變應(yīng)原的IgG響應(yīng)(即變態(tài) 反應(yīng)疫苗接種方案)；和c)使用單體變體作為治療劑以通過(guò)與天然變應(yīng)原競(jìng)爭(zhēng)對(duì)IgE的結(jié)合來(lái)治愈變態(tài) 反應(yīng)癥狀。具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的且具有選自SEQ IDNO :1_4的序 列的經(jīng)修飾的乳球蛋白或者涉及其用于制備用于治療乳變態(tài)反應(yīng)的藥物組合物或疫 苗的用途。本發(fā)明還涉及治療乳變態(tài)反應(yīng)的方法，其中對(duì)需要所述治療的患者施用藥學(xué)有效 量的低變應(yīng)原?？梢酝ㄟ^(guò)混合具有想要純度的蛋白質(zhì)與凍干餅或水溶液形式的任選的生理學(xué)可 接受載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑來(lái)將包含所述低變應(yīng)原的藥物組合物或疫苗制備用于貯存?？?接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)于接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑諸 如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其它有機(jī)酸。低變應(yīng)原還可包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠囊(例如分 別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、在膠狀藥物投遞系 統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中、或在粗滴乳狀液中。低變應(yīng)原施用的路徑依照已知方法，例如表面的、口服的或通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、 腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、或損傷內(nèi)(intralesional)手段進(jìn)行注射或輸注的通用路徑。 施用可以是連續(xù)的或周期性的。瞬時(shí)二聚體沒(méi)有關(guān)于變應(yīng)原的瞬時(shí)二聚體形成的已發(fā)表的實(shí)驗(yàn)研究。然而，通過(guò)查看可用的 晶體結(jié)構(gòu)來(lái)評(píng)估瞬時(shí)二聚體的頻率是有可能的。在典型的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)的濃度是約10mg/ml，其對(duì)應(yīng)對(duì)于20kDa蛋白質(zhì)的0. 5mM濃度。這會(huì)相當(dāng)大地提高可能的二聚體形式的 蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)。然而，應(yīng)當(dāng)注意到結(jié)晶溶液還含有可結(jié)晶的單體分?jǐn)?shù)。另外，非常高的或 低的PH、沉淀劑和添加劑可以影響結(jié)晶。對(duì)于瞬時(shí)二聚體，優(yōu)選地，二聚體界面的面積是約 或低于850A2,因?yàn)閷?duì)于那些預(yù)測(cè)為瞬時(shí)的二聚體，面積是530A2 (BLG) ,620A2 (Derp 1) 或820A2(Bet ν 1)。較強(qiáng)的二聚體似乎具有大得多的二聚體界面，諸如對(duì)于Bla g 2的 1139A2。因此，如上文所描述的，表述“瞬時(shí)二聚體”意指a)變應(yīng)原的二聚化是濃度依賴性的，在生理學(xué)濃度(IO-IOOnM)，它們基本上以單 體存在；b)共定位介導(dǎo)的局部濃度升高是體內(nèi)二聚化所需要的；結(jié)合肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì) 胞上的IgE-Fc ε RI受體復(fù)合物后，單體變應(yīng)原形成瞬時(shí)二聚體；c)在瞬時(shí)二聚體中，單體亞基不是共價(jià)連接的，而且單體亞基能夠獨(dú)立折疊；及d)瞬時(shí)二聚體面積的單體-單體界面的表面積是相對(duì)較小的(小于850Λ2 )。