專(zhuān)利名稱(chēng)：用于wt1特異性免疫治療的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及諸如白血病和癌癥等惡性疾病的免疫治療。本發(fā)明更具體的涉及用于產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)WT1的免疫應(yīng)答的組合物，和這種組合物在預(yù)防和/或治療惡性疾病中的使用。
背景技術(shù)：
癌癥和白血病是美國(guó)乃至全世界的重要健康問(wèn)題。盡管在這些疾病的檢測(cè)和治療中取得了一些進(jìn)展，但是目前仍然沒(méi)有獲得用于預(yù)防或治療癌癥和白血病的疫苗或其它普遍有效的方法。這些疾病的治療目前仍依賴(lài)早期診斷和攻擊性治療(包括諸如外科手術(shù)、放療、化療和激素治療等多種療法中的一種或多種)的組合。特定癌癥的療程通常根據(jù)多種預(yù)后參數(shù)(包括特異腫瘤標(biāo)記的分析)進(jìn)行選擇。然而，使用已建立的標(biāo)記通常產(chǎn)生難以解釋的結(jié)果，而且在許多癌癥患者中持續(xù)觀察到高死亡率。
免疫療法具有在本質(zhì)上改進(jìn)癌癥和白血病治療和存活的潛力。最近的資料表明，白血病可以通過(guò)免疫療法中的骨髓移植(如輸注捐獻(xiàn)者的淋巴細(xì)胞)治愈。這種療法可能涉及產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的免疫應(yīng)答。然而，迄今，已知的TAA相對(duì)較少，而且針對(duì)這種抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答并未顯示對(duì)治療有益(除了個(gè)別例外)。
相應(yīng)的，本領(lǐng)域中需要用于預(yù)防和治療白血病和癌癥的改進(jìn)方法。本發(fā)明滿足了這些要求，并進(jìn)一步提供其它相關(guān)優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明概述簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明提供了用于診斷和治療諸如白血病和癌癥等疾病的組合物和方法。一方面，本發(fā)明提供了包含天然WT1的免疫原性部分的多肽，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體。在某些實(shí)施方案中，多肽所含的天然WT1多肽的連續(xù)氨基酸殘基不超過(guò)16個(gè)。在其它實(shí)施方案中，多肽包含天然WT1多肽的第1-174位氨基酸殘基的免疫原性部分或其變體，其中多肽包含天然WT1多肽中第175-449位氨基酸中存在的不超過(guò)16個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。免疫原性部分優(yōu)選可與MHC I類(lèi)和/或II類(lèi)分子結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，多肽包含選自下組的序列(a)表2-46中一項(xiàng)或多項(xiàng)記錄的序列；(b)上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(c)上述多肽的模擬物，該模擬物與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小。
在其它實(shí)施方案中，多肽包含選自下組的序列(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(SEQ IDNO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(SEQID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO185和293)；(b)上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(c)上述多肽的模擬物，該模擬物與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小。模擬物可以包含與一種或多種氨基酸模擬物相組合的氨基酸，或者可以是完全非肽的模擬物。
在其它方面，本發(fā)明提供了包含WT1蛋白免疫原性部分的變體的多肽，其中變體因免疫原性部分中1-3個(gè)氨基酸位置的取代而與免疫原性部分不同、以至于變體與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力相對(duì)于天然WT1蛋白增強(qiáng)了。
本發(fā)明還提供了編碼上述WT1多肽的WT1多核苷酸。
在其它方面，本發(fā)明提供了藥物組合物和疫苗。藥物組合物可以包含上述多肽或模擬物，和/或與制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑相結(jié)合的下列一項(xiàng)或多項(xiàng)(a)WT1多核苷酸；(b)可特異結(jié)合WT1多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段；(c)可與WT1多肽特異反應(yīng)的T細(xì)胞；或(d)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞。疫苗包含上述多肽和/或下列一項(xiàng)或多項(xiàng)(a)WT1多核苷酸；(b)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；或(c)抗獨(dú)特型抗體，和非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。在某些實(shí)施方案中，這種藥物組合物和疫苗中采用的WT1多肽包含天然WT1多肽中少于23個(gè)，優(yōu)選少于17個(gè)連續(xù)氨基。免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑可以是佐劑。優(yōu)選的，免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑可增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了用于增強(qiáng)或誘導(dǎo)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)患者施用上述藥物組合物或疫苗。在某些實(shí)施方案中，患者是人。
本發(fā)明還提供了抑制患者體內(nèi)惡性疾病發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用上述藥物組合物或疫苗。惡性疾病包括(但不限于)白血病(如急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性髓性白血病)和癌癥(如乳腺、肺、甲狀腺、或胃腸癌或者黑色素瘤)?；颊呖赡?但不一定)患有惡性疾病，而且施用所述藥物組合物或疫苗可以抑制這種疾病的發(fā)作，或者可以抑制現(xiàn)有疾病的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移。
在其它方面，本發(fā)明還提供了用于由骨髓和/或外周血或其部分除去表達(dá)WT1的細(xì)胞的方法，包括將骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分與能和WT1多肽發(fā)生特異反應(yīng)的T細(xì)胞進(jìn)行接觸，其中接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足以將骨髓、外周血、或其級(jí)分的髓樣或淋巴細(xì)胞中的WT1陽(yáng)性細(xì)胞降至10％以下，優(yōu)選5％以下，更優(yōu)選1％以下。骨髓、外周血、和其級(jí)分可以由患有與WT1表達(dá)有關(guān)的疾病的患者獲得，或者可以由未患有這種疾病的人或非人哺乳動(dòng)物獲得。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)惡性疾病發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用如上制備的骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分。這種骨髓、外周血、或級(jí)分可以是自體的，或者可以由相關(guān)或無(wú)關(guān)的人或非人動(dòng)物(如同源的或異源的)獲得。
在其它方面，本發(fā)明提供了用于刺激(或引發(fā))和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法，包括將T細(xì)胞與WT1多肽進(jìn)行接觸，接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足以刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞。這種T細(xì)胞可以是自體的、異源的、同源的或無(wú)關(guān)的WT1特異性T細(xì)胞，而且可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行刺激。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)擴(kuò)增的T細(xì)胞可以存在于骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分中，而且可以(但不必)是無(wú)性系的。在某些實(shí)施方案中，在刺激和/或擴(kuò)增過(guò)程中T細(xì)胞可以存在于哺乳動(dòng)物中。WT1特異性T細(xì)胞可以用于例如捐獻(xiàn)者淋巴細(xì)胞輸注。
在相關(guān)方面，提供了用于抑制患者體內(nèi)惡性疾病發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用如上制備的T細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，這種T細(xì)胞可以是自體的、同源的、或異源的。
在其它方面，本發(fā)明還提供了用于監(jiān)控患者體內(nèi)用于WT1表達(dá)相關(guān)惡性疾病的免疫或治療的功效的方法。這種方法基于監(jiān)控患者體內(nèi)的抗體、CD4+T細(xì)胞和/或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在某些方面，這種方法可以包括下列步驟(a)將第一份生物學(xué)樣品與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞，其中第一份生物學(xué)樣品由治療或免疫前的患者獲得，且溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以形成免疫復(fù)合物；(b)檢測(cè)WT1多肽和生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合WT1多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物；(c)使用由治療或免疫后的同一患者獲得的第二份生物學(xué)樣品，重復(fù)步驟(a)和(b)；并(d)比較在第一份和第二份生物學(xué)樣品中檢測(cè)到的免疫復(fù)合物的量，并由此監(jiān)控患者體內(nèi)這種治療或免疫的功效。
在上述方法的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括(a)將免疫復(fù)合物與能夠結(jié)合該免疫復(fù)合物的檢測(cè)試劑一起進(jìn)行溫育，其中檢測(cè)試劑包含報(bào)道基團(tuán)；(b)除去未結(jié)合的檢測(cè)試劑；并(c)檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的存在與否。檢測(cè)試劑可以包括例如能夠與可特異結(jié)合WT1多肽的抗體結(jié)合的二抗或其抗原結(jié)合片段，或者諸如蛋白A之類(lèi)分子。在某些實(shí)施方案中，報(bào)道基團(tuán)結(jié)合在WT1多肽上，且檢測(cè)步驟包括除去未結(jié)合的WT1多肽并隨后檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的存在與否。
在其它方面，用于監(jiān)控患者體內(nèi)用于與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的免疫或治療的功效的方法，包括下列步驟(a)將第一份生物學(xué)樣品與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞，其中第一份生物學(xué)樣品包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞，且由治療或免疫前的患者獲得，而且溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以使得T細(xì)胞特異激活、增殖和/或裂解；(b)檢測(cè)激活、增殖和/或裂解的T細(xì)胞的量；(c)使用包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞、由治療或免疫后的同一患者獲得的第二份生物學(xué)樣品，重復(fù)步驟(a)和(b)；并(d)比較第一份和第二份生物學(xué)樣品中T細(xì)胞激活、增殖和/或裂解的量，并由此監(jiān)控患者體內(nèi)該治療或免疫的功效。
本發(fā)明還提供了用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞，以使T細(xì)胞增殖；并(b)對(duì)患者施用有效量的該增殖T細(xì)胞，由此抑制患者體內(nèi)惡性疾病的發(fā)展。在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞溫育步驟可以重復(fù)一次或多次。
在其它方面，本發(fā)明提供了用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞，以使T細(xì)胞增殖；(b)克隆一個(gè)或多個(gè)增殖細(xì)胞；并(c)對(duì)患者施用有效量的該克隆T細(xì)胞。
在其它方面，提供了用于測(cè)定患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD4+和/或CD8+T細(xì)胞與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；并(b)檢測(cè)T細(xì)胞特異激活的存在與否，由此測(cè)定與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟包括檢測(cè)T細(xì)胞增殖的存在與否。
在其它方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)定患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否的方法，包括下列步驟(a)將由患者獲得的生物學(xué)樣品與下列一項(xiàng)或多項(xiàng)一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞，其中溫育進(jìn)行的時(shí)間和條件足以形成免疫復(fù)合物；并(b)檢測(cè)WT1多肽和生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合WT1多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物；并由此測(cè)定與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否。
參照下面的詳述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面是顯而易見(jiàn)的。此處公開(kāi)的所有文獻(xiàn)是作為獨(dú)立每篇全文收入作為參考文獻(xiàn)的。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1描述了小鼠(MO)和人(HU)WT1蛋白質(zhì)序列(依次是SEQ IDNO320和319)的比較。
圖2是圖解血液學(xué)惡性腫瘤(AML)患者體內(nèi)WT1特異抗體檢測(cè)的Western印漬。1道顯示分子量標(biāo)記；2道顯示陽(yáng)性對(duì)照(與WT1特異抗體一起免疫沉淀的WT1陽(yáng)性人白血病細(xì)胞系)；3道顯示陰性對(duì)照(與小鼠血清一起免疫沉淀的WT1陽(yáng)性細(xì)胞系)；而4道顯示與AML患者血清一起免疫沉淀的WT1陽(yáng)性細(xì)胞系。對(duì)于2-4道，將免疫沉淀物通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，并用WT1特異抗體進(jìn)行探查。
圖3是圖解用TRAMP-C(一種WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系)免疫的B6小鼠體內(nèi)WT1特異抗體應(yīng)答檢測(cè)的Western印漬。1、3和5道顯示分子量標(biāo)記，而2、4和6道顯示W(wǎng)T1特異陽(yáng)性對(duì)照(N180，Santa CruzBiotechnology，跨越WT1蛋白質(zhì)N末端區(qū)域180個(gè)氨基酸的多肽，在Western印漬上遷移到52kD)。所用一抗是2道中的WT180、4道中的未免疫B6小鼠血清、和6道中的經(jīng)免疫B6小鼠血清。
圖4圖解用代表性WT1肽免疫的小鼠體內(nèi)WT1特異抗體檢測(cè)的Western印漬。1、3和5道顯示分子量標(biāo)記物，而2、4和6道顯示W(wǎng)T1特異陽(yáng)性對(duì)照(N180，Santa Cruz Biotechnology，跨越WT1蛋白質(zhì)N末端區(qū)域180個(gè)氨基酸的多肽，在Western印漬上遷移到52kD)。所用一抗是2道中的WT180、4道中的未免疫B6小鼠血清、和6道中的經(jīng)免疫B6小鼠血清。
圖5A至5C是圖解用代表性WT1肽免疫的小鼠體內(nèi)增殖性T細(xì)胞應(yīng)答的刺激的圖。如所示，使用一種T細(xì)胞系和兩種不同克隆進(jìn)行胸苷摻入分析，結(jié)果以cpm表述。x軸指示的對(duì)照是不含抗原(無(wú)Ag)和B6/培養(yǎng)基；所用抗原是p6-22人(p1)、p117-139(p2)或p244-262人(p3)。
圖6A和6B是圖解用代表性WT1肽免疫的小鼠體內(nèi)增殖性T細(xì)胞應(yīng)答的刺激的柱狀圖。第三次免疫三周后，將用疫苗A或疫苗B接種的小鼠的脾細(xì)胞僅與培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)、或與脾細(xì)胞和培養(yǎng)基(B6/無(wú)抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)、p244-262(p244)(疫苗A；圖6A)或p287-301(p287)、p299-313(p299)、p421-435(p421)(疫苗B；圖6B)脈沖的B6脾細(xì)胞、和用無(wú)關(guān)對(duì)照肽(無(wú)關(guān)肽)25μg/ml脈沖的脾細(xì)胞一起進(jìn)行培養(yǎng)，并在96小時(shí)后通過(guò)(3H)胸苷摻入測(cè)定增殖。條柱代表刺激指數(shù)(SI)，以實(shí)驗(yàn)孔平均值除以對(duì)照平均值(無(wú)抗原的B6脾細(xì)胞)計(jì)算。
圖7A至7D是圖解p117-139和p6-22特異的增殖性T細(xì)胞系和克隆的產(chǎn)生的柱狀圖。體內(nèi)免疫后，分別使用疫苗A或B的所有三種肽進(jìn)行最初的三次體外刺激(IVS)。只使用兩種相關(guān)肽p117-139和p6-22如單一肽刺激一樣進(jìn)行隨后的IVS。如所示，由p6-22和p117-139特異性T細(xì)胞系得到克隆。將T細(xì)胞僅與培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)、或與脾細(xì)胞和培養(yǎng)基(B6/無(wú)抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)、或無(wú)關(guān)對(duì)照肽(無(wú)關(guān)肽)25μg/ml脈沖的B6脾細(xì)胞一起進(jìn)行培養(yǎng)，并在96小時(shí)后通過(guò)(3H)胸苷摻入測(cè)定增殖。條柱代表刺激指數(shù)(SI)，以實(shí)驗(yàn)孔平均值除以對(duì)照平均值(無(wú)抗原的B6脾細(xì)胞)計(jì)算。
圖8A和8B展示了關(guān)于具有誘導(dǎo)Th應(yīng)答潛力的肽的人WT1(SEQ IDNO319)TSITES分析的結(jié)果?！癆”指示的區(qū)域是模塊的AMPHI中點(diǎn)，“R”指示匹配Rothbard/Tay1or基元的殘基，“D”指示匹配IAd基元的殘基，而“d”指示匹配IEd基元的殘基。
圖9A和9B是圖解用WT1肽免疫的小鼠體內(nèi)WT1肽特異性CTL的誘導(dǎo)的圖。圖9A圖解了異源細(xì)胞系對(duì)靶細(xì)胞的裂解，而圖9B顯示了肽包被細(xì)胞系的裂解。在每種情況中，在三個(gè)所示效應(yīng)物靶比率顯示裂解百分比(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定)。提供了淋巴瘤細(xì)胞(LSTRA和E10)以及E10＋p235－243(E10＋P235)的結(jié)果。E10細(xì)胞此處還稱(chēng)為EL-4細(xì)胞。
圖10A至10D是圖解用WT1肽P117免疫B6小鼠后，能夠殺死WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系但不殺死WT1陰性細(xì)胞系的WT1特異性CTL的誘導(dǎo)的圖。圖10A圖解了未免疫B6小鼠的T細(xì)胞不殺死WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系。圖10B圖解了異源細(xì)胞系對(duì)靶細(xì)胞的裂解。圖10C和10D證明了在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中，與WT1陰性細(xì)胞系相比，WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系的裂解。此外，圖10C和10D顯示了肽包被細(xì)胞系(相關(guān)WT1肽P117包被的WT1陰性細(xì)胞系E10)的裂解。在每種情況中，在三個(gè)所示效應(yīng)物靶比率顯示裂解百分比(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定)。提供了淋巴瘤細(xì)胞(E10)、前列腺癌細(xì)胞(TRAMP-C)、轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞系(BLK-SV40)、以及E10＋p117的結(jié)果。
圖11A和11B是圖解代表性肽P117-139特異性CTL裂解WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的能力的柱狀圖。第三次免疫三周后，將用肽p235-243或p117-139接種的小鼠的脾細(xì)胞在體外用相關(guān)肽進(jìn)行刺激，并測(cè)試裂解與WT1肽一起溫育的靶以及WT1陽(yáng)性和陰性腫瘤細(xì)胞的能力。條柱代表在E∶T比率25∶1進(jìn)行了三次的鉻釋放實(shí)驗(yàn)中平均特異裂解百分比。如所示，圖11A顯示了p235-243特異性T細(xì)胞系針對(duì)WT1陰性細(xì)胞系EL-4(EL-4，WT1陰性)；用相關(guān)(用于免疫以及再刺激)肽p235-243脈沖的EL-4(EL-4＋p235)；用無(wú)關(guān)肽p117-139(EL-4＋p117)、p126-134(EL-4＋p126)或p130-138(EL-4＋p130)脈沖的EL-4；WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞BLK-SV40(BLK-SV40，WT1陽(yáng)性)；和TRAMP-C(TRAMP-C，WT1陽(yáng)性)的細(xì)胞毒活性。如所示，圖11B顯示了p117-139特異性T細(xì)胞系針對(duì)EL-4；用相關(guān)肽p117-139脈沖的EL-4(EL-4＋p117)；以及用無(wú)關(guān)肽p123-131(EL-4＋p123)或p128-136(EL-4＋p128)脈沖的EL-4；BLK-SV40；和TRAMP-C的細(xì)胞毒活性。
圖12A和12B是圖解WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞裂解特異性的柱狀圖(如冷靶抑制證明的)。條柱代表在E∶T比率25∶1進(jìn)行了三次的鉻釋放實(shí)驗(yàn)中的平均特異裂解百分比。如所示，圖12A顯示了p117-139特異性T細(xì)胞系針對(duì)WT1陰性細(xì)胞系EL-4(EL-4，WT1陰性)；WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系TRAMP-C(TRAMP-C，WT1陽(yáng)性)；與10倍過(guò)量(與熱靶相比)的用未進(jìn)行51Cr標(biāo)記的相關(guān)肽p117-139(TRAMP-C＋p117冷靶)脈沖過(guò)的EL-4一起溫育的TRAMP-C細(xì)胞；和與用未進(jìn)行51Cr標(biāo)記的無(wú)關(guān)肽脈沖過(guò)的EL-4一起溫育的TRAMP-C細(xì)胞(TRAMP-C＋無(wú)關(guān)冷靶)的細(xì)胞毒活性。如所示，圖12B顯示了p117-139特異性T細(xì)胞系針對(duì)WT1陰性細(xì)胞系EL-4(EL-4，WT1陰性)；WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系BLK-SV40(BLK-SV40，WT1陽(yáng)性)；與相關(guān)冷靶一起溫育的BLK-SV40細(xì)胞(BLK-SV40＋p117冷靶)；和與無(wú)關(guān)冷靶一起溫育的BLK-SV40細(xì)胞(BLK-SV40＋無(wú)關(guān)冷靶)的細(xì)胞毒活性。
