專利名稱：一種檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法
一種檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
綠原酸是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)和清除自由基等作用。含綠原酸類成分的中藥注射劑如雙黃連注射液、清開靈注射液等約占已上市中藥注射劑品種數(shù)量的22%，其臨床療效確切，而不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生(主要為過(guò)敏反應(yīng)，其中類過(guò)敏反應(yīng)約占70%-80%)。綠原酸類成分作為一種主要的藥效成分，同時(shí)又是一種可疑的致敏物質(zhì)，但至今該類成分是否為過(guò)敏原尚未有定論，其客觀真實(shí)性亟待闡明！目前，類過(guò)敏反應(yīng)檢查缺乏足夠可靠的動(dòng)物模型，也就難以建立相應(yīng)的評(píng)價(jià)方法。新近開展的小鼠耳廓藍(lán)染試驗(yàn)法、 降壓檢查法在物種差異、反應(yīng)鏈末端化、重現(xiàn)性等方面還有待解決；過(guò)敏介質(zhì)或掃描/透射電鏡檢測(cè)，因半衰期短或需化學(xué)固定、顯色處理，操作繁瑣、且細(xì)胞已死亡導(dǎo)致系列生物信息缺失；僅能觀察某一時(shí)相狀態(tài)，缺乏連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明公開了一種檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，一般檢測(cè)溶液或藥液的類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)，本領(lǐng)域都是采用RBL-2H3作為檢測(cè)對(duì)象，本發(fā)明的方法可實(shí)時(shí)反映RBL-2H3在添加含綠原酸類成分前后經(jīng)歷的生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡生理狀態(tài)，并且得出綠原酸類成份導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的溶液濃度范圍，從而在使用含綠原酸類成份藥品的治療中，可避免藥液產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)對(duì)人體造成的不良影響，提高治療效率，減輕患者的痛苦。
實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是，本發(fā)明公開的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，包括以下步驟，(I)分別制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液和綠原酸類 成分溶液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)添加綠原酸類成分溶液前后的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)添加綠原酸類成分溶液后RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值的變化情況，判斷綠原酸類成分是否會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)。
所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法中，采用的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀為DP 型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀。DP型號(hào)是羅氏公司推出的最新型號(hào)的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀，新的DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀利用無(wú)標(biāo)記、非侵入性電極阻抗測(cè)量得出細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，提供了實(shí)時(shí)的細(xì)胞分析，并對(duì)平行進(jìn)行短期和長(zhǎng)期的分析研究者來(lái)說(shuō)具有高度的靈活性，DP型的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板共3塊16個(gè)孔板，可由三個(gè)不同的用戶同時(shí)操作，由于其體積小，檢測(cè)板可放入標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)箱中，輕松實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的培養(yǎng)的條件。
所述的綠原酸類成分為綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸或新綠原酸。綠原酸類成分是對(duì)綠原酸及其異構(gòu)體、分解產(chǎn)物、提取中可能產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變異等的統(tǒng)稱。所述不同濃度綠原酸類成分溶液的配制方法是，將綠原酸類成分用RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液溶解，再用孔徑為0.2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌得到綠原酸類成分母液，再用RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液將綠原酸類成分母液稀釋，得到不同濃度的綠原酸類成分溶液。利用RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液作為綠原酸類成分溶液的溶劑，防止其它化學(xué)試劑破壞細(xì)胞的黏性、彈性，避免了細(xì)胞破裂、聚堆不好觀察現(xiàn)象的發(fā)生。所述RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液為質(zhì)量濃度15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液或質(zhì)量濃度15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中C02的體積濃度為5%，溫度為37°C;②設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞培懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，選擇RBL-2H3細(xì)胞加入到RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)到45h時(shí)RBL-2H3細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液濃度，即為實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)。上述步驟④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線時(shí)，不同濃度RBL-2H3細(xì)胞細(xì)胞懸液是RBL-2H3細(xì)胞濃度為2X 105、4X 105、5X 105、8X 105的細(xì)胞懸液，上述RBL-2H3濃度的單位為個(gè)/ml。上述步驟④確定的用于實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度為2X 105個(gè)/ml。確定用于實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度時(shí)，依據(jù)RBL-2H3細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作為判斷細(xì)胞懸浮液濃度指標(biāo)的原因是，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好時(shí)期，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)期，細(xì)胞濃度過(guò)小則細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的潛伏期才能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，導(dǎo)致試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)；細(xì)胞濃度過(guò)大則營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，且細(xì)胞易粘 連、疊加，則細(xì)胞很快經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并開始脫落、死亡。