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(www. rcsb. org)現(xiàn)在(2008年2月)含有M種變應(yīng)原結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)。 已經(jīng)通過(guò)使用NMR來(lái)測(cè)定9種結(jié)構(gòu)，并且這些不能在評(píng)估中使用。剩余的45種變應(yīng)原結(jié)構(gòu) 通過(guò)使用來(lái)自歐洲生物信息學(xué)研究所的PISA服務(wù)器(www. ebi. ac. uk/msd-srv/prot int/ pistart.html) (Krissinel E等，2007)來(lái)研究。PISA使用晶體數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)寡聚物狀態(tài)(四 級(jí)結(jié)構(gòu))，而且還可以使用它來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面。PISA能夠良好地預(yù)測(cè)穩(wěn)定二聚 體的結(jié)構(gòu)。然而，由于單體-單體界面較小，它預(yù)測(cè)BLG會(huì)是單體的。然而，PISA在此研究中是有用的，因?yàn)樗o出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面。原則上，難以 區(qū)別二聚體界面與晶體接觸。然而，實(shí)際的同二聚體復(fù)合物幾乎總是對(duì)稱的，單體間存在旋 轉(zhuǎn)對(duì)稱軸(Blimdell等，1996)?？梢允褂肞ISA服務(wù)器來(lái)搜索界面，并尋找單體間可能的旋 轉(zhuǎn)對(duì)稱軸。我們已經(jīng)分析了 45種變應(yīng)原晶體結(jié)構(gòu)。35種變應(yīng)原(78% )以晶體形式存在，其 中發(fā)現(xiàn)變應(yīng)原形成對(duì)稱同寡聚物，主要為二聚體。對(duì)稱二聚體之兩種是非常弱的。然而，變 應(yīng)原間同寡聚物的分?jǐn)?shù)是非常高的，給出如下證據(jù)，即形成寡聚物的能力是變應(yīng)原間非常 常見(jiàn)的特性。圖1中顯示了一些發(fā)現(xiàn)的變應(yīng)原二聚體。發(fā)現(xiàn)10種變應(yīng)原在晶體中以單體 形式存在。檢測(cè)單體-單體界面并設(shè)計(jì)低變應(yīng)原性突變1)如果不可獲得感興趣變應(yīng)原的三維結(jié)構(gòu)，那么i)使變應(yīng)原結(jié)晶，ii)通過(guò)使 用X射線衍射來(lái)測(cè)定其結(jié)構(gòu)，并iii)使用解析的三維晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)來(lái)視覺(jué)分析變應(yīng) 原分子包裝，其通過(guò)使用分子圖形學(xué)軟件(如PYMOL(DeLano2002)、OCJones等1991)、和 XTALVIEff(McRee, 1999))來(lái)進(jìn)行?；蛘?，可以使用計(jì)算機(jī)程序諸如PISA (Krissinel等2007 ； http //www. ebi. ac. uk/msd-srv/prot_int/pistart. html)來(lái)分析晶體中的變應(yīng)原分子包 裝。在分析中，目的是尋找變應(yīng)原分子間的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸。在大多數(shù)情況中，它是二重對(duì)稱軸。 (可以圍繞軸旋轉(zhuǎn)而且在旋轉(zhuǎn)過(guò)程中重復(fù)其形式至少一次的目標(biāo)被說(shuō)成具有旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸。 進(jìn)行旋轉(zhuǎn)所沿的軸是稱為旋轉(zhuǎn)軸的對(duì)稱要素。旋轉(zhuǎn)180°后表現(xiàn)為相同的(這在360°旋 轉(zhuǎn)中為兩次)的目標(biāo)被說(shuō)成具有2重旋轉(zhuǎn)軸)。若在變應(yīng)原的單體間找到旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，則這 指明變應(yīng)原能夠至少在高蛋白質(zhì)濃度中形成對(duì)稱同寡聚物。
