專利名稱：一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶a熱穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
酶是一類非常重要的蛋白質(zhì)，能夠在生物體內(nèi)溫和的條件下催化多樣的化學(xué)反應(yīng)。目前，脂肪酶作為一類重要的生物催化劑被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。枯草芽孢桿菌脂肪酶A是最小的脂肪酶(19kDa)，并且缺乏大多數(shù)脂肪酶特有的蓋子結(jié)構(gòu)，因而沒有“界面效應(yīng)”。枯草芽孢桿菌脂肪酶A屬于“真酯酶”亞家族1.4，在中性或偏堿性的條件下具有良好的穩(wěn)定性。但是亞家族1.4脂肪酶對(duì)溫度極其敏感。枯草芽孢桿菌脂肪酶A的最適合溫度為35°C，溫度超過40°C時(shí)，其酶活急劇下降。熱穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)工業(yè)生物催化劑的一個(gè)重要指標(biāo)，工業(yè)上提高反應(yīng)溫度，可以提高轉(zhuǎn)化率、底物可溶性、降低微生物污染的可能性等，因而提高酶的耐溫性是酶工業(yè)化亟待解決的問題之一。雖然目前已經(jīng)有大量的關(guān)于酶熱穩(wěn)定性改造研究的報(bào)道，但是由于多數(shù)實(shí)驗(yàn)方案集中于定向進(jìn)化高通量篩選與高性能計(jì)算機(jī)篩選。前者雖然不需要了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其功能的關(guān)系，但是高通量篩選方法常常伴隨篩選工作量大、過程復(fù)雜等不足；后者對(duì)計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力要求嚴(yán)格，往往需要價(jià)格昂貴的高性能服務(wù)器的支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種高效的計(jì)算機(jī)輔助篩選提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的方法。如圖1所示，本發(fā)明的技術(shù)目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種提高枯草芽抱桿菌脂肪酶A (Bacillus subtilis lipase A,PDB:1I6W)熱穩(wěn)定性的方法，包括如下步驟:I)預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌脂肪酶A氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域；2)確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)；3)結(jié)合步驟I)與2)分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)；4)基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知，采用分子模擬技術(shù)解析離子鍵引入對(duì)穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制；5)構(gòu)建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株，并驗(yàn)證突變株的熱穩(wěn)定性，得到熱穩(wěn)定性提高后的枯草芽孢桿菌脂肪酶A。具體的，步驟I)所述的預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌脂肪酶A氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域的方法為:利用HotSpot Wizard在線服務(wù)器，對(duì)超過50種枯草芽孢桿菌脂肪酶家族蛋白一級(jí)序列進(jìn)行靜態(tài)分析比對(duì)，獲得枯草芽孢桿菌脂肪酶A每一個(gè)殘基可突變率及突變結(jié)果，篩選突變率高的氨基酸殘基位點(diǎn)，同時(shí)排除催化活性中心及底物通道周圍的功能氨基酸，從而預(yù)測(cè)氨基酸突變的熱 點(diǎn)區(qū)域。
步驟2)所述的蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)的確定方法是:利用Pymol可視化軟件與B-因子(B-factor)來得；利用分子動(dòng)力學(xué)方法，獲得枯草芽孢桿菌脂肪酶A的RMSF (Root Mean Square Fluctuation),從而確定枯草芽孢桿菌脂肪酶A柔性較大的區(qū)域，并結(jié)合Pymol可視化軟件，確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)。步驟3)的分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)方法是結(jié)合步驟I)與2)分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn):首先在于步驟2)后，得到的氨基酸位點(diǎn)突變可以選擇性突變?yōu)槌商於彼?Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)四種氨基酸殘基的任意一種；再利用Pymol可視化軟件，以該氨基酸為中心，在4 4A范圍內(nèi)尋找上述4種氨基酸中帶相反電荷的氨基酸殘基，從而確定突變位點(diǎn)及突變殘基為:Gln60Lys、Gln60Asp、Gln60Glu、GlylllAsp、Serl67Asp、Asnl74Glu、Glyl75Lys。