在選擇用于檢測(cè)的最佳細(xì)胞濃度時(shí)，一般選擇RBL-2H3細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1/3 2/3細(xì)胞的生長(zhǎng)率顯著增高的時(shí)段，同時(shí)為了方便后續(xù)不同濃度綠原酸類成分溶液添加到RBL-2H3細(xì)胞懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線好擬合對(duì)比，綜合考察，一般細(xì)胞指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，為添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)。所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入100 μ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中C02的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)將步驟(2) 確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳添加綠原酸類成分溶液的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的綠原酸類成分溶液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ 1RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；④設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分溶液中RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。步驟①中基準(zhǔn)的測(cè)定是為了扣除細(xì)胞培養(yǎng)液本身所帶電荷可能產(chǎn)生的背景數(shù)值，有效保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。
綜上，本發(fā)明檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法有益效果是，1、選用RBL-2H3作為被測(cè)細(xì)胞，RBL-2H3可從腫瘤狀態(tài)的嗜堿性細(xì)胞分離和克隆出來(lái)， 這些細(xì)胞能夠在體外增殖、傳代，被廣泛地用做類過(guò)敏反應(yīng)肥大細(xì)胞脫顆粒的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?、在本發(fā)明中所使用的方法能夠?qū)⒕G原酸類成分溶液對(duì)細(xì)胞作用的全過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)，無(wú)需標(biāo)記、靈敏專屬、而且能節(jié)約大量的人力物力；3、通過(guò)對(duì)不同濃度細(xì)胞懸液中RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)比不同濃度下的 RBL-2H3細(xì)胞增殖曲線，能夠篩選出用于檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的最佳細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液和最佳添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)；3、通過(guò)對(duì)本發(fā)明方法所得到的圖譜數(shù)據(jù)，與現(xiàn)有技術(shù)利用顯微照片進(jìn)行分析相比，能夠得到各個(gè)綠原酸單體致類過(guò)敏反應(yīng)的真實(shí)性及引起類過(guò)敏反應(yīng)的濃度范圍，同時(shí)節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，操作方便，僅需利用儀器自動(dòng)生成的圖譜就可清楚、精確的了解綠原酸類成分各種單體的類過(guò)敏反應(yīng)。
4、通過(guò)對(duì)比不同綠原酸溶劑的圖譜之間的差異也能對(duì)其作用機(jī)制研究提供支持;5、本發(fā)明的技術(shù)方案具有定性定量、簡(jiǎn)便快捷、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的不同濃度compound48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值譜圖，該譜圖以時(shí)間橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)Cl值為縱軸；圖2為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的不同濃度綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值譜圖，該譜圖以時(shí)間橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)Cl值為縱軸；圖3為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的不同濃度異綠原酸A溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值譜圖，該譜圖以時(shí)間橫軸，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)Cl值為縱軸；其中，曲線I為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)不同濃度cOmpOund48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)時(shí)，設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線；曲線2為質(zhì)量濃度100ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)； 曲線3為質(zhì)量濃度50ug/ml的COmpOund48/80溶液中R·BL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線4為質(zhì)量濃度40ug/ml的compound48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線5為質(zhì)量濃度30ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；曲線6為質(zhì)量濃度20ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線7為質(zhì)量濃度10ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線8為質(zhì)量濃度5ug/ml的COmpOund48/80溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線9為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)不同濃度綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)時(shí)，設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線；
