專利名稱：以受體為基礎的拮抗劑和制備方法及用途的制作方法
本申請要求1999年5月19日提交的美國申請?zhí)?9/313,942的優(yōu)先權(quán)、要求1998年9月25日提交的美國臨時申請?zhí)?0/101,858的優(yōu)先權(quán)。貫穿于本申請中的各種公開文獻作為參考。將這些文獻所公開的全部技術內(nèi)容引入本文作為本申請的參考。
背景技術：
盡管發(fā)現(xiàn)了不同的生物活性，但是睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、致癌蛋白M(OSM)和白細胞介素-6(IL-6)包括在所定義的細胞因子族中(本文指的是細胞因子的“CNTF族”)。這些細胞因子被分在一組的原因是因其不同的結(jié)構(gòu)相似性[Bazan，《神經(jīng)元雜志》(J.Neuron)7197-208(1991)；Rose和Bruce，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)888641-8645(1991)]并且可能更重要的是因為它們共有“β”信號轉(zhuǎn)導受體成分[Baumann等《生化雜志》(J.Bio.Chem.)26519853-19862(1993)；Davis等《科學》(Science)2601805-1808(1993)；Gearing等《科學》(Science)2551434-1437(1992)；Ip等《細胞》(Cell)691121-1132(1992)；Stahl等《生化雜志》(J.Bio.Chem.)2687628-7631(1993)；Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。通過該族細胞因子激活受體是由這些β成分的同二聚化或異二聚化所導致的[Davis等《科學》(Science)2601805-1808(1993)；Murakami等《科學》(Science)2601808-1810(1993)；Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。IL-6受體的激活需要gp130的同二聚化[Murakami等《科學》(Science)2601808-1810(1993)；Hibi等《細胞》(Cell)631149-1157(1990)]，所述的gp130是一種開始鑒定為IL-6信號轉(zhuǎn)導物的蛋白質(zhì)[Hibi等《細胞》(Cell)631149-1157(1990)]。CNTF、LIF和OSM受體的激活是由gp130與第二種與gp130相關的稱作LIFRβ的蛋白質(zhì)之間的異二聚化所導致的[Davis等《科學》(Science)2601805-1808(1993)]，所述的LIFRβ開始因其結(jié)合LIF的能力而被鑒定[Gearing等《歐洲分子生物學協(xié)會雜志》(EMBO J.)102839-2848(1991)]。
除β成分外，這些細胞因子中的某些還需要確定特異性的“α”成分，它們比β成分更局限于其組織分布且由此可確定特定細胞因子的細胞靶物[Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。因此，LIF和OSM是廣泛起作用的因子，它們僅需要在響應細胞上存在gp130和LIFRβ，而CNTF需要CNTFRα[Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]且IL-6需要IL-6Rα[Kishimoto《科學》(Science)258593-597(1992)]。CNTFRα(Davis等《科學》(Science)2591736-1739(1993))和IL-6Rα[Hibi等《細胞》(Cell)631149-1157；Murakami等《科學》(Science)2601808-1810(1990)；Taga等《細胞》(Cell)58573-581(1989)]可以起可溶性蛋白質(zhì)的作用，這與它們不與胞內(nèi)信號傳輸分子發(fā)生相互作用而用于幫助其配體與合適的信號轉(zhuǎn)導β亞單位發(fā)生相互作用的觀點相一致[Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。
來自其它細胞因子系統(tǒng)的附加證據(jù)也支持了二聚化提供了一種通常的機理的觀點，所有細胞因子受體通過該機理啟動信號轉(zhuǎn)導。在這方面，生長激素(GH)可能用作最佳的實例。晶體學研究已經(jīng)顯示各GH分子含有兩種不同的受體結(jié)合位點，它們均由受體中相同結(jié)合結(jié)構(gòu)域來識別，使得單一GH分子連接兩種受體分子[de Vos等《科學》(Science)255306-312(1992)]。二聚化依次發(fā)生，首先在GH上的位點1與一種受體分子結(jié)合，隨后位點2與第二種受體分子結(jié)合[Fuh等《科學》(Science)2561677-1680(1992)]。當紅細胞生成素(EPO)受體主要被引入半胱氨酸殘基并產(chǎn)生二硫鍵連接的同二聚體的單一氨基酸改變所激活時，使用紅細胞生成素(EP0)受體進行的研究也與受體激活中二聚化的重要性一致[Watowich等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)892140-2144(1991)]。
除β亞單位的同或異二聚化作為受體激活的關鍵步驟外，第二種重要特征在于由CNTF族細胞因子形成最終受體復合物通過一種機理而發(fā)生，由此配體以一種有序方式依次結(jié)合受體成分[Davis等《科學》(Science)2601805-1818(1993)；Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。因此，在最終使LIFRβ恢復成啟動信號轉(zhuǎn)導的β成分的異二聚體前，CNTF首先結(jié)合CNTFRα，從而形成一種復合物，該復合物結(jié)合gp130以形成因僅具有單一β成分而不適宜信號傳輸?shù)闹虚g體(此處稱作αβ1中間體)。盡管尚未直接分離含有與IL-6Rα和gp130單一分子結(jié)合的IL-6的類似中間體，但是我們已經(jīng)根據(jù)與其相對較遠的相關性(CNTF)類似以及最終活性IL-6受體復合物恢復兩種gp130單體這一事實推定它確實存在?？偠灾?，這些發(fā)現(xiàn)對一類細胞因子受體復合物的結(jié)構(gòu)提出了建議(附

圖1)，其中各細胞因子最高可以含有3個受體結(jié)合位點一個是結(jié)合可選擇的α特異性決定成分的位點(α位點)；一個是結(jié)合第一種β信號轉(zhuǎn)導成分的位點(β1位點)；且一個是結(jié)合第二種β信號轉(zhuǎn)導成分的位點(β2位點)[Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。以順序方式使用這3個位點，在復合物形成過程的最后步驟即導致β成分異二聚化的過程中，關鍵在于啟動信號轉(zhuǎn)導[Davis等《科學》(Science)2601805-1818(1993)]。有關受體激活的具體方式和用于CNTF的非功能性β1中間體存在的知識已經(jīng)導致了這樣一種發(fā)現(xiàn)、即CNTF在某些情況中是一種IL-6的高親和性拮抗劑并提供了設計以配體或受體為基礎的如下具體所述細胞因子CNTF族的拮抗劑的基礎策略。
一旦細胞因子的結(jié)合誘導受體復合物形成，則β成分的二聚化激活使各種底物磷酸化的胞內(nèi)酪氨酸激酶活性[Ip等《細胞》(Cell)69121-1132(1992)]。這種酪氨酸激酶的激活看起來是下游事件的關鍵，這是因為阻斷酪氨酸磷酸化的抑制劑也可防止諸如基因誘導這樣的隨后發(fā)生的事件[Ip等《細胞》(Cell)69121-1132(1992)；Nakajima和Wall，《細胞分子生物學》(Mol.Cell.Biol.)111409-1418(1991)]。近來，我們已經(jīng)證實新近發(fā)現(xiàn)的包括Jak1、Jak2和Tyk2(稱作Jak/Tyk激酶)[Firmbach-Kraft等《癌基因》(Oncogene)51329-1336(1990)；Wilks等《細胞分子生物學》(Mol.Cell.Biol.)112057-2065(1991)]并涉及與其它細胞因子信號轉(zhuǎn)導[Argetsinger等《細胞》(Cell)74237-244(1993)；Silvennoinen等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908429-8433(1993)；Velazquez等《細胞》(Cell)70313-322(1992)；Witthuhn等《細胞》(Cell)74227-236(1993)]的非受體酪氨酸激酶族在沒有配體存在的情況下預先與β亞單位gp130和LIFRβ的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域連接并在添加配體時使酪氨酸磷酸化和被激活[Stahl等《科學》(Science)26392-95(1994)]。因此，這些激酶作為細胞外部配體結(jié)合結(jié)果出現(xiàn)在細胞內(nèi)部激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的最接近的步驟中。下面描述檢測系統(tǒng)，它用于篩選以該系統(tǒng)為基礎的特異性激動劑或拮抗劑活性的小分子收集物。
CNTF族細胞因子在提供拮抗劑和激動劑的潛在治療應用的各種生理過程中起重要作用。
發(fā)明概括本發(fā)明的一個目的是用于治療與細胞因子相關的疾病或紊亂的細胞因子拮抗劑的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的另一個目的是所公開的細胞因子拮抗劑在治療與細胞因子相關的疾病或紊亂中的用途。例如，可以將本文所述的IL-6拮抗劑用于治療骨質(zhì)疏松、包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的癌癥的初期和二期結(jié)果或惡病質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是開發(fā)用于鑒定細胞因子受體的新型激動劑和拮抗劑的篩選系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是開發(fā)用于鑒定起CNTF族細胞因子激動劑或拮抗劑作用的小分子的篩選系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是開發(fā)用于鑒定CNTF族細胞因子的新型激動劑和拮抗劑的篩選系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是開發(fā)用于鑒定CNTF族細胞因子的新型激動劑和拮抗劑的篩選系統(tǒng)。
附圖簡述附圖1一類細胞因子受體模型中受體成分的順序結(jié)合。該模型顯示細胞因子最高含有3種受體結(jié)合位點且通過結(jié)合第一種可選擇的α成分、隨后結(jié)合β1且然后是β2而與其受體成分發(fā)生相互作用。許多細胞因子受體的β成分通過膜近側(cè)區(qū)(陰影部分)與Jak/Tyk族的胞質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶發(fā)生相互作用。僅在β成分的二聚化時啟動信號轉(zhuǎn)導，正如β成分和Jak/Tyk激酶的酪氨酸磷酸化(P)的圖解表示的。
附圖2CNTF在表達IL6Rα、gp130、CNTFRα而不是LIFRβ的PC12細胞系(稱作PC12D)中抑制IL-6響應。在有或沒有所述CNTF存在的情況下培養(yǎng)不含血清的PC12D細胞+IL-6(50ng/mL)。某些平板還含有所指示的可溶性IL6Rα(1mg/mL)或可溶性CNTFRα(1mg/mL)。用抗-gp130對細胞裂解物進行免疫沉淀并用抗磷酸酪氨酸進行免疫印跡。酪氨酸磷酸化的特征在于IL-6誘導的IL-6受體系統(tǒng)激活，它在共同添加CNTF時被阻斷。
附圖3碘化CNTF結(jié)合在PC12D細胞上的斯卡查德分析。在有或沒有用以測定特異性結(jié)合情況的過量非放射性競爭劑存在的情況下用不同濃度的碘化CNTF培養(yǎng)PC12D細胞。該附圖表示了特異性結(jié)合的一定量碘化CNTF的斯卡查德圖并給出了符合帶有9pM和3.4nM解離常數(shù)的兩種結(jié)合位點的數(shù)據(jù)。
附圖4人gp130-Fc-His6氨基酸序列。1-169位氨基酸來自人gp130(Hibi等《細胞》(Cell)631149-1157(1990))。注意2位氨基酸已經(jīng)由Leu改變成了Val以便順應編碼DNA序列中的Kozak序列。用斜體字表示gp130-Fc-His6的信號肽(1-22位氨基酸)。用粗體型字表示Ser-Gly的橋連(620、621位氨基酸)。662-853位氨基酸來自人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域(Lewis等《免疫學雜志》(J.Immunol.)1512829-2838(1993))。()表示位于形成連接兩個Fc結(jié)構(gòu)域的鏈間二硫鍵的Fc之前的IgG鉸合部的兩個半胱氨酸(632和635位氨基酸)。用粗體/斜體型字表示六組氨酸標記(854-859位氨基酸)。(·)表示終止(STOP)密碼子的位置。
附圖5人IL-6Rα-Fc的氨基酸序列。關鍵1-358位氨基酸來自人IL-6Rα(Yamasaki等《科學》(Science)241825-828(1988))。注意2位氨基酸已經(jīng)由Leu改變成了Val以便順應編碼DNA序列中的Kozak序列。用斜體字表示IL-6Rα-Fc的信號肽(1-19位氨基酸)。用粗體型字表示Ala-Gly的橋連(359、360位氨基酸)。361-592位氨基酸來自人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域(Lewis等《免疫學雜志》(J.Immunol.)1512829-2838(1993))。()表示位于形成連接兩個Fc結(jié)構(gòu)域的鏈間二硫鍵的Fc之前的IgG鉸合部的兩個半胱氨酸(371和374位氨基酸)。(·)表示終止(STOP)密碼子的位置。
附圖6CNTF/IL-6/IL-11受體系統(tǒng)。圖解描繪了有序形成的六聚化信號轉(zhuǎn)導受體復合物。細胞因子與Rα成分結(jié)合而形成一種專性細胞因子·Rα復合物(Kd約為5nM)。這種低親和性復合物接下來與第一種信號轉(zhuǎn)導成分(標記的β1)結(jié)合而形成一種高親和性細胞因子·Rα·β1復合物(Kd約為10pM)。就IL-6Rα而言，這種成分是gp130。這種三聚化高親和性復合物隨后與另一種這類復合物結(jié)合。這種復合物的形成產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導，此時它分別涉及兩種信號轉(zhuǎn)導成分即標記的β1和β2的二聚化(選自(Ward等《生物化學雜志》(J.Bio.Chem.)26923286-23289(1994)；Stahl和Yancopoulos《神經(jīng)生物學雜志》(J.Neurobiology)251454-1466(1994)；Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)))。
附圖7以異二聚化受體為基礎的用于IL-6的配體捕獲物的設計。異二聚化配體捕獲物(trap)由兩個鏈間二硫鍵連接的蛋白質(zhì)gp130-Fc和IL-6Rα-Fc組成。證實gp130-Fc·IL-6Rα-Fc復合物(上組)可模擬高親和性細胞因子·Rα·β1復合物(下組)。配體捕獲物通過隔離IL-6且由此不用來與IL-6-響應細胞上的天然受體發(fā)生相互作用而起拮抗劑的作用。
附圖8異二聚化免疫球蛋白重鏈/輕鏈受體融合體。圖解描繪了重鏈/輕鏈受體融合分子的一個實例。gp130的胞外結(jié)構(gòu)域與Cγ融合，而IL-6Rα的胞外結(jié)構(gòu)域與κ鏈(κ)的恒定區(qū)融合。還描繪了鏈間二硫鍵(S-S)。
附圖9gp130-Cγ1的氨基酸序列。關鍵1-619位氨基酸來自人gp130(Hibi等《細胞》(Cell)631149-1157(1990))。用粗體型字表示Ser-Gly的橋連。662-651位氨基酸來自人IgG1的恒定區(qū)(Lewis等《免疫學雜志》(J.Immunol.)1512829-2838(1993))。(*)表示終止(STOP)密碼子的位置。
附圖10gp130Δ3fibro的氨基酸序列。關鍵1-330位氨基酸來自人gp130(Hibi等《細胞》(Cell)631149-1157(1990))。其它符號如附圖9中所述。
附圖11J-CH1的氨基酸序列。關鍵用粗體型字表示Ser-Gly的橋連，用斜體字表示J-肽，給CH1結(jié)構(gòu)域加下劃線。
附圖12Cγ4的氨基酸序列。關鍵用粗體型字表示Ser-Gly的橋連，2-239位氨基酸包括Cγ4序列。
附圖13κ結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。關鍵用粗體型字表示Ser-Gly的橋連，2-108位氨基酸包括κ結(jié)構(gòu)域。涉及含有Cγ的CH1結(jié)構(gòu)域的κ結(jié)構(gòu)域二硫鍵的是C-末端半胱氨酸(108位氨基酸)。
