專利名稱：新的核酸轉(zhuǎn)移試劑、含有它們的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在體外、體內(nèi)或離體向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的新的轉(zhuǎn)移試劑、含有它們的組合物及其應(yīng)用。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，向細胞中有效轉(zhuǎn)移核酸正成為具有眾多生物技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)技術(shù)。例如為了生產(chǎn)重組蛋白，或在實驗室對基因表達調(diào)控、基因克隆的研究，或任何其他牽涉DNA的操作，都可能涉及體外細胞中的核酸轉(zhuǎn)移。再例如在實現(xiàn)免疫接種、研究標(biāo)記或治療方法中，也可能涉及在體內(nèi)細胞中的核酸轉(zhuǎn)移。還可能涉及在從機體取出的細胞中轉(zhuǎn)移基因，以便隨后回輸，例如為了建立轉(zhuǎn)基因動物。
現(xiàn)在，向細胞中轉(zhuǎn)移基因的最普遍的方法是使用病毒載體。但這些方法沒能完全排除危險，也提出了基于使用合成病毒的許多其他方法。這些合成載體有兩個主要功能復(fù)合并壓縮待轉(zhuǎn)移的核酸，促進其通過漿膜和有時通過兩層核膜。
已開發(fā)出許多類型的合成載體，例如聚合物或生化載體(由與細胞受體結(jié)合的陽離子蛋白構(gòu)成)，但在非病毒轉(zhuǎn)染方面重要的進步首先是由酯轉(zhuǎn)染劑、特別是陽離子脂的發(fā)展取得的。已證明陽離子脂類由于其總的正電荷自動干擾總體帶負電的DNA，形成能夠與細胞膜融合的核脂復(fù)合物，從而得以在細胞內(nèi)釋放DNA。
已合成了不同類型的陽離子脂類帶有季銨基團的脂類(例如DOTMA，DOTAP，DMRIE，DLRIE等)，脂多胺如DOGS、DC-Chol或?qū)＠暾圵O97/18185中公開的那些脂多胺，同時結(jié)合有季銨基團和多胺的脂類如DOSPA，以及帶有各種其他陽離子基團、特別是離子化脒基團的脂類(例如ADPDE，ADODE或?qū)＠暾圵O97/31935的脂類)。實際上，陽離子脂類的結(jié)構(gòu)多樣性部分反映了構(gòu)效關(guān)系的觀察結(jié)果。
但是，這些合成載體的應(yīng)用產(chǎn)生了許多困難，其效力有待改善。尤其是，可能希望得到非陽離子或陽離子較少的載體，這是因為如下各種原因-核酸和轉(zhuǎn)移試劑所形成的復(fù)合物由于其總體正電荷具有被內(nèi)織網(wǎng)系統(tǒng)截取的傾向，這導(dǎo)致其被消除，-由于所形成復(fù)合物的總體正電性，胞漿蛋白有吸附在其表面的傾向，這導(dǎo)致轉(zhuǎn)染能力的損失，-對于局部注射的情況，強總正電荷的存在妨礙核酸復(fù)合物向給藥部位之外的擴散，因為這些復(fù)合物被吸附在細胞外基質(zhì)上。這些復(fù)合物因此不能到達靶細胞，結(jié)果導(dǎo)致相對所注射的復(fù)合物量轉(zhuǎn)移效率降低，-最后，基因非病毒轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的許多成員已顯示，陽離子脂類或聚合物具有致炎作用。
另外，迄今為止開發(fā)的具有低電荷比的合成載體形成穩(wěn)定制劑通常是困難的，甚至不可能，而且已證明電荷比低時常常轉(zhuǎn)移效力就低(Pitard等，PNAS USA，94，p14412-14417，1997)。在下文中，“電荷比”指轉(zhuǎn)移試劑的正電荷與DNA的負電荷的比例。該比例常用每微克DNA的轉(zhuǎn)移試劑的納摩爾數(shù)表示。
這些問題就是本申請人提出的新轉(zhuǎn)染試劑(構(gòu)成本發(fā)明的主題)所要解決的。實際上，它們特別的結(jié)構(gòu)形成了一個疏水錨位，其一方面與多陽離子體結(jié)合、從而得以與核酸形成復(fù)合物，另一方面與至少一個親水頭結(jié)合、從而與非病毒轉(zhuǎn)染中常規(guī)使用的陽離子脂類或聚合物相比降低表觀總電荷密度。至少一個親水頭的存在通過降低與核酸所形成復(fù)合物的ζ電勢建立了一種“電荷屏障”。因此，這些復(fù)合物對機體顯示較低的陽離子性，從中產(chǎn)生了有利的結(jié)果。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)染試劑在物化性質(zhì)方面特別有利，當(dāng)它們與核酸以低電荷比接觸時特別穩(wěn)定。
因此，本發(fā)明的第一個主題涉及新的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其帶有一個一方面與多陽離子體另一方面與至少一個親水取代基化學(xué)結(jié)合的疏水間隔臂。
所述多陽離子體使得能通過與核酸的陰離子電荷作用與核酸形成復(fù)合物。所述疏水間隔臂有雙重功能。它一方面使得能通過細胞膜，另一方面它使得與核酸形成的復(fù)合物在生物介質(zhì)中可維持存在。實際上，這種疏水間隔臂在復(fù)合物上建立了一種物理限制，它保護核酸對抗外界環(huán)境。復(fù)合物生存所需的疏水性容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，例如使用常規(guī)研究方法或通過常用摸索方法。最后，親水取代基的存在使得所形成的復(fù)合物ζ電勢減小，這使得所述復(fù)合物對外界環(huán)境的陽離子性較小。