2.若三維晶體結(jié)構(gòu)是已知的，則有可能直接行進(jìn)至1)中的步驟iii)。3.在已經(jīng)找到軸時(shí)，可以使用分子圖形學(xué)程序諸如PYMOL來(lái)分析變應(yīng)原單體間的 單體-單體界面。在表2中，列出了許多變應(yīng)原的檢測(cè)出的單體-單體界面的面積。在下 一步中，可以使用單體-單體界面來(lái)檢測(cè)如下的氨基酸殘基，其取代會(huì)阻礙二聚體形成。在 圖3中，顯示了對(duì)不同變應(yīng)原的單體-單體界面中的氨基酸的建議的突變的列表。典型的氨 基酸取代會(huì)是將小殘基突變?yōu)檩^大的殘基。另外，可以通過(guò)親水性殘基(谷氨酸、賴氨酸) 替換疏水性殘基(如苯丙氨酸或亮氨酸)。下文討論了其它優(yōu)選的取代。4.若在單體間沒(méi)有找到旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，則有可能i)以不同晶體形式使變應(yīng)原結(jié)晶 (通過(guò)使用不同結(jié)晶條件，例如通過(guò)改變PH、蛋白質(zhì)或沉淀劑濃度)?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)使用對(duì) 稱約束來(lái)將單體在計(jì)算上?？吭谝黄稹＿@可以通過(guò)使用R0SETTA軟件(Andre等，2007)來(lái) 進(jìn)行。5.優(yōu)選地，會(huì)通過(guò)例如測(cè)定二聚體的解離常數(shù)來(lái)測(cè)試突變體蛋白質(zhì)形成二聚體的 能力降低。然而，重要的是，檢查單體變體是否與天然蛋白質(zhì)一樣地折疊，保留對(duì)IgE抗體 的結(jié)合特性。6.原則上，若不知道變應(yīng)原的三維結(jié)構(gòu)，則也可以使蛋白質(zhì)的殘基隨機(jī)突變。此 外，會(huì)測(cè)試可能降低的二聚體形成和單體變體折疊(還可參見(jiàn)圖9)。單體低變應(yīng)原的開(kāi)發(fā)可以通過(guò)使二聚體界面上的氨基酸殘基突變來(lái)制備變應(yīng)原的穩(wěn)定單體變體。作為 一個(gè)例子，圖2中顯示了 BLG的單體-單體界面。圖3中的突變氨基酸殘基(His 146、Arg 148, Ser 150)降低溶液中BLG的二聚體形式并提高單體形式。優(yōu)選地，可以通過(guò)將表面上與二聚體或寡聚物形成有關(guān)的一些(例如1-5個(gè))氨 基酸殘基突變成巨大的殘基(例如可以將Arg、Tyr、Lys、Trp突變?yōu)锳la或ftx))來(lái)獲得單體 變體。優(yōu)選地，突變殘基是那些側(cè)鏈向外指向溶劑，如此對(duì)變應(yīng)原的基本結(jié)構(gòu)引起最低限度 變化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)應(yīng)用常規(guī)的遺傳工程技術(shù)來(lái)容易地改變變應(yīng)原性多肽的 表面積。可以將突變引入編碼所述多肽的核酸，例如通過(guò)基于PCR的方法和其它用于定向 誘變的方法以及通過(guò)隨機(jī)誘變或通過(guò)全大小合成基因來(lái)進(jìn)行。這些方法是本領(lǐng)域中公知的 (參見(jiàn)例如 Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel 等編，John Wiley&Sons : 1992)。組胺釋放測(cè)定法組胺是變應(yīng)原施用后“即刻類型”變態(tài)反應(yīng)中的一種重要的介導(dǎo)物，并在過(guò)敏性反 應(yīng)的初始階段中找到。因此，可以通過(guò)不同組胺釋放測(cè)定法來(lái)容易地測(cè)試低變應(yīng)原用于免 疫療法的潛力。本發(fā)明的低變應(yīng)原與相應(yīng)的野生型變應(yīng)原相比具有降低的變應(yīng)原活性。依照本發(fā) 明，術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)原活性”意為化合物或組合物在致敏的哺乳動(dòng)物(例如在乳變應(yīng)性患者中) 誘導(dǎo)變應(yīng)性反應(yīng)的能力。