附圖14λ-結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。關鍵用粗體型字表示Ser-Gly的橋連，2-106位氨基酸包括λ結(jié)構(gòu)域(Cheung等《病毒學雜志》(J.Virol.)666714-6720(1992))。涉及含有Cγ的CH1結(jié)構(gòu)域的λ結(jié)構(gòu)域二硫鍵的是C-末端半胱氨酸(106位氨基酸)。
附圖15可溶性IL-6Rα結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。關鍵1-358位氨基酸包括可溶性IL-6Rα結(jié)構(gòu)域(Yamasaki等《科學》(Science)241825-828(1988))。用粗體型字表示Ala-Gly的橋連。
附圖16可溶性IL-6Rα313結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。關鍵1-313位氨基酸包括截短的IL-6Rα結(jié)構(gòu)域(IL-6Rα313)。用粗體型字表示Thr-Gly的橋連。
附圖17gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ的純化。在非還原條件下進行4％-12％梯度凝膠SDS-PAGE。通過用銀染色可以觀察到蛋白質(zhì)。泳道1在蛋白質(zhì)A瓊脂糖(Pharmacia)上純化的約100ng的物質(zhì)。泳道2標準物分子大小(Amersham)。泳道3此處所示的是在IL-6親和色譜步驟中進一步純化后蛋白質(zhì)A純化的物質(zhì)。表示了gp130-Cγ二聚體[(gp130-Cγ1)2]、與一種IL-6Rα-κ[(gp130-Cγ1)2·(IL-6Rα-κ)1]結(jié)合的gp130-Cγ1二聚體和與兩種IL-6Rα-κ[(gp130-Cγ1)2·(IL-6Rα-κ)2]結(jié)合的gp130-Cγ1二聚體的位置以及用千道爾頓表示的標準物分子大小的大小(200、100和46)。
附圖18緩慢與配體捕獲物IL-6解離。將來自以重鏈/輕鏈受體為基礎的配體捕獲物(gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ)的解離比例與用中和單克隆抗體B-E8(BE8 MAb)獲得的解離比例進行比較。
附圖19IL-6可以誘導配體捕獲物的多聚化。(A)圖解描繪兩種不同的配體捕獲物并根據(jù)其結(jié)合蛋白質(zhì)A的能力列舉。gp130-Fc·IL-6Rα-Fc(GF6F)通過其Fc-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白質(zhì)A，而gp130-CH1·IL-6Rα-κ(G16κ)不結(jié)合蛋白質(zhì)A。(B)用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖從如所標記的GF6F±IL-6、G16κ±IL-6或GF6G+G16κ±IL-6的混合物中沉淀的蛋白質(zhì)的抗卡巴蛋白質(zhì)印跡。
附圖20IL-6依賴性XG-1細胞增殖的抑制。為進行增殖試驗而通過使細胞缺乏IL-65小時來制備XG-1細胞[Zhang等《血液》(Blood)833654-3663(1994)]。將試驗設定在96-孔組織培養(yǎng)皿內(nèi)的RPMI+10％胎牛血清+青霉素/鏈霉素+0.050nM 2-巰基乙醇+谷氨酰胺中進行。每孔使用0.1ml的該培養(yǎng)基。在試驗的開始階段以250,000/ml的密度懸浮細胞。在添加IL-6±配體捕獲物或抗體72小時后，如上所述進行MTT試驗(Panayotatos等《生物化學》(Biochemistry)335813-5818(1994))。列舉了使用的不同配體捕獲物。
附圖21A-21D命名為424的融合多肽的核苷酸序列編碼和推定氨基酸序列，它能夠結(jié)合細胞因子IL-4而形成非功能性復合物。
附圖22A-22D命名為603的融合多肽的核苷酸序列編碼和推定氨基酸序列，它能夠結(jié)合細胞因子IL-4而形成非功能性復合物。
附圖23A-23D命名為622的融合多肽的核苷酸序列編碼和推定氨基酸序列，它能夠結(jié)合細胞因子IL-4而形成非功能性復合物。
附圖24A-24F命名為412的融合多肽的核苷酸序列編碼和推定氨基酸序列，它能夠結(jié)合細胞因子IL-6而形成非功能性復合物。
附圖25A-25F命名為616的融合多肽的核苷酸序列編碼和推定氨基酸序列，它能夠結(jié)合細胞因子IL-6而形成非功能性復合物。
附圖26A-26E命名為569的融合多肽的核苷酸序列編碼和推定氨基酸序列，它能夠結(jié)合細胞因子IL-1而形成非功能性復合物。
附圖27表示在TF1細胞生物測定試驗中屬于一種IL-2Rγ-scb-IL4Rα-FcΔC1融合多肽的命名為4SC375的IL-4捕獲物作為IL-4拮抗劑優(yōu)于單獨的IL4RαFcΔC1幾個數(shù)量級。
附圖28表示在TF1細胞生物測定試驗中命名為4SC375的IL-4捕獲物顯示出與命名為4SC424(附圖21A-21D中所述)的IL-4捕獲物相同的拮抗劑活性，其中4SC424是一種具有同等含量的IL-2Rγ成分與IL-4Rα成分的IL-2Rγ-IL4Rα-FcΔC1融合多肽。
附圖29表示附圖24A-24F中所述的IL6捕獲物(6SC412IL6R-scb-gpx-FcΔC1)在XG1生物測定試驗中是一種優(yōu)于中和單克隆抗體對人IL-6-BE8的IL-6拮抗劑。
附圖30表示捕獲物1SC569(附圖26A-26E中所述)能夠拮抗IL-1的作用并在用IL-1治療時阻斷IL-6從MRC 5細胞中產(chǎn)生。
附圖31A-31G列舉了IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc單鏈捕獲物構(gòu)建體的核苷酸和編碼的氨基酸序列。
附圖32A-32G列舉了IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc單鏈捕獲物構(gòu)建體的核苷酸和編碼的氨基酸序列。
附圖33由IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc阻斷IL-13。以10nM的濃度添加IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc捕獲物阻斷IL-13誘導的生長達～2nM。在～4-5nM的IL-13濃度下，TF1細胞的生長被抑制了50％。
附圖34由IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc阻斷IL-4。以10nM的濃度添加IL-4Rα1.IL-13Rα1.Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc阻斷IL-4誘導的生長達～1nM。在～3-4nM的IL-4濃度下，TF1細胞的生長被抑制了50％。
附圖35人IL-1捕獲物阻斷了外源給予的huIL-1的體內(nèi)作用。在0時給BALB/c小鼠皮下注射huIL-1(0.3μg/kg)。在注射huIL-1前24小時，用載體或150倍摩爾以上的huIL-1捕獲物預處理動物。在處死動物前2小時(26小時)，用第2次注射huIL-1(0.3μg/kg，皮下)攻擊小鼠。在不同的時間點處采集血樣并檢測血清中的IL-1水平(表示為平均值±/-SEM；n＝5/組)。
附圖36A和附圖36B人IL-4捕獲物拮抗猴體內(nèi)的人IL-4的作用。附圖36A用所指示的3個部分處理獼猴。每日皮下注射兩次人IL-4(25μg/kg)、持續(xù)4天；并從給予人IL-4前1天開始靜脈內(nèi)給予人IL-4捕獲物(8mg/ml)和載體5天。每日采集血漿并檢測MCP-1水平。將結(jié)果表示為平均值±/-SEM；n＝4。(ANOVA p＜0.0007；Tukey-Kramer部分2與部分1比較，p 0.05；部分2與部分3比較，p 0.05；部分1與部分3比較，沒有顯著性差異。)附圖36B用所指示的3個部分處理獼猴。每日皮下注射兩次人IL-4(25μg/kg)、持續(xù)4天；并從給予人IL-4前1天開始靜脈內(nèi)給予人IL-4捕獲物(8mg/ml)和載體5天。每日采集全血用于CD16的流式細胞儀分析。將結(jié)果表示為平均值±/-SEM；n＝4。(ANOVA p＜0.042；Tukey-Kramer部分2與部分1比較，p＜0.05；部分2與部分3和部分1比較，沒有顯著性差異。)
附圖37小鼠IL-4捕獲物部分防止小鼠體內(nèi)IL-4介導的IgE增加。將用抗小鼠IgD注射(100μl/小鼠，皮下)的BALB/C小鼠隨機分成3組，各組接受(第3-5天時)載體、鼠IL-4捕獲物(1mg/kg，皮下)或小鼠IL-4的單克隆抗體(1mg/kg，皮下)。在不同的時間點處采集血清并檢測IgE水平。將結(jié)果表示為平均值±/-SEM(n＝5/組)。(ANOVA p＝0.0002；Tukey-Kramer載體與IL-4捕獲物比較，p＜0.01；載體與IL-4抗體比較，p＜0.001；IL-4捕獲物與IL-4抗體比較，沒有顯著性差異)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種編碼能夠結(jié)合細胞因子而形成非功能性復合物的融合多肽的分離的核酸分子，它包括a)一種編碼第一種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一種融合多肽成分包括細胞因子受體特異性決定成分的胞外結(jié)構(gòu)域的細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；b)一種編碼第二種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二種融合多肽成分包括細胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導成分胞外結(jié)構(gòu)域的細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；c)一種編碼第三種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三種融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
所謂“細胞因子結(jié)合部分”指的是結(jié)合所述細胞因子所必需的胞外結(jié)構(gòu)域的最小部分。本領域技術人員可以接受的觀點是細胞因子受體的確定特征是存在的兩種含有規(guī)范半胱氨酸的纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域且存在的WSXWX盒狀室(Bazan，J.F.，1990，PNAS 876934-6938)。還可以將編碼細胞因子受體結(jié)合成分和細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導成分的胞外結(jié)構(gòu)域的序列用于生成本發(fā)明的融合多肽。類似地，可以使用編碼細胞因子受體成分較長部分的較長序列。然而，期望小于胞外結(jié)構(gòu)域的片段起結(jié)合細胞因子的作用，且由此本發(fā)明期望包括結(jié)合細胞因子所必需的胞外結(jié)構(gòu)域最小部分作為細胞因子結(jié)合部分的融合多肽。
本發(fā)明包括細胞因子受體的“特異性決定成分”和細胞因子受體的“信號轉(zhuǎn)導成分”。無論用于命名細胞因子特定成分或亞單位的命名法如何，本領域技術人員均可以識別用于決定細胞因子的細胞靶物的受體成分或亞單位且由此得知構(gòu)成“特異性決定成分”的成分。
類似地，無論所用的命名法如何，本領域技術人員均可以得知構(gòu)成“信號轉(zhuǎn)導成分”的受體成分或亞單位。本文所用的“信號轉(zhuǎn)導成分”是一種不屬于特異性決定成分且在沒有特異性成分存在的情況下不結(jié)合細胞因子或與之結(jié)合較弱的天然受體的成分。在該天然受體中，“信號轉(zhuǎn)導成分”可以參與信號傳輸。
例如，盡管某些細胞因子受體含有命名為α和β的成分，但是IL-4受體含有稱作IL-2Rγ的信號轉(zhuǎn)導成分。然而，無論何名稱與該成分相關，本領域技術人員均可以得知IL-4受體的何種成分是信號轉(zhuǎn)導成分。因此，為了實施本發(fā)明和產(chǎn)生對IL-4的高親和性捕獲物，本領域技術人員生產(chǎn)了一種分離的核酸分子，它包括編碼第一種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一種融合多肽成分包括IL-4受體特異性決定成分(IL-4Rα)的胞外結(jié)構(gòu)域的細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；編碼第二種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二種融合多肽成分包括IL-4受體的信號轉(zhuǎn)導成分(IL-2Rγ)胞外結(jié)構(gòu)域的細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；和編碼第三種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三種融合多肽成分包括多聚化成分(例如一種IgG的Fc結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列，從而生成一種IL-4的高親和性捕獲物。
將可以用于制備本發(fā)明細胞因子拮抗劑的受體成分的某些另外的實例列在表1中。表1中列舉了用于描述那些起某些細胞因子受體特異性決定成分作用的成分和那些起某些細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導成分作用的成分的科學文獻中所用的某些可變命名，它們僅作為實例而不以任何方式起限定作用。
表1細胞因子 特異性決定成分 信號轉(zhuǎn)導成分白細胞介素-1(IL-1) I型IL-1R(參考文獻8) IL-1R AcP(參考文獻8，11)I型IL-1R(參考文獻8)IL-1RI(參考文獻11)IL-1RII(參考文獻11)白細胞介素-2(IL-2) α-亞單位(參考文獻2) β-鏈(參考文獻3)α-鏈(參考文獻3) β-亞單位(參考文獻2)IL-2Rα(參考文獻1) γ-鏈(參考文獻3)IL-2Rβ(參考文獻1，10)IL-2Rγ(參考文獻1，10)白細胞介素-3(IL-3) IL-3Rα(參考文獻1) βc(參考文獻1)α-亞單位(參考文獻2) β-亞單位(參考文獻2)α-受體成分(參考文獻5) β-鏈(參考文獻3)β-受體成分(參考文獻5)白細胞介素-4(IL-4) IL-4R(參考文獻1) γ-鏈(參考文獻3)IL-2Rγ(參考文獻1)白細胞介素-5(IL-5) IL-5α(參考文獻1)βc(參考文獻1)α-亞單位(參考文獻2) β-亞單位(參考文獻2)α-受體成分(參考文獻5) β-鏈(參考文獻3)β-受體成分(參考文獻5)
表1(接續(xù))細胞因子 特異性決定成分 信號轉(zhuǎn)導成分粒細胞巨噬細胞集落刺激因 α-受體成分(參考文獻5)β-受體成分(參考文獻5)子α-亞單位(參考文獻2) β-亞單位(參考文獻2)GMRα-(參考文獻2) β-鏈(參考文獻3)βc(參考文獻1)GMRβ(參考文獻1，2)白血病抑制因子LIFBP(參考文獻1) Gp130(參考文獻1，3)α-受體成分(參考文獻5) β-受體成分(參考文獻5)白細胞介素-11(IL-11) α-鏈(參考文獻4) Gp130(參考文獻4)NR1(參考文獻4)白細胞介素-15(IL-15) IL-15Rα(參考文獻10) IL-2Rβ(參考文獻10)IL-2Rγ(參考文獻10)干擾素-γ(IFNγ) IFN-γR(參考文獻7) AF-1(參考文獻7)IFN-γR1(參考文獻7)IFN-γR2(參考文獻7)TGFβ II型(參考文獻6，9) I型(參考文獻6，9)
表1中僅引用了大量參考文獻中的幾篇并將它們列舉如下1.Sato和Miyajima《細胞生物學最新觀點》(Current Opinionin Cell Biology)6174-179(1994)-參見176頁第9-16行；2.Miyajima等《免疫學年鑒回顧》(Annual Review ofImmunology)10295-331(1992)-參見295頁第4行至296頁第1行；305頁最后一段；3.Kondo等《科學》(Science)2621874-1877(1993)-參見1874頁第1和2列；4.Hilton等《歐洲分子生物學協(xié)會雜志》(EMBO Journal)134765-4775(1994)-參見4766頁第1列、第20、24行；5.Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)-參見587頁第2列第15至22行；6.Bassing等《生物化學雜志》(Journal of BiologicalChemistry)26914861-14864(1994)-參見14861頁第2列第1至9和21至28行；7.Kotenko等《生物科學雜志》(Journal of BiologicalScience)27020915-20921(1995)-參見20915頁摘要的第1至5行；8.Greenfeder等《生物化學雜志》(Journal of BiologicalChemistry)27013757-13765(1995)-參見13757頁第1列第6行至第2列第3行和第2列第10-12行；第13764頁第2列倒數(shù)第3行和13765頁第1列第1至7行；9.Lebrun和Vale《細胞分子生物學》(Molecular CellBiology)171682-1691(1997)-參見1682頁摘要的第2至6行；10.Kennedy和Park《臨床免疫學雜志》(Journal of ClinicalImmunology)16134-143(1996)-參見134頁摘要的第1至7行；136頁第2列第1至5行；11.Wesche等《生物化學雜志》(Journal of BiologicalChemistry)2727727-7731(1997)-參見7731頁第20至26行。