在本發(fā)明中，多陽離子體是易于與核酸結(jié)合的多陽離子的直鏈或支鏈分子。在本發(fā)明中，與核酸結(jié)合指任何類型的連接，例如共價連接、靜電相互作用、離子鍵、氫鍵等。優(yōu)選，多陽離子體是一種直鏈或支鏈的多胺，每個氨基被一個或多個亞甲基分隔。任選地，這種多胺還可以被其他陽離子功能團取代，如脒離子或胍離子、環(huán)形胍等。尤其涉及如專利申請WO96/17823、WO97/18185、WO97/31935、WO98/54130或WO99/51581中所定義的多胺，更廣義地講，在涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知陽離子脂類結(jié)構(gòu)的任何文獻中所定義的多胺。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，多陽離子體為通式(II)的多胺 其中-R1、R2和R3獨立地代表氫原子或(CH2)qR’R”基團，q為1-6的整數(shù)，其在不同的R1、R2和R3基團間是獨立的，條件是R1、R2和R3中至少一個不是氫原子，-R和R”獨立地代表氫原子或(CH2)qNH2基團，q如上所定義，-m代表1-6的整數(shù)，-n和p獨立地代表0-6的整數(shù)，當(dāng)n大于或等于2時，m可以取不同的值，通式(II)中R3的意義可以不同，當(dāng)n等于0時，取代基R1和R2中至少一個不是氫原子。
其他可能的多陽離子體還選自精胺、亞精胺、尸胺、腐胺、六亞甲基四胺(六胺)、甲基丙烯酰氨基丙基-三甲基氯化銨(AMBTAC)、3-丙烯酰氨基-3-甲基丁基三甲基氯化銨(AMBTAC)、聚乙烯胺、聚乙烯亞胺、或紫羅烯(參考文獻Barton等，綜合有機化學(xué)(Comprehensive Organic Chemistry，Vol.2，Ed.PergamonPress，p90；聚合物科學(xué)和工程大全(Encyclopedia of PolymerScience and Engineering)第二版，Ed.Wiley Interscience，Vol.11，p489；Mahler和Cordes，生物化學(xué)(BiologicalChemistry，Harper International Edition，p124)。
只要具有保證保護核酸和使其通過膜的足夠的疏水性，疏水間隔臂可以采取相當(dāng)不同的結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用普通研究方法可以測定這種足夠的疏水性。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，疏水間隔臂由2條或3條線性脂肪烴鏈構(gòu)成(即，每條鏈10-20個碳原子，優(yōu)選每條鏈12、14、15、16、17或18個碳原子，每條鏈可以有不同的長度)。根據(jù)另一方案，疏水間隔臂由一個很長的線性脂肪烴鏈構(gòu)成，即含有20-50個碳原子，優(yōu)選40-50個碳原子、更優(yōu)選44-50個碳原子。
適合的親水取代基例如選自羥基、氨基、多元醇、糖、或親水性肽。多元醇指任何含有至少2個羥基的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴分子。作為實例可以舉出甘油、乙二醇、丙二醇、丁糖醇、戊糖醇、環(huán)狀戊糖醇(或櫟醇)、己糖醇如甘露糖醇、山犁糖醇、半乳糖醇，環(huán)狀己糖醇或肌醇等(Stanek等，The Monosaccharidess Academic Press，621-655頁和778-855頁)。
根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑含有至少一個作為糖的親水取代基。本發(fā)明中，“糖”指任何由一個或多個單糖(saccharide)組成的分子。作為糖的例子例如可以提到吡喃糖和呋喃糖，例如葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、或麥芽糖、乳糖、蔗糖、巖藻糖、纖維二糖、阿洛糖、昆布二糖、龍膽二糖、2-葡糖-β-葡糖苷、蜜二糖等。優(yōu)選地，糖選自葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖和纖維二糖。另外還涉及所謂的“復(fù)合”糖，即多個糖互相共價連接，其中每個糖優(yōu)選選自上述名單。作為適用的多糖，可以舉出葡聚糖、α-直鏈淀粉、支鏈淀粉、果聚糖、甘露聚糖、木聚糖和阿聚糖。某些優(yōu)選的糖還可以與細胞受體相作用，例如某些類型的凝集素。