圖13A至13C是描述p117-139中九聚CTL表位的評(píng)價(jià)的柱狀圖。針對(duì)包含或缺乏恰當(dāng)H-2bI6類(lèi)結(jié)合基元的aa117-139內(nèi)的肽，測(cè)試了p117-139腫瘤特異性CTL系，并隨后用p126-134或p130-138再刺激。條柱代表在E∶T比率25∶1進(jìn)行了三次的鉻釋放實(shí)驗(yàn)中的平均特異裂解百分比。圖13A顯示了p117-139特異性T細(xì)胞系針對(duì)WT1陰性細(xì)胞系EL-4(EL-4，WT1陰性)；和用肽p117-139(EL-4＋p117)、p119-127(EL-4＋p119)、p120-128(EL-4＋p120)、p123-131(EL-4＋p123)、p126-134(EL-4＋p126)、p128-136(EL-4＋p128)、和p130-138(EL-4＋p130)脈沖的EL-4細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖13B顯示了用p126-134再刺激后，CTL細(xì)胞系針對(duì)WT1陰性細(xì)胞系EL-4；用p117-139(EL-4＋p117)、p126-134(EL-4＋p126)脈沖的EL-4細(xì)胞；和WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系TRAMP-C的細(xì)胞毒活性。圖13C顯示了用p130-138再刺激后，CTL系針對(duì)EL-4；用p117-139(EL-4＋p117)、p130-138(EL-4＋p130)脈沖的EL-4細(xì)胞；和WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系TRAMP-C的細(xì)胞毒活性。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明一般性涉及用于惡性疾病的免疫治療和診斷的組合物和方法。此處描述的組合物可包括WT1多肽、WT1多核苷酸、表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC，如樹(shù)突狀細(xì)胞)、諸如能夠結(jié)合WT1多肽的抗體等試劑、和/或WT1特異的免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如T細(xì)胞)。本發(fā)明的WT1多肽一般包含至少部分Wilms腫瘤基因產(chǎn)物或其變體。本發(fā)明的核酸序列一般包含編碼完整或部分這種多肽的DNA或RNA序列或其互補(bǔ)序列?？贵w一般是能夠與WT1多肽部分結(jié)合的免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)或其抗原結(jié)合片段。在這種組合物中可以采用的T細(xì)胞一般是WT1多肽特異的T細(xì)胞(如CD4+和/或CD8+)。此處描述的某些方法還采用了表達(dá)此處提供的WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明是建立在下列發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)之上的針對(duì)Wilms腫瘤(WT)基因產(chǎn)物(如WT1)引起的免疫應(yīng)答可以為患有特征為WT1基因表達(dá)增加的惡性疾病患者提供預(yù)防性和/或治療性益處。這些疾病包括(但不限于)白血病(如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、和兒童ALL)，以及諸如肺、乳腺、甲狀腺和胃腸癌和黑色素瘤等許多癌癥。WT1基因最初是根據(jù)Wilms腫瘤患者染色體11p13上的細(xì)胞遺傳缺失鑒定出和分離到的(見(jiàn)Call等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,350,840)。該基因包括10個(gè)外顯子，并編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，圖1以及SEQ ID NO319和320提供了小鼠和人WT1蛋白質(zhì)的序列。WT1多肽如上所述，在本發(fā)明的內(nèi)容中，WT1多肽是至少包含天然WT1(即未遺傳修飾的有機(jī)體表達(dá)的WT1蛋白質(zhì))的免疫原性部分或其變體的多肽。倘若WT1多肽至少包含天然WT1蛋白的免疫原性部分或其變體，則它可以是任何長(zhǎng)度的。換言之，WT1多肽可以是寡肽(即由相對(duì)較小數(shù)目的氨基酸殘基(諸如8-10個(gè)殘基)組成，由肽鍵連接)、全長(zhǎng)WT1蛋白質(zhì)(如存在于人或非人動(dòng)物(諸如小鼠)中)、或中間大小的多肽。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用包含天然WT1多肽的小數(shù)目連續(xù)氨基酸殘基的WT1多肽。在需要產(chǎn)生T細(xì)胞應(yīng)答的某些用途中優(yōu)選這種多肽。例如，這種WT1多肽可以包含天然WT1多肽中少于23個(gè)，優(yōu)選不超過(guò)18個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。包含天然WT1多肽的9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的多肽一般適合于這種目的。由天然蛋白質(zhì)衍生的其它序列和/或異源序列可以存在于任何WT1多肽中，而且這種序列可以(但不必)具備其它免疫原性或抗原性。此處提供的多肽還可以與其它多肽或非多肽化合物相連(共價(jià)或非共價(jià))。
此處使用的“免疫原性部分”是多肽中由B細(xì)胞和/或T細(xì)胞表面抗原受體識(shí)別(即特異結(jié)合)的一部分。某些優(yōu)選的免疫原性部分可結(jié)合MHC I類(lèi)或II類(lèi)分子。如此處所用，如果這種結(jié)合是使用本領(lǐng)域已知任何實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)的，那么就說(shuō)免疫原性部分可與MHC I類(lèi)或II類(lèi)分子“結(jié)合”。例如，多肽結(jié)合MHC I類(lèi)的能力可以通過(guò)監(jiān)控其促進(jìn)將125I標(biāo)記的β2-微球蛋白(β2m)摻入MHC I類(lèi)/β2m/肽異源三聚復(fù)合物的能力間接評(píng)價(jià)(見(jiàn)Parker等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)152163，1994)?；蛘?，可以采用本領(lǐng)域已知的功能肽競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。某些免疫原性部分具有表2至14中一個(gè)或多個(gè)記錄的一種或多種序列。代表性免疫原性部分包括(但不限于)RDLNALLPAVPSLGGGG(人WT1第6-22位殘基；SEQ ID NO1)、PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(人和小鼠WT1第117-139位殘基；依次為SEQ ID NO2和3)、GATLKGVAAGSSSSVKWTE(人WT1第244-262位殘基；SEQ ID NO4)、GATLKGVAA(人WT1第244-252位殘基；SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(人和小鼠WT1第235-243位殘基；依次為SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(小鼠WT1第136-144位殘基；SEQ ID NO296)、SCLESQPAI(人WT1第136-144位殘基；SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(人和小鼠WT1第225-233位殘基；依次為SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(小鼠WT1第10-18位殘基；SEQ ID NO255)、或RMFPNAPYL(人和小鼠WT1第126-134位殘基；依次為SEQ ID NO185和293)。此處提供了其它免疫原性部分，而且一般可以使用諸如Paul(基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，第3版，第243-247頁(yè)，Raven出版社，1993)和其中引用的文獻(xiàn)中總結(jié)的那些方法等眾所周知的技術(shù)鑒定其它免疫原性部分。用于鑒定免疫原性部分的代表性技術(shù)包括篩選多肽與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆反應(yīng)的能力。天然WT1多肽的免疫原性部分是與這種抗血清和/或T細(xì)胞的反應(yīng)水平不顯著低于全長(zhǎng)WT1的反應(yīng)性(如在ELISA和/或T細(xì)胞反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)中)的部分。換言之，免疫原性部分在這種實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)水平可以與全長(zhǎng)多肽的反應(yīng)性相似或更高。這種篩選一般可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法進(jìn)行，諸如Harlow和Lane描述的那些方法(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)。
或者，可以使用諸如Tsites程序(參閱Rothbard和Taylor，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J)793-100，1988；Deavin等人，分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)33145-155，1996)等檢索具有引發(fā)Th應(yīng)答能力的肽基元的計(jì)算機(jī)分析，鑒定免疫原性部分。可以根據(jù)BIMAS(Parker等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)152163，1994)和其它HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析，鑒定包含適于結(jié)合鼠和人I型或II型MHC的基元的CTL肽。為了確認(rèn)免疫原性，可以使用HLA A2轉(zhuǎn)基因小鼠模型和/或使用樹(shù)突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、或外周血細(xì)胞的體外刺激實(shí)驗(yàn)，測(cè)試肽。
如上所述，組合物可以包含天然WT1蛋白的變體。如此處所用，多肽“變體”指與天然多肽因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是保留了天然多肽的免疫原性的多肽(即相對(duì)于天然多肽，變體與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆反應(yīng)的能力基本上沒(méi)有降低)。換言之，相對(duì)于天然多肽，變體與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆反應(yīng)的能力，可能增強(qiáng)或不變，或者可以降低少于50％，優(yōu)選少于20％。這些變體通?？梢酝ㄟ^(guò)修飾上述多肽序列之一并評(píng)價(jià)經(jīng)修飾多肽與此處所述抗血清和/或T細(xì)胞的反應(yīng)性而進(jìn)行鑒定。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的內(nèi)容中，WT1多肽免疫原性部分內(nèi)的相對(duì)小數(shù)目的取代(如1-3個(gè))可能增強(qiáng)多肽引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。合適的取代通常可以使用上述計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行鑒定，而且效果通?？梢愿鶕?jù)經(jīng)修飾多肽與上述抗血清和/或T細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行確認(rèn)。相應(yīng)的，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，WT1多肽包含免疫原性部分內(nèi)1-3個(gè)氨基酸殘基被取代、使得與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆的反應(yīng)能力在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于未修飾多肽的變體。這些取代優(yōu)選位于多肽的MHC結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，并可以如上所述進(jìn)行鑒定。優(yōu)選的取代使得與MHC I型或II型分子的結(jié)合增強(qiáng)。
某些變體包含保守取代?！氨Ｊ厝〈敝敢环N氨基酸被另一種具有相似特性的氨基酸取代，而且肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)測(cè)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水特性基本上不變。氨基酸取代通?？梢愿鶕?jù)殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性本質(zhì)的相似性進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴(lài)氨酸和精氨酸；而具有不帶電荷的極性頭基團(tuán)、具有相似親水性值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。代表保守改變的其它組氨基酸包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。變體還(或者)可以含有非保守改變。變體還(或者)可以通過(guò)例如缺失或加入對(duì)多肽的免疫原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水特性影響最小的氨基酸進(jìn)行修飾。
如上所述，WT1多肽可以與位于蛋白質(zhì)N-末端、在翻譯時(shí)或翻譯后引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的信號(hào)(或前導(dǎo))序列綴合。多肽還(或者)可以與接頭或其它序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定(如多聚組氨酸)，或增強(qiáng)多肽與固體支持物的結(jié)合。例如，多肽可以與免疫球蛋白Fc區(qū)綴合。
WT1多肽可以使用多種眾所周知的技術(shù)進(jìn)行制備。由上述WT1多核苷酸可以容易的制備多核苷酸編碼的重組多肽。通常，可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種表達(dá)載體來(lái)表達(dá)重組WT1多肽?？梢栽谌魏芜m當(dāng)?shù)?、用含編碼重組多肽的DNA分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母和高等真核細(xì)胞。優(yōu)選采用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(諸如COS或CHO)?？梢允紫仁褂觅?gòu)買(mǎi)的濾器將來(lái)自合適的宿主/載體系統(tǒng)(將重組蛋白質(zhì)或多肽分泌到培養(yǎng)基中)的上清液進(jìn)行濃縮。然后，可以將濃縮液應(yīng)用于合適的純化基質(zhì)(諸如親和基質(zhì)或離子交換樹(shù)脂)。最后，可以進(jìn)行一輪或多輪反相HPLC以進(jìn)一步純化重組多肽。這些技術(shù)可以用于制備天然多肽或其變體。例如，通常可以使用諸如寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變等標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)制備編碼天然多肽變體的多核苷酸，并且可以除去部分DNA序列以制備截短的多肽。
還可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)通過(guò)合成方法產(chǎn)生某些部分或其它變體。例如，可以合成少于大約500個(gè)氨基酸，優(yōu)選少于大約100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選少于大約50個(gè)氨基酸的多肽?？梢允褂萌魏钨?gòu)買(mǎi)的固相技術(shù)合成多肽，諸如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被依次加到正在延伸的氨基酸鏈上。參閱Merrifield，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)會(huì)刊(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963。用于多肽自動(dòng)合成的設(shè)備可以從供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi)，諸如Applied BioSystems公司(Foster City，CA)，而且可以根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
通常，此處所述的多肽和多核苷酸是分離的?！胺蛛x的”多肽或多核苷酸指與其最初的環(huán)境是分開(kāi)的。例如，如果將天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與在天然系統(tǒng)中共存的一些或所有物質(zhì)分開(kāi)，那么該蛋白質(zhì)就是分離的。優(yōu)選的，這些多肽是至少大約90％純，更優(yōu)選至少大約95％純，最優(yōu)選至少大約99％純。例如，如果將多核苷酸克隆到并非天然環(huán)境一部分的載體中，那么可以認(rèn)為該多核苷酸是分離的。
本發(fā)明在其它方面提供了WT1多肽的模擬物。這些模擬物可以包含與一種或多種氨基酸模擬物相結(jié)合的氨基酸(即WT1蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用氨基酸模擬物取代)，或者可以是完全非肽的模擬物。氨基酸模擬物是與氨基酸構(gòu)象相似的化合物，所以它可以取代WT1多肽中的氨基酸而基本上不降低與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆的反應(yīng)能力。非肽模擬物是不含氨基酸、但是具有與WT1多肽相似的總體構(gòu)象的化合物，從而相對(duì)于WT1多肽，模擬物與WT1特異的抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆的反應(yīng)能力基本上沒(méi)有降低。這些模擬物可以根據(jù)評(píng)價(jià)肽序列三維結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如核磁共振和計(jì)算機(jī)技術(shù))進(jìn)行設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)的模擬物中，WT1多肽的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)被不必具有相同大小或體積的基團(tuán)取代，但是取代基必須具有相似的化學(xué)和/或物理特性，以產(chǎn)生相似的生物學(xué)應(yīng)答。應(yīng)當(dāng)理解，在此處所述實(shí)施方案中，模擬物可以取代WT1多肽。WT1多核苷酸編碼此處所述WT1多肽的任何多核苷酸稱(chēng)為本發(fā)明包括的WT1多核苷酸。這些多核苷酸可以是單鏈(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈，而且可以是(基因組的、cDNA或合成的)DNA或RNA分子。本發(fā)明的多核苷酸可以(但不必)含有其它編碼或非編碼序列，而且多核苷酸可以(但不必)與其它分子和/或支持物相連。
WT1多核苷酸可以編碼天然WT1蛋白質(zhì)，或者可以編碼此處所述WT1的變體。多核苷酸變體可以含有一個(gè)或多個(gè)取代、加入、缺失和/或插入，但是相對(duì)于天然WT1蛋白質(zhì)，編碼的多肽的免疫原性并沒(méi)有降低。對(duì)編碼的多肽的免疫原性的影響通?？梢匀绱颂幩鲞M(jìn)行評(píng)價(jià)。優(yōu)選變體所含的核苷酸取代、加入、缺失和/或插入，不超過(guò)編碼天然WT1序列免疫原性部分的核苷酸位置的20％，優(yōu)選不超過(guò)10％。某些變體基本上與天然基因或其部分同源。這些多核苷酸變體能夠與天然產(chǎn)生的、編碼WT1多肽的DNA序列(或其互補(bǔ)序列)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。合適的中等嚴(yán)謹(jǐn)條件包括在溶液5x SSC/0.5％ SDS/1.0mMEDTA pH8.0中預(yù)清洗；于50-65℃在5x SSC中雜交過(guò)夜；隨后于65℃用含0.1％ SDS的2x、0.5x、和0.2x SSC各清洗2次，每次20分鐘。這種雜交DNA序列也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有許多種核苷酸序列編碼WT1多肽。這些多核苷酸中的一些與任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。雖然如此，本發(fā)明明確包括由于密碼子使用率的差異而變化的多核苷酸。
一旦如上所述鑒定了WT1的免疫原性部分，可以使用多種技術(shù)制備WT1多核苷酸。例如，可以由從表達(dá)WT1的細(xì)胞制備的cDNA擴(kuò)增得到WT1多核苷酸。這些多核苷酸可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。為了此研究，可以根據(jù)免疫原性部分的序列設(shè)計(jì)序列特異的引物，而且可以購(gòu)買(mǎi)或合成。例如，用于PCR擴(kuò)增人WT1基因的合適引物包括第一步-P1181434-14145’GAG AGT CAG ACT TGA AAGCAGT 3’(SEQ ID NO5)和P1355’CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3’(SEQ ID NO6)；第二步-P1365’GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACGTGC GGG 3’(SEQ ID NO7)和P1375’GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCCCCG A 3’(SEQ ID NO8)。用于PCR擴(kuò)增小鼠WT1基因的引物包括第一步-P1385’TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3’(SEQ ID NO9)和P1395’GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3’(SEQ ID NO10)；第二步-P1405’GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3’(SEQ ID NO11)和P1415’GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3’(SEQID NO12)。
然后使用眾所周知的技術(shù)，可以將擴(kuò)增得到的部分用于從人基因組DNA文庫(kù)或合適的cDNA文庫(kù)分離全長(zhǎng)基因。或者，可以由多種PCR片段構(gòu)建全長(zhǎng)基因。還可以通過(guò)合成寡核苷酸成分、并將各成分連接在一起產(chǎn)生完整多核苷酸，從而制備WT1多核苷酸。
WT1多核苷酸還可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法合成，包括化學(xué)合成，例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成法。還可以使用常規(guī)誘變技術(shù)，諸如寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異的誘變(見(jiàn)Adelman等人，DNA 2183，1983)，在多核苷酸序列中引入修飾。或者，倘若編碼WT1多肽的DNA已經(jīng)摻入到含有合適的RNA聚合酶啟動(dòng)子(諸如T7或SP6)的載體中，則可以通過(guò)DNA序列的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA分子。如此處所述，某些部分可以用于制備編碼的多肽。另外/或者，可以對(duì)病人施用部分多核苷酸，使得在體內(nèi)產(chǎn)生編碼的多肽(如通過(guò)用編碼WT1多肽的cDNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞(諸如樹(shù)突狀細(xì)胞)，并對(duì)病人施用轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。
編碼WT1多肽的多核苷酸通?？梢杂糜谠隗w外或體內(nèi)產(chǎn)生多肽。與編碼序列互補(bǔ)的WT1多核苷酸(即反義多核苷酸)還可以作為探針使用，或用于抑制WT1的表達(dá)。也可以將可以轉(zhuǎn)錄成反義RNA的cDNA構(gòu)建物導(dǎo)入組織細(xì)胞中，以有助于產(chǎn)生反義RNA。