曲線10為質(zhì)量濃度200ug/ml的綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線11為質(zhì)量濃度100ug/ml的綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線12為質(zhì)量濃度50ug/ml的綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線13為質(zhì)量濃度25ug/ml的綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線14為質(zhì)量濃度12.5u g/ml的綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線15為質(zhì)量濃度6.25ug/ml的綠原酸溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線16為DP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)不同濃度異綠原酸A溶液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)時(shí)，設(shè)置的空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線；
曲線17為質(zhì)量濃度200ug/ml的異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線18為質(zhì)量濃度100ug/ml的異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線19為質(zhì)量濃度50ug/ml的異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線20為質(zhì)量濃度25ug/ml的異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線21為質(zhì)量濃度12.5ug/ml的異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)；
曲線22為質(zhì)量濃度6.25ug/ml的異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)明內(nèi)容。實(shí)施例一:本發(fā)明檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，綠原酸類成分有綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸或新綠原酸，本發(fā)明方法可同時(shí)對(duì)不同濃度、各種綠原酸單體導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)監(jiān)測(cè)，類過(guò)敏反應(yīng)是是一種無(wú)免疫系統(tǒng)參與的，由化學(xué)性或藥理性介導(dǎo)的，首次用藥即表現(xiàn)出與過(guò)敏反應(yīng)相似癥狀的臨床反應(yīng)。實(shí)施例一列舉的是檢測(cè)綠原酸溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，本實(shí)施例中用到的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀均是DP型實(shí)施細(xì)胞分析儀。1、試驗(yàn)中所用到的儀器:RTCA DP (德國(guó)Roche公司)；E_Plate 16檢測(cè)板(6x6plates,德國(guó)Roche公司);恒溫培養(yǎng)箱(5410型，美國(guó)Napco公司);冷凍離心機(jī)(HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);電子天平(AL-204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；吉爾森移液器(P100型、PlOOO型，法國(guó)GILSON公司)；微孔濾膜(0.20 μπι，美國(guó)Millipore 公司);培養(yǎng)瓶(25cm、75cm,美國(guó) Corning 公司);離心管(2mL、5mL、IOmL>5OmL,美國(guó)Corning公司)。檢測(cè)不同濃度下綠原酸溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，包括以下步驟，(I)分別制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液和綠原酸溶液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加綠原酸溶液溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)；
(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)添加綠原酸溶液前后的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)添加綠原酸溶液后RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值的變化情況，判斷綠原酸溶液是否會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)。
步驟(I)中制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液時(shí)，RBL-2H3是從Wistar大鼠保持腫瘤狀態(tài)的嗜堿性細(xì)胞中分離和克隆出來(lái)的嗜堿性白血病細(xì)胞株，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，利用現(xiàn)有的方法對(duì)RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)，RBL-2H3細(xì)胞用的培養(yǎng)液是質(zhì)量濃度為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用體積濃度為5%C02，溫度為37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備RBL-2H3細(xì)胞懸液的具體步驟為選取在RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RBL-2H3細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化、吹打初步得到細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)移至離心管離心5min，離心后加入RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液并吹勻，此時(shí)得到的RBL-2H3細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈分散的單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)加入的 RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液的量，分別制備RBL-2H3細(xì)胞濃度為5X 104、5X 105、2X 105、4X 105、 8X105、1.25X104,2.5X104,6.25X103 個(gè)/ml 的 RBL-2H3 細(xì)胞懸液。
所述不同濃度綠原酸溶液的配制方法是，將綠原酸粉末5mg用25mlDMEM培養(yǎng)液溶解，再用孔徑為0.2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌得到200 μ g/ml綠原酸母液，用DMEM培養(yǎng)液將綠原酸母液稀釋，得到100、50、25、12.5,6.25 μ g/ml的綠原酸溶液。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中 C02的體積濃度為5%，溫度為37°C;②設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將 100 μ I不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞培懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，選擇RBL-2H3 細(xì)胞加入到RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)到45h時(shí)RBL-2H3細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液濃度，即為實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度； ⑤分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加綠原酸溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)。