特別優(yōu)選地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑可以由通式(I)代表 其中-R代表多陽離子體，-Z代表氫原子或氟原子，不同的Z互相獨立，-x和y相互獨立地代表10-22的整數(shù)，而X和Y相互獨立地代表氫原子、其中Alk代表1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基的-OAlk基團、羥基、氨基、多元醇、糖、親水或非親水肽、或寡核苷酸，條件是X和Y至少一個代表選自羥基、氨基、多元醇、糖或親水肽的親水基團，-或者，x等于0或1，y為20-50的整數(shù)，而X為氫原子或其中Alk代表1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基的-OAlk基團，Y為選自羥基、氨基、多元醇、糖或親水肽的親水基團。
在本發(fā)明中，通式(I)的多陽離子體、多元醇和糖如上所定義。
x和y在通式(I)中定義為根據(jù)情況在10-22或20-50之間取值。優(yōu)選，x和y相互獨立地在12-18之間。更優(yōu)選x和y的值相互獨立地為14、15、16、17或18。當(dāng)x等于0或1時，y優(yōu)選為30-50，或40-50。更優(yōu)選，y為44-50。
在本發(fā)明中，“寡核苷酸”是指含有一個或多個核苷酸、脫氧核苷酸、核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸的鏈，這些核苷酸是以堿基的存在互相區(qū)別的單體單元，堿基可以選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶[見Lehninger Biochimie，F(xiàn)lammarionMedecine Science，第二版，305-329頁]。由于它們形成堿基對的特性，寡核苷酸大量用于分子生物學(xué)，例如作為連接子(連接分子)或作為探針。另外，寡核苷酸還可以以偶聯(lián)物的形式使用，即與一個或多個具有不同特性的分子偶聯(lián)。例如，寡核苷酸可以與反應(yīng)性化學(xué)基團、熒光基團或化學(xué)發(fā)光基團、或與有利于分子間相互作用以促進進入細胞的基團偶聯(lián)。生物偶聯(lián)物化學(xué)(Bioconjugate Chemistry)[John Goodchild，寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的偶聯(lián)物其合成和性質(zhì)綜述(Conjugates of Oligonucleotides and ModifiedOligonucleotidesa Review of their Synthesis andproperties)，Vol.1，No.3，1990，165-187頁]中描述的這類偶聯(lián)物具有許多用途和優(yōu)勢，例如能改善復(fù)合物進入細胞、降低被核酸酶的降解率、提高相關(guān)復(fù)合物的穩(wěn)定性、跟蹤寡核苷酸在機體中的命運等。因此，當(dāng)接在本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑上時，這種寡核苷酸能給所述轉(zhuǎn)移試劑帶來額外的性質(zhì)(例如導(dǎo)向或標(biāo)記等特性)。這些寡核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，也可以按以下文獻描述的方法合成修飾的寡核苷酸“生物偶聯(lián)物化學(xué)”，JohnGoodchild，寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的偶聯(lián)物其合成和性質(zhì)綜述，Vol.1，No.3，1990，165-187頁，或“四面體”(Tetrahedron)，Beaucage等，用亞磷酰胺合成修飾的寡核苷酸及其應(yīng)用(The Synthesis of Modified Oligonucleotides by thePhosphoramiditeb Approach and Their Application)，Vol.49，No.28，p6123-6194，1993。
本發(fā)明中“肽”指含有由肽鍵相互連接的一個或多個氨基酸的鏈[Lehninger Biochimie，F(xiàn)lammarion Medecine Science，第二版]。其中的氨基酸可以是20種“常規(guī)”氨基酸，即通常在蛋白組成中發(fā)現(xiàn)的那些(丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，蛋氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酸)，或者也可以是所謂的“稀有”氨基酸，例如，4-羥基脯氨酸，鎖鏈賴氨素，5-羥基賴氨酸，N-甲基賴氨酸，3-甲基組氨酸，異鎖鏈賴氨素等。最后，還可以涉及以游離或結(jié)合形式出現(xiàn)在不同細胞或各種組織中并通常衍生自α-氨基酸的氨基酸(例如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，高半胱氨酸，鳥氨酸，刀豆氨酸，黎豆氨酸，β-氰基丙氨酸等)。這種肽例如可以使得導(dǎo)向于特定類型的細胞。對此，可以提到肽RGD或NLS。還可能涉及具有標(biāo)記特性的肽序列，即可以識別，例如通過一些分析技術(shù)，如熒光分光光度法、紅外分光光度法、核磁共振(NMR)等。