變應(yīng)性反應(yīng)可以是肥大細(xì)胞脫粒、陽(yáng)性皮膚反應(yīng)和/或鼻反應(yīng)。優(yōu) 選地，在合適的體外或體內(nèi)測(cè)試中定義變應(yīng)原活性。可以在皮刺測(cè)試中測(cè)定變應(yīng)原活性，如 記載于 van Hage-Hamsten 等(1999)或 Pauli 等 Q000)的。優(yōu)選地，低變應(yīng)原的變應(yīng)原活性小于野生型變應(yīng)原的變應(yīng)原活性的50%。更優(yōu)選 地，低變應(yīng)原的變應(yīng)原活性小于野生型變應(yīng)原的25%。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，低變應(yīng)原基本上沒(méi)有變應(yīng)原活性。一般地，由本發(fā)明的低變應(yīng)原誘導(dǎo)的組胺釋放與由相應(yīng)的野生型變 應(yīng)原性多肽誘導(dǎo)的組胺釋放相比是顯著降低的。用于測(cè)定組胺釋放的優(yōu)選體外測(cè)試是嗜堿 細(xì)胞組胺釋放測(cè)定法，如記載于Vrtala等，(1997)的(還可參見(jiàn)實(shí)施例幻。優(yōu)選地，組胺 釋放降低至少25%，更優(yōu)選地至少50%，最優(yōu)選地至少75%，其在相應(yīng)野生型變應(yīng)原顯示 最大組胺釋放的變應(yīng)原濃度時(shí)測(cè)定。通過(guò)提及而將本文中用于闡明本發(fā)明的背景，及特別地用于提供關(guān)于其實(shí)施的別 的詳情的出版物和其它材料收入本文。本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例并 不意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1β -乳球蛋白的單體-單體界面的檢測(cè)基于&ikurai和Goto Q002)并通過(guò)由Niemi等，2007最近發(fā)表的變應(yīng)原和IgE 抗體的三維免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu)確認(rèn)，已經(jīng)顯示了 β -乳球蛋白的單體-單體界面包含氨基酸 Asp33、Ala34、Arg40、Hisl46、Argl48 和 Serl50 等。實(shí)施例2重組單體β-乳球蛋白突變體的特征在此實(shí)施例中，構(gòu)建含有氨基酸取代的重組單體β-乳球蛋白(BLG)突變體，并表 征其抗BLG IgE抗體(Dl)結(jié)合特性。Sakurai和Goto 0002)已經(jīng)研究了 BLG的單體-二 聚體平衡作為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的模型。I.單體β-乳球蛋白突變體的構(gòu)建為了構(gòu)建單體BLG突變體，進(jìn)行以下氨基酸取代H146P、R148P、S150P和Η146Ρ/ R148P/S150P (三重(triple)突變體)(SEQ ID N0:l_4)。先前，將編碼重組二聚體BLG的 cDNA克隆入細(xì)菌表達(dá)載體pKKtac中。通過(guò)使用5’端引物A和3’端引物B-E (表I)的PCR 擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行氨基酸取代。對(duì)H146P使用引物B，對(duì)R148P使用引物C，對(duì)S150使用引物D，并 對(duì)H146P/R148P/S150P取代使用引物E。使用“降落”條件來(lái)實(shí)施PCR擴(kuò)增首先于95°C 2 分鐘，然后是于94°C 1分鐘進(jìn)行變性，于70°C 30秒和每個(gè)循環(huán)降低0. 7°C進(jìn)行退火和于 700C 2分鐘進(jìn)行延伸的25個(gè)循環(huán)，接著是于94°C 1分鐘，于55°C 30秒和于72°C 2分鐘的 20個(gè)循環(huán)，接著是于72°C 10分鐘的1個(gè)循環(huán)。使用NcoI和HindIII克隆位點(diǎn)(圖4)將單體BLG突變體的所得擴(kuò)增cDNA克隆 入細(xì)菌表達(dá)載體(pKKtac)中，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌RV308中。用細(xì)菌大規(guī)模(1升)生產(chǎn) 含有C端六組氨酰標(biāo)簽的單體BLG突變體以進(jìn)行IMAC純化。因?yàn)橹亟MBLG突變體被分泌 入大腸桿菌的壁膜間隙中而不是到培養(yǎng)基，將周質(zhì)分離，然后將它們?cè)诰哂泄潭ɑ逆嚨?Sepharose柱上進(jìn)行。純化的單體BLG突變體具有實(shí)質(zhì)性純度。II.單體β-乳球蛋白突變體的表征通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA來(lái)分析抗BLG IgE抗體(Dl)對(duì)純化的單體BLG突變體的結(jié)合 特性。首先，將增加量的非生物素化的天然BLG(nBLG)和單體BLG突變體與Dl IgE Fab 片段一起溫育，然后將反應(yīng)混合物應(yīng)用到用生物素化的BLG包被的鏈霉抗生物素蛋白微量滴定板孔上。圖5顯示了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的結(jié)果。在用作競(jìng)爭(zhēng)劑的天然BLG和單體H146P、 R148P和S150P BLG突變體的情況中，Dl IgE Fab對(duì)生物素化的β-乳球蛋白可以得到抑 制。III.圓二色性測(cè)量可以使用圓二色性(CD)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)是否正確折疊，并進(jìn)一步為同一蛋白質(zhì)的 不同突變體比較結(jié)構(gòu)。對(duì)于圓二色性(CD)測(cè)量，使用透析來(lái)將所有rBLG的緩沖液交換入 5mM Hepes (pH 7.4)中。使用 Imm 石英池于用 Peltier 恒溫器(Jasco PTC-348WI)控制 的+20°C用Jasco J-715旋光分光計(jì)來(lái)測(cè)量天然BLG(nBL G，Sigma)、單體H146P、R148P和 S150P BLG突變體的遠(yuǎn)UV譜。蛋白質(zhì)濃度是對(duì)于nBLG的lmg/ml、對(duì)于H146P的0. 50mg/ ml、對(duì)于R148P的0. 20mg/ml和對(duì)于S150 BLG突變體的0. 23mg/ml。所顯示的⑶譜是三次 測(cè)量的平均值(圖6)。根據(jù)⑶譜，重組單體BLG突變體(除三重突變體外)顯示了與天然 BLG (nBLG)相比相似的結(jié)果。實(shí)施例3單體BLG突變體對(duì)于組胺釋放的功能性使用剝離的且致敏的嗜堿細(xì)胞的組胺釋放EIA，接著進(jìn)行組胺ELISA(LD-BA)來(lái)分 析nBLG和單體BLG突變體誘導(dǎo)自嗜堿性白細(xì)胞體外釋放組胺。使用來(lái)自非乳變應(yīng)性供體的全血05ml)來(lái)分離白細(xì)胞。如下裂解紅細(xì)胞，即將它 們與裂解緩沖液(155mM NH4ClUOmM NH4HC03、0. ImM EDTA, ρΗ7· 4)混合，在冰上溫育15分 鐘，然后于RT以450xg離心10分鐘。棄去上清液，并再次裂解細(xì)胞沉淀物，如上文的。最 后，用無(wú)菌PBS和0. 9%NaCl(w/v)將白細(xì)胞沉淀物清洗一次，并通過(guò)血球計(jì)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。 然后如下自嗜堿細(xì)胞剝落結(jié)合的IgE分子，即它們?cè)?-ml剝離緩沖液(13. 4mM乳酸、140mM NaCl、5mM KCl, pH 3.9)中溫育 3. 5 分鐘。用 Hepes 緩沖液[20mM H印es、132mMNaCl、6mM KClUmM MgSO4U, 2mM K2HP04、5. 5mM 葡萄糖、0. 5%人血清清蛋白(w/v, Sigma A3782)，pH 7.4]清洗剝離的細(xì)胞。最后，將細(xì)胞重懸入600 μ 1 !fepes緩沖液中，并分成兩管P3(+)管 (400 μ 1)和陰性對(duì)照(_)管QOO μ 1)。為了通過(guò)乳變應(yīng)性IgE血清使細(xì)胞致敏，于+37°C 將它們與下列致敏混合物一起溫育90分鐘來(lái)自乳變應(yīng)性P3(+)的100 μ 1血清或來(lái)自非 變應(yīng)性(_)供體的50 μ 1血清，4mM EDTA,總體積為0. 5ml。致敏后，將^iil Hepes緩沖液添 加至細(xì)胞，并用Ifepes緩沖液將它們清洗兩次。