上述步驟④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線時(shí)，選擇最佳濃度時(shí)是經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)最終確定的，最后從2\105、4\105、5\105、8父105的中得到最佳的細(xì)胞濃度為2X IO5個(gè)/ml，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)一般是細(xì)胞在培養(yǎng)液中生長(zhǎng) 20 28h時(shí)，從中選擇最佳的時(shí)間點(diǎn)是23h時(shí)。
所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中 C02的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)將步驟(2) 確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳添加綠原酸溶液時(shí)間點(diǎn) 時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的綠原酸溶液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200μ 1RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；④設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸溶液溶液中RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。監(jiān)測(cè)結(jié)束后，將結(jié)果導(dǎo)入實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀Software 1.2.1中進(jìn)行分析，提取數(shù)據(jù)用Origin 8.5作圖，得到綠原酸溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)變化情況，見圖2，由圖可以看出，添加綠原酸溶液的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值減低，說(shuō)明綠原酸溶液會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)，并且綠原酸溶液的濃度越大，過(guò)敏反應(yīng)越強(qiáng)。利用現(xiàn)有方法檢查本發(fā)明方法的結(jié)果準(zhǔn)確及可靠性，現(xiàn)有方法中利用肥大細(xì)胞脫顆粒對(duì)綠原酸溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)衡量，一般采取的方法是利用顯微拍照觀察細(xì)胞是否有大量肥大細(xì)胞脫顆粒。以下利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)Compound 48/80溶液和綠原酸溶液致類過(guò)敏時(shí)，選取空白對(duì)照、具有代表性的2個(gè)濃度(50 μ g/ml、20 μ g/ml)在不同時(shí)間點(diǎn)(24h、30h、36h )進(jìn)行顯微拍照。Compound 48/80是已知的誘導(dǎo)類過(guò)敏反應(yīng)的藥物，配制不同濃度的Compound48/80溶液:精密稱取Compound 48/80粉末5mg，加入到50mlDMEM培養(yǎng)液中，完全溶解后用0.20 μπι微孔濾膜過(guò)濾除菌得到100 μ g/ml Compound 48/80母液，用培養(yǎng)液稀釋母液得到以下6個(gè)濃度:50、40、30、20、10、5 μ g/ml ;得到不同質(zhì)量濃度的Compound 48/80溶液后，利用實(shí)施例一中的檢測(cè)綠原酸溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，檢測(cè)不同濃度Compound48/80中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，見圖一，分析對(duì)比Compound 48/80溶液與綠原酸中的RBL-2H3細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，在前期未添加溶液時(shí)細(xì)胞都是處于快速增長(zhǎng)期，當(dāng)添加溶液后，細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)都開始下降，并且濃度值越高細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值越小，說(shuō)明綠原酸和已知的Compound 48/80溶液一樣，都會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)。再根據(jù)顯微鏡的照片，可以看出綠原酸和Compound 48/80 一樣，在它們?nèi)芤褐械腞BL-2H3細(xì)胞都具有肥大細(xì)胞脫顆粒，且濃度越高，脫顆粒越多。說(shuō)明本發(fā)明方法利用細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值作為衡量過(guò)敏反應(yīng)的指標(biāo)是準(zhǔn)確，并且可重復(fù)進(jìn)行。檢測(cè)試驗(yàn)并不是在一個(gè)實(shí)施例中進(jìn)行，為了確定本發(fā)明檢測(cè)綠原酸類成分溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法可靠、穩(wěn)定，是經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次上述試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證的，最終說(shuō)明本發(fā)明方法利用細(xì)胞 生長(zhǎng)指數(shù)值來(lái)衡量類過(guò)敏反應(yīng)是完全可以實(shí)現(xiàn)的，并且?guī)?lái)了操作手法方便，僅利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀自動(dòng)生成的圖譜就可判斷綠原酸類成分溶液是否會(huì)發(fā)生類過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，能夠精確的確定類過(guò)敏強(qiáng)弱的濃度范圍等具有實(shí)質(zhì)性地有益效果。實(shí)施例二:本實(shí)施例列舉的是監(jiān)測(cè)不同濃度下異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)值，所用的試驗(yàn)儀器同實(shí)施例一，異綠原酸A對(duì)照品(純度大于98%)，購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司。檢測(cè)不同濃度下異綠原酸A溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法步驟為，包括以下步驟，包括以下步驟，(I)分別制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液和異綠原酸A溶液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)異綠原酸A溶液導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加異綠原酸A溶液最佳時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)添加異綠原酸A溶液前后的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)添加異綠原酸A溶液后RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值的變化情況，判斷異綠原酸A溶液是否會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)。