對此，例如可以舉出含有整聯(lián)蛋白類蛋白主要和/或次要受體的識別表位Arg-Gly-Asp(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的線性或環(huán)狀肽序列或假肽序列。本發(fā)明的肽另外可以在一個或多個功能團上被取代，例如在α位羧基、α位氨基和/或每個氨基酸側(cè)鏈的功能團上。例如，可以提到被下列基團的取代含1-24個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀飽和或不飽和脂肪基團，如膽甾烯基、花生四烯基(arachidonyl)或視黃酰基(retinoyl)，單芳基或多芳基基團，如取代或未取代的芐氧羰基、芐基酯或若丹明基衍生物。這些取代基的意義體現(xiàn)在對所述肽的化學(xué)性質(zhì)和有時對生物性質(zhì)的修飾，例如為了標(biāo)記。當(dāng)所述肽用作親水取代基時，它們選自親水肽，即僅由親水性氨基酸組成的或部分由親水性氨基酸組成但其組成使得總體為親水性的肽。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，基團Z均代表氫原子。
根據(jù)本發(fā)明一個特別有利的方面，所述轉(zhuǎn)移試劑具有通式(III) 其中-R代表多陽離子體，--x和y相互獨立地代表10-22的整數(shù)，而X和Y相互獨立地代表氫原子或糖，條件是X和Y至少一個代表糖，-或者，x等于0或1，y為20-50的整數(shù)，而X為氫原子，Y為糖。
在本發(fā)明中，通式(III)中的多陽離子體、糖、x和y如通式(I)中所定義。
特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)移試劑具有通式(III)，x和y相互獨立地為10-22的整數(shù)，X和Y之一代表氫原子，另一個為糖。根據(jù)另一個有利的方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑具有通式(III)，且x等于0，y為40-50的整數(shù)，X代表氫原子，Y為糖。
應(yīng)理解，本發(fā)明還涉及通式(I)產(chǎn)品的異構(gòu)體(當(dāng)其存在時)、它們的混合物或它們的鹽。
值得注意的是，本發(fā)明的化合物可以以藥物可接受的無毒鹽的形式存在。這些無毒鹽包括與無機酸(例如鹽酸，硫酸，氫溴酸，磷酸，硝酸)的鹽，與有機酸(例如乙酸，丙酸，琥珀酸，馬來酸，羥基馬來酸，苯甲酸，富馬酸，甲磺酸或草酸)的鹽，與無機堿(例如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鋰，氫氧化鈣)的鹽，與有機堿(例如叔胺如三乙胺，哌啶，芐基胺)的鹽。
根據(jù)本發(fā)明，通式(I)產(chǎn)物的制備可按以下步驟進行1)首先通過打開相應(yīng)的內(nèi)酯制備帶有羥基功能團和酯功能團的x個碳原子(x如上所定義)的烷基鏈。該反應(yīng)一般在醇中、堿性pH和-10℃到室溫的溫度下進行。例如，醇可以是甲醇或乙醇。
2)然后，將基團X結(jié)合在上步得到的雙官能烷基鏈上。當(dāng)X代表糖時，在含氯溶劑如二氯甲烷或氯仿中、在路易斯酸存在下、于-5℃到10℃的溫度下進行縮合。路易斯酸例如可以選自氯化錫、氯化鐵、對甲苯磺酸(tsOH)、三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸(TMStf)、三氟化硼醚化物等[Kazunobu Toshima等，O-糖基化方法的最新進展和其在天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用，Chem.Rev.1993，Vol.93，1503-1531頁]。
當(dāng)X代表親水或非親水性肽基團時，按常規(guī)方法(Bodanski M.，肽合成原理和實踐，Springe-Verlag編)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類似方法進行肽偶聯(lián)。特別是，該反應(yīng)一般在非親核性堿存在下、在適當(dāng)?shù)姆琴|(zhì)子溶劑中、在0-100℃的溫度下和9-11的pH條件下進行。例如，氯仿、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯或苯可用作溶劑。所用的非親核性堿優(yōu)選為叔胺、碳酸鈣或碳酸氫鈉。更優(yōu)選，所用的堿是叔胺，如三乙胺(TEA)或N-乙基二異丙基胺。肽偶聯(lián)有利地在0-50℃、優(yōu)選10-30℃下進行。
當(dāng)希望X代表羥基時，不進行這一步。
當(dāng)X代表氨基時，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能從醇獲得胺的常規(guī)方法通過親核取代進行反應(yīng)。
當(dāng)X代表-OAlk基團時，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法或類似方法進行醇功能團的烷基化。例如，任選在催化劑如HBF4或硅膠存在下，與式Alk-N2的偶氮化合物反應(yīng)。還可以在Williamson反應(yīng)條件下進行，即在堿性介質(zhì)中將式Alk-Hal的化合物(Hal代表鹵原子如氯、溴或碘)與帶有醇功能團的鏈反應(yīng)。