Kotenko等近來鑒定了據(jù)報導可用作活性IL-10受體復合物和啟動IL-10誘導的信號轉(zhuǎn)導事件所必需的輔助鏈的IL-10R2(IL-10Rβ)鏈(S.V.Kotenko等《歐洲分子生物學協(xié)會雜志》(EMBO Journal)1997第16卷5894-5903)。另外的細胞因子及其受體描述在由Chares A.Janeway，Jr.和Paul Travers著、Current BiologyLtd./Garland Publishing Inc.copyright 1996出版的《免疫生物學、健康與疾病的免疫系統(tǒng)》(Immunobiology，The Immune SystemIn Health and Disease)第2版第A9頁附錄II中。
在制備編碼本發(fā)明融合多肽的核酸序列的過程中，用由宿主載體系統(tǒng)表達時產(chǎn)生融合多肽單體種類的單鏈核苷酸編碼所述融合多肽的第一種、第二種和第三種成分。由此表達的單體因多聚化成分(第三種融合多肽成分)之間的相互作用而多聚化。以這種方式生產(chǎn)融合多肽避免了如果第一種和第二種成分作為獨立的分子產(chǎn)生且然后多聚化而對由此產(chǎn)生的異二聚化混合物純化的需求。例如，1995年11月28日授權(quán)的美國專利號5,470,952描述了起CNTF或IL-6拮抗劑作用的異二聚化蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。從用合適的α和β成分共轉(zhuǎn)染的細胞系純化異二聚體。然后使用諸如從制備型非變性聚丙烯酰胺凝膠中的被動洗脫法這樣的方法或通過使用高效陽離子交換層析法從同二聚體中分離異二聚體。使用本發(fā)明的方法可以避免對該純化步驟的需求。
此外，1996年4月18日公開的PCT國際申請WO 96/11213中命名了二聚化IL-4抑制劑，該申請的申請人已經(jīng)制備了兩種IL-4受體被聚合間隔物所結(jié)合的同二聚體并已經(jīng)制備了IL-4受體被聚合間隔物連接成IL-2受體γ鏈的異二聚體。所述的聚合間隔物是聚乙二醇(PEG)。分別表達兩種受體成分IL-4R和IL-2Rγ并純化它們。然后通過使用雙官能PEG試劑將所述成分彼此連接而生產(chǎn)聚乙二醇化(pegylated)的同二聚體和異二聚體。本發(fā)明的有利因素是它可避免對這類耗時而昂貴的純化和聚乙二醇化(pegylated)步驟的需求。
在本發(fā)明的一個實施方案中，編碼第一種成分的核苷酸序列是編碼第二種成分的核苷酸序列的上游。在本發(fā)明的另一個實施方案中，編碼第一種成分的核苷酸序列是編碼第二種成分的核苷酸序列的下游。可以準備實施本發(fā)明另外的實施方案，其中依次重排第一種、第二種和第三種融合多肽成分。例如，如果將編碼第一種成分的核苷酸序列命名為1、將編碼第二種成分的核苷酸序列命名為2并將編碼第三種成分的核苷酸序列命名為3，那么作為從5’-3’讀碼的本發(fā)明分離的核酸中的成分順序可以是下列6種組合中的任意一種1，2，3；1，3，2；2，1，3；2，3，1；3，1，2或3，2，1。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，由所述融合多肽結(jié)合的細胞因子可以是血細胞生成素族細胞因子，它們選自白細胞介素-2、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-5、白細胞介素-6、白細胞介素-7、白細胞介素-9、白細胞介素-11、白細胞介素-13、白細胞介素-15、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、制癌蛋白M、白血病抑制因子和心臟營養(yǎng)蛋白-1(cardiotrophin-1)組成的組。
在本發(fā)明另外的實施方案中，由所述融合多肽結(jié)合的細胞因子可以是干擾素族細胞因子，它們選自IFN-γ、IFN-α和IFN-β組成的組。
在本發(fā)明另外的實施方案中，由所述融合多肽結(jié)合的細胞因子可以是免疫球蛋白超家族的細胞因子，它們選自B7.1(CD80)和B7.2(B70)組成的組。
在本發(fā)明另外的實施方案中，由所述融合多肽結(jié)合的細胞因子可以是TNF族細胞因子，它們選自TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體和4-1 BBL組成的組。
在本發(fā)明另外的實施方案中，由所述融合多肽結(jié)合的細胞因子可以是選自白細胞介素-1、白細胞介素-10、白細胞介素-12、白細胞介素-14、白細胞介素-18和MIF組成的組的細胞因子。
因為在TGF-β/BMP族細胞因子中的特異性確定和信號轉(zhuǎn)導通過類似機理發(fā)生(參見D.Kingsley，《基因與發(fā)育》(Genes &Development)1994，8133-146；J.Wrana，《無機電解質(zhì)代謝》(Miner Electrolyte Metab)24120-130(1998)；R.Deryneck和X.Feng《生物化學和生物物理學誌》(Biochimica et BiophysicaActa)1333(1997)F105-F150；和J.Massague和F.Weis-Garcia“絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉(zhuǎn)化β族生長因子信號的介體”-《癌癥調(diào)查》(Cancer Surveys)1996第27卷“細胞信號傳輸”，皇家癌癥研究基金會(Imperial Cancer Research Fund))，所以可以將本發(fā)明用于生產(chǎn)屬于TGF-β/BMP族的細胞因子的高親和性拮抗劑。
因此，在本發(fā)明另外的實施方案中，由融合多肽結(jié)合的細胞因子可以是TGF-β/BMP族的細胞因子，它們選自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、與子宮內(nèi)膜出血相關的因子(EBAF)、生長分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒抑制物質(zhì)(mullerian inhibiting substance)(MIS)、活化素-1、活化素-2、活化素-3、活化素-4和活化素-5組成的組。
在本發(fā)明的可選擇的實施方案中，特異性決定成分、信號轉(zhuǎn)導成分或兩者均可以被單鏈Fv取代。單鏈Fv(scFv)是一種僅具有通過一段合成肽序列與輕鏈V區(qū)連接的重鏈V區(qū)的截短的Fab。參見，例如轉(zhuǎn)讓給Cambridge Antibody Technology Limited的美國專利號5,565,332、5,733,743、5,837,242、5,858,657和5,871,907，將它們引入本文作為參考。因此，本發(fā)明期望例如，一種編碼能夠結(jié)合細胞因子而形成非功能性復合物的融合多肽的分離的核酸分子，它包括一種編碼第一種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一種融合多肽成分包括細胞因子受體特異性決定成分的胞外結(jié)構(gòu)域的細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；一種編碼第二種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二種融合多肽成分包括scFv的氨基酸序列，所述的scFv能夠在與細胞因子受體的特異性決定成分胞外結(jié)構(gòu)域細胞因子結(jié)合部分結(jié)合的位點不同的位點上結(jié)合細胞因子；和一種編碼第三種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三種融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。另一方面，所述的特異性決定成分可以被scFv取代，所述的scFv在細胞因子上結(jié)合到與信號轉(zhuǎn)導成分結(jié)合的位點不同的位點。因此，本發(fā)明關注一種編碼能夠結(jié)合細胞因子而形成非功能性復合物的融合多肽的分離的核酸分子，它包括一種編碼第一種含有scFv氨基酸序列的融合多肽成分的核苷酸序列，所述的scFv在細胞因子上結(jié)合與細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導成分的胞外結(jié)構(gòu)域細胞因子結(jié)合的位點不同的位點；一種編碼第二種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二種融合多肽成分包括細胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導成分胞外結(jié)構(gòu)域的細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；和一種編碼第三種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三種融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明關注一種編碼能夠結(jié)合細胞因子而形成非功能性復合物的融合多肽的分離的核酸分子，它包括一種編碼第一種含有第一種scFv氨基酸序列的融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一種scFv與細胞因子上的位點結(jié)合；一種編碼第二種含有第二種scFv氨基酸序列的融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二種scFv在細胞因子上結(jié)合與第一種scFv結(jié)合的位點不同的位點；和一種編碼第三種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三種融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
在所有上述含有scFv’s的實施方案中，本發(fā)明還關注編碼第一種成分的核苷酸序列是編碼第二種成分的核苷酸序列的上游的實施方案；編碼第一種成分的核苷酸序列是編碼第二種成分的核苷酸序列的下游的實施方案；和本發(fā)明另外的依次重排第一種、第二種和第三種融合多肽的實施方案。例如，如果將編碼第一種成分的核苷酸序列命名為1、將編碼第二種成分的核苷酸序列命名為2并將編碼第三種成分的核苷酸序列命名為3，那么作為從5’-3’讀碼的本發(fā)明分離的核酸中的成分順序可以是下列6種組合中的任意一種1，2，3；1，3，2；2，1，3；2，3，1；3，1，2或3，2，1。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的多聚化成分包括免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域。更具體地說，免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域可以選自IgG的Fc結(jié)構(gòu)域、IgG的重鏈和IgG的輕鏈組成的組。在另一個實施方案中，所述的多聚化成分可以是Fc結(jié)構(gòu)域，可以從其中除去前5個氨基酸(包括半胱氨酸)以便產(chǎn)生稱作Fc(ΔC1)的多聚化成分。另一方面，所述的多聚化成分可以是Fc結(jié)構(gòu)域，其中前5個氨基酸內(nèi)的半胱氨酸已經(jīng)被另一種諸如(例如)絲氨酸或丙氨酸這樣的氨基酸所取代。
本發(fā)明還提供了由本發(fā)明分離的核酸分子編碼的融合多肽。因第三種多聚化成分的功能而優(yōu)選該融合多肽是多聚化形式。在優(yōu)選的實施方案中，多聚體是二聚體。合適的多聚化成分是編碼免疫球蛋白重鏈鉸合區(qū)的序列(Takahashi等，1982，《細胞》(Cell)29671-679)、免疫球蛋白基因序列及其部分。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，將免疫球蛋白基因序列、特別是一種編碼Fc結(jié)構(gòu)域的基因序列用于編碼第三種多聚化成分。
本發(fā)明還關注一種包括本文所述本發(fā)明核酸分子的載體。
本發(fā)明還提供了一種包括本文所述本發(fā)明核酸分子的表達載體，其中所述的核酸分子可操作地與一種表達控制序列連接。本發(fā)明還提供了一種用于生產(chǎn)融合多肽的宿主-載體系統(tǒng)，它包括已經(jīng)引入適于表達所述融合多肽的宿主細胞的本發(fā)明表達載體。所述的合適的宿主細胞可以是一種諸如大腸桿菌這樣的細菌細胞、諸如巴斯德畢赤氏酵母這樣的酵母細胞、諸如草地貪夜蛾這樣的昆蟲細胞或諸如COS、CHO、293、BHK或NSO細胞這樣的哺乳動物細胞。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)本發(fā)明融合多肽的方法，該方法在允許生產(chǎn)所述融合多肽并回收如此生產(chǎn)的融合多肽的條件下通過使本文所述的宿主-載體系統(tǒng)的細胞生長來進行。
本發(fā)明提供了以由諸如CNTF族細胞因子這樣的細胞因子共有的受體成分為基礎的新型拮抗劑。
本文所述的本發(fā)明關注任意細胞因子拮抗劑的生產(chǎn)方法，它應用一種α特異性決定成分，在與細胞因子混合時與第一種β信號轉(zhuǎn)導成分結(jié)合而形成非功能性中間體，然后與第二種β信號轉(zhuǎn)導成分結(jié)合，從而導致β-受體二聚化和隨后的信號轉(zhuǎn)導。根據(jù)本發(fā)明，使受體的可溶性α特異性決定成分(sRα)與細胞因子受體(β1)的第一種β信號轉(zhuǎn)導成分的胞外結(jié)構(gòu)域(β1)結(jié)合成異二聚體(sRαβ1)，它們通過結(jié)合細胞因子而形成一種非功能性復合物而起拮抗劑的作用。
正如實施例1中所述，CNTF和IL-6共有β1受體成分gp130。CNTF與CNTFRα和gp130形成中間體這一事實可以在缺乏LIFRβ的細胞中得到證實(實施例1)，其中CNTF與CNTFRα的復合物結(jié)合gp130并通過IL-6和IL-6Rα防止gp130的同二聚化，由此阻斷信號轉(zhuǎn)導。這些研究為開發(fā)本文所述的IL-6拮抗劑提供了基礎，正如它們表明在配體存在的情況下，如果可以形成由配體、其α受體成分及其β1受體成分組成的非功能性中間體復合物，那么它將有效地阻斷配體的作用。其它細胞因子可以使用諸如LIFRβ這樣的其它β1受體成分，它們也可用于生產(chǎn)本發(fā)明的拮抗劑。
因此，例如在本發(fā)明的一個實施方案中，IL-6或CNTF的有效拮抗劑由其受體的α特異性決定成分(分別是sIL-6Rα和sCNTFRα)胞外結(jié)構(gòu)域與gp130的胞外結(jié)構(gòu)域的異二聚體組成。下文分別稱作sIL-6Rαβ1或sCNTFRαβ1的所得的異二聚體分別起IL-6或CNTF高親和性捕獲物的作用，由此使細胞因子難以與天然膜結(jié)合形式的其受體形成信號轉(zhuǎn)導復合物。