容許細(xì)胞在具有ImM CaCl2的!fepes緩沖液 中于+37°C恢復(fù)30分鐘。如下用具有ImM CaCl2的!fepes緩沖液調(diào)節(jié)樣品體積P3(+)細(xì) 胞8ml和陰性對(duì)照(-)細(xì)胞4ml (約2. 2xl05個(gè)細(xì)胞/ml)。使用組胺釋放補(bǔ)充試劑盒(SupplementaryKit for Histamine Release) (Labor Diagnostika Nord GmbH&Co. K G，產(chǎn)品目錄編號(hào)BA 10-1100)來(lái)進(jìn)行組胺釋放測(cè)定法。對(duì)于 組胺的總釋放，將30 μ 1剝離的且致敏的細(xì)胞與270 μ 1釋放緩沖液混合，并于90°C—起溫 育10分鐘。以700xg將樣品離心10分鐘，并取出50 μ 1上清液用于?；?duì)于變應(yīng)原誘導(dǎo) 的組胺釋放，將變應(yīng)原(nBLG、rBLG及其突變體)稀釋成進(jìn)入釋放緩沖液(Vtot = 500 μ 1) 中的0. lmg/ml,0. 0lmg/ml和0. 00lmg/ml的濃度。然后，混合150 μ 1每種變應(yīng)原稀釋物和 150 μ 1細(xì)胞懸浮液或150 μ 1釋放緩沖液和150 μ 1細(xì)胞懸浮液(對(duì)于自發(fā)釋放)或150 μ 1 抗IgE抗血清(1 μ g/ml)和150 μ 1細(xì)胞懸浮液(作為陽(yáng)性對(duì)照)，并于+37°C溫育60分鐘。 為了停止釋放反應(yīng)，將樣品在冰上溫育10分鐘，然后以700xg離心10分鐘。為了使所釋放的組胺?；褂?0 μ 1澄清的上清液。通過(guò)組胺ELISA (Labor Diagnostika Nord GmbH&Co. KG,產(chǎn)品目錄編號(hào) BA 10-1000)來(lái)測(cè)量所釋放的組胺。在ELISA中，將組胺定量衍生化成N-酰基組胺，將所述 N-?；M胺結(jié)合至微量滴定板的固相。釋放的且?；慕M胺和固相結(jié)合的?；M胺競(jìng)爭(zhēng) 固定數(shù)目的抗血清IgE結(jié)合位點(diǎn)。在系統(tǒng)處于平衡時(shí)，通過(guò)清洗步驟除去游離的抗原和游 離的抗原-抗血清復(fù)合物。通過(guò)偶聯(lián)有過(guò)氧化物酶的抗山羊抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合固相組胺的抗 體。于450nm監(jiān)測(cè)底物TMB/過(guò)氧化物酶反應(yīng)。結(jié)合固相組胺的抗體量與樣品釋放的組胺 濃度成反比。通過(guò)遵循制造商的指令(Labor Diagnostika Nord GmbH&Co. KG，產(chǎn)品目錄編 號(hào)BA 10-1000)來(lái)進(jìn)行樣品的?；兔庖邷y(cè)定法。從標(biāo)準(zhǔn)曲線直接讀出樣品的組胺濃度， 并用總組胺的結(jié)果乘以因數(shù)5。關(guān)于總組胺濃度(100%)，也以百分比計(jì)算變應(yīng)原誘導(dǎo)的組 胺濃度。圖7A顯示了用于組胺釋放測(cè)定法的細(xì)胞的總體條件。依照制造商的方案，自發(fā)釋 放應(yīng)當(dāng)給出小于5%總組胺釋放的數(shù)值，而陽(yáng)性對(duì)照樣品給出大于5%總組胺釋放的數(shù)值。 圖7B中顯示了 nBLG和重組單體BLG突變體的組胺釋放。二聚體nBLG觸發(fā)高水平組胺釋 放，而單體突變體顯示了顯著更低的組胺釋放水平。這些結(jié)果表明單體BLG突變體在功能 測(cè)定法中如預(yù)期的那樣表現(xiàn)。三明治式ELISA于+4°C用1 μ g抗BLG Dl Fab將微量滴定板孔(Nunc)包被16小時(shí)。為了預(yù)防對(duì) 孔的非特異性結(jié)合，用200 μ 1 0. 5% BSA-PBS于室溫將它們封閉1小時(shí)。將BLG(天然的或 重組單體突變體)以0. 5% BSA-PBS中的濃度100、10、和1 μ g/ml添加至孔，并于室溫溫育 1小時(shí)。清洗步驟后，將含有myc-tag的抗BLGDl scFv(l 1000稀釋)添加至孔，于室溫 溫育1小時(shí)。