同樣的Williamson型反應(yīng)也可以在希望X代表多元醇時使用。
最后，當(dāng)X代表寡核苷酸時，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的共價接枝寡核苷酸的常規(guī)方法將其與雙官能鏈偶聯(lián)。例如，所述寡核苷酸借助于適當(dāng)?shù)慕宇^(連接分子)連接。
3)第三步，雙官能鏈上存在的酯功能基按已知方法水解成酸功能基。例如，可以在高沸點醇中堿性介質(zhì)中在50℃至反應(yīng)混合物回流溫度間的溫度下進行。
4)然后，將通式(IV)的取代或未取代的烷基胺鏈H2N-(CH2)y-Y(IV)其中y和Y如上所定義，與上步獲得的化合物按常規(guī)肽偶聯(lián)方法(Bodanski M.，肽合成原理和實踐，Springe-Verlag編)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類似方法偶聯(lián)。具體講，該反應(yīng)一般在適當(dāng)?shù)姆琴|(zhì)子溶劑中在非親核性堿存在下在0-100℃的溫度下進行，pH調(diào)節(jié)在9-11之間。例如，氯仿、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯或苯可用作溶劑。所用的非親核性堿優(yōu)選為叔胺、碳酸鈣或碳酸氫鈉。更優(yōu)選，所用的堿是叔胺，如三乙胺(TEA)或N-乙基二異丙基胺。肽偶聯(lián)有利地在0-50℃、優(yōu)選10-30℃下進行。通式(IV)的化合物可在市場上得到或者可以通過Y與相應(yīng)的未取代烷基胺按類似于以上2)中所述方法縮合得到。
5)然后將上步獲得的酰胺還原成胺。按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進行該反應(yīng)。例如，在無水有機溶劑如無水四氫呋喃中，在氫化鋰鋁LiAlH4的作用下進行?？梢允褂玫钠渌€原劑例如有硼烷、二甲硫醚中的硼烷(BH3-SMe2)、硼氫化鈉/四氯化鈦(NaBH4，TiCl4)、三氯氧磷/鋅(POCl3/Zn)、五硫化磷(P4S10)/Raney鎳等[Richard C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers Inc.，1989]。還可以通過催化氫化進行。有利地，在無水四氫呋喃中在混合物回流溫度下用氫化鋰鋁LiAlH4作用進行該反應(yīng)。從而得到通式(V)的化合物 其中X、Y、x和y如上所定義。
6)最后，在最后一步中，將相應(yīng)于如上所定義多陽離子體R的酸衍生物按常規(guī)肽偶聯(lián)方法(Bodanski M.，肽合成原理和實踐，Springe-Verlag編)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類似方法與通式(IV)的化合物偶聯(lián)。具體講，該反應(yīng)一般在適當(dāng)?shù)姆琴|(zhì)子溶劑中在非親核性堿存在下在0-100℃的溫度下進行，pH調(diào)節(jié)在9-11之間。例如，氯仿、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯或苯可用作溶劑。所用的非親核性堿優(yōu)選為叔胺、碳酸鈣或碳酸氫鈉。更優(yōu)選，所用的堿是叔胺，如三乙胺(TEA)或N-乙基二異丙基胺。肽偶聯(lián)有利地在0-50℃、優(yōu)選10-30℃下進行。相應(yīng)于多陽離子體的酸衍生物可在市場上得到。
根據(jù)另一方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)移試劑可按以下方式制備1)首先通過打開相應(yīng)的內(nèi)酯制備帶有一個羥基功能團和一個酯功能團的x個碳原子(x如上所定義)的烷基鏈。該反應(yīng)一般在醇中、堿性pH和-10℃到室溫的溫度下進行。例如，醇可以是甲醇或乙醇。
2)然后，在該雙官能烷基鏈上偶聯(lián)一個通式(IV)的取代或未取代的烷基胺鏈H2N-(CH2)y-Y(IV)其中y和Y如上所定義。該反應(yīng)在高于每種反應(yīng)物的熔點的溫度下在有或無真空的條件下進行。該反應(yīng)還可以在醇溶劑存在下在回流溫度下進行。例如，溶劑可以是甲醇或乙醇。例如在45-60℃的溫度下進行。
該反應(yīng)還可以在醇如甲醇作為溶劑存在下在混合物回流溫度下進行。另一種選擇是將通式(IV)的化合物與內(nèi)酯直接偶聯(lián)(此時，不進行第一步的內(nèi)酯打開)。
通式(IV)的化合物可以在市場上得到或可以按上述類似方法將相應(yīng)未取代的烷基胺與Y偶聯(lián)而得到。
3)然后將獲得的雙鏈雙官能酰胺還原成胺。按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進行該反應(yīng)。例如，在無水有機溶劑如無水四氫呋喃中，在氫化鋰鋁LiAlH4的作用下進行。可以使用的其他還原劑例如有硼烷、二甲硫醚中的硼烷(BH3-SMe2)、硼氫化鈉/四氯化鈦(NaBH4，TiCl4)、三氯氧磷/鋅(POCl3/Zn)、五硫化磷(P4S10)/Raney鎳等[Richard C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers Inc.，1989]。還可以通過催化氫化進行。有利地，在無水四氫呋喃中在混合物回流溫度下用氫化鋰鋁LiAlH4作用進行該反應(yīng)。從而得到通式(VI)的化合物 其中Y、x和y如上所定義。