任何多核苷酸可以進(jìn)行進(jìn)一步的修飾以增加體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸?但不限于)在5’和/或3’末端加入側(cè)翼序列；在主鏈中使用磷酸硫酯或2’氧-甲基而非磷酸二酯鍵；和/或包含非常見(jiàn)堿基，諸如次黃核苷、queosine和wybutosine，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙?；?、甲基-、硫代-和其它修飾形式。
此處所述核苷酸序列可以使用已建立的重組DNA技術(shù)與多種其它核苷酸序列進(jìn)行連接。例如，可以將多核苷酸克隆到多種克隆載體中，包括質(zhì)粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和粘粒。特別感興趣的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。通常，載體包含在至少一種有機(jī)體中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、和一種或多種選擇標(biāo)記。其它元件取決于設(shè)計(jì)用途，且對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是明顯的。
在某些實(shí)施方案中，可以將多核苷酸配成制劑，使得能夠進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并在其中表達(dá)。如下文所述，這些制劑對(duì)于治療性目的特別有用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，有許多方法可以實(shí)現(xiàn)多核苷酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)，而且可以采用任何合適的方法。例如，可以將多核苷酸摻入病毒載體，諸如(但不限于)腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或者牛痘或其它痘病毒(如鳥(niǎo)類(lèi)痘病毒)。用于將DNA摻入這些載體的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是眾所周知的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還可以轉(zhuǎn)移或摻入一個(gè)作為選擇標(biāo)記的基因(以幫助鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞)和/或靶向部分(諸如編碼特異靶細(xì)胞上受體的配基的基因，使得載體具有目標(biāo)特異性)。靶向作用還可以使用抗體通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種載體中的cDNA構(gòu)建物可以用于例如轉(zhuǎn)染人或動(dòng)物細(xì)胞系，以建立WT1陽(yáng)性腫瘤模型，進(jìn)行腫瘤保護(hù)和過(guò)繼免疫治療實(shí)驗(yàn)，從而證明腫瘤或白血病生長(zhǎng)抑制或這些細(xì)胞的裂解。
多核苷酸的其它治療性制劑包括膠狀分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、微囊、微球體、珠、和基于脂類(lèi)的系統(tǒng)(包括水包油乳狀液、微膠粒、混和微膠粒、和脂質(zhì)體)。作為體外和體內(nèi)投遞載體使用的優(yōu)選膠狀系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜泡)。這些系統(tǒng)的制備和使用在本領(lǐng)域中是眾所周知的?？贵w及其片段本發(fā)明還提供了結(jié)合劑，諸如可與WT1多肽特異結(jié)合的抗體及其抗原結(jié)合片段。如此處使用的，如果試劑以可檢測(cè)的水平(在例如ELISA中)與WT1多肽發(fā)生反應(yīng)，而與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)在相似條件下不發(fā)生可檢測(cè)反應(yīng)，則稱(chēng)其與WT1多肽可“特異結(jié)合”。如此處使用的，“結(jié)合”指兩個(gè)分開(kāi)的分子之間的非共價(jià)聯(lián)系，以至于形成“復(fù)合物”。結(jié)合能力可以通過(guò)例如測(cè)定復(fù)合物形成的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)合常數(shù)是將復(fù)合物濃度除以各成分濃度的乘積得到的數(shù)值。通常，當(dāng)復(fù)合物形成的結(jié)合常數(shù)超過(guò)大約103L/mol時(shí)，稱(chēng)此兩種成分是“結(jié)合”的。結(jié)合常數(shù)可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行測(cè)定。
滿足上述要求的任何試劑可以作為結(jié)合劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。某些抗體可以由例如Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz CA)購(gòu)買(mǎi)得到?；蛘撸梢员绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的多種技術(shù)制備抗體。參閱如Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988。通常，可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生抗體，包括上述單克隆抗體的產(chǎn)生，或者用抗體基因轉(zhuǎn)染合適的細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主，從而產(chǎn)生重組抗體。在一種技術(shù)中，首先將包含多肽的免疫原注射到多種哺乳動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)的任一種中。在此步驟，本發(fā)明的多肽可以作為不經(jīng)修飾的免疫原。或者，特別是對(duì)于相對(duì)較短的多肽，如果將多肽與載體蛋白(諸如牛血清清蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白)進(jìn)行連接，可以引起較好的免疫應(yīng)答。優(yōu)選根據(jù)預(yù)先排定的時(shí)間表，將免疫原注射到動(dòng)物宿主中，并包括一次或多次加強(qiáng)免疫，并對(duì)動(dòng)物定期取血。然后可以使用例如與合適固體支持物偶聯(lián)的多肽的親和層析，由該血清純化多肽特異的多克隆抗體。
可以使用例如Kohler和Milstein，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976的技術(shù)及其改進(jìn)，制備感興趣抗原多肽特異的單克隆抗體。簡(jiǎn)而言之，這些方法涉及制備能夠產(chǎn)生具有期望特異性(即與感興趣的多肽的反應(yīng)性)的抗體的永生細(xì)胞系。這些細(xì)胞系可以由例如從上述免疫動(dòng)物得到的脾細(xì)胞產(chǎn)生。然后通過(guò)例如與骨髓瘤細(xì)胞融合對(duì)象(優(yōu)選與免疫動(dòng)物同源)進(jìn)行融合，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行永生化?？梢圆捎枚喾N融合技術(shù)。例如，可以將非離子去污劑與脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合幾分鐘，然后以低密度在支持雜合細(xì)胞而非骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行鋪板。優(yōu)選的選擇技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)選擇。足夠時(shí)間后，通常大約1-2周，可觀察到雜合體的菌落。選擇單集落，并測(cè)試它們的培養(yǎng)物上清液對(duì)多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤細(xì)胞。
可以由生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞集落上清液分離單克隆抗體。此外，可以采用多種技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)量，諸如將雜交瘤細(xì)胞系注射到合適的脊椎動(dòng)物宿主(諸如小鼠)的腹膜腔中。然后可以由腹水或血液收獲單克隆抗體?？梢酝ㄟ^(guò)傳統(tǒng)技術(shù)，諸如層析、凝膠過(guò)濾、沉淀、和抽提，從抗體中除去污染物。本發(fā)明的多肽可以用于例如親和層析步驟的純化過(guò)程。
在某些實(shí)施方案中，使用抗體的抗原結(jié)合片段可能是優(yōu)選的。這些片段包括可以使用常規(guī)技術(shù)制備的Fab片段。簡(jiǎn)而言之，可以通過(guò)蛋白A珠層析柱上的親和層析，由兔血清純化免疫球蛋白(Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)，并用木瓜蛋白酶進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生Fab和Fc片段?？梢酝ㄟ^(guò)蛋白A珠層析柱上的親和層析，將Fab和Fc片段分開(kāi)。
單克隆抗體或其片段可以與一種或多種治療劑進(jìn)行偶聯(lián)。這方面的合適試劑包括可以用于例如體外清除自體骨髓的放射性示蹤物和化療試劑。代表性治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素、及其衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At、和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲喋呤、和嘧啶及嘌呤類(lèi)似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波醇酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、白樹(shù)毒素(gelonin)、假單胞菌外毒素、志賀氏桿菌毒素、和商陸抗病毒蛋白。為了診斷性目的，放射性試劑的偶聯(lián)可以有助于轉(zhuǎn)移的追蹤或WT1陽(yáng)性腫瘤的定位。
治療劑可以與合適的單克隆抗體直接或間接(如通過(guò)連接基團(tuán))進(jìn)行偶聯(lián)(如共價(jià)鍵合)。若試劑和抗體都含有能夠相互反應(yīng)的取代基，則它們之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，二者之一上的親核基團(tuán)(諸如氨基或巰基)可以與二者之另一上的含羰基的基團(tuán)(諸如酐或酸鹵化物)或與含易離去基團(tuán)(如鹵化物)的烷基發(fā)生反應(yīng)。
或者，可能需要將治療劑和抗體通過(guò)連接基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。連接基團(tuán)可以作為間隔抗體與試劑的間隔子發(fā)揮功能，以避免對(duì)結(jié)合能力的影響。連接基團(tuán)還可以用來(lái)增加試劑或抗體上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性，并由此增加偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增加還可以有助于試劑或試劑上的功能基團(tuán)的使用，否則，則不可能。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以采用多種雙功能或多功能試劑(相同和不同功能的，諸如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的產(chǎn)品目錄中描述的)作為連接基團(tuán)。偶聯(lián)可以通過(guò)例如氨基、羧基、巰基或經(jīng)氧化后的糖類(lèi)殘基實(shí)現(xiàn)。有大量參考文獻(xiàn)描述這種方法，如授予Rodwell的美國(guó)專(zhuān)利4,67l,958。
若治療劑不含本發(fā)明免疫綴合物的抗體部分時(shí)更有效，則可能需要使用在進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中或其后可切割的連接基團(tuán)。已經(jīng)描述了大量不同的可切割的連接基團(tuán)。試劑在細(xì)胞內(nèi)從連接基團(tuán)釋放的機(jī)制， 包括通過(guò)還原二硫鍵(如授予Spitler的美國(guó)專(zhuān)利4,489,710)、通過(guò)照射光不穩(wěn)定鍵(授予Senter等人的美國(guó)專(zhuān)利4,625,014)、通過(guò)衍生氨基酸側(cè)鏈的水解(如授予Kohn等人的美國(guó)專(zhuān)利4,638,045)、通過(guò)血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(如授予Rodwell等人的美國(guó)專(zhuān)利4,671,958)、和通過(guò)酸催化的水解(如授予Blattler等人的美國(guó)專(zhuān)利4,569,789)的切割。
可能需要將多于一種試劑與抗體進(jìn)行偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將多分子試劑與單分子抗體偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多于一種試劑可以與一種抗體偶聯(lián)。不管特殊實(shí)施例如何，含有多于一種試劑的免疫綴合物可以由多種方法進(jìn)行制備。例如，多于一分子試劑可以與一個(gè)抗體分子直接進(jìn)行偶聯(lián)，或者可以使用提供多個(gè)吸附位點(diǎn)的接頭。或者，可以使用載體。載體可以以多種方式攜帶試劑，包括直接的或通過(guò)連接基團(tuán)的共價(jià)鍵合。合適的載體包括蛋白質(zhì)諸如清蛋白(如授予Kato等人的美國(guó)專(zhuān)利4,507,234)、肽和多糖諸如氨基葡聚糖(授予Shih等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,699,784)。載體還可以通過(guò)非共價(jià)鍵合或通過(guò)包裹(諸如在脂質(zhì)體囊泡中，如美國(guó)專(zhuān)利4,429,008和4,873,088)攜帶試劑。對(duì)放射性核素試劑特異的載體包括放射性鹵化物小分子和螯合化合物。例如，美國(guó)專(zhuān)利4,735,792公開(kāi)了代表性放射性鹵化物小分子及其合成方法。放射性核素螯合物可以由螯合化合物(包括含有氮和硫原子作為結(jié)合金屬或金屬氧化物放射性核素的供體原子的那些螯合化合物)構(gòu)成。例如，授予Dayison等人的美國(guó)專(zhuān)利4,673,562公開(kāi)了代表性螯合化合物和它們的合成方法。
對(duì)于抗體和免疫綴合物可以使用多種施用途徑。通常，施用可以是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或切除了腫瘤的病灶。顯然抗體/免疫綴合物的準(zhǔn)確劑量將隨使用的抗體、腫瘤上的抗原密度、和抗體的清除速率而變化。
此處還提供了模擬WT1免疫原性部分的抗獨(dú)特型抗體。使用眾所周知的技術(shù)，可以制備針對(duì)可特異結(jié)合WT1免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段的這些抗體。模擬WT1免疫原性部分的抗獨(dú)特型抗體是那些與可特異結(jié)合上述WT1免疫原性部分的抗體或其抗原結(jié)合片段可結(jié)合的抗體。T細(xì)胞免疫治療組合物可以還/或包含對(duì)WT1特異的T細(xì)胞。這些細(xì)胞通?？梢允褂贸Ｒ?guī)步驟在體外或離體進(jìn)行制備。例如，使用購(gòu)自CellProInc.，Bothell WA的細(xì)胞分離系統(tǒng)諸如CEPRATETM(還可參閱美國(guó)專(zhuān)利5,240,856；美國(guó)專(zhuān)利5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)，可以由哺乳動(dòng)物(諸如患者)的骨髓、外周血、或者一骨髓或外周血級(jí)分分離T細(xì)胞?；蛘?，T細(xì)胞可以由相關(guān)或無(wú)關(guān)人、非人哺乳動(dòng)物、細(xì)胞系或培養(yǎng)物衍生得到。
T細(xì)胞可以用WT1多肽、編碼WT1多肽的多核苷酸和/或表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)進(jìn)行刺激。這種刺激進(jìn)行的條件和時(shí)間足夠產(chǎn)生WT1多肽特異的T細(xì)胞。優(yōu)選的，WT1多肽或多核苷酸存在于投遞載體(諸如微球體)中，以促進(jìn)產(chǎn)生抗原特異的T細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將由患者或相關(guān)或無(wú)關(guān)供體通過(guò)常規(guī)技術(shù)(諸如外周血淋巴細(xì)胞的菲科爾(Ficol)/泛影葡胺(Hypaque)密度梯度離心)分離得到的T細(xì)胞與WT1多肽一起溫育。例如，可以將T細(xì)胞在體外與WT1多肽(如5-25μg/ml)或合成相當(dāng)量WT1多肽的細(xì)胞一起于37℃溫育2-9天(通常4天)?？赡苄枰獙⒁徊糠植缓琖T1多肽的T細(xì)胞單獨(dú)溫育，作為對(duì)照。
如果T細(xì)胞殺死WT1多肽包被的或表達(dá)這種多肽的編碼基因的靶細(xì)胞，那么認(rèn)為T(mén)細(xì)胞對(duì)WT1多肽是特異的。T細(xì)胞特異性可以使用多種常規(guī)技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，在鉻釋放實(shí)驗(yàn)或增殖實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照相比，裂解和/或增殖增長(zhǎng)超過(guò)2倍的刺激指數(shù)指示T細(xì)胞特異性。這些實(shí)驗(yàn)可以如Chen等人，癌癥研究(Cancer Res.)541065-1070，1994中描述進(jìn)行?；蛘撸琓細(xì)胞增殖的檢測(cè)可以通過(guò)多種已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，T細(xì)胞增殖可以通過(guò)測(cè)量DNA合成的增加速率(如通過(guò)用氚胸苷脈沖標(biāo)記T細(xì)胞的培養(yǎng)物，并測(cè)量摻入DNA的氚胸苷的量)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)T細(xì)胞增殖的其它方法包括，測(cè)量白介素-2(IL-2)產(chǎn)生、Ca2+流、或染料(諸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-四唑鎓)攝取的增加?；蛘?，可以測(cè)量淋巴因子(諸如干擾素-γ)的合成，或者對(duì)能夠應(yīng)答WT1多肽的T細(xì)胞相對(duì)數(shù)目進(jìn)行定量。與WT1多肽(200ng/ml-100μg/ml，優(yōu)選100ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天，應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致T細(xì)胞增殖增長(zhǎng)至少2倍；并且/或者如上所述接觸2-3小時(shí)，應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致T細(xì)胞的激活，這是使用常規(guī)細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量的，其中細(xì)胞因子(如TNF或TNF-γ)釋放水平增加2倍是T細(xì)胞活化的指標(biāo)(參閱Coligan等人，免疫學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols inImmunology)，第1卷，Wiley Interscience(Greene 1998))?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)擴(kuò)增WT1特異的T細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞衍生自患者或者相關(guān)或無(wú)關(guān)供體，而且在刺激和擴(kuò)增后對(duì)患者施用。
應(yīng)答WT1多肽、多核苷酸或表達(dá)WT1多肽的APC而被激活的T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+?？梢砸远喾N方法檢測(cè)CD4+或CD8+T細(xì)胞的特異活化。用于檢測(cè)特異T細(xì)胞活化的方法包括檢測(cè)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生(如淋巴因子)、或溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生(如WT1特異的細(xì)胞毒T細(xì)胞的產(chǎn)生)。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，用于檢測(cè)特異T細(xì)胞活化的優(yōu)選方法是T細(xì)胞增殖的檢測(cè)。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，用于檢測(cè)特異T細(xì)胞活化的優(yōu)選方法是溶細(xì)胞活性產(chǎn)生的檢測(cè)。
為了治療性目的，應(yīng)答WT1多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T細(xì)胞，可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行數(shù)目擴(kuò)增。這些T細(xì)胞的體外增殖可以以多種方法實(shí)現(xiàn)。例如，可以在加有或未加T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(諸如干擾素-2和/或合成WT1多肽的刺激細(xì)胞)的條件下，將T細(xì)胞再一次暴露于WT1多肽。在產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的情況中，加入刺激細(xì)胞是優(yōu)選的。T細(xì)胞可以在體外生長(zhǎng)至較大數(shù)目，而仍保持應(yīng)答WT1多肽間歇性再刺激的特異性。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于初次體外刺激(IVS)，可以將大數(shù)目的淋巴細(xì)胞(如超過(guò)4×107個(gè))置于裝有含人血清培養(yǎng)基的燒瓶中。可以與破傷風(fēng)類(lèi)毒素(如5μg/ml)一起直接加入WT1多肽(如10μg/ml)。然后將燒瓶進(jìn)行溫育(如于37℃7天)。為了進(jìn)行第二次IVS，收獲T細(xì)胞，并置于含2－3×107個(gè)經(jīng)照射的外周血單核細(xì)胞的新燒瓶中。直接加入WT1多肽(如10μg/ml)。將燒瓶于37℃溫育7天。在第二次IVS后第2天和第4天，加入2-5個(gè)單位的白介素-2(IL-2)。為了進(jìn)行第三次IVS，將T細(xì)胞置于孔中，并用肽包被的、用個(gè)體自身EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞進(jìn)行刺激。在每個(gè)循環(huán)的第2天和第4天加入IL-2。一旦細(xì)胞顯示為特異細(xì)胞毒T細(xì)胞，即可以使用在第2、4、6天加入更高IL-2(20個(gè)單位)的10天刺激循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。
或者，可以通過(guò)克隆對(duì)當(dāng)存在WT1多肽時(shí)增殖的一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞進(jìn)行數(shù)目擴(kuò)增。用于克隆細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且包括有限稀釋法?？梢杂芍旅艋颊咄庵苎ㄟ^(guò)密度梯度離心和綿羊紅細(xì)胞花結(jié)純化應(yīng)答T細(xì)胞，并在培養(yǎng)物中通過(guò)標(biāo)明抗原在經(jīng)照射的自體填充細(xì)胞(filler cell)存在時(shí)的刺激建系。為了產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞系，將WT1多肽作為抗原刺激物使用，而將通過(guò)Epstein Barr病毒感染而永生化的自體外周血淋巴細(xì)胞(PBL)或類(lèi)淋巴母細(xì)胞系(LCL)作為抗原呈遞細(xì)胞使用。為了產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞系，可以將用產(chǎn)生WT1多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的自體抗原呈遞細(xì)胞作為刺激細(xì)胞使用。抗原刺激后，將經(jīng)刺激T細(xì)胞以0.5個(gè)細(xì)胞/孔的頻率與1×106個(gè)經(jīng)照射PBL或LCL細(xì)胞和50U/ml重組白介素-2(rIL-2)一起置于平底96孔板中，由此在抗原刺激2-4天可克隆建系T細(xì)胞。初次鋪板大約2-3周后，鑒定建系克隆生長(zhǎng)的孔，并用適當(dāng)抗原在自體抗原呈遞細(xì)胞存在時(shí)進(jìn)行再刺激，然后加入低劑量的rIL-2(10U/ml)擴(kuò)增2-3天。通過(guò)定期(大約每?jī)芍芤淮?用抗原和rIL-2再刺激，將T細(xì)胞克隆維持在24孔板中。