步驟(I)中制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液時(shí)，RBL-2H3是從Wistar大鼠保持腫瘤狀態(tài)的嗜堿性細(xì)胞中分離和克隆出來(lái)的嗜堿性白血病細(xì)胞株，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，利用現(xiàn)有的方法對(duì)RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)，RBL-2H3細(xì)胞用的培養(yǎng)液是質(zhì)量濃度為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，用體積濃度為5%C02，溫度為37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備RBL-2H3細(xì)胞懸液的具體步驟為選取在RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RBL-2H3細(xì)胞，用質(zhì)量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化，加入RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化、吹打初步得到細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)移至離心管離心5min，離心后加入RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液并吹勻，此時(shí)得到的RBL-2H3細(xì)胞懸液中的細(xì)胞呈分散的單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。根據(jù)加入的 RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液的量，分別制備RBL-2H3細(xì)胞濃度為5X 104、5X 105、2X 105、4X 105、 8X 105、1.25X104,2.5X104,6.25X103 個(gè) /ml 的 RBL-2H3 細(xì)胞懸液。
所述不同濃度異綠原酸A溶液的配制方法是，將異綠原酸A粉末5mg用25mlDMEM 培養(yǎng)液溶解，再用孔徑為0.2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌得到200 μ g/ml異綠原酸A母液，用 DMEM培養(yǎng)液將異綠原酸A母液稀釋，得到100、50、25、12.5,6.25 μ g/ml的異綠原酸A溶液。
所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中 C02的體積濃度為5%，溫度為37°C;②設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將 100 μ I不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞培懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，選擇RBL-2H3 細(xì)胞加入到RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)到45h時(shí)RBL-2H3細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液濃度，即為實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)異綠原酸A導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度；⑤分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加異綠原酸A溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)。
上述步驟④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線時(shí)，選擇最佳濃度時(shí)是經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)最終確定的，最后從2X 105、4X 105、5X 105、8X IO5的中得到最佳的細(xì)胞濃度為2X IO5個(gè)/ml，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)一般是細(xì)胞在培養(yǎng)液中生長(zhǎng) 20 28h時(shí)，從中選擇最佳的時(shí)間點(diǎn)是23h時(shí)。
所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入ΙΟΟμ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中 C02的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min,實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)將步驟(2) 確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳添加異綠原酸A溶液的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的異綠原酸 Α,另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ 1RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。
監(jiān)測(cè)結(jié)束后，將結(jié)果導(dǎo)入實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀Software 1.2.1中進(jìn)行分析，提取數(shù)據(jù)用Origin 8.5作圖，得到異綠原酸A溶液中RBL-2H3細(xì)胞的生長(zhǎng)指數(shù)變化情況，見圖3，由圖可以看出，添加異綠原酸A溶液的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值減低，說(shuō)明異綠原酸A溶液會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)，并且異綠原酸A溶液的濃度越大，過(guò)敏反應(yīng)越強(qiáng)。利用DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸、新綠原酸類過(guò)敏反應(yīng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)變化情況判斷是否發(fā)生類過(guò)敏反應(yīng)的方法同上述幾個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的方法還可用于檢測(cè)同一濃度下、不同種類的綠原酸單體是否導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)，還可用于評(píng)價(jià)不同濃度、不同種類的綠原酸單體導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)，以上僅為說(shuō)明發(fā)明內(nèi)容所列舉出的幾個(gè)實(shí)施例而已，一切基于本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容所做出成份、數(shù)量等簡(jiǎn)單的變化，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù) 范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟，(O分別制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液和綠原酸類成分溶液；(2)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3懸液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確定實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)添加綠原酸類成分溶液前后的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值，根據(jù)添加綠原酸類成分溶液后RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值的變化情況，判斷綠原酸類成分是否會(huì)導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀為DP型實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，所述綠原酸類成分為綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、隱綠原酸或新綠原酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，所述不同濃度綠原酸類成分溶液的配制方法是，將綠原酸類成分用RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液超聲溶解10 20min，再用孔徑為O. 