4)然后，將X基團縮合在上步獲得的通式(VI)的胺上。按類似于第一合成路線中所述的方法進行該縮合。
5)最后，在最后一步中，將相應(yīng)于如上所定義多陽離子體R的酸衍生物按常規(guī)肽偶聯(lián)方法(Bodanski M.，肽合成原理和實踐，Springe-Verlag編)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何類似方法與通式(VI)的化合物偶聯(lián)。具體講，該反應(yīng)一般在適當(dāng)?shù)姆琴|(zhì)子溶劑中在非親核性堿存在下在0-100℃的溫度下進行，pH調(diào)節(jié)在9-11之間。例如，氯仿、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯或苯可用作溶劑。所用的非親核性堿優(yōu)選為叔胺、碳酸鈣或碳酸氫鈉。更優(yōu)選，所用的堿是叔胺，如三乙胺(TEA)或N-乙基二異丙基胺。肽偶聯(lián)有利地在0-50℃、優(yōu)選10-30℃下進行。相應(yīng)于多陽離子體的酸衍生物可在市場上得到。
自然，當(dāng)X、Y和/或多陽離子體的取代基可能干擾反應(yīng)時，優(yōu)選預(yù)先用適當(dāng)?shù)幕鶊F保護這些取代基，所述基團可以在不影響分子其余部分的情況下接上和消除。按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進行這種保護，特別是根據(jù)T.W.GREENE，有機合成中的保護基，第二版，Wiley-Interscience、McOMIE，有機化學(xué)中的保護基，PlenumPress(1973)、或Philip J Kocienski，保護基，Thieme中描述的方法。
另外，上述制備方法的每一步后視情況可以有按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法分離和純化所得化合物的步驟。
作為本發(fā)明有利的核酸轉(zhuǎn)移試劑的說明性實例，可以提到下列化合物 本發(fā)明的另一個主題涉及含有如上所定義的核酸轉(zhuǎn)移試劑和核酸的組合物。每種成分的量容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所用的轉(zhuǎn)移試劑、核酸、所尋求的應(yīng)用(特別是待轉(zhuǎn)移的細胞類型)來調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明中，“核酸”應(yīng)該理解是脫氧核糖核酸或核糖核酸?？赡苌婕疤烊换蛉斯さ男蛄校貏e是基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、雜合序列或合成或半合成序列、修飾或未修飾的寡核苷酸。這些核酸可以來自人、動物、植物、細菌、病毒等。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，特別是采用文庫篩選、化學(xué)合成，或采用混合方法，其中包括化學(xué)修飾或酶修飾采用篩選文庫所得到的序列，可以得到這些核酸。這些核酸可以采用化學(xué)方法進行修飾。
更特別地涉及脫氧核糖核酸，它們可以是單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸，以及短的寡核苷酸或較長的序列。特別是，這些核酸有利地由質(zhì)粒、載體、附加體、表達盒等組成。這些脫氧核糖核酸可以帶有在靶細胞中有功能或非功能性復(fù)制起點、一個或多個標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)錄或復(fù)制調(diào)控序列、有治療意義的基因、修飾或未修飾的反義序列、與其他細胞組分結(jié)合的區(qū)域等。
優(yōu)選地，核酸含有在調(diào)控序列如在靶細胞中有活性的一個或多個啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子控制下的一個或多個有治療意義的基因。
在本發(fā)明中，關(guān)于“有意義的基因”特別應(yīng)該理解為任何編碼具有治療效果的蛋白產(chǎn)物的基因。如此編碼的蛋白產(chǎn)物特別可以是一種蛋白質(zhì)或一種肽。該蛋白產(chǎn)物相對宿主細胞可以是同源或內(nèi)源的，即當(dāng)細胞沒有任何疾病的情況下在宿主細胞中正常表達的產(chǎn)物。此時，蛋白的表達可以例如克服細胞中的表達不足、或由于突變所表達的蛋白無活性或活性低、或所述蛋白的過量表達。有治療意義的基因還可以編碼穩(wěn)定性提高、活性改變等的細胞蛋白突變體。該蛋白產(chǎn)物還可以是相對靶細胞異源的。