使用小鼠抗myc抗體(克隆9E10, ATCC#CRL_1729)和偶聯(lián)有AFOS的抗體小 鼠Ig抗體(Bio-Rad)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的Dl ScFv0作為陰性對(duì)照，在此測(cè)定法中使用BLG的三 重突變體(T18Y, E45Y, L57Y)。這種三明治式ELISA結(jié)構(gòu)顯示了重組BLG突變體H146P、H148P和S150P是單體 的，這通過(guò)濃度依賴性方式實(shí)現(xiàn)。在高濃度(100μ g/ml)時(shí)，BLG突變體像二聚體一樣表現(xiàn)， 但是在較低濃度(10yg/ml)時(shí)，有不能通過(guò)三明治式ELISA識(shí)別的單體，在所述三明治式 ELISA中將Dl Fab片段在孔上包被，并使用Dl scFv-myc融合物來(lái)檢測(cè)，而仍在10 μ g/ml 的濃度明顯檢測(cè)出二聚體天然BLG。這表明在高濃度中，rBLG突變體形成瞬時(shí)二聚體，而在 低濃度中，BLG突變體作為單體，如此，這些不能被三明治式ELISA中的BLG特異性抗體識(shí) 別。實(shí)施例4通過(guò)使用分子圖形學(xué)軟件(PYM0L (DeLano 2002)、0 (Jones等1991)、和 XTALVIEW(McRee，1999))，使用變應(yīng)原 Bos d 5, Bet ν UBet ν 2, Equ cl、Api m UPhl ρ UDer ρ UDer ρ 2,Fel d UApi g UChe a 3、和Apl m5的解析的三維晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo) 來(lái)視覺(jué)分析變應(yīng)原分子包裝。在分析中，目的是尋找變應(yīng)原分子間的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸和相應(yīng)的 單體-單體界面(參見(jiàn)圖1)。圖3中顯示了 12種對(duì)稱變應(yīng)原二聚體的找到的單體-單體 界面上建議的突變體的例子。表I 用于PCR擴(kuò)增單體BLG突變體的引物。



A :5’ -GCGCCGACATCATAACGGTTC-3‘
B 5'
-ACCTGAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGAATATGGCACTGTTCTT CCAGCTGGGTCGGGTTAAAGCTCAGACGAATCGGCATCGGCAGC-3' C 5' -ACCTGAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGAATATGGCACTGTTCTT
CCAGCTGGGTCGGGTTAAAGCTC AGCGGAATATGCATC-3 ’ D 5' -ACCTGAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGAATATGGCACTGTTCTT
CCAGCTGGGTCGGGTTAAACGGC AGACGAATATG-3 ’ E 5' -ACCTGAAGCTTAATGGTGATGGTGATGATGAATATGGCACTGTTCTT CCAGCTGGGTCGGGTTAAACGGCAGCGGAATCGGCATCGGCAGC-3'
權(quán)利要求
1.具有選自SEQID NO :1-4的序列的低變應(yīng)原用于制備用于治療乳變態(tài)反應(yīng)的藥物 組合物或疫苗的用途。
2.用于治療乳變態(tài)反應(yīng)的經(jīng)修飾的β-乳球蛋白，其具有選自SEQIDN0:l-4的序列。
3.經(jīng)修飾的β-乳球蛋白，其具有選自SEQID NO :1-4的序列。
4.藥物組合物，其包含依照權(quán)利要求3的經(jīng)修飾的β-乳球蛋白。
5.疫苗，其包含依照權(quán)利要求3的經(jīng)修飾的β-乳球蛋白。
6.用于制備供免疫療法用的低變應(yīng)原的方法，包括下列步驟a)對(duì)已知的變應(yīng)原性多肽檢查與瞬時(shí)二聚體或寡聚物形成有關(guān)的表面結(jié)構(gòu)，或者若用 于二聚體或寡聚物形成的表面積是已經(jīng)知道的，那么直接采用步驟(b)；b)改變所述多肽中發(fā)現(xiàn)或懷疑與瞬時(shí)二聚體或寡聚物形成有關(guān)的表面積以滅活或降 低所述多肽的形成瞬時(shí)二聚體或寡聚物的天然能力；并c)對(duì)自步驟b)獲得的經(jīng)改變的多肽測(cè)試激活自人細(xì)胞釋放組胺或變應(yīng)性反應(yīng)的其它 介導(dǎo)物的能力，其中認(rèn)為那些不激活組胺釋放或所述其它介導(dǎo)物或者比親本多肽更少地激 活組胺釋放或所述其它介導(dǎo)物的經(jīng)改變的多肽是供免疫療法用的低變應(yīng)原候選物。