步驟4)所述的基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知，采用分子模擬技術(shù)解析離子鍵引入對(duì)穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制的方法為:所有的模擬和分析都用GR0MACS4.5.4進(jìn)行，力場(chǎng)為GR0M0S9643al，溫度為500K，pH=7.0 ;體系采用周期性立方體盒子，枯草芽孢桿菌脂肪酶A的周圍填充水分子1.0nm，加入CL離子中和體系電荷，溶劑模型采用顯式模型SPC ;模擬首先進(jìn)行5000步的最速下降法能量最小化(Steepest Descent);然后進(jìn)行約束優(yōu)化，約束枯草芽孢桿菌脂肪酶A，采用壓力(Parrinello-Rahman)與溫度(V_rescale),進(jìn)行IOOps的平衡模擬；長程靜電相互作用采用PME(ParticleMeshEwald)法，短程作用力的閥值(rlist)為1.0nm、范德華(vdW)相互作用的截?cái)嘀?rvdw)為1.0nm,庫侖相互作用的截?cái)嘀?rco μ Lomb)為1.0nm;最后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，沒有約束，模擬時(shí)間為7ns，時(shí)間步長為2fs ;體系中各原子的坐標(biāo)每Ips收集I次；通過分析 均方根偏差RMSD (Root Mean Square Deviation)、均方根漲落 RMSF (Root Mean Square Fluctuation)、回轉(zhuǎn)半徑 Rg (Radius of Gyration)、溶液可及表面積 SAS (Solvent Accessible Surface)、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量(The content of secondarystructure)、氫鍵(hydrogen bond)、鹽鍵(salt bond)參數(shù),來解析突變位點(diǎn)對(duì)枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定的貢獻(xiàn)，確定得到提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的重要氨基酸位點(diǎn)是 Asnl74Glu。步驟5)所述的分子生物學(xué)構(gòu)建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株的方法是采用全質(zhì)粒擴(kuò)增的方式進(jìn)行突變:設(shè)計(jì)引物，引物上分別Asnl74Glu,用primSTAR對(duì)全質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH5 α，涂布LB平板，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中；過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)，涂布平板，構(gòu)建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變菌BL21-pET22b-Lip-A。其次，驗(yàn)證枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株的熱穩(wěn)定性:將突變菌接到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，離心收集細(xì)胞，破碎，上清液用Ni柱純化。將原始菌與突變株的發(fā)酵液在40°C下，保存lOmin，測(cè)定殘余活力。測(cè)定酶活:兩個(gè)空白，兩個(gè)樣品，240 μ L底物溶液，IOyL酶液反應(yīng)lOmin，波長405下測(cè)定酶活，結(jié)果證明本發(fā)明得到的枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株產(chǎn)生的枯草芽孢桿菌脂肪酶A在高溫下酶活得到明顯提高。本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明以枯草芽孢桿菌脂肪A (PDB:1I6W)為研究對(duì)象，首先利用HotSpot Wizard在線服務(wù)器來虛擬篩選突變熱點(diǎn)區(qū)域；再利用Pymol可視化軟件與B-因子(B-factor)，來確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)；結(jié)合上述兩步理性分析，篩選得到的氨基酸位點(diǎn)突變成天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)四種氨基酸殘基的任意一種，并利用Pymol可視化軟件，以該氨基酸為中心，在4 A范圍內(nèi)尋找上述4種氨基酸中帶相反電荷的氨基酸殘基，從而確定突變位點(diǎn)及突變殘基；基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知，再通過分子模擬技術(shù)解析離子鍵引入對(duì)穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制；最終，通過枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證熱穩(wěn)定改造的熱點(diǎn)殘基，最終實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌脂肪酶A的熱穩(wěn)定性的顯著提高。通過HotspotWizard與理性分析結(jié)合，快速篩選出對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用的殘基，克服了傳統(tǒng)方法定向進(jìn)化等方法高通量篩選及高性能計(jì)算機(jī)篩選巨大運(yùn)算量的缺點(diǎn)，方法簡單快捷，是一種聞效的提聞脂肪酶熱穩(wěn)定性方法。


圖1本發(fā)明枯草芽孢桿菌脂肪酶A篩選熱穩(wěn)定點(diǎn)示意圖。圖2本發(fā)明中Lip-A及Lip-AN174E突變體的Ca -RMSD隨時(shí)間演變圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本實(shí)施例說明本發(fā)明的步驟I)的預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌脂肪酶A氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域的方法。以枯草芽孢桿菌脂肪 酶A (Bacillus subtilis lipase A，PDB: 1I6W)為研究目標(biāo)，利用HotSpot Wizard在線服務(wù)器，虛擬篩選突變熱點(diǎn)區(qū)域，對(duì)超過50種枯草芽孢桿菌脂肪酶家族蛋白一級(jí)序列進(jìn)行靜態(tài)分析比對(duì)，獲得枯草芽孢桿菌脂肪酶A每一個(gè)殘基可突變率及突變結(jié)果，篩選突變率高的氨基酸殘基位點(diǎn)，同時(shí)排除催化活性中心及底物通道周圍的功能氨基酸，從而預(yù)測(cè)氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域。該輪篩選熱穩(wěn)定點(diǎn)以突變率為9的殘基進(jìn)行。如第一輪以突變率為9的殘基不能篩選合理突變點(diǎn)，進(jìn)而第二輪可以研究突變率為7或者8的殘基。