此時，所表達的蛋白例如可以補充或帶來細胞中缺乏的活性，使其得以對抗疾病或刺激免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的治療產(chǎn)物中，可以特別舉出酶，血液衍生物，激素，淋巴因子白介素、干擾素、TNF等(FR92/03120)，生長因子，神經(jīng)遞質(zhì)或其前體或合成酶，營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP/多效因子等)，載脂蛋白(ApoAI，ApoAIV，ApoE等，F(xiàn)R93/05125)，營養(yǎng)不良蛋白或小營養(yǎng)不良蛋白(FR91/11947)，與黏稠物阻塞癥相關(guān)的CFTR蛋白，腫瘤抑制基因(p53，Rb，RaplA，DCC，k-rev等，F(xiàn)R93/04745)，編碼凝血相關(guān)因子的基因(第VII、VIII、IX因子)，參與DNA修復(fù)的基因，自殺基因(胸苷激酶，胞嘧啶脫氨酶)，血球蛋白或其他蛋白轉(zhuǎn)運蛋白、代謝-分解代謝酶的基因等。
有治療意義的核酸還可以是反義基因或序列，其在宿主細胞中的表達可以控制細胞基因的表達或mRNA的轉(zhuǎn)錄。這種序列例如可以在靶細胞中轉(zhuǎn)錄成細胞mRNA的互補RNA并因此阻斷其翻譯成蛋白質(zhì)，參見專利EP 140 308。治療基因還包括核酶編碼序列，它們能夠選擇性地破壞靶RNA(EP 321 201)。
如前面所指出的，核酸還可以含有一個或多個編碼抗原性肽的基因，這種肽在人體或動物中能夠造成免疫應(yīng)答。在這種特定實施方式中，本發(fā)明因此使得可能制備用于人體或動物的疫苗或進行免疫治療，尤其是用于抗微生物、病毒或癌的疫苗。特別地涉及對E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP 185 573)、偽狂犬病病毒、“合胞體形成病毒”、其他病毒特異的抗原性肽、或?qū)δ[瘤特異的抗原性肽(EP 259 212)。
優(yōu)選地，核酸還含有允許有治療意義的基因和/或抗原肽編碼基因在細胞或所希望的器官中表達的序列。這可以涉及天然地負責(zé)表達所考慮的基因的序列，只要這些序列在感染的細胞中能夠起作用。還涉及不同來源的序列(負責(zé)表達其他的蛋白質(zhì)，或甚至是合成的)。具體地，可以涉及真核細胞或病毒基因的啟動子序列。例如，可以涉及來自人們希望感染的細胞基因組的啟動子序列。同樣地，可以涉及來自病毒基因組的啟動子序列。為此，例如可以列舉基因E1A、MLP、CMV、RSV等的啟動子。另外，這些表達序列可以通過加入活化序列、調(diào)控序列等進行修飾。也可以涉及可誘導(dǎo)的或可抑制的啟動子。
另外，核酸特別在有治療意義的基因上游還可以含有指導(dǎo)合成的治療產(chǎn)品至靶細胞分泌通道中的信號序列。這種信號序列可以是治療產(chǎn)品的天然信號序列，但也可以涉及任何其他功能性信號序列或人工信號序列。核酸還可以含有將合成的治療產(chǎn)品引導(dǎo)向特定的細胞室的信號序列。
本發(fā)明的組合物還可以含有能夠與本發(fā)明化合物與核酸所形成復(fù)合物結(jié)合并能夠改善其轉(zhuǎn)染能力的一種或多種添加劑。在另外一種實施方式中，本發(fā)明因此涉及含有核酸、如前面定義的核酸轉(zhuǎn)移試劑以及至少一種能夠與轉(zhuǎn)移試劑/核酸復(fù)合物結(jié)合并能夠改善其轉(zhuǎn)染能力的添加劑的組合物。這類添加劑(例如脂類、肽或蛋白質(zhì))對增加化合物轉(zhuǎn)染能力可以很有利。對此，本發(fā)明的組合物可以含有作為添加劑的一種或多種中性脂。
更優(yōu)選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的中性脂是具有兩個脂肪鏈的脂類。特別有利地，使用在生理條件下為兩性離子或無離子電荷的天然或合成脂類。更具體地，它們可以選自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、油酰基棕櫚?；字Ｒ掖及?POPE)、二硬脂酰基-、二棕櫚酰基-、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺以及它們的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂?；视汀⒍；视?、糖基二?；视?、腦苷脂(具體如半乳糖腦苷脂)、鞘脂(具體如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(具體如脫唾液酸GM1和GM2)。
這些不同的脂類采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的經(jīng)典技術(shù)通過合成方法，或者從器官(例如腦)或蛋提取的方法得到。特別是，采用有機溶劑的方法可以提取天然脂類(也可參見Lehninger，Biochemistry)。