在某些實(shí)施方案中，可以在體內(nèi)和/或體外引發(fā)(即使之對(duì)WT1致敏)異源T細(xì)胞。通過(guò)使T細(xì)胞接觸WT1多肽、編碼這種多肽的多核苷酸、或產(chǎn)生這種多肽的細(xì)胞，接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足夠引發(fā)T細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)這種引發(fā)。通常，如果通過(guò)此處所述的常規(guī)增殖、鉻釋放實(shí)驗(yàn)和/或細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)的測(cè)量，與WT1多肽的接觸導(dǎo)致T細(xì)胞的增殖和/或活化，則認(rèn)為T(mén)細(xì)胞被引發(fā)。與陰性對(duì)照相比，增殖或裂解增長(zhǎng)超過(guò)2倍和細(xì)胞因子水平增長(zhǎng)超過(guò)3倍的刺激指數(shù)指示T細(xì)胞特異性。例如骨髓移植中或者作為淋巴細(xì)胞融合供體，可以采用體外引發(fā)的細(xì)胞。藥物組合物和疫苗在某些方面，可以將多肽、多核苷酸、抗體和/或T細(xì)胞摻入藥物組合物或疫苗?；蛘?，藥物組合物可以包含經(jīng)WTl多核苷酸轉(zhuǎn)染、從而表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞)。藥物組合物包含一種或多種這種化合物或細(xì)胞和生理學(xué)可接受的載體或賦形劑。某些疫苗可以包含一種或多種這種化合物或細(xì)胞和非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑(諸如摻入化合物的佐劑或脂質(zhì)體)。藥物組合物和疫苗還可以含有投遞系統(tǒng)，諸如美國(guó)專(zhuān)利4,897,268和5,075,109中公開(kāi)的生物可降解的微球體。本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物和疫苗還可以含有生物學(xué)有活性或無(wú)活性的其它化合物。
在某些實(shí)施方案中，藥物組合物和疫苗被設(shè)計(jì)用于在患者(諸如人)體內(nèi)引發(fā)WT1多肽特異的T細(xì)胞應(yīng)答。通常，T細(xì)胞應(yīng)答可能偏愛(ài)使用相對(duì)短的多肽(如含有天然WT1多肽中少于23個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，優(yōu)選4-16個(gè)連續(xù)殘基，更優(yōu)選8-16個(gè)連續(xù)殘基，仍更優(yōu)選8-10個(gè)連續(xù)殘基)。或者/另外，疫苗可以包含優(yōu)先增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。換言之，免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑可以以高于抗體應(yīng)答被增強(qiáng)的量而增強(qiáng)針對(duì)WT1多肽的T細(xì)胞應(yīng)答水平。例如，與基于油的標(biāo)準(zhǔn)佐劑(諸如CFA)相比，優(yōu)先增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑可以，與WT1陰性對(duì)照細(xì)胞系相比，使增殖性T細(xì)胞應(yīng)答至少增強(qiáng)2倍，裂解應(yīng)答至少增強(qiáng)10％，且/或T細(xì)胞活化至少增強(qiáng)2倍，而沒(méi)有檢測(cè)到抗體應(yīng)答的增強(qiáng)。針對(duì)WT1多肽的T細(xì)胞或抗體應(yīng)答的增強(qiáng)量通常可以使用本領(lǐng)域已知的任何代表性技術(shù)(諸如此處提供的技術(shù))進(jìn)行測(cè)定。
藥物組合物或疫苗可以含有編碼上述一種或多種多肽的DNA，使得可以原位合成多肽。如上所述，該DNA可以存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的多種投遞系統(tǒng)中，包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)、和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)暮怂岜磉_(dá)系統(tǒng)含有在患者體內(nèi)表達(dá)所必需的DNA、cDNA或RNA序列(諸如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。細(xì)菌投遞系統(tǒng)涉及施用在其細(xì)胞表面表達(dá)多肽免疫原性部分的細(xì)菌(諸如卡介苗Bacillus-Calmette-Guerrin)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用可能涉及使用非致病的(有缺陷的)、能復(fù)制的病毒的病毒表達(dá)系統(tǒng)(如牛痘或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或腺病毒)導(dǎo)入DNA。用于將DNA摻入這些表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是眾所周知的。DNA還可以是“裸露的”，如Ulmer等人，科學(xué)(Science)2591745-1749，1993中描述的，并由Cohen，科學(xué)(Science)2591691-1692，1993回顧的?？梢酝ㄟ^(guò)用DNA包被能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的、生物可降解的小珠，從而增加裸露DNA的攝取。
如上所述，藥物組合物或疫苗可以包含表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞。為了治療性目的，如上所述，抗原呈遞細(xì)胞優(yōu)選是自體樹(shù)突狀細(xì)胞。這些細(xì)胞可以使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備和轉(zhuǎn)染，諸如Reeves等人，癌癥研究(Cancer Res.)565672-5677，1996；Tuting等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1601139-1147，1998；和Nair等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.)16364-369，1998中描述的那些技術(shù)?？乖蔬f細(xì)胞表面上WT1多肽的表達(dá)可以通過(guò)如上所述體外刺激和常規(guī)增殖以及鉻釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。
雖然可以在本發(fā)明的藥物組合物中采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的任何合適的載體，但是載體的類(lèi)型隨施用方式而變化。本發(fā)明的組合物可以配制成任何適當(dāng)?shù)氖┯梅绞?，包括例如局部、口、鼻、靜脈內(nèi)、顱腔內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、或肌肉內(nèi)施用。對(duì)于非腸道施用，諸如皮下注射，載體優(yōu)選包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對(duì)于口施用，可以采用任何上述載體或固體載體，諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸鎂。還可以采用生物可降解的微球體(如聚乳酯聚甘醇酸酯)作為用于本發(fā)明藥物組合物的載體。對(duì)于某些局部施用，優(yōu)選使用眾所周知的成分配制成乳膏或洗液。
這些組合物還可以包含緩沖液(如中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水)、糖類(lèi)(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸(諸如甘氨酸)、抗氧化劑、螯合劑(諸如EDTA或谷胱甘肽)、佐劑(如氫氧化鋁)和/或防腐劑。或者，本發(fā)明的組合物可以配制成凍干劑?；衔镞€可以使用眾所周知的技術(shù)包裹入脂質(zhì)體。
在本發(fā)明的疫苗中可以采用多種非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑(諸如佐劑)。大多數(shù)佐劑含有保護(hù)抗原免于快速代謝的物質(zhì)(諸如氫氧化鋁或礦物油)，和免疫應(yīng)答刺激物(諸如脂質(zhì)A、百日咳桿菌(Bortadellapertussis)或結(jié)核分技桿菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白質(zhì))。合適的非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑包括基于鋁的佐劑(如Alhydrogel、Rehydragel、磷酸鋁、Algammulin、氫氧化鋁)；基于油的佐劑(弗氏佐劑(FA)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Speppic MONTANIDE ISA720)；細(xì)胞因子(如GM-CSF或Flat3配基)；微球體；基于非離子型嵌段共聚物的佐劑；基于二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)的佐劑AS-1、AS-2(Smith Kline Beecham)；基于Ribi佐劑系統(tǒng)的佐劑；QS21(Aquila)；基于皂甙的佐劑(粗制皂甙、皂甙Quil A)；基于胞壁酰二肽(MDP)的佐劑，諸如SAF(微流化形式的Syntex佐劑(SAF-m))；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)；基于人補(bǔ)體的佐劑m.vaccae和衍生物；基于免疫刺激復(fù)合物(iscom)的佐劑；滅活的毒素；和減毒的傳染因子(諸如結(jié)核桿菌)。
如上所述，在某些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑根據(jù)優(yōu)先引發(fā)或增強(qiáng)針對(duì)WT1多肽的T細(xì)胞應(yīng)答(如CD4+和/或CD8+)的能力進(jìn)行選擇。這些免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且包括(但不限于)Montanide ISA50、Speppic MONTANIDE ISA720、細(xì)胞因子(如GM-CSF或Flat3配基)、微球體、基于二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)的佐劑AS-1(Smith Kline Beecham)、AS-2(Smith Kline Beecham)、基于Ribi佐劑系統(tǒng)的佐劑、QS21(Aquila)、基于皂甙的佐劑(粗制皂甙、皂甙Quil A)、微流化形式的Syntex佐劑(SAF-m)、MV、ddMV(Genesis)、基于免疫刺激復(fù)合物(iscom)的佐劑和滅活的毒素。
此處所述的組合物和疫苗可以作為緩釋制劑(即諸如施用后緩慢釋放化合物的膠囊或海綿體等制劑)的一部分施用。這些制劑通?？梢允褂帽娝苤募夹g(shù)進(jìn)行制備，并通過(guò)例如口、直腸或皮下植入，或者通過(guò)期望靶位點(diǎn)的植入進(jìn)行施用。在緩釋制劑中，多肽、多核苷酸、抗體、或細(xì)胞可以散布于載體基質(zhì)中，和/或包含于由速率控制膜包圍的空間內(nèi)。用于這些制劑的載體是生物相容性的，而且還可以是生物可降解的；優(yōu)選制劑提供的活性成分的釋放水平相對(duì)穩(wěn)定。緩釋制劑內(nèi)含有的活性成分的量取決于植入位點(diǎn)、釋放速率和預(yù)期的釋放持續(xù)時(shí)間、以及治療或預(yù)防的狀況的本質(zhì)。惡性疾病的治療在本發(fā)明的其它方面中，此處所述組合物和疫苗可以用于抑制惡性疾病(諸如進(jìn)行性或轉(zhuǎn)移性疾病或者特征為小腫瘤的疾病諸如微小殘余疾病(minimal residual disease)的發(fā)展。通常，這些方法可以用于預(yù)防、遲滯、或治療與WT1表達(dá)有關(guān)的疾病。換言之，此處提供的治療性方法可以用于治療已有的WT1相關(guān)疾病，或者可以用于預(yù)防或遲滯這種疾病在未患病或患有與WT1表達(dá)無(wú)關(guān)的疾病的患者體內(nèi)的發(fā)作。
如此處所用，如果患病細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)在疾病過(guò)程的某些時(shí)候產(chǎn)生的WT1多肽水平比相同組織的正常細(xì)胞可檢測(cè)的更高，則該疾病“與WT1表達(dá)有關(guān)”。WT1表達(dá)與惡性疾病的相關(guān)性不要求WT1存在于腫瘤上。例如，腫瘤的起始可能涉及WT1的過(guò)度表達(dá)，但是蛋白質(zhì)表達(dá)隨后可能消失?；蛘?，特征并不在于WT1表達(dá)增加的惡性疾病可能在較晚的時(shí)候發(fā)展成特征為WT1表達(dá)增加的疾病。相應(yīng)的，患病細(xì)胞的WT1表達(dá)水平曾經(jīng)、目前、或預(yù)計(jì)隨后增加的任何惡性疾病被認(rèn)為“與WT1表達(dá)有關(guān)”。
可以使用多種技術(shù)進(jìn)行免疫治療，其中此處提供的化合物或細(xì)胞發(fā)揮由患者體內(nèi)清除表達(dá)WT1的細(xì)胞的功能。發(fā)生的這種清除可能是增強(qiáng)或誘導(dǎo)患者體內(nèi)WT1或表達(dá)WT1的細(xì)胞特異的免疫應(yīng)答的結(jié)采?；蛘?，可以離體清除表達(dá)WT1的細(xì)胞(如通過(guò)處理自體骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分)。骨髓或外周血級(jí)分可以使用本領(lǐng)域任何常規(guī)技術(shù)獲得。
在這些方法中，可以對(duì)患者施用藥物組合物和疫苗。如此處所用，“患者”指任何溫血?jiǎng)游?，?yōu)選人?；颊呖赡芑加谢蛭椿加袗盒约膊　Ｏ鄳?yīng)的，上述藥物組合物和疫苗可以用于預(yù)防疾病的發(fā)作(即預(yù)防性的)，或者用于治療患有疾病的患者(如用于預(yù)防或遲滯已有疾病的發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移)?；加屑膊〉幕颊呖赡苡形⑿堄嗉膊?如完全或部分緩解的白血病患者或者外科放療和/或化療后腫瘤減小的癌癥患者中的低腫瘤負(fù)擔(dān))?？梢詫?duì)這種患者進(jìn)行免疫，以抑制復(fù)發(fā)(即預(yù)防或遲滯復(fù)發(fā)，或降低復(fù)發(fā)的嚴(yán)重性)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，患者患有白血病(如AML、CML、ALL或兒童ALL)、骨髓增生異常綜合癥(MDS)或癌癥(如胃腸、肺、甲狀腺或乳腺癌或者黑色素瘤)，其中癌癥或白血病是WT1陽(yáng)性的(即與此處提供的抗WT1抗體發(fā)生可檢測(cè)的反應(yīng)，或者表達(dá)的WT1mRNA水平通過(guò)此處所述RT-PCR可檢測(cè)到)，或者遭受直接針對(duì)表達(dá)WT1的細(xì)胞的自身免疫疾病的痛苦。
此處提供的組合物可以單獨(dú)使用，或與諸如外科手術(shù)、照射、化療和/或骨髓移植(自體的、同源的、異源的或無(wú)關(guān)的)等傳統(tǒng)化療方案進(jìn)行組合。如下文更詳細(xì)討論的，此處提供的結(jié)合劑和T細(xì)胞可以用于清除自體干細(xì)胞。在例如骨髓移植或者輸入血或其成分之前，這種清除可能是有益的。此處提供的結(jié)合劑、T細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(APC)和組合物還可以用于在體外和/或體內(nèi)擴(kuò)增并刺激(或引發(fā))自體的、異源的、同源的或無(wú)關(guān)的WT1特異性T細(xì)胞。這些WT1特異性T細(xì)胞可以用于例如供體淋巴細(xì)胞灌輸中。
施用途徑、頻率、以及劑量，隨個(gè)體變化，而且可以使用常規(guī)技術(shù)容易的確定。通常，藥物組合物和疫苗可以通過(guò)注射(如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(如通過(guò)吸入)或口服施用。在一些腫瘤中，藥物組合物或疫苗可以局部施用(通過(guò)例如直腸鏡檢查術(shù)、胃鏡檢查術(shù)、電視、內(nèi)窺鏡檢查術(shù)、血管造影術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它方法)。優(yōu)選的，可以在52周時(shí)間內(nèi)施用1到10個(gè)劑量。優(yōu)選的，間隔一個(gè)月施用6個(gè)劑量，而且此后可以定期加強(qiáng)接種。替代方案可能適合于個(gè)別患者。合適的劑量是，當(dāng)如上所述施用后，能夠促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，而且比基本(即未處理)水平高至少10-50％。這些應(yīng)答可以通過(guò)測(cè)量患者體內(nèi)的抗腫瘤抗體或通過(guò)能夠在體外殺死患者腫瘤細(xì)胞的疫苗依賴(lài)性細(xì)胞裂解效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生進(jìn)行監(jiān)控。這些疫苗還應(yīng)當(dāng)能夠在接種疫苗的患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，與未接種疫苗的患者相比，將導(dǎo)致改進(jìn)的臨床效果(如更頻繁的完全或部分緩解，或者更長(zhǎng)的無(wú)病和/或全面存活)。通常，對(duì)于包含一種或多種多肽的藥物組合物和疫苗，一劑中每種多肽的量的范圍為大約100μg-5mg。合適的劑量大小將隨患者的體型而變化，但是通常范圍為大約0.1-大約5mL。
通常，適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨柑峁┝俗銐蛄康幕钚猿煞?，足以提供治療性?或預(yù)防性作用。這種應(yīng)答可以通過(guò)測(cè)定治療患者體內(nèi)與未治療患者相比有所改進(jìn)的臨床效果(如更頻繁的完全或部分緩解，或者更長(zhǎng)的無(wú)病和/或全面存活)進(jìn)行監(jiān)控。先前存在的針對(duì)WT1的免疫應(yīng)答的增加通常與改進(jìn)的臨床效果有關(guān)。這些免疫應(yīng)答通?？梢允褂贸Ｒ?guī)增殖、細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)，利用在治療之前和之后由患者得到的樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。
在其它方面，用于抑制與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法涉及應(yīng)答上述WT1多肽或表達(dá)WT1的APC而被激活的自體T細(xì)胞的施用。這些T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+，而且可以如上所述進(jìn)行增殖。可以以有效抑制惡性疾病發(fā)展的量施用T細(xì)胞。通常，靜脈內(nèi)、腔內(nèi)或已切除腫瘤病灶處施用大約1×109－1×1011個(gè)T細(xì)胞/M2。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，細(xì)胞數(shù)目和施用頻率取決于患者的應(yīng)答。
在某些實(shí)施方案中，可以在自體骨髓移植前刺激T細(xì)胞。這種刺激可以發(fā)生于體內(nèi)或體外。對(duì)于體外刺激，可以使由患者得到的骨髓和/或外周血(或者骨髓或外周血級(jí)分)接觸WT1多肽、編碼WT1多肽的多核苷酸、和/或表達(dá)WT1多肽的APC，接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足以刺激上述T細(xì)胞。然后可以使用常規(guī)技術(shù)對(duì)患者施用骨髓、外周血干細(xì)胞、和/或WT1特異的T細(xì)胞。
在相關(guān)實(shí)施方案中，可以在同源或異源(相關(guān)或無(wú)關(guān))骨髓移植前刺激相關(guān)或無(wú)關(guān)供體的T細(xì)胞。這種刺激可以發(fā)生于體內(nèi)或體外。對(duì)于體外刺激，可以使由相關(guān)或無(wú)關(guān)供體得到的骨髓和/或外周血(或者骨髓或外周血級(jí)分)接觸WT1多肽、WT1多核苷酸、和/或表達(dá)WT1多肽的APC，接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足以刺激上述T細(xì)胞。然后可以使用常規(guī)技術(shù)對(duì)患者施用骨髓、外周血干細(xì)胞、和/或WT1特異的T細(xì)胞。
在其它實(shí)施方案中，在對(duì)患者施用前，自體骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分(如富集CD34+的外周血(PB))可以用此處所述WT1特異的T細(xì)胞清除表達(dá)WT1的細(xì)胞。這些方法可以通過(guò)使骨髓或PB接觸這種T細(xì)胞而進(jìn)行，接觸的條件和時(shí)間足以將表達(dá)WT1的細(xì)胞降至骨髓或外周血中髓樣或淋巴細(xì)胞總數(shù)目的10％以下，優(yōu)選5％以下，更優(yōu)選1％以下。這些細(xì)胞的清除程度可以通過(guò)諸如定性和定量PCR分析、形態(tài)、免疫組織化學(xué)和FACS分析等常規(guī)技術(shù)容易的測(cè)定。然后可以使用常規(guī)技術(shù)對(duì)患者施用骨髓或PB(或其級(jí)分)。診斷方法本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病，和監(jiān)控用于這些疾病的免疫接種或治療的效力的方法。這些方法是根據(jù)本發(fā)明的下列發(fā)現(xiàn)可以在患有這些疾病的患者體內(nèi)檢測(cè)到WT1蛋白質(zhì)特異的免疫應(yīng)答，而且增強(qiáng)這些免疫應(yīng)答的方法可以提供預(yù)防性或治療性益處。
為了檢測(cè)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否，可以檢測(cè)患者的WT1特異的T細(xì)胞水平。在某些方法中，將由患者分離得到的、包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的生物學(xué)樣品如此處所述，與WT1多肽、編碼WT1多肽的多核苷酸和/或表達(dá)WT1多肽的APC一起溫育，然后檢測(cè)T細(xì)胞特異活化的情況。合適的生物學(xué)樣品包括(但不限于)分離T細(xì)胞。例如，T細(xì)胞可以由患者通過(guò)常規(guī)技術(shù)(諸如通過(guò)外周血淋巴細(xì)胞的Ficoll/Hypaque密度梯度離心)進(jìn)行分離。可以將T細(xì)胞與WT1多肽(如5-25μg/ml)一起在體外于37℃溫育2-9天(通常4天)?？赡苄枰獙⒘硪徊糠諸細(xì)胞在不存在WT1多肽的情況下單獨(dú)溫育，作為對(duì)照。對(duì)于CD4+T細(xì)胞，活化優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)T細(xì)胞的增殖進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于CD8+T細(xì)胞，活化優(yōu)選通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞裂解活性進(jìn)行檢測(cè)。比未患病患者至少高2倍的增殖水平和/或至少高20％的細(xì)胞裂解活性水平，指示與WT1表達(dá)有關(guān)的疾病的存在。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，可以在增殖水平和/或細(xì)胞裂解活性水平與預(yù)測(cè)的治療應(yīng)答之間產(chǎn)生其它相關(guān)性。特別是展示較高抗體、增殖和/或裂解應(yīng)答的患者預(yù)計(jì)可能顯示較高的治療應(yīng)答。
在其它方法中，測(cè)試由患者獲得的生物學(xué)樣品的WT1特異的抗體水平。將生物學(xué)樣品與WT1多肽、編碼WT1多肽的多核苷酸和/或表達(dá)WT1多肽的APC一起，在足夠形成免疫復(fù)合物的條件和時(shí)間下進(jìn)行溫育。然后檢測(cè)WT1多肽與生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合WT1多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物。用于這些方法的生物學(xué)樣品可以是由預(yù)計(jì)含有抗體的患者獲得的任何樣品。合適的生物學(xué)樣品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸腔積液、和腦脊液。
將生物學(xué)樣品與WT1多肽在反應(yīng)混和物中在足夠在多肽和WT1特異性抗體之間形成免疫復(fù)合物的條件和時(shí)間下進(jìn)行溫育。例如，可以將生物學(xué)樣品與WT1多肽于4℃溫育24-48小時(shí)。