盡管已經(jīng)證實來自受體胞外部分的可溶性配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為其配體的捕獲物起一定的作用且由此起拮抗劑的作用[Bargetzi等《癌癥研究》(Cancer Res.)534010-4013(1993)；等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)898616-8620(1992)；Mohler等《免疫學雜志》(J.Immunol.)1511548-1561(1993)；Narazaki等《血液》(Blood)821120-1126(1993)]，但是IL-6和CNTF受體的異常方面在于α受體成分構(gòu)成了配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們以可溶性形式與其配體一同有效地起受體激動劑的作用[Davis等《科學》(Science)2591736-1739(1993)；Taga等《細胞》(Cell)58573-581(1989)]。按照本發(fā)明制備的sRαβ1異二聚體為其配體提供了有效的捕獲物，從而結(jié)合皮摩爾范圍的具有親和性的這些配體(以對CNTF與PC12D細胞的結(jié)合研究為基礎)而不會產(chǎn)生功能性中間體。可以將本文所述的技術應用于開發(fā)任意細胞因子的細胞因子捕獲物，它使用提供特異性的α-成分，以及一種β成分，該β成分在與α-特異性成分結(jié)合時，對細胞因子具有的親和性高于各單獨成分。因此，本發(fā)明的拮抗劑包括下列物質(zhì)的拮抗劑白細胞介素1-5[IL-1，Greenfeder等《生化雜志》(J.Bio.Chem.)27013757-13765(1995)；Gou等《生化雜志》(J.Bio.Chem.)27027562-27568(1995)]；IL-2[Taniguchi等歐洲專利號0386289-A和0386394-A(1990)；Takeshita等《科學》(Science)257379-382(1992)]；IL-3[Kitamura等《細胞》(Cell)661165-1174(1991)]；IL-4[Idzerda等《實驗藥物雜志》(J.Exp.Med.)171861-873(1990)]；IL-5[Taverneir等《細胞》(Cell)661175-1184(1991)]；IL-11[Cherel等直接提交給EMBL/GenBank/DDBJ數(shù)據(jù)庫；登記號Z38102]；白細胞介素15[IL-15；Hemar等《細胞生物學雜志》(J.Cell.Biol.)129555-64(1995)；Taniguchi等歐洲專利號0386289-A和0386394-A(1990)；Takeshita等《科學》(Science)257379-382(1992)]；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子[GM-CSF；Hayashida等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)979655-9659(1990)]；LIF；γ干擾素[IFNγ；Aguet等《細胞》(Cell)55273-280(1988)；Soh等《細胞》(Cell)76793-802(1994)]和β轉(zhuǎn)化生長因子[TGFβ；Inagaki等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905359-5363(1993)]。
使用本領域技術人員所公知的方法可以制備α和β受體胞外結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)克隆、測序并表達了CNTFRα受體[Davis等《科學》(Science)25359-63(1993)，將該文獻的全部內(nèi)容引入本文作為參考]。Gearing等在《歐洲分子生物學協(xié)會雜志》(EMBO J.)102839-2848(1991)、Hibi等在《細胞》(Cell)631149-1157(1990)中和1993年5月27公開的PCT申請WO 93/10151中描述了LIFRβ和gp130的克隆方法，將這些文獻的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
通過在原核或真核表達系統(tǒng)中克隆并表達可以制備用于實施本發(fā)明的受體分子。使用許多方法可以表達和純化重組受體基因。可以將編碼所述因子的基因亞克隆入諸如例如不以任何方式起限定作用的pCP110這樣的細菌表達載體中。
通過任意技術可以純化重組因子，使得隨后形成穩(wěn)定的具有生物活性的蛋白質(zhì)。例如(且不以任何方式起限定作用)，可以從細胞中回收作為可溶性蛋白質(zhì)或作為包含體的所述因子，用8M鹽酸胍和透析可以從細胞中定量提取它們。為了進一步純化所述因子，可以使用常規(guī)的離子交換層析、疏水作用層析、反相層析或凝膠過濾。
可以使用公知的融合區(qū)改造sRαβ1異二聚化受體，1993年5月27公開的描述β受體異二聚體的生產(chǎn)方法的標題為“致癌蛋白M和白血病抑制因子的受體”的PCT申請WO 93/10151中描述了這些公知的融合區(qū)；或可以通過以化學方式交聯(lián)胞外結(jié)構(gòu)域來制備sRαβ1異二聚化受體。所用的結(jié)構(gòu)域可以由α和β成分的完整胞外結(jié)構(gòu)域組成或它們可以由維持與其配體形成復合物和sRαβ1復合物中其它成分的能力的突變體或其片段組成，例如，正如下面實施例4中所述，已經(jīng)使用缺乏三種纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域的gp130制備了IL-6拮抗劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，使用亮氨酸拉鏈改造胞外結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)使用1∶1的化學計量法證實了人轉(zhuǎn)錄因子c-jun和c-fos的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可形成穩(wěn)定的異二聚體[Busch和Sassone-Corsi《遺傳學趨勢》(Trends Genetics)636-40(1990)；Gentz等《科學》(Science)2431695-1699(1989)]。盡管還證實了可形成jun-jun同二聚體，但是它們的穩(wěn)定性低于jun-fos異二聚體約1000倍。尚未檢測到Fos-fos同二聚體。
使用遺傳工程嵌合基因在上述受體成分的可溶性或胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端上對c-jun和c-fos的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域進行框內(nèi)融合。這些融合體可以是直接的或它們可以使用諸如人IgG鉸合區(qū)這樣的柔性接頭或由諸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸這樣的氨基酸組成的各種長度和組合形式的多肽接頭。另外，可以用His-His-His-His-His-His(His6)、[SEQ.ID NO.1]標記嵌合蛋白以便通過金屬螯合物層析和/或通過可利用的抗體表位進行快速純化，從而進行蛋白質(zhì)印跡上的檢測、免疫沉淀或生物測定試驗中的活性缺失/阻斷。
在另一個實施方案中，正如下面實施例3中所述，使用類似的方法、且使用人IgG1的Fc-結(jié)構(gòu)域制備sRαβ1異二聚體[Aruffo等《細胞》(Cell)6735-44(1991)]。與后者相反，當將攜帶Fc-結(jié)構(gòu)域的嵌合分子表達為二硫鍵連接的同二聚體時，異二聚體的形成必須通過化學方式實現(xiàn)。因此，在有利于破壞鏈間二硫鍵但不影響鏈內(nèi)二硫鍵的條件下可以減少同二聚體。然后按照等摩爾量混合單體與不同的胞外部分并將其氧化成同二聚體和異二聚體的混合物。通過層析技術分離該混合物中的成分。另一方面，通過遺傳工程和表達由受體成分的可溶性或胞外部分組成的分子、隨后是hIgG的Fc-結(jié)構(gòu)域、隨后是上述c-jun或c-fos亮氨酸拉鏈可以使形成的這類異二聚體產(chǎn)生偏差[Kostelny等《免疫學雜志》(J.Immunol.)1481547-1553(1992)]。由于這些亮氨酸拉鏈主要形成異二聚體，所以如果需要可以將它們用于形成異二聚體。就使用亮氨酸拉鏈描述的嵌合蛋白而言，還可以用金屬螯合物或表位標記它們。可以將這種標記的結(jié)構(gòu)域用于通過金屬-螯合物層析和/或通過抗體快速純化，從而進行蛋白質(zhì)印跡上的檢測、免疫沉淀或生物測定試驗中的活性缺失/阻斷。
在另一個實施方案中，可以使用形成二聚體的其它免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域來制備異二聚體。例如，這類結(jié)構(gòu)域包括IgG重鏈(Cγ1和Cγ4)以及人免疫球蛋白κ和λ輕鏈的恒定區(qū)。Cγ與輕鏈的異二聚化發(fā)生在Cγ的CH1結(jié)構(gòu)域與輕鏈(CL)恒定區(qū)之間并且通過經(jīng)單一二硫橋共價連接兩個結(jié)構(gòu)域得到穩(wěn)定。因此，正如實施例4中所述，使用這些免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以制備構(gòu)建體。另一方面，所述的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括可以來源于啟動二聚化的T細胞受體成分的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過使用柔性接頭環(huán)表達為嵌合分子來制備sRαβ1異二聚體。將編碼嵌合蛋白的DNA構(gòu)建體設計成它可表達以串聯(lián)方式通過柔性環(huán)彼此融合的兩種可溶性或胞外結(jié)構(gòu)域。這種環(huán)可以是完全人工的(例如由絲氨酸或蘇氨酸在某一間隔處打斷聚甘氨酸重復序列)或“借”自天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)(例如hIgG的鉸合區(qū))。可以對分子進行改造，其中對融合的可溶性或胞外結(jié)構(gòu)域的順序進行轉(zhuǎn)換(例如sIL6Rα/環(huán)/sgp130或sgp130/環(huán)/sIL6Rα)和/或其中所述環(huán)的長度和組成是可變的，從而對具有所需特征的分子進行選擇。
另一方面，按照本發(fā)明制備的異二聚體可以純化自與合適的α和β成分共轉(zhuǎn)染的細胞系。使用本領域技術人員可得到的方法可以從同二聚體中分離異二聚體。例如，通過從制備型、非變性聚丙烯酰胺凝膠中的被動洗脫法可以回收有限量的異二聚體。另一方面，使用高效陽離子結(jié)合層析法可以純化異二聚體。已經(jīng)使用單S陽離子交換柱獲得了極佳的純化結(jié)果。
除通過結(jié)合游離的CNTF或IL-6而起拮抗劑作用的sRαβ1異二聚體外，本發(fā)明還關注具有新特性的IL-6的改造的突變譯本的用途，所述的新特性是能夠結(jié)合IL-6Rα和單一gp130分子、而不能使第二種gp130完成β成分的同二聚化且由此對任意IL-6響應細胞起有效IL-6拮抗劑的作用。我們用于IL-6和CNTF受體復合物結(jié)構(gòu)的模型表明這些細胞因子具有不同的結(jié)合α、β1和β2受體成分的位點[Stahl和Yancopoulos《細胞》(Cell)74587-590(1993)]。包括這些位點中的每一個的關鍵氨基酸殘基的突變產(chǎn)生具有所需拮抗劑特性的新型分子。β1位點的脫離會產(chǎn)生一種仍然結(jié)合α受體而非β1成分且由此包括具有納摩爾親和力的拮抗劑的分子。包括IL-6的β2位點(IL-6β2-)的關鍵氨基酸殘基的突變產(chǎn)生一種可結(jié)合IL-6Rα和第一種gp130單體而不能連接(engage)第二種gp130且由此功能失活的分子。類似地，CNTFβ2位點的突變產(chǎn)生一種可結(jié)合CNTFRα和gp130而不能連接LIFRβ的分子(CNTFβ2-)，由此通過形成非功能性β1中間體而拮抗CNTF的作用。以上述CNTF形成具有高親和性的β1中間體的結(jié)合結(jié)果為基礎，CNTFβ2-和IL-6β2-可構(gòu)成具有10pM范圍親和力的拮抗劑。
將不同的方法用于生成并鑒定具有所需特性的IL-6或CNTF的突變。可以使用通過編碼IL-6或CNTF的DNA的標準方法進行的隨機誘變，隨后分析收集的產(chǎn)物以便鑒定具有下面所概括的所需新特性的突變細胞因子。已經(jīng)廣泛使用遺傳工程進行誘變來闡明重組蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)組成。在文獻中已經(jīng)描述了進行缺失或取代誘變的幾種不同手段。最成功的手段看起來是丙氨酸掃描誘變[Cunningham和Wells(1989)《科學》(Science)2441081-1085]和同系物掃描誘變[Cunningham等(1989)《科學》(Science)2431330-1336]。
可以將使用這類方法進行的IL-6或CNTF核酸序列的定向誘變用于生成CNTFβ2-和IL-6β2-候選物。有系統(tǒng)地進行適于定向誘變的區(qū)的選擇或這種選擇根據(jù)研究來決定，由此將對各因子的各組單克隆抗體用于設計細胞因子區(qū)，它在結(jié)合單一α受體成分或上述αβ1異二聚化可溶性受體后可能暴露。類似地，對單一或與α受體成分或上述αβ1異二聚化可溶性受體結(jié)合的復合物形式的細胞因子進行化學修飾或有限蛋白水解、隨后分析保護和暴露區(qū)可以揭示出潛在的β2結(jié)合位點。
鑒定具有所需特性的CNTF或IL-6突變體的檢測試驗涉及高親和力阻斷對適當響應的細胞系的IL-6或CNTF的作用[Davis等《科學》(Science)2591736-1739(1993)；Murakami等《美國國家科學院學報》(Natl.Acad.Sci.USA)8811349-11353(1991)]。這類檢測試驗包括由CNTF或IL-6引起的細胞增殖、存活力或DNA合成或細胞系的構(gòu)建，其中因子的結(jié)合誘導諸如CAT或β-半乳糖苷酶這樣的報導基因產(chǎn)生[Savino等《美國國家科學院學報》(Natl.Acad.Sci.USA)904067-4071(1993)]。
另一方面，可以使用以受體為基礎的檢測試驗評價不同突變體的特性。一種這類檢測試驗由下列步驟組成對突變體使用表位標記的[Davis等《科學》(Science)25359-63(1991)]sRαβ1試劑篩選其結(jié)合上述sRαβ1受體異二聚體的能力。此外，一種檢測試驗可以通過評價表位標記的可溶性β2試劑是否可以在有β1異二聚體存在的情況下結(jié)合細胞因子來探測β2位點的存在或不存在。例如，CNTF僅在有CNTFRα和gp130存在的情況下結(jié)合LIFRβ(β2成分)[Davis等《科學》(Science)2601805-1808(1993)；Stahl等《生化雜志》(J.Biol.Chem.)2687628-7631(1993)]。因此，可溶性LIFRβ試劑僅可以在有可溶性sRαβ1二聚體sCNTFRαβ1存在的情況下結(jié)合CNTF。對于IL-6來說，sRαβ1試劑可以是I1-6Rαβ1且用于β2的探針可以是表位標記的sgp130。因此，可以將CNTF的β2-突變體鑒定為結(jié)合sRαβ1試劑的那些突變體，從而證明細胞因子的α和β1位點是完整的，不過不能結(jié)合β2試劑。
此外，本發(fā)明提供了檢測或測定潛在2-突變體活性的方法，該方法通過測定β-受體成分或選自Jak1、Jak2和Tyk2或任意其它信號轉(zhuǎn)導成分(諸如CLIPs)組成的組的信號轉(zhuǎn)導成分的磷酸化情況來進行，經(jīng)測定它們對CNTF族細胞因子的響應是磷酸化。
表達本文所述的信號轉(zhuǎn)導成分的細胞可以如此自然進行或被遺傳改造以便如此進行。例如，可以使用本領域中任何公知的方法，通過轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔經(jīng)轉(zhuǎn)基因動物等將如Velazquez等在《細胞》(Cell)第70卷313-322(1992)中獲得的Jak1和編碼Tyk-2核酸序列引入細胞。
根據(jù)本發(fā)明，使細胞與潛在拮抗劑接觸并將β-成分或信號轉(zhuǎn)導成分的酪氨酸磷酸化情況與沒有潛在拮抗劑存在情況下的相同成分的酪氨酸磷酸化情況進行比較。在本發(fā)明的另一個實施方案中，將上述細胞與潛在拮抗劑接觸所導致的酪氨酸磷酸化與接觸親代CNTF族的相同細胞的酪氨酸磷酸化進行比較。在這類檢測試驗中，細胞表達必須胞外受體(α-成分)或可以使細胞在有可溶性受體成分存在的情況下與測試活性劑接觸。因此，例如，在為鑒定CNTF激動劑或拮抗劑所設計的檢測系統(tǒng)中，細胞可以表達α-成分CNTFRα、β-成分gp130和LIFRβ以及諸如Jak1這樣的信號轉(zhuǎn)導成分。使細胞與測試活性劑接觸并將β-成分或信號轉(zhuǎn)導成分的酪氨酸磷酸化與在有CNTF存在情況下產(chǎn)生的的磷酸化形式進行比較。另一方面，將接觸測試活性劑所導致的酪氨酸磷酸化與沒有測試活性劑存在情況下發(fā)生的磷酸化進行比較。另一方面，例如，用于IL-6的一種檢測系統(tǒng)可以包括使表達β-成分gp130和諸如Jak1、Jak2或Tyk2這樣的信號轉(zhuǎn)導蛋白質(zhì)的細胞接觸與可溶性IL-6受體共同施用的測試活性劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將上述手段用于開發(fā)篩選小分子拮抗劑的方法，所述的小分子拮抗劑在配體結(jié)合、受體復合物形成和隨后的信號轉(zhuǎn)導過程中的不同步驟時起作用。通過評價對如上所述的可溶性受體與配體之間復合物形成的干擾情況來篩選可能干擾配體-受體相互作用的分子。另一方面，對小分子或天然產(chǎn)物的文庫篩選IL-6或CNTF誘導報道基因響應的以細胞為基礎的檢測試驗以便鑒定潛在的拮抗劑。在對其它因子(諸如類似于激活受體酪氨酸激酶的GM-CSF或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3)產(chǎn)生反應的以細胞為基礎的檢測試驗中重新篩選那些顯示出拮抗劑活性的分子以便評價其對CNTF/IL-6/OSM/LIF族因子的特異性。將這類以細胞為基礎的篩選方法用于鑒定在信號轉(zhuǎn)導過程中抑制任意大量靶物的拮抗劑。