2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌得到綠原酸類成分母液，再用RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液將綠原酸類成分母液稀釋，得到不同濃度的綠原酸類成分溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，所述RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液為質(zhì)量濃度15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液或質(zhì)量濃度15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入 οομ I的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中C02的體積濃度為5%，溫度為37°C;②設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀未有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)分別將100 μ I不同細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液加入每個(gè)檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中，設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，測(cè)量實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀有RBL-2H3細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)；④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，選擇RBL-2H3細(xì)胞加入到RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液后最快經(jīng)過(guò)潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且當(dāng)實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)到45h時(shí)RBL-2H3細(xì)胞仍能處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液濃度，即為實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度分析④步確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為I的時(shí)間點(diǎn)，即為添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，步驟④分析比較不同濃度RBL-2H3細(xì)胞懸液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)曲線時(shí)，不同濃度RBL-2H3細(xì)胞細(xì)胞懸液是RBL-2H3細(xì)胞濃度為2X 105、4X 105、5X 105、8X 105的細(xì)胞懸液，上述RBL-2H3濃度的單位為個(gè)/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，步驟④確定的用于實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度為2X 105個(gè)/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，其特征在于，所述步驟(3)的具體操作步驟是，①在實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀的檢測(cè)板每個(gè)板孔中分別加入ΙΟΟμ I 的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再將檢測(cè)板置入培養(yǎng)箱中的細(xì)胞分析儀上，培養(yǎng)箱中C02的體積濃度為5%，溫度為37°C，設(shè)置信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)未有RBL-2H3 細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)，將此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)定位基準(zhǔn)將步驟(2)確定的最佳細(xì)胞濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液100 μ I加入到每個(gè)檢測(cè)板板孔的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液中， 設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/15min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀對(duì)培養(yǎng)液中RBL-2H3的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；③待細(xì)胞生長(zhǎng)到步驟(2)確定的最佳添加綠原酸類成分溶液的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，吸棄檢測(cè)板板孔中的RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每個(gè)板孔中加入200 μ I不同濃度的綠原酸類成分溶液，另設(shè)置2個(gè)板孔，添加200 μ 1RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)液，即為空白對(duì)照板孔；④設(shè)定信號(hào)采集頻率為I次/min，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分溶液中RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開的一種檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的方法，包括以下步驟，(1)分別制備不同濃度的RBL-2H3細(xì)胞懸液和綠原酸類成分溶液；(2)確定實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)時(shí)使用的RBL-2H3細(xì)胞懸液的最佳細(xì)胞濃度及添加綠原酸類成分溶液的最佳時(shí)間點(diǎn)；(3)利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)添加綠原酸類成分溶液前后的RBL-2H3細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)值。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，可實(shí)時(shí)反映RBL-2H3細(xì)胞在添加綠原酸類成分溶液前后經(jīng)歷的生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡生理狀態(tài)，并且能夠得出綠原酸類成分導(dǎo)致類過(guò)敏反應(yīng)的溶液濃度范圍。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK103255197SQ20131021062
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月31日
發(fā)明者鄢丹, 馬麗娜, 張樂(lè)樂(lè), 韓玉梅, 張毅, 肖小河 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三0二醫(yī)院