溫育后，測(cè)試反應(yīng)混和物中免疫復(fù)合物的存在?？梢酝ㄟ^(guò)多種已知技術(shù)，諸如放射免疫實(shí)驗(yàn)(RIA)和酶聯(lián)免疫吸收實(shí)驗(yàn)(ELISA)，實(shí)現(xiàn)WT1多肽與生物學(xué)樣品中存在的抗體之間形成的免疫復(fù)合物的檢測(cè)。合適的實(shí)驗(yàn)在本領(lǐng)域是眾所周知的，并詳細(xì)描述于科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中(如Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA LaboratoryManual)冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)?？梢允褂玫膶?shí)驗(yàn)包括(但不限于)David等人(美國(guó)專(zhuān)利4,376,110)的雙重單克隆抗體三明治免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)；Wide等人的單克隆-多克隆抗體三明治實(shí)驗(yàn)(Kirkham和Hunter編，放射免疫實(shí)驗(yàn)方法(Radioimmunoassay Methods)，E.and S.Livingstone，Edinburgh，1970)；Gordon等人(美國(guó)專(zhuān)利4,452,901)的“Western印漬”方法；Brown等人(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2554980-4983，1980)的標(biāo)記配基免疫沉淀；例如Raines和Ross(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2575154-5160，1982)描述的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；Brooks等人(臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)39477，1980)的包括熒光色素使用的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)；和Bowen-Pope等人(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)812396-2400，1984)的活性中和實(shí)驗(yàn)。其它免疫實(shí)驗(yàn)包括(但不限于)美國(guó)專(zhuān)利3,817,827、3,850,752、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、和4,098,876中描述的那些方法。
為了檢測(cè)目的，WT1多肽可以是經(jīng)標(biāo)記的或未標(biāo)記的。未標(biāo)記WT1多肽可以用于凝集實(shí)驗(yàn)，或者與經(jīng)標(biāo)記的可結(jié)合免疫復(fù)合物的檢測(cè)試劑(如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A、或植物凝血素，和能夠與可特異結(jié)合WT1多肽的抗體結(jié)合的二抗或其抗原結(jié)合片段)組合使用。如果WT1多肽是經(jīng)標(biāo)記的，則報(bào)道基團(tuán)可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的報(bào)道基團(tuán)，包括放射性同位素、熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、酶、生物素、和染料顆粒。
在某些實(shí)驗(yàn)中，未標(biāo)記WT1多肽是固定在固體支持物上的。固體支持物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何吸附多肽的物質(zhì)。例如，固體支持物可以是微量滴定板中的測(cè)試孔，或者是硝酸纖維素或其它合適的膜?；蛘?，支持物可以是珠或盤(pán)，諸如玻璃、纖維玻璃、乳膠、或塑料(諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。支持物還可以是磁性顆?；蚶w維光導(dǎo)傳感器，諸如美國(guó)專(zhuān)利5,359,681中公開(kāi)的那些。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的多種技術(shù)將多肽固定在固體支持物上，所述技術(shù)詳細(xì)描述于專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中。在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“固定化” 指非共價(jià)結(jié)合(諸如吸附)和共價(jià)結(jié)合(可以是抗原和和支持物上的功能基團(tuán)之間的直接連接，或者可以是通過(guò)交聯(lián)劑的連接)。優(yōu)選通過(guò)吸附在微量滴定板的孔或膜上的固定化。在這些情況中，可以通過(guò)將合適緩沖液中的WT1多肽與固體支持物接觸適當(dāng)時(shí)間而完成吸附。接觸時(shí)間隨溫度而變化，但是通常是大約1小時(shí)-大約1天。通常，將塑料微量滴定板(諸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔與大約10ng-大約10μg，優(yōu)選大約100ng-大約1μg多肽接觸，足夠固定足夠量的多肽。
通常在固定化后封閉支持物上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何合適的封閉劑，諸如牛血清清蛋白、吐溫20TM(SigmaChemical公司，St.Louis，MO)、熱滅活的正常山羊血清(NGS)、或BLOTTO(脫脂奶粉緩沖液，還含有防腐劑、鹽、和除泡劑)。然后將支持物與懷疑含有特異抗體的生物學(xué)樣品一起溫育。樣品可以直接應(yīng)用，或者更常見(jiàn)的，通常將其在含少量(0.1-5.0％，以重量計(jì))蛋白質(zhì)(諸如BSA、NGS、或BL0TTO)的緩沖液中進(jìn)行稀釋。通常，適當(dāng)?shù)慕佑|時(shí)間(即溫育時(shí)間)是足以在含有可特異結(jié)合WT1的抗體的樣品中檢測(cè)到這種抗體的存在的一段時(shí)間。優(yōu)選的接觸時(shí)間足以達(dá)到在已結(jié)合和未結(jié)合抗體達(dá)到平衡時(shí)結(jié)合水平的至少大約95％的結(jié)合水平。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以領(lǐng)會(huì)，達(dá)到平衡需要的時(shí)間可以通過(guò)檢測(cè)一段時(shí)間后發(fā)生的結(jié)合水平容易的測(cè)定。室溫下大約30分鐘的溫育時(shí)間通常是足夠的。
然后可以通過(guò)用適當(dāng)緩沖液(諸如含0.1％吐溫20TM的PBS)清洗固體支持物，除去未結(jié)合的樣品。然后可以加入含有報(bào)道基團(tuán)的可結(jié)合免疫復(fù)合物的檢測(cè)試劑。將檢測(cè)試劑與免疫復(fù)合物一起溫育，溫育時(shí)間足以檢測(cè)結(jié)合的抗體。適當(dāng)量的時(shí)間通?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)一段時(shí)間后發(fā)生的結(jié)合水平進(jìn)行測(cè)定。然后除去未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并使用報(bào)道基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)采用的方法取決于報(bào)道基團(tuán)的本質(zhì)。對(duì)于放射性基團(tuán)，閃爍計(jì)數(shù)或放射自顯影方法通常是適當(dāng)?shù)?。分光光度法可以用于檢測(cè)染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)。生物素可以使用與不同報(bào)道基團(tuán)(通常是放射性或熒光基團(tuán)或酶)偶聯(lián)的抗生物素蛋白進(jìn)行檢測(cè)。酶報(bào)道基團(tuán)(如辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶)通?？梢酝ㄟ^(guò)加入底物(通常是特殊長(zhǎng)度的時(shí)間)，隨后通過(guò)分光光度法或反應(yīng)產(chǎn)物的其它分析進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)論采用哪種特殊方法，比背景(即由無(wú)病個(gè)體獲得的生物學(xué)樣品觀察到的水平)高至少2倍的檢測(cè)試劑結(jié)合水平指示與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在。
通常，用于監(jiān)控免疫接種或治療的效力的方法涉及監(jiān)控患者體內(nèi)WT1特異的抗體或T細(xì)胞水平的變化。監(jiān)控抗體水平的方法可以包括下列步驟(a)將由治療或免疫接種前的患者得到的第一份生物學(xué)樣品與WT1多肽一起溫育，其中溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以形成免疫復(fù)合物；(b)檢測(cè)WT1多肽與生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合WT1多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物；(c)使用由治療或免疫接種后的患者得到的第二份生物學(xué)樣品，重復(fù)步驟(a)和(b)；并(d)比較第一份和第二份生物學(xué)樣品中檢測(cè)到的免疫復(fù)合物的量?；蛘撸梢圆捎镁幋aWT1多肽的多核苷酸或表達(dá)WT1多肽的APC取代WT1多肽。在這些方法中，檢測(cè)由多核苷酸編碼的或由APC表達(dá)的WT1多肽與生物學(xué)樣品中的抗體之間形成的免疫復(fù)合物。
監(jiān)控T細(xì)胞活化和/或WT1特異性前體的數(shù)目的方法可以包括下列步驟(a)將由治療或免疫接種前的患者得到的、包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的第一份生物學(xué)樣品(如骨髓、外周血或其級(jí)分)與WT1多肽一起溫育，其中溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以使得T細(xì)胞特異激活、增殖和/或裂解；(b)檢測(cè)T細(xì)胞特異激活、增殖和/或裂解的量；(c)使用由治療或免疫接種后的相同患者得到的、包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的第二份生物學(xué)樣品，重復(fù)步驟(a)和(b)；并(d)比較第一份和第二份生物學(xué)樣品中T細(xì)胞特異激活、增殖和/或裂解的量。或者，可以采用編碼WT1多肽的多核苷酸或表達(dá)WT1多肽的APC取代WT1多肽。
用于這些方法的生物學(xué)樣品可以是由預(yù)計(jì)含有抗體、CD4+T細(xì)胞和/或CD8+T細(xì)胞的患者獲得的任何樣品。合適的生物學(xué)樣品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸腔積液和腦脊液。第一份生物學(xué)樣品可以在治療或免疫接種起始前、或者治療或免疫接種方案中途采集。第二份生物學(xué)樣品應(yīng)當(dāng)以相似方式、但在治療或免疫接種后采集。倘若在采集第一份和第二份生物學(xué)樣品之間進(jìn)行了至少部分治療或免疫接種，則第二份生物學(xué)樣品可以在治療或免疫接種完全或部分完成時(shí)采集。
兩份樣品的溫育和檢測(cè)步驟通?？梢匀缟纤鲞M(jìn)行。第二份樣品中的免疫復(fù)合物的量相對(duì)于第一份樣品在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加，反映治療或免疫接種的成功。
提供下列實(shí)施例作為例示而非限制。
實(shí)施例實(shí)施例1血液學(xué)惡性瘤患者體內(nèi)針對(duì)WT1的免疫應(yīng)答的鑒定此實(shí)施例例示了血液學(xué)惡性腫瘤患者體內(nèi)已有免疫應(yīng)答的鑒定。
為了評(píng)價(jià)患者體內(nèi)已有WT1特異性抗體應(yīng)答的存在，使用Western印漬分析法，分析了AML、ALL、CML和嚴(yán)重的再生障礙性貧血癥患者的血清。對(duì)血清測(cè)試了從人白血病細(xì)胞系K562(美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)免疫沉淀WT1的能力。在各種情況中，將免疫沉淀物通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到膜上，并用抗WT1的抗體WT180(Santa Cruz生物技術(shù)公司，Santa Cruz，CA)進(jìn)行探查。此Western印漬分析鑒定了血液學(xué)惡性腫瘤患者體內(nèi)潛在的WT1特異抗體。圖2顯示了顯示AML患者的結(jié)果的代表性Western印漬。使用患者血清產(chǎn)生的免疫沉淀物中的52kD蛋白質(zhì)被WT1特異抗體識(shí)別。該52kD蛋白質(zhì)與陽(yáng)性對(duì)照按相同大小遷移。實(shí)施例2用表達(dá)WT1的細(xì)胞系免疫的小鼠體內(nèi)針對(duì)WT1的抗體的誘導(dǎo)此實(shí)施例例示了在體內(nèi)使用表達(dá)WT1的細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)WT1特異性抗體應(yīng)答。
白血病患者體內(nèi)已有WT1抗體的檢測(cè)強(qiáng)烈暗示，通過(guò)免疫WT1蛋白質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)WT1的免疫力是可能的。為了測(cè)試通過(guò)接種疫苗能否產(chǎn)生針對(duì)WT1的免疫力，給小鼠注射TRAMP-C，一種B6起源的WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系。簡(jiǎn)而言之，給雄性B6小鼠皮下注射5×106個(gè)TRAMP-C細(xì)胞，并間隔3周用5×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行兩次加強(qiáng)。最后一次免疫3周后，采集血清，并在含25μM β-2-巰基乙醇、200U/ml青霉素、10mM L-谷氨酰胺、和10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)中制備脾單細(xì)胞懸浮液。
TRAMP-C免疫后，在經(jīng)免疫動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到WT1特異性抗體應(yīng)答。圖3顯示了代表性Western印漬。這些結(jié)果顯示，通過(guò)免疫WT1蛋白質(zhì)可以誘發(fā)針對(duì)WT1蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。實(shí)施例3用WT1肽免疫的小鼠體內(nèi)Th的誘導(dǎo)和抗體應(yīng)答此實(shí)施例例示了通過(guò)免疫WT1肽誘發(fā)WT1特異性免疫應(yīng)答的能力。
根據(jù)搜索具有誘發(fā)Th應(yīng)答潛力的肽基元的Tsites程序(Rothbard和Taylor，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMB0 J.)793-100，1988；Deavin等人，分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)33145-155，1996)，鑒定了適合于誘發(fā)Ab和增殖T細(xì)胞應(yīng)答的肽。合成表1所示肽，并測(cè)序。
表1WT1肽

將用于免疫的肽分組如下A組 p6-22人 10.9mg溶于1ml(10μl＝100μg)p117-139人/小鼠 7.6mg溶于1ml(14μl＝100μg)p244-262人4.6mg溶于1ml(22μl＝l00μg)B組 p287-301人/小鼠 7.2mg溶于1ml(14μl＝100μg)p299-313小鼠 6.6mg溶于1ml(15μl＝100μg)p421-435人/小鼠 3.3mg溶于1ml(30μl＝100μg)對(duì)照(FBL肽100μg)＋CFA/IFA對(duì)照(CD45肽100μg)＋CFA/IFAA組所含的肽位于WT1的氨基末端部分(外顯子1)，而B(niǎo)組所含的肽位于羧基末端。羧基末端包含與其它DNA結(jié)合蛋白具有序列同源性的一個(gè)四鋅指區(qū)。在B組中，p287-301和p299-313由外顯子7(鋅指1)衍生得到，而p421-435由外顯子10(鋅指IV)衍生得到。
將B6小鼠用一組WT1肽或一種對(duì)照肽進(jìn)行免疫。將肽溶于1ml注射用無(wú)菌水，并對(duì)B6小鼠進(jìn)行3次免疫，間隔3周。所用佐劑是CFA/IFA、GM-CSF、和Montinide。然后如實(shí)施例1和2所述，測(cè)定WT1特異性抗體的存在，并使用標(biāo)準(zhǔn)胸苷摻入實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)增殖性T細(xì)胞應(yīng)答，其中將細(xì)胞與抗原一起進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)測(cè)量摻入的放射性評(píng)價(jià)增殖(Chen等人，癌癥研究(Cancer Res.)541065-1070，1994)。具體而言，將淋巴細(xì)胞在96孔板中以每孔2×105個(gè)細(xì)胞與4×105個(gè)經(jīng)照射(3000rad)同源脾細(xì)胞和指定肽一起進(jìn)行培養(yǎng)。
用A組肽免疫的小鼠誘發(fā)了針對(duì)WT1的抗體應(yīng)答(圖4)。疫苗B免疫后沒(méi)有檢測(cè)到抗體，這與疫苗B的免疫缺乏輔助T細(xì)胞應(yīng)答是一致的。P117-139誘發(fā)了增殖性T細(xì)胞應(yīng)答(圖5A至5C)。刺激指數(shù)(SI)在8和72之間變化。其它肽(P6-22和P299-313)也顯示誘發(fā)了增殖性T細(xì)胞應(yīng)答。P6-22的免疫產(chǎn)生的SI是2.3，P299-313的免疫產(chǎn)生的SI是3.3。陽(yáng)性對(duì)照包括ConA刺激的T細(xì)胞，以及用諸如CD45和FBL等已知抗原刺激的T細(xì)胞，和異源T細(xì)胞系(DeBruijn等人，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)212963-2970，1991)。
圖6A和6B顯示了，關(guān)于疫苗A(圖6A)和疫苗B(圖6B)的三種肽，觀察到的增殖應(yīng)答。疫苗A誘發(fā)了針對(duì)免疫肽p6-22和p117-139的增殖性T細(xì)胞應(yīng)答，刺激指數(shù)(SI)在3和8之間變化(粗線)。沒(méi)有檢測(cè)到針對(duì)p244-262的增殖應(yīng)答(圖6A)。
只使用p6-22和p117-139作為單一肽刺激進(jìn)行隨后的體外刺激。用p117-139刺激疫苗A特異T細(xì)胞系，導(dǎo)致針對(duì)p117-139的增殖，而沒(méi)有針對(duì)p6-22的應(yīng)答(圖7A)。由該系衍生得到的克隆是對(duì)p117-139特異的(圖7B)。作為對(duì)比，用p6-22刺激疫苗A特異T細(xì)胞系，導(dǎo)致針對(duì)p6-22的增殖，而沒(méi)有針對(duì)p117-139的應(yīng)答(圖7C)。由該系衍生得到的克隆是對(duì)p6-22特異的(圖7D)。
這些結(jié)果顯示，接種WT1肽可以誘發(fā)針對(duì)WT1蛋白質(zhì)的抗體應(yīng)答和針對(duì)免疫肽的增殖性T細(xì)胞應(yīng)答。實(shí)施例4用WT1肽免疫的小鼠體內(nèi)CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)此實(shí)施例例示了WT1肽誘發(fā)CTL免疫力的能力。
使用BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析(Parker等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)152163，1994)鑒定了具有適合結(jié)合I類(lèi)MHC的基元的肽(9聚體)。表2至44顯示了在這種分析中鑒定的肽。在這些表中，得分反映了肽與MHC分子理論上的結(jié)合親和力(解離半衰期)。
使用搜索具有誘發(fā)Th應(yīng)答潛力的肽基元的Tsites程序(Rothbard和Taylor，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBOJ.)793-100，1998；Deavin等人，分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)33145-155，1996)鑒定了這些肽，并顯示于圖8A和8B以及表45。
表2人WT1肽和人HLA A1結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表3人WT1肽和人HLA A0201結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表4人WT1肽和人HLA A0205結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表5人WT1肽和人HLA A24結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表6人WT1肽和人HLA A3結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表7人WT1肽和人HLA A68.1結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表8人WT1肽和人HLA A1101結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表9人WT1肽和人HLA A3101結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表10人WT1肽和人HLA A3302結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表11人WT1肽和人HLA B14結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表12人WT1肽和人HLA B40結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表13人WT1肽和人HLA B60結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表14人WT1肽和人HLA B61結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表15人WT1肽和人HLA B62結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表16人WT1肽和人HLA B7結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表17人WT1肽和人HLA B8結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表18人WT1肽和人HLA B2702結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表19人WT1肽和人HLA B2705結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表20人WT1肽和人HLA B3501結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表21人WT1肽和人HLA B3701結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表22人WT1肽和人HLA B3801結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表23人WT1肽和人HLAB 3901結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表24人WT1肽和人HLA B3902結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表25人WT1肽和人HLA B4403結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表26人WT1肽和人HLA B5101結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表27人WT1肽和人HLA B5102結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表28人WT1肽和人HLA B5201結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表29人WT1肽和人HLA B5801結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表30人WT1肽和人HLA CW0301結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表31人WT1肽和人HLA CW0401結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表32人WT1肽和人HLA CW0602結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表33人WT1肽和人HLA CW0702結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表34人WT1肽和小鼠MHC I型Db結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表35人WT1肽和小鼠MHC I型Dd結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表36人WT1肽和小鼠MHC I型Kb結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表37人WT1肽和小鼠MHC I型Kd結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表38人WT1肽和小鼠MHC I型Kk結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表39人WT1肽和小鼠MMC I型Ld結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表40人WT1肽和牛HLA A20結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表41小鼠WT1肽和小鼠MHC I型A0201結(jié)合的BIMASHLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表42小鼠WT1肽和小鼠MHC I型Db結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表43小鼠WT1肽和小鼠MHC I型Kb結(jié)合的_BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表44小鼠WT1肽和小鼠MHC I型Kd結(jié)合的BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