在一種這樣的檢測系統(tǒng)中，拮抗劑的特異性靶物是Jak/Tyk族激酶與受體β亞單位之間的相互作用[Firmbach-Kraft《癌基因》(Oncogene)51329-1336(1990)；Wilks等《細胞分子生物學》(Mol.Cell.Biol.)112057-2065(1991)]。如上所述，LIFRβ和gp130預先與Jak/Tyk族胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶結(jié)合，這些激酶隨配體誘導的β成分二聚化而被激活(參見Stahl等《科學》(Science)26392-95(1993))。因此，可以進入細胞質(zhì)并破壞β成分與Jak/Tyk激酶之間相互作用的小分子能夠阻斷所有隨之發(fā)生的胞內(nèi)信號傳輸。使用評價小分子阻斷純化β成分相關結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Jak/Tyk激酶之間相互作用的能力的體外實驗方案可以篩選這類活性。另一方面，一種方法使用雙雜交相互作用系統(tǒng)易于篩選這樣的分子，它們可以抑制結(jié)合Jak/Tyk激酶的β成分的以酵母為基礎進行的檢測。[Chien等《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sci.)889578-9582(1991)]。在這類系統(tǒng)中，兩種蛋白質(zhì)(在本實施例中是β成分和Jak/Tyk激酶或其相關結(jié)構(gòu)域)之間的相互作用誘導諸如β-半乳糖苷酶這樣的合適的標記產(chǎn)生。對選擇的小分子測試其破壞所需相互作用而不抑制兩種對照蛋白質(zhì)之間相互作用的能力。這種篩選方法的優(yōu)點在于需要測試化合物在抑制β成分與Jak/Tyk激酶之間相互作用之前進入細胞。
本文所述的CNTF拮抗劑結(jié)合細胞因子CNTF和IL-6或與之競爭。因此，它們可用于治療由CNTF或IL-6介導的疾病或紊亂。例如，IL-6拮抗劑的治療應用包括如下情況1)在可以因絕經(jīng)后婦女或經(jīng)過卵巢切除術的雌激素水平下降而惡化的骨質(zhì)疏松癥中，看起來IL-6是破骨細胞發(fā)生的關鍵介體，從而導致骨的吸收[Horowitz《科學》(Science)260626-627(1993)；Jilka等《科學》(Science)25788-91(1992)]。重要的是，看起來IL-6僅在雌激素缺失的情況下起主要作用且顯然與正常骨的維持的關系最小。與它一致的實驗證據(jù)表明阻斷抗體對IL-6的功能可以減少破骨細胞的數(shù)量[Jilka等《科學》(Science)25788-91(1992)]。盡管也使用雌激素替代療法，但是看起來存在包括子宮內(nèi)膜和乳腺癌的危害增加在內(nèi)的副作用。因此，本文所述的IL-6拮抗劑更特別可以將破骨細胞發(fā)生降低至正常水平。
2)看起來IL-6通過以自分泌或旁分泌方式起作用來促進腫瘤形成而直接與多發(fā)性骨髓瘤相關[van Oers等《血液學年鑒》(Ann.Hematol.)66219-223(1993)]。此外，IL-6水平升高產(chǎn)生不需要的繼發(fā)性反應諸如骨吸收、血鈣過多和惡病質(zhì)；在有限的研究中，對IL-6或IL-6Rα的功能阻斷抗體具有一定成效[Klein等《血液》(Blood)781198-1204(1991)；Suzuki等《歐洲免疫學雜志》(Eur.J.Immunol.)221289-1993(1992)]。因此，本文所述的IL-6拮抗劑有利于繼發(fā)性反應和抑制腫瘤生長。
3)IL-6可以是導致與AIDS和癌癥相關的惡病質(zhì)的腫瘤壞死因子(TNF)的介體[Strassmann等《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)891681-1684(1992)]，可能通過降低脂肪組織中脂蛋白脂酶活性來達到該目的[Greenberg等《癌癥研究》(Cancer Research)524113-4116(1992)]。因此，本文所述的拮抗劑可以用于在這類患者中緩解或減少惡病質(zhì)。
可以使用本領域技術人員公知的方法來確定用于治療這些或其它CNTF族相關疾病或紊亂的有效劑量[參見，例如Fingl等《治療學的藥理基礎》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，Goodman和Gilman編輯，Macmillan Publishing Co.，New York，pp.1-46(1975)]。本發(fā)明應用的藥物組合物包括藥理上可接受的液體、固體或半固體載體中的與載體或靶分子(targeting)(例如抗體、激素、生長因子等)連接的上述拮抗劑和/或在體內(nèi)給藥前混入脂質(zhì)體、微囊和控釋制劑(包括表達細胞的拮抗劑)。例如，所述的藥物組合物可以在諸如無菌水、鹽水、磷酸鹽緩沖液或右旋糖溶液這樣的水溶液中包括一種或多種拮抗劑。另一方面，在可以根據(jù)這類治療需要植入患者體內(nèi)的固體(例如蠟)或半固體(例如膠質(zhì))制劑中可以包括所述的活性劑。給藥途徑可以是本領域中公知的任意給藥方式，包括但不限于靜脈內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、皮下給藥、經(jīng)注入所涉及的組織給藥、動脈內(nèi)給藥、口服給藥或通過植入裝置給藥。
給藥可以導致本發(fā)明活性劑分布在整個身體中或發(fā)布在局限區(qū)域。例如，在涉及神經(jīng)系統(tǒng)遠區(qū)的某些條件下，可能需要靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)給予活性劑。在某些情況中，可以將含有活性劑的移植物放入損害區(qū)域或放在接近損害的區(qū)域。合適的移植物包括但不限于以可吸收明膠海綿、蠟或以微粒為基礎的移植物。
實施例實施例1CNTF與IL-6競爭結(jié)合GP130材料和方法材料從DNAX獲得對IL-6有響應的PC12細胞的克隆(PC12D)。如[Kasiakowski等《神經(jīng)化學雜志》(J.Neurochem.)571003-10012(1991)]所述制備大鼠CNTF。IL-6和sIL-6Rα商購自R&D System。通過所述的方法(Stahl等《生化雜志》(J.Biol.Chem.)2687628-7631(1993))使家兔體內(nèi)對來源于接近gp130 C-末端區(qū)的肽(序列CGTEGQVERFETVGME[SEQ.ID.NO.2])的抗血清升高?？沽姿崂野彼釂慰寺?G10商購自UBI且用于ECL的試劑商購自Amersham。信號轉(zhuǎn)導檢測試驗使平板(10cm)中的PC12D在不含血清的培養(yǎng)基(RPMI1640+谷氨酰胺)內(nèi)饑餓1小時，然后在37℃和有或沒有規(guī)定濃度下的添加的大鼠CNTF存在的情況下用IL-6(50ng/mL)+sIL-6Rα(1mg/mL)對其培養(yǎng)5分鐘。接著使樣品進行所述的抗-gp130免疫沉淀、SDS-PAGE和抗磷酸酪氨酸免疫印跡(Stahl等《生化雜志》(J.Biol.Chem.)2687628-7631(1993))。結(jié)果使用表達IL-6Rα、gp130和CNTFRα而非LIFRβ的PC12細胞系(稱作PC12D)測定CNTF阻斷IL-6響應的能力。正如作預計的，這些細胞對IL-6有響應而對LIFRβ沒有響應(附圖2)，這是因為LIFRβ是一種CNTF信號轉(zhuǎn)導所需要的成分[Davis等《科學》(Science)26059-63(1993)]。根據(jù)對其它細胞系的結(jié)果[Ip等《細胞》(Cell)691121-1132(1992)]，PC12D細胞使gp130(以及各種其它稱作CLIPs的蛋白質(zhì))酪氨酸磷酸化作為對2nM IL-6的響應(附圖2)。添加重組可溶性IL-6Rα(sIL-6Rα)提高了gp130酪氨酸磷酸化的水平，正如在某些其它系統(tǒng)中所報導的[Taga等《細胞》(Cell)58573-581(1989)]。然而，與IL-6同時添加2nM CNTF可嚴重減少gp130的酪氨酸磷酸化。盡管在有CNTF、IL-6和sIL-6Rα在的情況下保留了輕度的gp130酪氨酸磷酸化響應，但是如果CNTF的濃度有四倍于8nM的增加，那么這種情況被消除。因此，在含有CNTFRα而非LIFRβ的IL-6響應細胞中，CNTF是一種相當有效的IL-6作用的拮抗劑。
實施例2CNTF與CNTFRαβ的結(jié)合材料和方法CNTF結(jié)合的斯卡查德分析如[Stahl等《生化雜志》(JBC)2687628-7631(1993)]所述制備和純化125I-CNTF。使用濃度范圍在20pM-10nM的125I-CNTF在PC12細胞中進行飽和結(jié)合研究。直接在單層細胞上進行結(jié)合。從孔中除去培養(yǎng)基并用由磷酸緩沖鹽水(PBS；pH7.4)、0.1mM桿菌肽、1mM PMSF、1mg/ml亮異蛋白酶肽和1mg/ml BSA組成的測試緩沖液將細胞洗滌一次。將細胞在室溫下的125I-CNTF中培養(yǎng)2小時，隨后用測試緩沖液快速洗滌2次。將細胞用含有1％SDS的PBS裂解并用Packardγ計數(shù)器在90-95％的效率下計數(shù)。通過存在的100倍以上的未標記CNTF來確定非特異性結(jié)合的情況。特異性結(jié)合的范圍在70％-95％。結(jié)果根據(jù)對PC12D細胞上碘化CNTF結(jié)合情況進行斯卡查德分析來估計CNTF與CNTFRαβ1結(jié)合的平衡常數(shù)(附圖3)。該數(shù)據(jù)與具有解離常數(shù)為9pM和3.4nM的2個位點配合一致。低親和性位點相當于CNTF與具有接近3nM的Kd的CNTFRα的相互作用[Panayptatos等《生化雜志》(J.Biol.Chem.)26819000-19003(1993)]。我們將高親和性復合物解釋為含有CNTF、CNTFRα和gp130的中間體。確實含有CNTFRα、gp130和LIFRβ且由此作為對CNTF的響應產(chǎn)生強有力的酪氨酸磷酸化的尤文氏肉瘤細胞系(EW-1)顯示出與具有1nM和10的解離常數(shù)極為類似的2個位點配合。因此，如果CNTF結(jié)合另外含有LIFRβ的復合物，那么顯然CNTF通過同樣高的親和性與僅含有CNTFRα和gp130的復合物結(jié)合，由此證明產(chǎn)生本文所述的sRαβ拮抗劑的可能性。
實施例3細胞因子配體捕獲物的生產(chǎn)方法病毒原種的生產(chǎn)在27℃下的Gibco SF900II培養(yǎng)基中使獲自草地貪夜蛾的SF21昆蟲細胞生長至密度為1×106個細胞/ml。將用于GP130-Fc-His6(附圖4)或IL6Rα-Fc(附圖5)的各病毒原種加入到生物反應器中至低復數(shù)為0.01-0.1PFU/細胞以便啟動感染。使該感染過程持續(xù)5-7天，從而使病毒復制達到最大值而基本上不發(fā)生細胞裂解。以無菌方式將細胞混懸液等分入無菌離心瓶并通過離心除去細胞。將不含細胞的上清液收集在無菌瓶中并在4℃下儲存至進一步應用為止。
通過如O’Reilly、Miller和Luckow所述的噬菌斑測定試驗測定病毒滴度。在接種有2×106個細胞的60mm組織-培養(yǎng)皿中實施該方法。將順序稀釋的病毒原種加入到粘附細胞中并通過振搖培養(yǎng)該混合物以便使病毒吸附各個細胞。加入瓊脂覆蓋物并在27℃下將平板培養(yǎng)5-7天。用中性紅染色存活細胞顯示有環(huán)狀噬菌斑產(chǎn)生，對它們進行計數(shù)而得到病毒滴度。用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細胞共感染使未感染的SF21細胞在裝有40L SF900II培養(yǎng)基的ABEC生物反應器中生長。將溫度控制在27℃并通過控制惰性氣流中氧的流速將溶解的氧的濃度維持在50％飽和度的水平。當達到2×106個細胞/mL密度時，使用一種帶有具有Milipore Prostak 0.65微米膜的切向流過濾裝置的低剪切蒸汽滅菌泵將細胞在生物反應器內(nèi)濃縮至20L體積。濃縮后，將新鮮無菌生長培養(yǎng)基緩慢加入到所述的生物反應器中，同時過濾系統(tǒng)經(jīng)滲濾持續(xù)除去剩余的生長培養(yǎng)基。在已經(jīng)進行2個體積的交換(40L)后，將另外20L新鮮培養(yǎng)基加入到所述的生物反應器中以便使細胞重新懸浮至40L的原始體積。通過使用血細胞計數(shù)器對存活細胞進行計數(shù)再測定一次細胞密度。
以細胞密度、病毒滴度和所需的感染復數(shù)(MOI)為基礎計算各病毒原種的所需用量。5∶1、5∶2、10∶2和10∶4的IL-6Rα-Fc與GP130-Fc-His6的病毒原種之比均導致產(chǎn)生顯著量的異二聚體。理想的病毒原種之比高度取決于來自兩種同二聚體中每一種的異二聚體純化的簡化。IL6Rα-Fc同二聚體通過固定化金屬親和層析相對易于除去下游。選擇病毒感染比例以便將形成的更難以清除下游的GP130-Fc-His6同二聚體減少到最低限度。如果改進了用于清除所得同二聚體的純化方法時，那么為感染選擇的GP130-Fc-His6病毒原種的相對量隨連續(xù)的批量而增加。
以無菌方式將病毒原種在單一容器內(nèi)混合、然后轉(zhuǎn)染入生物反應器。這導致SF21細胞的同步感染。使感染過程進行3-4天，從而有充足的時間產(chǎn)生最大量的異二聚體蛋白質(zhì)?；厥蘸偷鞍踪|(zhì)A的層析純化在生物反應器過程的感染階段結(jié)束時，使用10ft2MiliporeProstak濾膜(0.65微米)孔大小在所述的生物反應器中濃縮細胞。在清潔的加工容器內(nèi)收集通過濾膜的不含細胞的透過物。在過濾操作結(jié)束時，用10N NaOH將含有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的透過物流的pH調(diào)節(jié)至8.0。通過將提取物壓過0.8微米的深度濾膜(Sartorious)、隨后通過0.2微米濾膜而除去所得的沉淀。加入足量的0.5M EDTA儲備液而得到5mM的終濃度。將過濾的蛋白質(zhì)溶液上含有100-200mL PharmaciaProtein A Sepharose 4 Fast Flow的用PBS平衡的10cm直徑柱。蛋白質(zhì)A對3種重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物中的每一種的Fc-Fc結(jié)構(gòu)域具有極高的親和性，從而使它們結(jié)合，而其它不含細胞的提取物中的蛋白質(zhì)流過該柱。在上樣后，用另含有350mM NaCl的PBS將該柱洗滌至基線。在低pH下用0.5M乙酸或用降低pH梯度的0.1M檸檬酸和0.2M磷酸二鈉緩沖液洗脫IgG-Fc標記的蛋白質(zhì)。將Tris堿或磷酸二鈉加入到所洗脫的蛋白質(zhì)中以便避免與過長時間的與低pH條件的接觸。
將收集的蛋白質(zhì)滲濾入PBS或HEPES緩沖液并用1mM碘乙酰胺衍生(derivitized)以便保護接近各Fc結(jié)構(gòu)域鉸合區(qū)的游離半胱氨酸上暴露的硫氫基。這可防止二硫化物介導的蛋白質(zhì)聚集。將具有標稱30千道爾頓截斷值的6ft2微孔螺旋紋(spiral wound)超濾膜用于進行緩沖液交換。使用滲濾緩沖液作為空白、通過在280nm處的UV吸收度來測定總蛋白質(zhì)。使用6％的Tris-甘氨酸凝膠(Novex)、通過SDS PAGE凝膠電泳來測定異二聚體和兩種同二聚體蛋白質(zhì)的相對量。將凝膠進行考馬斯染色、然后轉(zhuǎn)入脫色溶液過夜。將Shimadzu光密度掃描儀用于測定SDS PAGE凝膠上各蛋白質(zhì)帶的相對密度。將峰面積比用于計算柱收集級分中異二聚體和各同二聚體的級分。固定化金屬親和層析純化GP130-Fc-His6融合蛋白C-末端上的6個組氨酸殘基為從兩種同二聚體中分離異二聚化IL-6拮抗劑提供了極佳的分子柄(handle)。GP130-Fc-His6部分的各C-末端組氨酸上的咪唑基具有與包括銅、鎳、鋅、鈷、鐵和鈣在內(nèi)的幾種二價金屬的強結(jié)合常數(shù)。由于IL6Rα-Fc同二聚體不具有C-末端組氨酸殘基，所以顯然具有最低的親和性。IL6Rα-Fc-GP130-Fc-His6異二聚體具有單一固定組的6個組氨酸，使得它對金屬具有更強的親和性，同時GP130-Fc-His6同二聚體具有2組6個組氨酸，它們均使得三種IgG標記的蛋白質(zhì)與金屬親和柱具有最高的親和性。在洗脫緩沖液中使用增加量的咪唑選擇性洗脫三種蛋白質(zhì)由此可按如下順序洗脫蛋白質(zhì)1.IL6Rα-Fc同二聚體2.IL6Rα-Fc-GP130-Fc-His異二聚體3.GP130-Fc-His同二聚體用硫酸鎳溶液飽和含有100mL Pharmacia Chelating SepharoseFast Flow的26mm直徑柱，直到在柱洗脫液中觀察到明顯的綠色為止。然后將該柱用幾個柱體積的去離子水洗滌、接著用50mM HEPES、40mM咪唑(pH8.0)平衡。咪唑與固定化鎳結(jié)合產(chǎn)生綠色至藍色的改變。將咪唑加入到上樣的蛋白質(zhì)中至終濃度為40mM。將咪唑加入到上樣的蛋白質(zhì)中可減少與IL6Rα-Fc同二聚體的結(jié)合、增加剩余兩個種類可利用的表面積。上樣后，將該柱用幾個柱體積的50mMHEPES、80mM咪唑(pH8.0)洗滌至重新建立穩(wěn)態(tài)基線為止。用幾個柱體積范圍內(nèi)的50mM HEPES、150mM咪唑(pH8.0)選擇性洗脫異二聚體。如上部分中所述收集蛋白質(zhì)級分并將其滲濾入PBS。