最終，本輪篩選的結(jié)果是:Ala20、Tyr25、Val27、Ser29、Ser32、Tyr49、Asn50、Val50、Val54、Phe58、Gln60、Ala97、Glylll、Proll8、Glnl50、Asnl74、Glyl75、Glyl76。實(shí)施例2本實(shí)施例說明本發(fā)明的步驟2)的確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)的方法。利用Pymol可視化軟件與B-因子(B_factor)來確定蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)。利用PyMOl可視化確定位于蛋白表面氨基酸過程:PyM0L>load 1I6W.pdb (打開枯草芽孢桿菌脂肪酶A三維結(jié)構(gòu))；PyM0L>show surface (蛋白以表面形式表示出來)；PyM0L>color white (蛋白表面以白色顯不)；PyM0L>select3, resi3 (3代表第三位殘基,后面殘基顯不以此方式類推)；
PyM0L>color red, 3 (將第三位氨基酸以紅色表示,判斷是否位于蛋白表面)；PyMODcolor white, 3 (將第三位氨基酸表位白色)。重復(fù)上述操作，繼續(xù)判斷下一位氨基酸，得到位于蛋白表面的氨基酸:His3、Asn4、Glyl3、Alal5、Serl6、Phel7、Asnl8、Ala20、Gly21、Lys23、Ser24、Tyr25、Val27、Ser28、Gln29、Gly30> Ser32> Arg33> Asp34、Lys35> Tyr37> Ala38、Asp40、phe41、Trp42> Asp43、lys44> Thr45> Thr47> Asn48、Tyr49> Asn50、Pro53> Val54、Ser56> Arg57> Phe58、Gln60、Lys61> Leu63、Asp64、Glu65、Thr66> Gly67> Ala68、Lys69> Lys70> His76、Ser77> Met78、Tyr85> Ile87、Lys88> Asn89、Leu90、Asp91、Gly93> Asn94、Lys95> Asn98、Argl07> Leul08、Thrl09、Thrll0、Glylll、Lysll2、Leull4、Proll5、Glyll6、Thrll7、Aspll8、Proll9、Asnl20、Glnl21、Lysl22、Leul24、Tyrl29、Serl31、Alal32、Aspl33、Metl34、Ilel35、Vall36、Metl37、Asnl38、Tyrl39、Leul40、Argl42、Aspl44、Glyl45、Alal46、Argl47、Asnl48、Vall49、Glnl50、Ilel51、Hisl52、Glyl53、Vall54、Glyl55、HiS156、Ilel57、Glyl58、Tyrl61、Serl62、Serl63、Glnl64、Asnl66、Leul68、Lysl70、Glul71、Asnl74、Glyl75、Glyl76、Glyl77、Glnl78、Asnl79、Thrl80、Asnl81。利用分子動(dòng)力學(xué)方法，獲得枯草芽孢桿菌脂肪酶A的均方根漲落RMSF (Root MeanSquare Fluctuation),從而確定枯草芽孢桿菌脂肪酶A位于柔性較大的區(qū)域的殘基。通過上述步驟結(jié)合，確定以下殘基:Asn4、Glyl3、Alal5、Serl6、Val27、Ser28、Gln29、Gly30、Ser32、Ala38、Phe41、Trp42、Thr45、Thr47、Asn48、Gln60、Thr66、Gly67、Ala68、Met78、Asn89、Leu90、Gly93、Asn94、Asn98、Thrl09、Thrll0、Glylll、Leull4、Proll5、Glyll6、Thrll7、Proll9、Asnl20、Glnl21、Leul24、Alal32、、Metl34、Glyl45、Alal46、Glnl50、Ilel51、Glyl53、Vall54、Glyl55、Tyrl61、Serl62、Serl63、Serl67、Asnl74、Glyl75、Glyl76、Glyl77、Glnl78、A snl79、Thrl80、Asnl81 位于蛋白質(zhì)表面且 RMSF 值較大。實(shí)施例3本實(shí)施例說明結(jié)合實(shí)施例1與實(shí)施例2獲得結(jié)果，分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)的方法。結(jié)合實(shí)施例1與2獲得結(jié)果，確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)，若突變成天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)四種氨基酸殘基的任意一種，可以使該酶熱穩(wěn)定性提聞。利用Pymol可視化軟件，以該氨基酸為中心，在4 A范圍內(nèi)尋找上述4種氨基酸中帶相反電荷的氨基酸殘基過程。PyM0L>select60, resi60 (選中可以突變的氛基酸)；PyMODselect near60, 60expand4 (選中4 A范圍的殘基，確定是否與此帶相反電荷的殘基)。通過上述分析，最終確定了表I的以下高突變率殘基及結(jié)果，可能對(duì)枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性起到重要作用。表I枯草芽孢桿菌脂肪酶A高突變率殘基及突變結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌脂肪酶A氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域； 2)確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)； 3)結(jié)合步驟I)與2)分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)； 4)基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知，采用分子模擬技術(shù)解析離子鍵引入對(duì)穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制； 5)構(gòu)建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株，并驗(yàn)證突變株的熱穩(wěn)定性，得到熱穩(wěn)定性提高后的枯草芽孢桿菌脂肪酶A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟I)所述的預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌脂肪酶A氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域的方法為:利用HotSpot