表45能夠引發(fā)輔助T細(xì)胞應(yīng)答的人WT1肽的TSites肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析結(jié)果


選擇了某些CTL肽(表46所示)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。對(duì)于表46中的每種肽，提供了使用BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析得到的得分。
表46WT1肽序列和HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)

如Ljunggren等人，自然(Nature)346476-480，1990所述，使用白血病細(xì)胞系RMA-S，確認(rèn)了結(jié)合C57B1/6鼠MHC的肽。簡(jiǎn)而言之，將RMA-S細(xì)胞在添加了1％FCS的完全培養(yǎng)基中于26℃培養(yǎng)7小時(shí)。向24孔板的每個(gè)孔中加入106個(gè)RMA-S細(xì)胞，單獨(dú)或與指定肽(25μg/ml)一起在完全培養(yǎng)基中于26℃培養(yǎng)16小時(shí)，再于37℃培養(yǎng)3小時(shí)。然后將細(xì)胞清洗3次，并用異硫氰酸熒光素綴合的抗Db或抗Kb抗體(PharMingen，San Siego，CA)染色。將經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞清洗2次，在含1％ 聚甲醛的500μl PBS中重懸并固定，在流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson FACSCalibur)中分析熒光強(qiáng)度。通過(guò)將與肽一起溫育的細(xì)胞與在培養(yǎng)基中單獨(dú)溫育的細(xì)胞相比較其平均熒光強(qiáng)度的增加，測(cè)量RMA-S細(xì)胞表面Db或Kb分子的增長(zhǎng)百分比。
用能夠結(jié)合鼠I型MHC的肽免疫小鼠。免疫后，體外刺激脾細(xì)胞，并測(cè)試裂解與WT1多肽一起溫育的靶細(xì)胞的能力。使用標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放實(shí)驗(yàn)(Chen等人，癌癥研究(Cancer Res.)541065-1070，1994)評(píng)價(jià)CTL。將106個(gè)靶細(xì)胞與150μCi Na51Cr于37℃一起溫育90分鐘(含或不含特異肽)。將細(xì)胞清洗3次，并重懸于含5％胎牛血清的RPMI。為了檢測(cè)，將104個(gè)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞與不同濃度的效應(yīng)細(xì)胞在U形底96孔板中一起溫育(終體積200μl)。37℃4-7小時(shí)后除去上清液，并通過(guò)下面的公式確定特異裂解百分比％特異裂解＝100×(實(shí)驗(yàn)釋放值-自發(fā)釋放值)/(最大釋放值-自發(fā)釋放值)。
列于表47的結(jié)果顯示，一些WT1肽能夠結(jié)合I型MHC分子，這是產(chǎn)生CTL所必需的。而且，如使用鉻釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定的，幾種肽能夠引發(fā)肽特異的CTL(圖9A和9B)。免疫CTL肽p10-18人、p136-144人、p136-144小鼠和p235-243后，產(chǎn)生了肽特異的CTL系，并建立了克隆。這些結(jié)果指出肽特異性CTL能夠殺死表達(dá)WT1的惡性細(xì)胞。
表47WT1 CTL肽與小鼠B6 I型抗原的結(jié)合

實(shí)施例5WT1多肽在小鼠體內(nèi)引發(fā)WT1特異性CTL的使用此實(shí)施例例示了代表性WT1多肽引發(fā)能夠殺死WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的CTL免疫力的能力。
如上所述使用TSITES和BIMAS HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析，鑒定了含有適于結(jié)合I型和II型MHC的基元的肽P117-139。如實(shí)施例3所述免疫小鼠。免疫后，體外刺激脾細(xì)胞，并測(cè)試裂解與WT1肽一起溫育的靶細(xì)胞以及WT1陽(yáng)性和陰性腫瘤細(xì)胞的能力。使用標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CTL。列于圖10A-10D的結(jié)果顯示，P117能夠引發(fā)能夠殺死WT1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，而不殺死WT1陰性細(xì)胞的WT1特異性CTL。這些結(jié)果證明肽特異性CTL事實(shí)上能殺死表達(dá)WT1的惡性細(xì)胞，而且疫苗和T細(xì)胞療法對(duì)表達(dá)WT1的惡性腫瘤是有效的。
使用I型MHC結(jié)合肽9聚體p136-144、p225-233、p235-243，以及23聚體肽p117-139，進(jìn)行了相似的免疫。免疫后，分別用這4種肽中的一種體外刺激脾細(xì)胞，并測(cè)試裂解與WT1肽一起溫育的靶細(xì)胞的能力。產(chǎn)生了對(duì)p136-144、p235-243、和p117-139特異的CTL，而沒(méi)有產(chǎn)生對(duì)p225-233特異的CTL。p235-243和p117-139的CTL數(shù)據(jù)顯示于圖11A和11B。沒(méi)有顯示肽p136-144和p225-233的數(shù)據(jù)。
CTL裂解要求靶WT1肽受到內(nèi)源加工而且與腫瘤細(xì)胞I型MHC分子結(jié)合展示。測(cè)試了上述WT1肽特異性CTL裂解WT1陽(yáng)性及陰性腫瘤細(xì)胞系的能力。p235-243特異的CTL可裂解與p235-243一起溫育的靶細(xì)胞，但是不能裂解表達(dá)WT1蛋白質(zhì)的細(xì)胞系(圖11A)。顯著不同的是，p117-139特異的CTL可裂解與p117-139肽一起溫育的靶細(xì)胞，還裂解表達(dá)WT1的惡性細(xì)胞(圖11B)。作為陰性對(duì)照，p117-139特異的CTL不裂解WT1陰性的EL-4(此處還稱(chēng)為E10)。
通過(guò)冷靶抑制(圖12A-12B)確認(rèn)了WT1特異裂解的特異性。以多種效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率將效應(yīng)細(xì)胞鋪在U形底96孔板中。加入10倍過(guò)量(與熱靶相比)的指定肽包被而無(wú)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。最后，每個(gè)孔加入104個(gè)51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，并將平板于37℃溫育4小時(shí)。每個(gè)孔的總體積是200μl。
p117-139特異性CTL對(duì)TRAMP-C的裂解被與有關(guān)肽p117-139一起溫育的EL-4由58％阻滯在36％，而與無(wú)關(guān)肽一起溫育的EL-4則不行(圖12A)。相似的，BLK-SV40的裂解被與有關(guān)肽p117-139一起溫育的EL-4由18％阻滯在0％(圖12B)。結(jié)果確認(rèn)了WT1肽特異性CTL可通過(guò)識(shí)別經(jīng)加工的WT1而特異殺死惡性細(xì)胞。
p117-139內(nèi)含有具有假定CTL基元的幾個(gè)片段。為了測(cè)定CTL表位的精確序列，合成了p117-139內(nèi)所有潛在的9聚體肽(表48)。這些肽中的兩種(p126-134和p130-138)顯示能夠結(jié)合H-2bI型分子(表48)。p117-139免疫產(chǎn)生的CTL裂解與p126-134和p130-138一起溫育的靶細(xì)胞，但不裂解與p117-139內(nèi)的其它9聚體肽一起溫育的靶細(xì)胞(圖13A)。
用p126-134或p130-138對(duì)p117-139特異性CTL系進(jìn)行再刺激。用p126-134或p130-138再刺激后，兩種T細(xì)胞系都展示肽特異性裂解，但是只有p130-138特異性CTL顯示W(wǎng)T1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系的裂解(圖13B和13C)。由此，p130-138似乎為天然加工表位。
表48p117-139內(nèi)WT1 CTL9聚體肽與小鼠B6I型抗原的結(jié)合

實(shí)施例6小鼠腫瘤細(xì)胞系中WT1特異的mRNA的鑒定此實(shí)施例例示了使用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞和細(xì)胞系中的WT1特異性mRNA。
通過(guò)密度梯度離心分離單核細(xì)胞，并立即凍存于-80℃，直至通過(guò)RT-PCR分析WT1特異性mRNA的存在。RT-PCR通常如Fraizer等人，血液(Blood)864704-4706，1995所述進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟由107個(gè)細(xì)胞提取總RNA。將RNA沉淀重懸于25μl經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水中，并直接用于逆轉(zhuǎn)錄。通過(guò)PCR擴(kuò)增鋅指區(qū)(外顯子7-10)得到330bp小鼠cDNA。擴(kuò)增在熱循環(huán)儀中進(jìn)行1或2(如果需要)輪PCR。使用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin E1mer Centus，Norwalk，CT)、2.5mM MgCl2、和20pmol每種引物，總反應(yīng)體積50μl。將20μlPCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色。用Polaroid底片(Polaroid 667，Polaroid有限公司，Hertfordshire，英國(guó))對(duì)凝膠進(jìn)行拍照。遵循Kwok和Higuchi，自然(Nature)339237-238，1989的推薦，預(yù)防交叉污染。陰性對(duì)照包括cDNA-和PCR-試劑混和物，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中以水取代cDNA。為了避免假陰性，通過(guò)使用β-肌動(dòng)蛋白引物的對(duì)照PCR評(píng)價(jià)每種樣品中完整RNA的存在和適量cDNA的產(chǎn)生。將用這些引物不擴(kuò)增的樣品排除在分析之外。
用于擴(kuò)增小鼠細(xì)胞系中WT1的引物是P1151458-14785’CCCAGG CTG CAA TAA GAG ATA 3’(正向引物；SEQ ID NO21)；和P1161767-17875’ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3’(反向引物；SEQ IDNO22)(參閱Inoue等人，血液(Blood)882267-2278，1996；Fraizer等人，血液(Blood)864704-4706，1995)。
用于對(duì)照反應(yīng)的β-肌動(dòng)蛋白引物是5’GTG GGG CGC CCC AGG CACCA 3’(有義引物；SEQ ID NO23)；和5’GTC CTT AAT GTC ACG CACGAT TTC 3’(反義引物；SEQ ID NO24)。
用于擴(kuò)增人WT1的引物是P117954-9745’GGC ATC TGA GACCAG TGA GAA 3’(SEQID NO25)；和P1181434-14145’GAG AGTCAG ACT TGA AAG CAGT 3’(SEQ ID NO5)。用于嵌套R(shí)T-PCR的引物可以是P1191023-10435’GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3’(SEQID NO26)；和P1201345-13655’TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT3’(SEQ ID NO27)。
表48顯示了小鼠腫瘤細(xì)胞系的WT1 PCR分析結(jié)果。在表4中，(+++)表示第一步RT-PCR中的強(qiáng)WT1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，(++)表示通過(guò)第一步WT1 RT-PCR可檢測(cè)到的WT1擴(kuò)增產(chǎn)物，(+)表示只在第二步WT1RT-PCR中可檢測(cè)到的產(chǎn)物，而(-)表示W(wǎng)T1 PCR陰性。
表49小鼠腫瘤細(xì)胞系中WT1 mRNA的檢測(cè)

由上所述，應(yīng)當(dāng)這樣理解，雖然此處為例示目的描述了本發(fā)明的特殊實(shí)施方案，但仍可以進(jìn)行多種修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。相應(yīng)的，本發(fā)明保護(hù)范圍僅由所附權(quán)利要求限制。
序列表<110> Gaiger， AlexanderCheever，Martin A.
<120> 用于WT1特異性免疫治療的組合物和方法<130> 210121.465C1<140> US<141> 1999-03-25<160> 326<170> FastSEQ for Windows Version 3.0<210> 1<211> 17<212> PRT<213> Homo sapien<400> 1Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210> 2<211> 23<212> PRT<213> Homo sapien<400> 2Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Set Cys Leu Glu20<210> 3<211> 23<212> PRT<213> Mus musculus<400> 3Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu20<210> 4<211> 19<212> PRT<213> Homo sapien<400> 4Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5 10 15Trp Thr Glu<210>
<211> 22<212> DNA<213> Homo sapien<400> 5gagagtcaga cttgaaagca gt 22<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Homo sapien<400> 6ctgagcctca gcaaatgggc 20<210> 7<211> 27<212> DNA<213> Homo sapien<400> 7gagcatgcat gggctccgac gtgcggg 27<210> 8<211> 25<212> DNA<213> Homo sapien<400> 8ggggtaccca ctgaacggtc cccga25<210> 9<211> 18<212> DNA<213> Mus musculus<400> 9tccgagccgc acctcatg18<210> 10<211> 18<212> DNA<213> Mus musculus<400> 10gcctgggatg ctggactg18<210> 11<211> 27<212> DNA<213> Mus musculus<400> 11gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg 27<210> 12<211> 29<212> DNA<213> Mus musculus<400> 12ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt29
<210> 13<211> 17<212> PRT<213> Mus musculus<400> 13Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210> 14<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 14Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5 10 15Trp Thr Glu<210> 15<211> 15<212> PRT<213> Homo sapien<400> 15Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg1 5 10 15<210> 16<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 16Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg1 5 10 15<210> 17<211> 14<212> PRT<213> Mus musculus<400> 17Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser1 5 10<210> 18<211> 14<212> PRT<213> Homo sapien<400> 18Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser1 5 10<210> 19<211> 15<212> PRT<213> Homo sapien
<400> 19Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His1 5 10 15<210> 20<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 20Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His1 5 10 15<210> 21<211> 21<212> DNA<213> Mus musculus<400> 21cccaggctgc aataagagat a 21<210> 22<211> 21<212> DNA<213> Mus musculus<400> 22atgttgtgat ggcggaccaa t 21<210> 23<211> 20<212> DNA<213> Homo sapien<400> 23gtggggcgcc ccaggcacca 20<210> 24<211> 24<212> DNA<213> Homo sapien<400> 24gtccttaatg ctacgcacga tttc24<210> 25<211> 21<212> DNA<213> Homo sapien<400> 25ggcatctgag accagtgaga a 21<210> 26<211> 21<212> DNA<213> Homo sapien<400> 26gctgtcccac ttacagatgc a 21
<210> 27<211> 21<212> DNA<213> Homo sapien<400> 27tcaaagcgcc agctggagtt t 21<210> 28<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 28Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5<210> 29<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 29Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe1 5<210> 30<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 30Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu1 5<210> 31<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 31Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe1 5<210> 32<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 32Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp1 5<210> 33<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 33Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr1 5
<210> 34<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 34Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu1 5<210> 35<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 35Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu1 5<210> 36<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 36Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys1 5<210> 37<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 37Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe1 5<210> 38<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 38Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr1 5<210> 39<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 39Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His1 5<210> 40<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 40Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe1 5
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<400> 61Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu15<210> 62<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 62Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu1 5<210> 63<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 63Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala1 5<210> 64<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 64Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser1 5<210> 65<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 65Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr1 5<210> 66<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 66Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys1 5<210> 67<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 67Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr1 5<210> 68<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien
<400> 68Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser1 5<210> 69<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 69Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val1 5<210> 70<211> 9<212>PRT<213> Homo sapien<400> 70Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile1 5<210> 71<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 71Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile1 5<210> 72<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 72Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln1 5<210> 73<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 73Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met1 5<210> 74<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 74Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr1 5<210> 75<211> 9<212> PRT
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<213> Mus musculus<400> 261Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val1 5<210> 262<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 262Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu1 5<210> 263<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 263Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu1 5<210> 264<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 264Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu1 5<210> 265<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 265Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu1 5<210> 266<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 266Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile1 5<210> 267<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 267Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser1 5<210> 268<211> 9
<212> PRT<213> Mus musculus<400> 268Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu1 5<210> 269<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 269Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala1 5<210> 270<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 270Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val1 5<210> 271<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 271Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala1 5<210> 272<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 272His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met1 5<210> 273<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 273His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile1 5<210> 274<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 274Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile1 5<210> 275
<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 275Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val1 5<210> 276<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 276Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu1 5<210> 277<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 277Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys1 5<210> 278<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 278Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met1 5<210> 279<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 279Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu1 5<210> 280<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 280Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr1 5<210> 281<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 281Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu1 5
<210> 282<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 282Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu1 5<210> 283<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 283Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met1 5<210> 284<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 284Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu1 5<210> 285<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 285Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala Leu1 5<210> 286<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 286Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu1 5<210> 287<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 287Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu1 5<210> 288<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 288Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met1 5
<210> 289<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 289Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met1 5<210> 290<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 290Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val1 5<210> 291<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 291Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val1 5<210> 292<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 292Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr1 5<210> 293<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 293Arg Met Phe Pro Asn A la Pro Tyr Leu1 5<210> 294<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 294Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu1 5<210> 295<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 295Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu
<210> 296<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 296Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile1 5<210> 297<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 297Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser1 5<210> 298<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 298Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu1 5<210> 299<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 299Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val1 5<210> 300<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 300Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser1 5<210> 301<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 301Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile1 5<210> 302<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 302Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr1 5<210> 303<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 303Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr1 5<210> 304<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 304Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala1 5<210> 305<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 305Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr1 5<210> 306<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 306Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met1 5<210> 307<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 307Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys1 5<210> 308<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 308Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met1 5<210> 309<211> 6<212> PRT<213> Homo sapien
<400> 309Gly Ala Ala Gln Trp Ala15<210> 310<211> 12<212> PRT<213> Homo sapien<400> 310Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro1 5 10<210> 311<211> 15<212> PRT<213> Homo sapien<400> 311Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly1 5 10 15<210> 312<211> 5<212> PRT<213> Homo sapien<400> 312His Ala Ala Gln Phe1 5<210> 313<211> 32<212> PRT<213> Homo sapien<400> 313Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu20 25 30<210> 314<211> 32<212> PRT<213> Homo sapien<400> 314Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg1 5 10 15Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser20 25 30<210> 315<211> 4<212> PRT<213> Homo sapien<400> 315Arg Tyr Phe Lys1
<210> 316<211> 14<212> PRT<213> Homo sapien<400> 316Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln1 5 10<210> 317<211> 22<212> PRT<213> Homo sapien<400> 317Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr1 5 10 15His Thr Gly Lys Thr Ser20<210> 318<211> 21<212> PRT<213> Homo sapien<400> 318Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Ash1 5 10 15Met His Gln Arg Ash20<210> 319<211> 449<212> PRT<213> Homo sapien<400> 319Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Ash Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly G1n Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu<210> 320<211> 449<212> PRT<213> Mus musculus<400> 320Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu ASn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala435 440 445Leu<210> 321<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 321Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala1 5<210> 322<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 322Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro1 5<210> 323<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 323Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5<210> 324<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 324Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro1 5<210> 325<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 325Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys15<210> 326<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 326Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu1 權(quán)利要求
1.包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與WT1特異的抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽中存在的不超過(guò)16個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性部分可與MHCI類(lèi)分子結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的多肽，其中免疫原性部分可與MHC II類(lèi)分子結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含選自下組的序列(a)表2-46中一項(xiàng)或多項(xiàng)記錄的序列；(b)上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(c)上述序列的模擬物，其中模擬物與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小。
5.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含選自下組的序列；(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)，GATLKGVAA(SEQ ID NO88)，CMTWNQMNL(SEQ ID NOs49和258)，SCLESQPTI(SEQ ID NOs199和296)，SCLESQPAI(SEQ ID NO198)，NLYQMTSQL(SEQ ID NOs147和284)；ALLPAVSSL(SEQ ID NOs35和255)，RMFPNAPYL(SEQ ID NOs185和293)；(b)上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(c)上述序列的模擬物，其中所述模擬物與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小。
6.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽的4-16個(gè)連續(xù)氨基酸。
7.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽的8-10個(gè)連續(xù)氨基酸。
8.包含天然WT1多肽的第1-174位氨基酸殘基的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與WT1特異性T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽的第175-449位氨基酸中存在的不超過(guò)16個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
9.包含因WT1免疫原性部分中1-3個(gè)氨基酸位置的取代而不同、以至于與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力相對(duì)于天然WT1有所增強(qiáng)的WT1免疫原性部分變體的多肽。
10.WT1多肽的免疫原性部分的模擬物，其中至少一個(gè)氨基酸殘基被非氨基酸化合物取代，但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有減小。
11.包含與制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑相組合的權(quán)利要求1的多肽的藥物組合物。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述多肽包含天然WT1多肽的4-16個(gè)連續(xù)氨基酸。
13.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述多肽包含天然WT1多肽的8-16個(gè)連續(xù)氨基酸。
14.包含與制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑相組合的權(quán)利要求8的多肽的藥物組合物。
15.包含與非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑相組合的權(quán)利要求1的多肽的疫苗。
16.權(quán)利要求15的疫苗，其中所述多肽包含天然WT1多肽的4-16個(gè)連續(xù)氨基酸。
17.權(quán)利要求15的疫苗，其中所述多肽包含天然WT1多肽的8-10個(gè)連續(xù)氨基酸。
18.權(quán)利要求15的疫苗，其中免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
19.包含與非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑相組合的權(quán)利要求8的多肽的疫苗。
20.權(quán)利要求19的疫苗，其中免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
21.包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)WT1多肽，其中所述多肽包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異性T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(b)在患者體內(nèi)優(yōu)先增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答的非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。
22.權(quán)利要求21的疫苗，其中免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑選自MontanideISA50、Seppic MONTANIDE ISA 720、細(xì)胞因子(如GM-CSF、Flat3配基)、微球體、基于二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)的佐劑、AS-1、AS-2、基于Ribi佐劑系統(tǒng)的佐劑、QS21、基于皂甙的佐劑、微流化形式的Syntex佐劑、MV、ddMV、基于免疫刺激復(fù)合物(iscon)的佐劑和經(jīng)滅活的毒素。