實施例4構(gòu)建配體捕獲物的另一種方法如上所述，通過CNTF且類似地是通過IL-6和IL-11激活受體，其結(jié)合事件遵循一固定的順序(附圖6)。細胞因子開始結(jié)合其具有低親和性的同源Rα(Kd＝3-10nM)；這是一種所需的步驟-不表達所述同源Rα的細胞對同源細胞因子沒有響應。細胞因子·Rα復合物結(jié)合第一種信號轉(zhuǎn)導成分gp130而形成高親和性復合物(10pM等級的CNTF·CNTFRα·gp130復合物的Kd)。因為產(chǎn)生信號傳輸?shù)男盘栟D(zhuǎn)導成分二聚化，這種復合物不會轉(zhuǎn)導信號(Stahl和Yancopoulos《神經(jīng)生物學雜志》(J.Neurobiology)251454-1446(1994)；Stahl等《科學》(Science)2671349-1353(1995)；Davis等《科學》(Science)2601805-1808(1993)；Stahl等《科學》(Science)26392-95(1994)；Murakami等《科學》(Science)2601808-1810(1993))。至少就Il-6的情況而言，細胞因子·Rα信號轉(zhuǎn)導物異二聚化復合物隨后結(jié)合另一種類似的復合物而形成六聚化復合物(附圖6)(Ward等《生化雜志》(J.Biol.Chem.)26923286-23289(1994))。所得信號轉(zhuǎn)導物的二聚化-就IL-6而言是gp130(Murakami等《科學》(Science)2601808-1810(1993))且就CNTF而言是IL-11、gp130和LIFR(Davis等《科學》(Science)2601805-1808(1993))-引起信號轉(zhuǎn)導。
開始制備的異二聚化分子包括與gp130胞外結(jié)構(gòu)域連接的可溶性Rα成分。證實這些分子可模擬高親和性細胞因子·Rα·gp130復合物并起其同源細胞因子高親和性拮抗劑的作用(附圖7)。為了制備這些分子，將gp130的胞外結(jié)構(gòu)域分別與IL-6和CNTF、IL-6Rα和CNTFRα的α-受體成分的胞外結(jié)構(gòu)域配對。為了使Rα與gp130胞外結(jié)構(gòu)域連接，使可溶性Rα-成分和gp130與人IgG1的Fc部分融合而分別產(chǎn)生Rα-Fc和gp130-Fc。選擇Fc結(jié)構(gòu)域主要但并非唯一的原因是，它自然形成二硫鍵連接的二聚體。將包括Rα-Fc·gp130-Fc的異二聚化分子表達、純化并證實起其同源配體高效拮抗劑的作用。此外，發(fā)現(xiàn)這些分子對其同源細胞因子具有高度特異性，因為這是確定細胞因子被結(jié)合和捕獲的α-受體成分的選擇(在沒有合適的Rα存在的情況下不存在可測定的細胞因子與gp130結(jié)合)。
此處我們描述了該項技術的延伸，它使得通過設計可以具有另外的有利特征諸如穩(wěn)定性、Fc-受體-介導的清除或降低的效應器功能(諸如補體結(jié)合)的不同異二聚化可溶性受體配體捕獲物的改造成為可能。此外，應證實所述的技術適合于改造哺乳動物或其它合適的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中的任意異二聚化蛋白質(zhì)，包括但不限于應用受體、配體和諸如酶或催化抗體這樣的催化成分的異二聚化分子。材料和方法用于IL-6的以異多聚化免疫球蛋白重鏈/輕鏈可溶性受體為基礎的配體捕獲物的遺傳工程使用人gp130、人IL-6α-受體(IL-6Rα)、帶有或不帶有連接區(qū)(J)的人IgG1(Cγ1)(Lewis等《免疫學雜志》(Journal ofImmunology)1512829-2838(1993))或IgG4(Cγ4)的重鏈(Cγ)恒定區(qū)以及還帶有或不帶有不同j-肽(j)的人免疫球蛋白(Ig)的輕鏈κ和λ恒定區(qū)(Cheung等《病毒學雜志》(Journal of Virology)666714-6720(1992))來改造本文所述的IL-6捕獲物。這種設計利用了Cγ結(jié)構(gòu)域與κ或λ輕鏈異二聚化的天然能力。Cγ與輕鏈的異二聚化發(fā)生在Cγ的CH1結(jié)構(gòu)域與輕鏈(CL)恒定區(qū)之間且通過經(jīng)單二硫橋共價連接2個結(jié)構(gòu)域而得到穩(wěn)定。我們推定與人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域類似，可以將Cγ與CL的結(jié)合用于產(chǎn)生二硫鍵連接的異二聚化蛋白質(zhì)，它們由一個鏈上的gp130胞外結(jié)構(gòu)域與另一個鏈上的IL-6Rα胞外結(jié)構(gòu)域組成。與這類蛋白質(zhì)的以Fc為基礎的配對物類似，據(jù)推測這類蛋白質(zhì)是IL-6的高親和性配體捕獲物且結(jié)果是抑制IL-6與IL-6響應細胞上的天然受體的相互作用，由此起IL-6拮抗劑的作用。此外，與抗體極為類似的是，應用全長Cγ區(qū)的構(gòu)建體可以形成Cγ鏈的同二聚體，從而產(chǎn)生由兩個“輕鏈”和兩個“重鏈”組成的抗體樣分子(附圖8)。這種設計的潛在優(yōu)點在于它可以更為接近地模擬IL-6·IL-6Rα·gp130復合物且可以顯示出對配體的親和性高于可比擬的單異二聚體。將另外的設計與使用僅含CH1結(jié)構(gòu)域的截短譯本的Cγ結(jié)合起來。這些方法與受體-κ融合蛋白一起形成異二聚化分子且由此類似于抗體的Fab片段。
可以在質(zhì)粒載體中改造所有的可溶性受體-Ig嵌合基因，所述的質(zhì)粒載體包括但不限于適合于哺乳動物表達的載體(COS猴腎細胞、中國倉鼠卵巢細胞[CHO]和ras-轉(zhuǎn)化的成纖維細胞[MG-ras])且在用于有效翻譯的各嵌合基因開始處包括Kozak序列(CGC CGC CAC CATGGT G)。使用標準遺傳工程方法來進行改造。通過DNA測序、哺乳動物表達、隨后使用合適抗體進行蛋白質(zhì)印跡、測定配體結(jié)合和解離的生物物理檢測試驗并通過生長抑制試驗(如下所述的XG-1)來檢驗各構(gòu)建體。由于用于改造這些嵌合蛋白的結(jié)構(gòu)域位于合適限制位點的側(cè)翼，所以能夠使用這些結(jié)構(gòu)域改造其它嵌合蛋白，包括應用諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、GM-CSF、LIF、IL-11、IL-15、IFNγ、TGFβ及其它這樣的因子的受體胞外結(jié)構(gòu)域的嵌合體。將用于制備IL-6捕獲物的各成分的氨基酸配位體列在下面(注意將帶有起始的甲硫氨酸的起始碼編為#1；使用20個氨基酸的單字母碼列出長序列)(a)應用人gp130的構(gòu)建體(i)通過使gp130的胞外結(jié)構(gòu)域(1-619位氨基酸)與Ser-Gly橋、隨后是包括Cγ1和終止密碼子的330個氨基酸框內(nèi)融合來改造gp130-Cγ1(附圖9)。
(ii)除將J-肽(氨基酸序列GQGTLVTVSS)插入Ser-Gly橋與Cγ1序列之間外，按照與gp130-Cγ1相同的方式改造gp130-Cγ1(參見附圖9)。
(iii)通過框內(nèi)融合不帶有其三個纖連蛋白樣結(jié)構(gòu)域的gp130的胞外結(jié)構(gòu)域來改造gp130Δ3fibro-Cγ1(附圖10)。嵌合蛋白的剩余部分與gp130-Cγ1相同。
(iv)除僅使用Cγ1的CH1部分取代Cγ1區(qū)外，按照與對gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-J-CH1(附圖11)。這種構(gòu)建體的C-末端結(jié)構(gòu)域包括含有導致IgG的重鏈與輕鏈異二聚化的半胱氨酸殘基的鉸合部分。含有兩個涉及Cγ1同二聚化的鉸合部分已經(jīng)與CH2和CH3結(jié)構(gòu)域一起缺失。
(v)除使用Cγ4取代Cγ1外，按照與對gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-Cγ4(附圖12)。此外，通過在Cγ4結(jié)構(gòu)域的鉸合區(qū)引入兩個堿基的沉默突變來改造RsrII DNA限制位點。RsrsII位點要求進行其它所需的遺傳工程操作，諸如構(gòu)建與gp130-Cγ4相同的CH1。
(vi)除使用人Ig的κ輕鏈取代Cγ1外，按照與對gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-κ(附圖13)。
(vii)除將J-肽(氨基酸序列TFGQGTKVEIK)插入Ser-Gly橋與κ-區(qū)之間外，按照與對gp130-J-k所述相同的方式改造gp130-J-κ(附圖13)。
(viii)除使用人Ig的λ輕鏈的恒定區(qū)(Cheung等《病毒學雜志》(Journal of Virology)666714-6720(1992))取代Cγ1外，按照與對gp130-Cγ1所述相同的方式改造gp130-λ(附圖14)。
(b)應用人IL-6Rα的構(gòu)建體(i)通過使包括IL-6Rα胞外結(jié)構(gòu)域(附圖15)的IL-6Rα(Yamasaki等《科學》(Science)241825-828(1988))的1-358位氨基酸與Ala-Gly橋、隨后是包括Cγ1和終止密碼子的330個氨基酸框內(nèi)融合來改造IL6Rα-Cγ1。
(ii)除使用用于gp130-κ的κ-結(jié)構(gòu)域(附圖13)取代Cγ1外，如對IL6Rα-Cγ1所述改造IL6Rα-κ。
(iii)除將對gp130-j-κ所述的j-肽放置在Ala-Gly橋與κ-結(jié)構(gòu)域之間外，如對IL6Rα-κ所述改造IL6Rα-j-κ。
(iv)使用由1-313位氨基酸組成的截短型IL-6Rα改造三種另外的構(gòu)建體IL6Rα313-Cγ1、IL6Rα313-κ和IL6Rα313-j-κ(附圖16)。通過使IL6Rα313與Thr-Gly橋、隨后是上述Cγ1、κ和j-κ-結(jié)構(gòu)域框內(nèi)融合來制備這些構(gòu)建體中的每一種。改造這些構(gòu)建體以便補充gp130Δ3fibro-衍生的構(gòu)建體。配體捕獲物的表達和純化為了生產(chǎn)共價連接的可溶性gp130與可溶性IL-6Rα的異二聚體，將gp130-Ig嵌合蛋白與以互補對形式的合適IL-6Rα-Ig嵌合蛋白共同表達。通過以穩(wěn)定或短暫的方式將相應的表達載體共轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)染入合適的哺乳動物細胞系來實現(xiàn)共表達。通過幾種不同的方法從條件培養(yǎng)基中純化所得的二硫鍵連接的異二聚體，所述的方法包括但不限于固定化蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G上的親和色譜法、以配體為基礎的親和色譜法、離子交換法和凝膠過濾法。
用于純化重鏈/輕鏈受體融合蛋白的方法類型的一個實例如下通過共轉(zhuǎn)染分別編碼gp130-Cγ1和IL-6Rα-κ的兩種不同載體而在COS細胞中表達gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ。在共轉(zhuǎn)染2天后收集不含血清的條件培養(yǎng)基(400ml)并通過1ml蛋白質(zhì)A瓊脂糖(Phramacia)上的親和色譜法來純化含有Cγ1的蛋白質(zhì)。通過1ml NHS-活化瓊脂糖(Phramacia)上的第二次親和色譜步驟進一步純化該步驟中產(chǎn)生的用重組人IL-6衍生的物質(zhì)以便從gp130-Cγ1和IL-6Rα-κ復合物中除去gp130-Cγ1二聚體(該gp130-Cγ1二聚體不結(jié)合IL-6)。正如由SDS-PAGE、隨后是銀染色所證實的，通過該方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的純度超過90％(附圖17)。已經(jīng)成功地使用類似方案對其它重鏈/輕鏈受體異二聚體進行了純化。結(jié)果免疫球蛋白重鏈/輕鏈受體融合體拮抗劑的生物活性在各種不同的檢測試驗中對純化的配體捕獲物測試其結(jié)合IL-6的能力。例如，與IL-6自抗-IL-6單克隆中和抗體B-E8的解離率一起平行測定與配體捕獲物結(jié)合的IL-6的解離率[Brochier等《國際免疫藥理學雜志》(Int.J.Immunopharmacology)1741-48(1995)及其中的參考文獻]。該類型實驗的一個實例如附圖18中所示。在該實驗中用500pM的gp130-Cγ1·IL-6Rα-κ或mAb B-E8將20pM125I-IL-6(1000μCi/mmol；Amersham)預培養(yǎng)20小時。此時加入1000倍以上(20nM)的“冷”IL-6。定期取出反應的等分試樣、用蛋白質(zhì)G-瓊脂糖沉淀配體捕獲物或B-E8并測定剩余結(jié)合的125I-IL-6的cpm數(shù)量。在3天后，顯然人125I-IL-6從配體捕獲物中的解離率極低，大約起始計數(shù)的75％仍然與配體捕獲物結(jié)合。相反，3天后低于5％的計數(shù)仍然與抗體結(jié)合。這一結(jié)果證明配體從這些配體捕獲物中的解離率極低。
在不同組實驗中測試在有配體存在的情況下配體捕獲物多聚化的能力。該實驗的一個實例如附圖19中所示。通過測試不經(jīng)自身結(jié)合蛋白質(zhì)A的gp130-CH1·IL-6Rα-κ是否可以在有gp130-Fc·IL-6Rα-Fc存在的情況下以IL-6依賴性方式被蛋白質(zhì)A-瓊脂糖沉淀來測定IL-6誘導的gp130-Fc·IL-6Rα-Fc與gp130-CH1·IL-6Rα-κ的結(jié)合(附圖9)。通過使用不檢測gp130-Fc·IL-6Rα-Fc的抗卡巴特異性HRP接合物的蛋白質(zhì)印跡來測定由蛋白質(zhì)A-瓊脂糖沉淀的gp130-CH1·IL-6Rα-κ。僅在gp130-Fc·IL-6Rα-Fc和IL-6都存在時，gp130-CH1·IL-6Rα-κ可以被蛋白質(zhì)A-瓊脂糖沉淀。這一結(jié)果最終表明IL-6可以誘導配體捕獲物多聚化且進一步表明配體捕獲物可以模擬六聚化細胞因子·Rα·信號轉(zhuǎn)導物復合物(附圖1)。配體誘導的多聚化可以在體內(nèi)清除細胞因子·配體捕獲物方面起顯著作用。
可以在測定配體依賴性細胞增殖的檢測試驗中進一步測試不同配體捕獲物的生物活性。有幾種IL-6細胞增殖試驗且它們應用諸如B9、CESS或XG-1這樣的細胞系。使用XG-1細胞系的該類型試驗的一個實例如下所述XG-1是一種來源于人多發(fā)性骨髓瘤的細胞系(Zhang等《血液》(Blood)833654-3663(1994))。XG-1依賴于外源提供的存活和增殖用人IL-6。XG-1系的IL-6的EC50約為50pmoles/ml。通過在XG-1培養(yǎng)物中用50pg/ml IL-6培養(yǎng)增加量的純化配體捕獲物來測試幾種不同IL-6捕獲物阻斷XG-1細胞的IL-6-依賴性增殖的能力。已經(jīng)使用與上述那些方法類似的方法表達和純化了所測試的配體捕獲物。發(fā)現(xiàn)所有所測試的配體捕獲物均可以以劑量依賴性方式抑制IL-6-依賴性增殖(附圖20)。所測試的5種不同捕獲物中gp130-CH1·IL-6Rα-κ最具活性且主要顯示出與抗體B-E8相同的對IL-6的中和活性。低至10倍摩爾過量的gp130-CH1·IL-6Rα-κ或B-E8完全阻斷了IL-6的活性(A570-650＝0.3AU的讀數(shù)相當于沒有XG-1細胞增殖)。100倍摩爾過量的所有測試配體捕獲物完全阻斷了IL-6的活性。這種觀測到的抑制是高度選擇性的，因為，甚至以相對于IL-6 1000倍摩爾過量使用時，阻斷CNTF活性的gp130-Fc·CNTFRα-Fc配體捕獲物和gp130-Fc同二聚體均沒有表現(xiàn)出任何對IL-6的阻斷活性(數(shù)據(jù)未列出)。該數(shù)據(jù)證明以異二聚化免疫球蛋白重鏈/輕鏈受體為基礎的配體捕獲物作為其同源配體的高親和性拮抗劑起作用。
實施例5融合多肽成分的克隆使用組織cDNAs(CLONTECH)、通過標準PCR技術獲得人細胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域；將其克隆入表達載體pMT21(GeneticsInstitute，Inc.)；并使用ABI 373A DNA測序儀和Taq雙脫氧終止子循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)、通過標準技術測序序列。對于IL-4Rα來說，克隆來自基因庫序列的241-868位核苷酸(相當于24-231位氨基酸)。對于IL-2Rγ來說，克隆來自基因庫序列D11086的15-776位核苷酸(相當于1-233位氨基酸)。對于IL-6Rα來說，克隆來自基因庫序列X52425的52-1044位核苷酸(相當于1-331位氨基酸)。對于gp130來說，克隆來自基因庫序列M57230的322-2112位核苷酸(相當于30-619位氨基酸)。對于IL-1RAcP來說，克隆來自基因庫序列AB006357的1-1074位核苷酸(相當于1-358位氨基酸)。對于IL-1RI來說，克隆來自基因庫序列X16896的55-999位核苷酸(相當于19-333位氨基酸)核苷酸。
實施例6融合多肽(細胞因子捕獲物)的生產(chǎn)通過標準克隆和PCR技術由各個克隆的DNAs(上文所述)來構(gòu)建編碼細胞因子捕獲物的核苷酸序列。在每種情況中，框內(nèi)構(gòu)建所述序列以便使編碼第一種融合多肽成分的序列與編碼第二種融合多肽成分的序列、隨后是作為多聚化成分的Fc結(jié)構(gòu)域(人IgG1的鉸合部、CH2和CH3區(qū))融合。在某些情況中，將另外的核苷酸框內(nèi)插入編碼第一種和第二種融合多肽成分的序列之間以便在兩種成分之間添加接頭(參見附圖21A-附圖21D-捕獲物424；附圖24A-附圖24F-捕獲物412；和附圖26A-附圖26E-捕獲物569)。