7.依照權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟，即檢查對(duì)所述變應(yīng)原性多肽特異 性的IgE抗體是否仍結(jié)合自步驟b)或c)獲得的所述經(jīng)改變的多肽以確認(rèn)所述變應(yīng)原性多 肽具有天然樣結(jié)構(gòu)，阻止肥大細(xì)胞或嗜堿細(xì)胞表面抗體上的IgE-Fc ε RI復(fù)合物交聯(lián)的能 力和形成保護(hù)性IgG分子的免疫原性潛力。
8.依照權(quán)利要求6的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟，即對(duì)罹患變態(tài)反應(yīng)的患者施用藥 學(xué)有效量的自步驟b)或c)獲得的所述經(jīng)改變的多肽。
9.依照權(quán)利要求6的方法，其中步驟c)中所使用的人細(xì)胞是白細(xì)胞或肥大細(xì)胞。
10.依照權(quán)利要求6的方法，其中步驟c)的測(cè)試是體外測(cè)試。
11.依照權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)與多肽的分子建模和3D模型有關(guān)的計(jì)算 (computational)分析來(lái)進(jìn)行步驟a)。
12.依照權(quán)利要求6的方法，其中在步驟b)中，通過(guò)定向誘變編碼所述多肽的核酸來(lái)改 變所述多肽中與二聚體或寡聚物形成有關(guān)的表面積。
13.依照權(quán)利要求12的方法，其中使用定向誘變來(lái)對(duì)所述多肽產(chǎn)生氨基酸取代。
14.依照權(quán)利要求13的方法，其中所述取代是自小的殘基改變?yōu)檩^大的殘基或自疏水 性殘基諸如苯丙氨酸和亮氨酸改變?yōu)橛H水性殘基諸如谷氨酸和賴氨酸或改變多肽主鏈的 結(jié)構(gòu)，諸如使用脯氨酸。
15.依照權(quán)利要求6的方法，其中在步驟a)中，使感興趣的變應(yīng)原性多肽結(jié)晶，通過(guò)使 用X射線衍射來(lái)確定其結(jié)構(gòu)，并使用解析的三維晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)來(lái)分析變應(yīng)原分子包裝以 尋找所述變應(yīng)原的單體間的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，而且如果找到所述軸，那么對(duì)所述單體-單體界 面搜索氨基酸殘基，所述氨基酸殘基的取代會(huì)阻礙二聚體形成。
16.依照權(quán)利要求6的方法，其中所述變應(yīng)原性多肽的所述單體-單體界面的面積是約 或小于850 A2。
17.依照權(quán)利要求6的方法，其中所述變應(yīng)原性多肽選自下組Bosd 5, Bet ν UBet ν 2、Api m l、Der ρ l、Der ρ 2、Api g l、Che a 3、禾口 Api m 5。
18.依照權(quán)利要求6的方法，其中所述變應(yīng)原性多肽是β-乳球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及變應(yīng)性(超敏感性)疾病領(lǐng)域，而且提供了一種用于生成免疫療法中使用的經(jīng)修飾的變應(yīng)性多肽的方法。在本發(fā)明的方法中，修飾所述變應(yīng)性多肽以使它們不能形成瞬時(shí)二聚體。本發(fā)明還提供了用于乳變態(tài)反應(yīng)的免疫療法的經(jīng)修飾的β-乳球蛋白。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102131523SQ200980131722
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月18日
發(fā)明者克里斯蒂娜·塔基南, 朱哈·盧維南, 梅爾賈·尼米, 漢斯·索德倫德, 瑪賈-利娜·勞卡南, 瑟帕·吉爾哈 申請(qǐng)人:芬蘭國(guó)家技術(shù)研究中心