23.包含與制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑相組合的權(quán)利要求10的模擬物的藥物組合物。
24.包含與非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑相組合的權(quán)利要求10的模擬物的疫苗。
25.編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要求8的多肽的多核苷酸。
26.包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)編碼WT1多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(b)制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
27.包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)可特異結(jié)合WT1多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b)制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
28.包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)可與WT1多肽特異反應(yīng)的T細(xì)胞；和(b)制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
29.包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)抗原呈遞細(xì)胞，其表達(dá)(i)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的WT1多肽；和(b)制藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
30.包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)編碼WT1多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體；和(b)非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。
31.包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)抗原呈遞細(xì)胞，其表達(dá)(i)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的WT1多肽；和(b)非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。
32.包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)能夠與可特異結(jié)合WT1的免疫原性部分的抗體特異結(jié)合的抗獨(dú)特型抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b)非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。
33.權(quán)利要求30-32任一項(xiàng)的疫苗，其中免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
34.權(quán)利要求30-32任一項(xiàng)的疫苗，其中免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑在患者體內(nèi)優(yōu)先增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答。
35.用于增強(qiáng)或誘導(dǎo)人類(lèi)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)患者施用包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的WT1多肽；和(b)生理學(xué)可接受的載體或賦形劑；并由此增強(qiáng)或誘導(dǎo)人類(lèi)患者體內(nèi)對(duì)WT1或表達(dá)WT1的細(xì)胞特異的免疫應(yīng)答。
36.用于增強(qiáng)或誘導(dǎo)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)患者施用權(quán)利要求11、14、23或26-29任一項(xiàng)的藥物組合物。
37.用于增強(qiáng)或誘導(dǎo)人類(lèi)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)患者施用包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的WT1多肽；和(b)非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑；并由此增強(qiáng)或誘導(dǎo)人類(lèi)患者體內(nèi)對(duì)WT1或表達(dá)WT1的細(xì)胞特異的免疫應(yīng)答。
38.用于增強(qiáng)或誘導(dǎo)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)患者施用權(quán)利要求15、19、21、24或30-32任一項(xiàng)的疫苗，并由此增強(qiáng)或誘導(dǎo)患者體內(nèi)對(duì)WT1或表達(dá)WT1的細(xì)胞特異的免疫應(yīng)答。
39.用于抑制人類(lèi)患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括對(duì)人類(lèi)患者施用包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的WT1多肽；和(b)生理學(xué)可接受的載體或賦形劑；并由此抑制人類(lèi)患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展。
40.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用權(quán)利要求11、14、23或26-29任一項(xiàng)的藥物組合物，并由此抑制患者體內(nèi)惡性疾病的發(fā)展。
41.用于抑制人類(lèi)患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括對(duì)人類(lèi)患者施用包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是與抗原特異的抗體和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體的WT1多肽；和(b)非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑；并由此抑制患者體內(nèi)惡性疾病的發(fā)展。
42.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用權(quán)利要求15、19、21、24或30-32任一項(xiàng)的疫苗，并由此抑制患者體內(nèi)惡性疾病的發(fā)展。
43.權(quán)利要求39或權(quán)利要求41的方法，其中惡性疾病是白血病。
44.權(quán)利要求43的方法，其中白血病是急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性髓性白血病。
45.權(quán)利要求39或權(quán)利要求41的方法，其中惡性疾病是癌癥。
46.權(quán)利要求45的方法，其中癌癥是乳腺、肺、甲狀腺或胃腸癌癥或黑色素瘤。
47.權(quán)利要求40的方法，其中惡性疾病是白血病。
48.權(quán)利要求47的方法，其中白血病是急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性髓性白血病。
49.權(quán)利要求40的方法，其中惡性疾病是癌癥。
50.權(quán)利要求49的方法，其中癌癥是乳腺、肺、甲狀腺或胃腸癌癥或黑色素瘤。
51.權(quán)利要求42的方法，其中惡性疾病是白血病。
52.權(quán)利要求51的方法，其中白血病是急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性髓性白血病。
53.權(quán)利要求42的方法，其中惡性疾病是癌癥。
54.權(quán)利要求53的方法，其中癌癥是乳腺、肺、甲狀腺或胃腸癌癥或黑色素瘤。
55.權(quán)利要求39的方法，其中所述藥物組合物包含具有選自下列的序列的WT1多肽表2-46中一項(xiàng)或多項(xiàng)記錄的序列，和上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有減小的變體。
56.權(quán)利要求39的方法，其中所述藥物組合物包含具有選自下列的序列的WT1多肽ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ IDNO88)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(SEQ ID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ IDNO185和293)，和上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有減小的變體。
57.權(quán)利要求41的方法，其中疫苗包含具有選自下列的序列的WT1多肽表2-46中一項(xiàng)或多項(xiàng)記錄的序列，和上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有減小的變體。
58.權(quán)利要求41的方法，其中疫苗包含具有選自下列的序列的WT1多肽ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(SEQ ID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO185和293)，和上述序列因一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是與抗原特異性抗血清和/或T細(xì)胞系或克隆發(fā)生反應(yīng)的能力并沒(méi)有顯著減小的變體。
59.由骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分除去表達(dá)WT1的細(xì)胞的方法，包括將骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分與能與WT1多肽發(fā)生特異反應(yīng)的T細(xì)胞進(jìn)行接觸，其中接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足以將骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分中的WT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目降至髓性或淋巴細(xì)胞數(shù)目的10％以下。
60.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用按權(quán)利要求59的方法制備的骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分。
61權(quán)利要求60的方法，其中骨髓、外周血、或其級(jí)分是自體的。
62.權(quán)利要求60的方法，其中骨髓、外周血、或其級(jí)分是同源的或異源的。
63.用于刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法，包含將T細(xì)胞與WT1多肽、編碼WT1多肽的多核苷酸和/或表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行接觸，接觸進(jìn)行的條件和時(shí)間足以刺激和/或擴(kuò)增T細(xì)胞。
64.權(quán)利要求63的方法，其中T細(xì)胞存在于骨髓、外周血、或者骨髓或外周血級(jí)分中。
65.權(quán)利要求63的方法，其中骨髓、外周血、或其級(jí)分得自患有與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的患者。
66.權(quán)利要求63的方法，其中骨髓、外周血、或其級(jí)分得自未患有與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的哺乳動(dòng)物。
67.權(quán)利要求63的方法，其中T細(xì)胞在擴(kuò)增之前進(jìn)行了克隆。
68.用于刺激和/或擴(kuò)增哺乳動(dòng)物體內(nèi)T細(xì)胞的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用包含下列各項(xiàng)的藥物組合物(a)下列各項(xiàng)的一種或多種(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；和(b)生理學(xué)可接受的載體或賦形劑；并由此刺激和/或擴(kuò)增哺乳動(dòng)物體內(nèi)T細(xì)胞。
69.用于刺激和/或擴(kuò)增哺乳動(dòng)物體內(nèi)T細(xì)胞的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用包含下列各項(xiàng)的疫苗(a)下列各項(xiàng)的一種或多種(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；和(b)非特異免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑；并由此刺激和/或擴(kuò)增哺乳動(dòng)物體內(nèi)T細(xì)胞。
70.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括對(duì)患者施用根據(jù)權(quán)利要求63的方法制備的T細(xì)胞。
71.權(quán)利要求70的方法，其中骨髓、外周血、或其級(jí)分得自患有與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的患者。
72.權(quán)利要求70的方法，其中骨髓、外周血、或其級(jí)分得自未患有與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的哺乳動(dòng)物。
73.用于監(jiān)控患者體內(nèi)用于與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的免疫接種或治療的功效的方法，包括下列步驟(a)將第一份生物學(xué)樣品與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；其中第一份生物學(xué)樣品由治療或免疫前的患者獲得，且溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以形成免疫復(fù)合物；(b)檢測(cè)WT1多肽和生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合WT1多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物；(c)使用由治療或免疫后的患者獲得的第二份生物學(xué)樣品，重復(fù)步驟(a)和(b)；并(d)比較在第一份和第二份生物學(xué)樣品中檢測(cè)到的免疫復(fù)合物的量，并由此監(jiān)控患者體內(nèi)治療或免疫的功效。
74.權(quán)利要求73的方法，其中檢測(cè)步驟包括(a)將免疫復(fù)合物與能夠結(jié)合該免疫復(fù)合物的檢測(cè)試劑一起進(jìn)行溫育，其中檢測(cè)試劑包含報(bào)道基團(tuán)，(b)除去未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并(c)檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的存在與否。
75.權(quán)利要求74的方法，其中檢測(cè)試劑包括能夠與可特異結(jié)合WT1多肽的抗體結(jié)合的二抗或其抗原結(jié)合片段。
76.權(quán)利要求74的方法，其中檢測(cè)試劑包括蛋白A。
77.權(quán)利要求74的方法，其中報(bào)道基團(tuán)選自放射性同位素、熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、酶、生物素和染料顆粒。
78.權(quán)利要求73的方法，其中報(bào)道基團(tuán)結(jié)合在WT1多肽上，且檢測(cè)步驟包括除去未結(jié)合的WT1多肽并隨后檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的存在與否。
79.用于監(jiān)控患者體內(nèi)用于與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的免疫或治療的功效的方法，包括下列步驟(a)將第一份生物學(xué)樣品與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的WT1多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；其中該生物學(xué)樣品包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞，且由治療或免疫前的患者獲得，而且溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以使得T細(xì)胞特異激活、增殖和/或裂解；(b)檢測(cè)T細(xì)胞激活、增殖和/或裂解的量；(c)使用包含CD4+和/或CD8+T細(xì)胞、由治療或免疫后的同一患者獲得的第二份生物學(xué)樣品，重復(fù)步驟(a)和(b)；并(d)比較第一份和第二份生物學(xué)樣品中T細(xì)胞激活、增殖和/或裂解的量，并由此監(jiān)控患者體內(nèi)該治療或免疫的功效。
80.權(quán)利要求73或權(quán)利要求79的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
81.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD4+T細(xì)胞與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；使得T細(xì)胞增殖；并(b)對(duì)患者施用有效量的增殖T細(xì)胞，并由此抑制患者體內(nèi)惡性疾病的發(fā)展。
82.權(quán)利要求81的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
83.權(quán)利要求81的方法，其中T細(xì)胞溫育步驟重復(fù)一次或多次。
84.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD4+T細(xì)胞與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；使得T細(xì)胞增殖；(b)克隆一個(gè)或多個(gè)在WT1多肽存在時(shí)增殖的細(xì)胞；并(c)對(duì)患者施用有效量的克隆T細(xì)胞。
85.權(quán)利要求84的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
86.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD8+T細(xì)胞與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；使得T細(xì)胞增殖；并(b)對(duì)患者施用有效量的經(jīng)增殖T細(xì)胞，并由此抑制患者體內(nèi)惡性疾病的發(fā)展。
87.權(quán)利要求86的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
88.權(quán)利要求86的方法，其中T細(xì)胞溫育步驟重復(fù)一次或多次。
89.用于抑制患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD8+T細(xì)胞與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；使得T細(xì)胞增殖；(b)克隆一個(gè)或多個(gè)在WT1多肽存在時(shí)增殖的細(xì)胞；并(c)對(duì)患者施用有效量的克隆T細(xì)胞。
90.權(quán)利要求89的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
91.用于測(cè)定患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD4+T細(xì)胞與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；并(b)檢測(cè)T細(xì)胞特異激活的存在與否，由此測(cè)定與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否。
92.權(quán)利要求91的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
93.權(quán)利要求91的方法，其中檢測(cè)步驟包括檢測(cè)T細(xì)胞增殖的存在與否。
94.用于測(cè)定患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的CD8+T細(xì)胞與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；并(b)檢測(cè)T細(xì)胞特異激活的存在與否，由此測(cè)定與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否。
95.權(quán)利要求94的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
96.權(quán)利要求94的方法，其中檢測(cè)步驟包括檢測(cè)溶細(xì)胞活性的存在與否。
97.用于測(cè)定患者體內(nèi)與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否的方法，包括下列步驟(a)將由患者分離得到的生物學(xué)樣品與下列一種或多種一起溫育(i)WT1多肽；(ii)編碼WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表達(dá)WT1多肽的抗原呈遞細(xì)胞；其中溫育進(jìn)行的條件和時(shí)間足以形成免疫復(fù)合物；并(b)檢測(cè)WT1多肽和生物學(xué)樣品中可特異結(jié)合WT1多肽的抗體之間形成的免疫復(fù)合物；并由此測(cè)定與WT1表達(dá)有關(guān)的惡性疾病的存在與否。
98.權(quán)利要求97的方法，其中惡性疾病是癌癥或白血病。
99.權(quán)利要求97的方法，其中檢測(cè)步驟包括(a)將免疫復(fù)合物與能夠結(jié)合該免疫復(fù)合物的檢測(cè)試劑一起進(jìn)行溫育，其中檢測(cè)試劑包含報(bào)道基團(tuán)，(b)除去未結(jié)合的檢測(cè)試劑，并(c)檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的存在與否。
100.權(quán)利要求99的方法，其中檢測(cè)試劑包括能夠與可特異結(jié)合WT1多肽的抗體結(jié)合的二抗或其抗原結(jié)合片段。
101.權(quán)利要求99的方法，其中檢測(cè)試劑包括蛋白A。
102.權(quán)利要求99的方法，其中報(bào)道基團(tuán)選自放射性同位素、熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、酶、生物素和染料顆粒。
103.權(quán)利要求97的方法，其中報(bào)道基團(tuán)結(jié)合在WT1多肽上，且檢測(cè)步驟包括除去未結(jié)合的WT1多肽并隨后檢測(cè)報(bào)道基團(tuán)的存在與否。
104.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的多肽作為活性治療物質(zhì)使用的用途。
105.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的多肽在用于增強(qiáng)或誘導(dǎo)患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的藥物制備中的用途。
全文摘要
此處公開(kāi)了用于治療諸如白血病和癌癥等惡性疾病的組合物和方法。組合物包含下述中的一種或多種:WT1多核苷酸、WT1多肽、展示W(wǎng)T1多肽的抗原呈遞細(xì)胞、可特異結(jié)合WT1多肽的抗體、或可與WT1多肽特異反應(yīng)的T細(xì)胞。這種組合物可以用于例如預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性疾病。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1336935SQ99813349
公開(kāi)日2002年2月20日 申請(qǐng)日期1999年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月30日
發(fā)明者亞歷山大·蓋杰, 馬丁·奇弗 申請(qǐng)人:科里克薩有限公司, 亞歷山大·蓋杰 被以下專(zhuān)利引用 (3),