對于IL-4捕獲物424(附圖21A-附圖21D)、603(附圖22A-附圖22D)和622(附圖23A-附圖23D)來說，IL-2Rγ成分與5’連接、后面是IL4Rα成分且然后是Fc成分。對于IL-6捕獲物412(附圖24A-附圖24F)和616(附圖25A-附圖25F)來說，IL-6Rα成分與5’連接、后面是gp130成分且然后是Fc結(jié)構(gòu)域。對于IL-1捕獲物569(附圖26A-附圖26E)來說，IL-1RAcP成分是5’，后面連接有IL-1RI成分且然后是Fc結(jié)構(gòu)域。將最終的構(gòu)建體克隆入哺乳動物表達載體pCDNA3.1(STRATAGENE)。
在569序列(附圖26A-附圖26E)中，1-1074位核苷酸編碼IL1RAcP成分；1075-1098位核苷酸編碼接頭區(qū)；1099-2043位核苷酸編碼IL1RI成分且2044-2730位核苷酸編碼Fc結(jié)構(gòu)域。
在412序列(附圖24A-附圖24F)中，1-993位核苷酸編碼IL6Rα成分；994-1023位核苷酸編碼接頭區(qū)；1024-2814位核苷酸編碼gp130成分且2815-3504位核苷酸編碼Fc結(jié)構(gòu)域。
在616序列(附圖25A-附圖25E)中，1-993位核苷酸編碼IL6Rα成分；994-2784位核苷酸編碼gp130成分且2785-3474位核苷酸編碼Fc結(jié)構(gòu)域。
在424(附圖21A-附圖21D)和622(附圖23A-附圖23D)序列中，1-762位核苷酸編碼IL2Rγ成分；763-771位核苷酸編碼接頭區(qū)；772-1395位核苷酸編碼IL4Rα成分且1396-2082位核苷酸編碼Fc結(jié)構(gòu)域。
最后，在603序列(附圖22A-附圖22D)中，1-762位核苷酸編碼IL2Rγ成分；763-1386位核苷酸編碼IL4Rα成分且1387-2073位核苷酸編碼Fc結(jié)構(gòu)域。
通過本領域技術人員眾所周知的標準技術將DNA構(gòu)建體短暫轉(zhuǎn)染入COS細胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入CHO細胞。通過標準技術、使用蛋白質(zhì)A親和層析和大小排阻層析來收集和純化上清液。(參見，例如Harlow和Lane“抗體-實驗室手冊”(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
實施例7使用TF-1(ATCC)細胞的IL-4生物測定試驗方案所需的試劑和設備MTT染料溶液MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基])(Sigma目錄號M2128)。
工作濃度將5mg的無水MTT溶于不含Ca+2、Mg+2的200ml PBS中。
無菌過濾并在-20℃下等分儲存。增溶溶液將100g SDS、950ml dH2O、50ml二甲基甲酰胺和850μl濃HCl混合成1000ml。
用0.45μm濾膜裝置進行無菌過濾。
在室溫下儲存。TF-1細胞生長培養(yǎng)基RPMI1640、10％FBS、Pen/Strep、2mM L-谷氨酰胺。其它0.4％錐蟲藍染料；稀釋用無菌試管；96孔無菌細胞培養(yǎng)平板(Falcon#3072)；血細胞計數(shù)器；離心管；ELISA平板讀出器；15、25、50和100μl體積的多道移液管；無菌試劑儲蓄器、無菌移液管管頭；手套。試驗方案A.試驗平板的制備1.用不同濃度的IL-4和10nM IL-4拮抗劑制備含有50μl生長培養(yǎng)基/孔的96孔無菌組織培養(yǎng)平板?？梢酝ㄟ^制備4倍最高檢測濃度的IL-4工作稀釋液來進行該步驟。在獨立的試管中，制備2倍順序稀釋的IL-4。將25μl各稀釋液加入到平板的一橫行中(即A行得到最高濃度，G行得到最低濃度)。將25μl不含IL-4的生長培養(yǎng)基加入到H行中。通過制備4倍于終濃度的儲備液來制備測試用拮抗劑。將25μl加入到一式三份一組的含有IL-4的孔中(縱行1、2、3，A-H)。確定在H行中包括拮抗劑。
2.作為陽性對照，保持一組孔中不含拮抗劑。這些孔中僅含有IL-4和培養(yǎng)基。
3.在制備用于試驗的細胞前將平板在37℃下和5％CO2加濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-2小時。B.細胞的制備4.通過在不含生長因子的試驗培養(yǎng)基中離心將細胞洗滌兩次。
5.測定細胞數(shù)量和錐蟲藍存活率并在試驗培養(yǎng)基中將細胞懸浮至終濃度為8×105/ml。
6.將50μl細胞混懸液(40,000個細胞)分散入平板的所有孔中?？傮w積目前應為100μl/孔。
7.在37℃下的5％CO2加濕培養(yǎng)箱中將平板培養(yǎng)68小時。C.顯色8.在培養(yǎng)68小時后，向各孔中加入15μl的MTT染料溶液。
9.將平板在37℃下的5％CO2加濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時。
10. 4小時后，向各孔中加入100μl的增溶溶液。使平板在密封容器內(nèi)穩(wěn)定過夜以便完全增溶甲晶體。
11.在570/650nm處記錄吸收度。結(jié)果附圖27表明在TF1細胞生物測定試驗中，屬于IL-2Rγ-scb-IL4Rα-FcΔC1融合多肽的命名為4SC375的IL-4捕獲物作為IL-4拮抗劑優(yōu)于單獨的IL4RαFcΔC1幾個數(shù)量級。
附圖28表明在TF1細胞生物測定試驗中的拮抗劑活性與命名為4SC424的IL-4捕獲物相同，所述的4SC424是一種含有等量IL-2Rγ成分與IL-4Rα成分的IL-2Rγ-IL4Rα-FcΔC1融合多肽。
實施例8屬于XG-1細胞的IL-6生物測定試驗方案所需的試劑和設備MTT染料溶液MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基])(Sigma目錄號M2128)。
工作濃度將5mg的無水MTT溶于不含Ca+2、Mg+2的200ml PBS中。
無菌過濾并在-20℃下等分儲存。增溶溶液將100g SDS、950ml dH2O、50ml二甲基甲酰胺和850μl濃HCl混合成1000ml。
用0.45μm濾膜裝置進行無菌過濾。
在室溫下儲存。試驗培養(yǎng)基RPMI1640、10％FBS、Pen/Strep、2mM L-谷氨酰胺、50μM巰基乙醇。其它0.4％錐蟲藍染料；稀釋用無菌試管；96孔無菌細胞培養(yǎng)平板(Falcon#3072)；血細胞計數(shù)器；離心管；ELISA平板讀出器；15、25、50和100μl體積的多道移液管；無菌試劑儲蓄器、無菌移液管管頭；手套。試驗方案A.試驗平板的制備1.用不同濃度的IL-6和10nM IL-6拮抗劑制備含有50μl生長培養(yǎng)基/孔的96孔無菌組織培養(yǎng)平板。可以通過制備4倍最高檢測濃度的IL-6工作稀釋液來進行該步驟。在獨立的試管中，制備2倍順序稀釋的IL-6。將25μl各稀釋液加入到平板的一橫行中(即A行得到最高濃度，G行得到最低濃度)。將25μl不含IL-6的生長培養(yǎng)基加入到H行中。通過制備4倍于終濃度的儲備液來制備測試用拮抗劑。將25μl加入到一式三份一組的含有IL-6的孔中(縱行1、2、3，A-H)。確定在H行中包括拮抗劑。典型的IL-6滴定以200ng/ml開始至3.1ng/ml結(jié)束。
2.作為陽性對照，保持一組孔中不含拮抗劑。這些孔中僅含有IL-6和培養(yǎng)基但不含拮抗劑。
3.在制備用于試驗的細胞前將平板在37℃下和5％CO2加濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-2小時。B.細胞的制備4.通過在不含生長因子的試驗培養(yǎng)基中離心將細胞洗滌兩次(以1000RPM進行5分鐘)。
5.測定細胞數(shù)量和錐蟲藍存活率并在試驗培養(yǎng)基中將細胞懸浮至終濃度為8×105/ml。
6.將50μl細胞混懸液(40000個細胞)分散入平板的所有孔中。總體積目前應為100μl/孔。
7.在37℃下的5％CO2加濕培養(yǎng)箱中將平板培養(yǎng)68小時。C.顯色8.在68小時后，向各孔中加入15μl的染料溶液。
9.將平板在37℃下的5％CO2加溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時。
10. 4小時后，向各孔中加入100μl的增溶溶液。使平板在密封容器內(nèi)穩(wěn)定過夜以便完全增溶甲晶體。
11.在570/650nm處記錄吸收度。結(jié)果附圖29表明在XG1生物測定試驗中，附圖24A-附圖24F中所述的IL6捕獲物(6SC412IL6R-scb-gpx-FcΔC1)是一種優(yōu)于對人IL-6-BE8的中和單克隆抗體的拮抗劑。
實施例9用于IL1捕獲物的MRC5生物測定試驗MRC5人肺成纖維細胞通過分泌IL-6而對IL-1起反應且由此將它們用于檢測IL-1捕獲物阻斷IL-6的IL-1-依賴性產(chǎn)生的能力。對照屬于與Fc結(jié)構(gòu)域融合的IL-1 I型受體胞外結(jié)構(gòu)域的IL-1-RI.Fc測試IL1捕獲物1SC569(附圖26A-附圖26E)。
以1×105個細胞/ml將MRC5細胞懸浮于培養(yǎng)基中并將0.1ml的細胞平板固定(10,000個細胞/孔)入96孔組織培養(yǎng)平板的孔中。在37℃下和加濕5％CO2培養(yǎng)箱中將平板培養(yǎng)24小時。
在96孔組織培養(yǎng)皿中將不同劑量下的IL-1捕獲物和重組人IL-1進行預培養(yǎng)并在37℃下培養(yǎng)2小時。然后將0.1ml的該混合物加入到含有MRC5細胞的96孔平板中，使得IL-1捕獲物的終濃度為10nM且IL-1的終濃度范圍在2.4pM-5nM。對照孔中只含有捕獲物或不含任何物質(zhì)。
接著在37℃下和加濕5％CO2培養(yǎng)箱中將平板培養(yǎng)24小時。收集上清液并使用R&D Systems Quantikine免疫試驗試劑盒、按照制造商的說明檢測IL-6的水平。結(jié)果附圖30表明捕獲物569(附圖26A-26E)能夠拮抗IL-1的作用并在用IL-1處理時阻斷IL-6從MRC5細胞中產(chǎn)生。在10nM濃度下，捕獲物569能夠阻斷IL-6產(chǎn)生至IL-1濃度為3nM。相反，IL-1-RI.Fc是一種極差的IL-1的拮抗劑。它僅能夠阻斷IL-1的作用至約10-20pM。因此，捕獲物569在阻斷IL-1方面優(yōu)于IL-1-RI.Fc約100倍。
實施例10IL-13/IL-4單鏈捕獲物的構(gòu)建1.為了生成命名為IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc的IL-13/IL-4雙捕獲物，將人IL-4Rα胞外結(jié)構(gòu)域(相當于附圖31A-附圖31G的#1-693位核苷酸)和人IL-13Rα1胞外結(jié)構(gòu)域(相當于附圖31A-附圖31G的#700-1665位核苷酸)通過標準PCR技術擴增并連入含有人Fc序列(相當于附圖31A-附圖31G的#1671-2355位核苷酸)的表達載體pMT21中，由此生成由N-C末端IL-4Rα、IL-13Rα1以及人IgG1的鉸合部、CH2和CH3區(qū)組成的融合蛋白。此外，在IL-4Rα與IL-13Rα1之間框內(nèi)構(gòu)建帶有氨基酸序列SerGly的2個氨基酸接頭(相當于附圖31A-附圖31G的#694-699位核苷酸)并在IL-13Rα1與Fc部分之間框內(nèi)構(gòu)建帶有氨基酸序列ThrGly的2個氨基酸接頭(相當于附圖31A-附圖31G的#1666-1671位核苷酸)。通過標準技術對所有序列進行序列鑒定。然后使用標準分子生物學技術將IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc編碼序列亞克隆入表達載體pCDNA3.1(Stratagene)。
2.為了生成命名為IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc的IL-13/IL-4雙捕獲物，將IL-13Rα1胞外結(jié)構(gòu)域(相當于附圖32A-附圖32G的#1-1029位核苷酸)和人IL-4Rα胞外結(jié)構(gòu)域(相當于附圖32A-附圖32G的#1060-1692位核苷酸)通過步驟PCR技術擴增并連入含有人Fc序列(相當于附圖32A-附圖32G的#1699-2382位核苷酸)的表達載體pJEF14中以便生成由N至C的IL-13Rα1、IL-4Rα以及人IgG1的鉸合部、CH2和CH3區(qū)組成的融合蛋白。此外，在IL-13Rα1與IL-4Rα之間框內(nèi)構(gòu)建帶有氨基酸序列GlyAlaProSerGlyGlyGlyGlyArgPro的10個氨基酸接頭(相當于附圖32A-附圖32G的#1030-1059位核苷酸)并在IL-4Rα與Fc部分之間框內(nèi)構(gòu)建帶有氨基酸序列SerGly的2個氨基酸接頭(相當于附圖32A-附圖32G的#1693-1698位核苷酸)。通過標準技術對所有序列進行序列鑒定。然后使用標準分子生物學技術將IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc的編碼序列亞克隆入表達載體pCDNA3.1(Stratagene)。實施例11IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc的表達在LB+氨芐西林內(nèi)使DH10B細胞中大規(guī)模(IL)培養(yǎng)的pCAE801(編碼IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc的DNA載體構(gòu)建體)和pCAE802(編碼IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc的DNA質(zhì)粒構(gòu)建體)生長過夜并使用QiagenEndofree Mega試劑盒、按照制造商的方案提取質(zhì)粒DNA。用UV分光光度計和熒光計測定純化質(zhì)粒DNA的濃度。還可以通過用BbsI、XmnI和NcoI限制酶消化等分試樣來檢驗質(zhì)粒DNA。所有限制酶消化相當于1％瓊脂糖凝膠中預定大小的片段。
以4×106個細胞/平板的密度給40個15cm培養(yǎng)平板接種CHO-K1/E1A細胞。平板固定培養(yǎng)基是Gibco Ham’s F-12 w/10％Hyclone胎牛血清(FBS)+青霉素/鏈霉素并給該培養(yǎng)基補充谷氨酰胺。第二天使用溶于12ml體積的Gibco Oprimem和Gibco Lipofectamine、按照制造商的方案給各平板轉(zhuǎn)染6μg的pCAE801或pCAE802。在向細胞中添加轉(zhuǎn)染混合物4小時后加入12ml/平板的Optimem w/10％FBS。在37℃下和5％CO2培養(yǎng)箱中將平板培養(yǎng)過夜。第二天從各平板中除去培養(yǎng)基并加入25ml表達培養(yǎng)基(Gibco CHO-S-SFM II w/谷氨酰胺+1mM丁酸鈉)。在37℃下將該平板培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)基從各平板中除去并用吊桶式轉(zhuǎn)頭以400rpm離心至沉淀出細胞。將上清液潷析入1L無菌瓶中并如下所述純化表達的蛋白質(zhì)。