Wizard在線服務(wù)器，對(duì)超過50種枯草芽孢桿菌脂肪酶家族蛋白一級(jí)序列進(jìn)行靜態(tài)分析比對(duì)，獲得枯草芽孢桿菌脂肪酶A每一個(gè)殘基可突變率及突變結(jié)果，篩選突變率高的氨基酸殘基位點(diǎn)，同時(shí)排除催化活性中心及底物通道周圍的功能氨基酸，從而預(yù)測(cè)氨基酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述的蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)的確定方法是:利用Pymol可視化軟件與B-因子來得；利用分子動(dòng)力學(xué)方法，獲得枯草芽孢桿菌脂肪酶A的RMSF，從而確定枯草芽孢桿菌脂肪酶A柔性較大的區(qū)域，并結(jié)合Pymol可視化軟件,確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)所述的分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn)方法是結(jié)合步驟I)與2)分析確定與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸突變位點(diǎn):首先在于步驟2)后，得到的氨基酸位點(diǎn)突變可以選擇性突遍為成天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸四種氨基酸殘基的任意一種；再利用Pymol可視化軟件，以該氨基酸為中心，在4A范圍內(nèi)尋找上述4種氨基·酸中帶相反電荷的氨基酸殘基，從而確定突變位點(diǎn)及突變殘基為:Gln60Lys、Gln60Asp、Gln60Glu、GlylllAsp、Serl67Asp、Asnl74Glu、Glyl75Lys。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟4)所述的基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知，采用分子模擬技術(shù)解析離子鍵引入對(duì)穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制的方法為:所有的模擬和分析都用GR0MACS 4.5.4進(jìn)行，力場(chǎng)為GR0M0S96 43al，溫度為500 K，pH=7.0 ;體系采用周期性立方體盒子，枯草芽孢桿菌脂肪酶A的周圍填充水分子1.0 nm,加入CL離子中和體系電荷，溶劑模型采用顯式模型SPC ;模擬首先進(jìn)行5000步的最速下降法能量最小化；然后進(jìn)行約束優(yōu)化，約束枯草芽孢桿菌脂肪酶A，采用壓力與溫度，進(jìn)行100 ps的平衡模擬；長程靜電相互作用采用PME法，短程作用力的閥值為1.0nm、范德華相互作用的截?cái)嘀禐?.0 nm，庫侖相互作用的截?cái)嘀禐?.0 nm ;最后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，沒有約束，模擬時(shí)間為7 ns，時(shí)間步長為2 fs;體系中各原子的坐標(biāo)每I ps收集I次；通過分析均方根偏差RMSD、均方根漲落RMSF、回轉(zhuǎn)半徑Rg、溶液可及表面積SAS、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量、氫鍵、鹽鍵參數(shù)，來解析突變位點(diǎn)對(duì)枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定的貢獻(xiàn)，確定得到提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的重要氨基酸位點(diǎn)是Asnl74Glu。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟5)所述的分子生物學(xué)構(gòu)建枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株的方法是采用全質(zhì)粒擴(kuò)增的方式進(jìn)行突變:設(shè)計(jì)引物，引物上Asnl74Glu，用prim STAR對(duì)全質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH5 α，涂布LB平板，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中；過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入BL21，涂布平板，構(gòu)建枯草芽孢 桿菌脂肪酶A突變菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高枯草芽孢桿菌脂肪酶A熱穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌脂肪A為研究對(duì)象，首先篩選突變熱點(diǎn)區(qū)域；再確定位于蛋白質(zhì)表面且柔性較大區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)；結(jié)合上述兩步理性分析，篩選得到的氨基酸位點(diǎn)突變成天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸四種氨基酸殘基的任意一種，并以該氨基酸為中心，在4 范圍內(nèi)尋找上述4種氨基酸中帶相反電荷的氨基酸殘基，從而確定突變位點(diǎn)及突變殘基；基于對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知，再解析離子鍵引入對(duì)穩(wěn)定枯草芽孢桿菌脂肪脂肪酶A蛋白結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制；最終，通過枯草芽孢桿菌脂肪酶A突變株的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證熱穩(wěn)定性改造的熱點(diǎn)殘基。
文檔編號(hào)C12N9/20GK103243078SQ20131020838
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月29日
發(fā)明者黃和, 張洋, 江凌, 胡燚, 李曉彤, 張紅漫 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)