實施例12從培養(yǎng)基中純化IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα1.Fc1.IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc的純化在CHO細胞中短暫表達人IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc并如上所述從平板轉(zhuǎn)染物中收集上清液。分別使用山羊抗-hIgG(γ鏈特異性；Sigma1-3382)和山羊抗-hIgG(Fc特異性)-FITC接合物(Sigma F9512)捕獲和報道抗體、通過夾心式ELISA測定表達的分泌蛋白質(zhì)。產(chǎn)量在5.8-9.2mg(平均7.5mg)/升條件培養(yǎng)基的范圍。將CompleteTM蛋白酶抑制劑片(Roche Diagnostics Corp.)溶入培養(yǎng)基(1片/L)。在4℃下，在上用pH 7.4的Dulbecco’s PBS緩沖液(LifeTechnologies)預平衡的5mL Hi Trap蛋白質(zhì)A親和柱(AmershamPharmacia Biotech)前將條件培養(yǎng)基進行無菌過濾(0.22μm孔大小)。流速為～1-2mL/分鐘。用PBS充分洗滌該柱以便從該柱中除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。使用20mM檸檬酸鈉、150mM NaCl(pH 3.5)洗脫IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc。通過用1M Tris-OH滴定而立即中和該洗脫液。收集含有蛋白質(zhì)的級分并立即將其透析入4℃下、pH 7.4的PBS緩沖液。從蛋白質(zhì)A純化步驟中回收6.8mg(73％)。在環(huán)境溫度下，使用用PBS、5％v/v甘油(pH 7.4)預平衡的superose 6柱(25mL床體積；Amersham Pharmacia Biotech)、通過大小排阻層析進一步純化IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc。流速為0.5mL/分鐘。根據(jù)考馬斯染色的非還原和還原的SDS-PAGE(Novex NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝膠)估計蛋白質(zhì)級分。適當收集級分以便減少聚集的蛋白質(zhì)的量?？偖a(chǎn)率為51％(4.4mg)，通過SDS-PAGE評定的純度為97％。通過非還原和還原的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris)、分析型大小排阻層析(Tosohaas TSKG4000SWXL)、N-末端測序和使用山羊抗-hIgG-HRP接合物(Promega W403B)以及小鼠單克隆抗-hIL-4R(R&DMAB230)、隨后是作為二次抗體的抗-mIgG-HRP接合物(PromegaW402B)進行的免疫印跡分析純化的IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc。2.IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc的純化在CHO細胞中短暫表達人IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc并如上所述從平板轉(zhuǎn)染物中收集上清液。分別使用山羊抗-hIgG(γ鏈特異性；Sigma1-3382)和山羊抗-hIgG(Fc特異性)-FITC接合物(Sigma F9512)捕獲和報道抗體、通過夾心式ELISA測定表達的分泌蛋白質(zhì)。產(chǎn)量為8.8/升條件培養(yǎng)基。將CompleteTM蛋白酶抑制劑片(RocheDiagnostics Corp.)溶入培養(yǎng)基(1片/L)。在4℃下，在上用pH 7.4的Dulbecco’s PBS緩沖液(Life Technologies)預平衡的5mL HiTrap蛋白質(zhì)A親和柱(Amersham Pharmacia Biotech)前將條件培養(yǎng)基進行無菌過濾(0.22μm孔大小)。流速為～1-2mL/分鐘。用PBS充分洗滌該柱以便從該柱中除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。使用20mM檸檬酸鈉、150mM NaCl(pH 3.5)洗脫IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc。通過用1M Tris-OH滴定而立即中和該洗脫液。收集含有蛋白質(zhì)的級分并立即將其透析入4℃下、pH 7.4的PBS緩沖液。從蛋白質(zhì)A純化步驟中回收3.8mg(43％)。在環(huán)境溫度下，使用用PBS、5％v/v甘油(pH 7.4)預平衡的superose 6柱(25mL床體積；AmershamPharmacia Biotech)、通過大小排阻層析進一步純化IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc。流速為0.5mL/分鐘。根據(jù)考馬斯染色的非還原和還原的SDS-PAGE(Novex NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝膠)估計蛋白質(zhì)級分。適當收集級分以便減少聚集的蛋白質(zhì)的量?？偖a(chǎn)率為17％(1.5mg)，通過SDS-PAGE評定的純度為95％。通過非還原和還原的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris)、分析型大小排阻層析(TosohaasTSKG4000SWXL)、N-末端測序和使用山羊抗-hIgG-HRP接合物(Promega W403B)以及小鼠單克隆抗-hIL-4R(R&D MAB230)、隨后是作為二次抗體的抗-mIgG-HRP接合物(Promega W402B)進行的免疫印跡分析純化的IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc。實施例13通過IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc阻斷IL-4和IL-13材料和方法TF1生物測定試驗 將TF1細胞維持在生長培養(yǎng)基(10ng/ml GM-CSF、RPMI1640、10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素)中。為了進行生物測定試驗，將細胞用試驗培養(yǎng)基(如上所述但不含GM-CSF)洗滌2次且然后以2×105個細胞固定在50μl試驗培養(yǎng)基中。以40nM的濃度將純化的IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc稀釋入試驗培養(yǎng)基。將25μl各捕獲物加入到細胞中。在試驗培養(yǎng)基中將IL-13或IL-4稀釋成40nM且然后制備溶于試驗培養(yǎng)基中的2倍稀釋液系列。接著將25μl IL-13或IL-4加入到含有細胞和捕獲物的孔中。接下來在37℃下和5％CO2中將細胞培養(yǎng)～70小時。通過MTS檢測試驗、按照制造商的方案(Promega，Inc.)測定TF1細胞增殖程度。結(jié)果如上所述在TF1生物測定試驗中測定IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc捕獲物阻斷人IL-13和人IL-4活性的能力。IL-13刺激TF1細胞增殖，其半數(shù)最大生長濃度是0.2nM。添加10nM濃度的IL-4Rα.IL-13Rα1. Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc捕獲物可阻斷最高可達2nM的IL-13-誘導的生長(附圖33)。在～4-5nM IL-13濃度下，TF1細胞的生長被抑制了50％。TF1細胞對半數(shù)最大生長為～0.02nM的刺激其增殖的IL-4更為敏感。添加10nM濃度的IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc或IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc可阻斷最高可達～1nM的IL-13-誘導的生長(附圖34)。在～3-4nM IL-4濃度下，TF1細胞的生長被抑制了50％。這些結(jié)果證明IL-4Rα.IL-13Rα1.Fc和IL-13Rα1.IL-4Rα.Fc均可以阻斷IL-4和IL-13刺激細胞響應的能力。
實施例14體內(nèi)通過IL-1捕獲物阻斷注射的IL-1IL-1是一種促炎細胞因子。已經(jīng)證實系統(tǒng)性給予Il-1可在動物體內(nèi)引起急性反應，包括短暫高血糖、血胰島素過少、發(fā)熱、厭食和白細胞介素-6(IL-6)血清水平升高(Reimers，1998)。由于小鼠對鼠和人IL-1有反應，所以可以使用人IL-1且可以評價人特異性IL-1拮抗劑的體內(nèi)結(jié)合作用。將這種急性小鼠模型用于測定人IL-1捕獲物拮抗外源給予的人IL-1的體內(nèi)作用的能力。這產(chǎn)生了人IL-1捕獲物的體內(nèi)功效的快速跡象且可以將它用作輔助分子篩選的檢測試驗。實驗設計給小鼠皮下注射人IL-1(0.3μg/kg)。在注射人IL-1前24小時用載體或150倍摩爾以上的人IL-1捕獲物(0.54mg/kg)預治療動物。在處死動物前2小時(26小時)，給小鼠第二次注射人IL-1(0.3μg/kg)。在不同的時間點處采集血樣并檢測血清的IL-6水平。結(jié)果外源給予人IL-1導致血清IL-6水平顯著升高。在150倍摩爾以上時，人IL-1捕獲物完全阻斷了IL-6的增加(附圖35)。此外，人IL-1捕獲物的作用至少又持續(xù)了24小時，甚至再次給予IL-1時也可防止IL-6增加(附圖35)。這類持續(xù)長久的功效提示每日注射IL-6捕獲物對慢性應用并不是必需的。實施例15在獼猴中評價IL-4捕獲物阻斷對人IL-4的生理反應的能力系統(tǒng)性給予人IL-4在獼猴體內(nèi)引起全身反應(Gundel等，1996)。因此，通過確定這些反應可以證明IL-4捕獲物阻斷人IL-4的有效性。實驗設計本實驗由3部分組成人IL-4+載體(部分1)；人IL-4+人IL-4捕獲物(部分2)；和人IL-4+載體(部分3)。從給予人IL-4前第1天開始，每日兩次皮下注射人IL-4(25μg/kg)、持續(xù)4天；且每日靜脈內(nèi)給予人IL-4捕獲物(8mg/kg)和載體、持續(xù)5天。每日采集全血用于對CD16的流式細胞分析并獲得血漿用于檢測細胞因子單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)。CD16和MCP-1是IL-4介導的人和猴體內(nèi)的炎癥的標記。結(jié)果在有人IL-4存在的情況下，MCP-1增加了2.5倍且被IL-4捕獲物明顯阻斷(附圖36A)。類似地，IL-4捕獲物減弱外周血液中CD16陽性淋巴細胞百分比的減少(附圖36B)。在剩余期限后，給猴重新注射IL-4并重新證實動物對人IL-4的反應性(附圖36A和36B)，從而提示IL-4捕獲物特異性介導對MCP-1和CD16反應的抑制作用。
實施例16IL-4捕獲物對IL-4-誘導的IgE分泌的作用已經(jīng)證實注射抗小鼠IgD抗體可刺激正常小鼠體內(nèi)IL-4-介導的IgE增加。已經(jīng)將該模型廣泛用于評價IL-4拮抗劑諸如可溶性IL-4受體和抗-IL-4單克隆抗體(Sato等，1993)。我們決定使用該模型評價IL-4捕獲物阻斷IL-4-介導的IgE增加的能力。實驗設計將注射了抗-小鼠IgD(100μl/小鼠，皮下)的BALB/C小鼠隨機分成3組。各組接受(第3-5天時)載體、鼠IL-4捕獲物(1mg/kg，皮下)或?qū)π∈驣L-4的單克隆抗體(1mg/kg，皮下)。在不同時間點處采集血清并檢測IgE水平。結(jié)果用鼠IL-4捕獲物或小鼠IL-4抗體治療均可顯著拮抗這種小鼠模型中IL-4-介導的IgG升高(附圖37)。這提示鼠IL-4捕獲物結(jié)合鼠IL-4并拮抗由體內(nèi)內(nèi)源性IL-4引起的生理反應。
本發(fā)明在范圍上并不限于本文所述的特定實施方案。實際上，除所述的那些實施方案外，本領域技術人員顯然可以根據(jù)上述描述和附圖對本發(fā)明進行各種修改。這類修改也屬于所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種編碼能夠結(jié)合細胞因子而形成非功能性復合物的融合多肽的分離的核酸分子，它包括a)一種編碼第一種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第一種融合多肽成分包括細胞因子受體特異性決定成分的胞外結(jié)構(gòu)域細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；b)一種編碼第二種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第二種融合多肽成分包括細胞因子受體的信號轉(zhuǎn)導成分胞外結(jié)構(gòu)域細胞因子結(jié)合部分的氨基酸序列；c)一種編碼第三種融合多肽成分的核苷酸序列，所述的第三種融合多肽成分包括多聚化成分的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，其中編碼所述第一種成分的核苷酸序列是編碼所述第二種成分的核苷酸序列的上游。
3.權(quán)利要求1的核酸分子，其中編碼所述第一種成分的核苷酸序列是編碼所述第二種成分的核苷酸序列的下游。
4.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的細胞因子受體是血細胞生成素族細胞因子的受體，所述的細胞因子選自白細胞介素-2、白細胞介素-3、白細胞介素-4、白細胞介素-5、白細胞介素-6、白細胞介素-7、白細胞介素-9、白細胞介素-11、白細胞介素-13、白細胞介素-15、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、制癌蛋白M和白血病抑制因子以及心臟營養(yǎng)蛋白-1(cardiotrophin-1)組成的組。
5.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的細胞因子受體是干擾素族細胞因子的受體，所述的細胞因子選自IFN-γ、IFN-α和IFN-β組成的組。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的細胞因子受體是免疫球蛋白超家族細胞因子的受體，所述的細胞因子選自B7.1(CD80)和B7.2(B70)組成的組。
7.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的細胞因子受體是TNF族細胞因子的受體，所述的細胞因子選自TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配體、Fas配體、CD27配體、CD30配體和4-1 BBL組成的組。
8.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的細胞因子受體是TGF-β/BMP族的受體，所述的TGF-β/BMP族選自TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3a、BMP-3b、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8a、BMP-8b、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15、BMP-16、與子宮內(nèi)膜出血相關的因子(EBAF)、生長分化因子-1(GDF-1)、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-12、GDF-14、米勒抑制物質(zhì)(mullerian inhibiting substance)(MIS)、活化素-1、活化素-2、活化素-3、活化素-4和活化素-5組成的組。
9.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的細胞因子受體是選自白細胞介素-1、白細胞介素-10、白細胞介素-12、白細胞介素-14、白細胞介素-18和MIF組成的組的細胞因子的受體。
10.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述的多聚化成分包括一種免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求10的分離的核酸分子，其中所述的免疫球蛋白衍生的結(jié)構(gòu)域選自IgG的Fc結(jié)構(gòu)域、IgG的重鏈和IgG的輕鏈組成的組。
12.一種由權(quán)利要求1所述分離的核酸分子編碼的融合多肽。
13.一種能夠結(jié)合細胞因子而形成包括權(quán)利要求12所述融合多肽的多聚體的非功能性復合物的組合物。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述的多聚體是一種二聚體。
15.一種包括權(quán)利要求1所述核酸分子的載體。
16.一種包括權(quán)利要求1核酸分子的表達載體，其中所述的核酸分子可操作地與一種表達控制序列連接。
17.一種包括權(quán)利要求16所述表達載體的用于生產(chǎn)融合多肽的宿主-載體系統(tǒng)，該表達載體在合適的宿主細胞內(nèi)。
18.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
19.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是大腸桿菌。
20.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是COS細胞。
21.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是CHO細胞。
22.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是293細胞。
23.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是BHK細胞。
24.權(quán)利要求17的宿主-載體系統(tǒng)，其中所述的合適的宿主細胞是NSO細胞。
25.一種包括生長權(quán)利要求17宿主-載體系統(tǒng)細胞的生產(chǎn)融合多肽的方法，該方法在允許生產(chǎn)所述融合多肽并回收如此生產(chǎn)的融合多肽的條件下進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠結(jié)合細胞因子而形成非功能性復合物的融合多肽。本發(fā)明還提供了一種編碼該融合多肽的核酸序列和該融合多肽的制備方法和用途。
文檔編號C12P21/02GK1357049SQ99813723
公開日2002年7月3日 申請日期1999年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月25日
發(fā)明者N·斯塔爾, G·D·彥科普洛斯 申請人:里珍納龍藥品有限公司