最近，申請人已證明，使用直接或間接干預(yù)所述核酸濃集(condensation)的化合物作為添加劑，也是特別有利的，如專利申請WO96/25508中描述的那些。在本發(fā)明組合物中，這樣一種化合物的存在，能夠降低轉(zhuǎn)染試劑的量，在毒理學(xué)方面由此獲得有益結(jié)果，對所述組合物的轉(zhuǎn)染活性不會帶來任何損害。關(guān)于干預(yù)核酸濃集的產(chǎn)品，應(yīng)該定義為直接或非直接地壓緊核酸的化合物。更確切地，這種產(chǎn)品或者直接作用于待轉(zhuǎn)染核酸，或者干預(yù)直接參與這種核酸濃集作用的輔助化合物。優(yōu)選地，直接作用于核酸。例如，預(yù)致密(precompactant)產(chǎn)品可以是任何多陽離子物，例如聚賴氨酸。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，干預(yù)核酸濃集作用的這種產(chǎn)品完全或部分地從魚精蛋白、組蛋白、核仁蛋白和/或它們的衍生物得到。這樣一種產(chǎn)品還可以全部或部分地由肽基元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)構(gòu)成，基元數(shù)可以是2-10。在本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)中，這些基元可以連續(xù)地或不連續(xù)地重復(fù)。因此它們可以通過生物化學(xué)性質(zhì)的連接(例如一個或多個氨基酸)隔開，例如通過一個或多個氨基酸隔開，或通過化學(xué)性質(zhì)的連接隔開。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有每一核酸當(dāng)量為0.01-20當(dāng)量的一種或多種添加劑(摩爾/摩爾)，更優(yōu)選地是0.5-5。
在一種特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物還可以使用一種靶向元件，這些元件能夠使核酸轉(zhuǎn)移定向。這種靶向元件可以是細胞外靶向元件，該元件能夠使DNA向一些細胞類型或一些希望的組織結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移(腫瘤細胞、肝細胞、造血細胞等)。還可以涉及細胞內(nèi)靶向元件，該元件能夠使核酸向一些特別有利的細胞室轉(zhuǎn)移(線粒體、核等)。靶向元件可以與本發(fā)明化合物連接也可與核酸連接，如以前詳細描述過的。當(dāng)靶向元件與通式(I)的核酸轉(zhuǎn)移試劑連接時，優(yōu)選它構(gòu)成取代基X和Y之一。
在本發(fā)明范圍內(nèi)可使用的靶向元件中，可以列舉糖、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、脂類、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、維生素或它們的衍生物。優(yōu)選地，涉及糖、肽或蛋白質(zhì)，如抗體或抗體片段、細胞受體的配體或它們的片段、受體或受體片段等。特別地，可以涉及生長因子受體配體、細胞因子受體配體、細胞凝集素受體配體或具有RGD序列并與如整聯(lián)蛋白之類粘附蛋白的受體有親和力的配體。還可以列舉轉(zhuǎn)鐵蛋白、HDL和LDL的受體，或葉酸轉(zhuǎn)運蛋白。靶向元件還可以是能夠靶向于整聯(lián)蛋白的糖，例如靶向脫唾液酸糖蛋白或唾液酸化衍生物(syalydes)如syalyde Lewis X的受體，或抗體Fab片段，或單鏈抗體(ScFv)。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，例如通過與本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑的疏水部分或與核酸作用部分偶合的方法，或與本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑作用的基團偶合的方法，或與核酸偶合，將靶向元件與本發(fā)明核脂復(fù)合物結(jié)合。根據(jù)一種優(yōu)選方式，所述相互作用可以是離子或共價性質(zhì)。
本發(fā)明還涉及如上定義的化合物用于在體外、體內(nèi)或離體向細胞中轉(zhuǎn)移多核苷酸(更一般地，多陰離子體)的用途。更具體地講，本發(fā)明涉及如上定義的化合物在制備用于治療疾病、特別是由于缺乏一種蛋白或核酸產(chǎn)物引起的疾病的藥物中的用途。所述藥物中含有的多核苷酸編碼所述蛋白或核酸產(chǎn)物，或構(gòu)成所述核酸產(chǎn)物，用于在體內(nèi)或離體治療所述疾病。
對于體內(nèi)應(yīng)用，例如治療方面的應(yīng)用，或為了研究基因的調(diào)節(jié)或建立動物疾病模型，本發(fā)明的組合物經(jīng)配制可以采用局部、皮膚、口、直腸、陰道、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)等方式給藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有下述藥學(xué)上可接受的賦形劑，該賦形劑適用于注射劑，尤其是用于在所希望器官中直接注射的注射劑，或適于用局部方式(皮膚和/或粘膜上)用藥。特別涉及等滲的無菌溶液，或干的尤其是凍干的組合物，這些組合物可根據(jù)情況加入無菌水或生理鹽水配制成注射溶液。注射使用的核酸劑量以及用藥次數(shù)可以根據(jù)不同的參數(shù)而變化，特別是根據(jù)用藥方式、涉及的疾病、待表達基因或所進行治療的時間長短而變化。更具體地對于用藥方式，可以涉及在組織中，例如在腫瘤中，或循環(huán)通路中直接注射，或者處理培養(yǎng)細胞接著采用注射或移植方法將它們再植入體內(nèi)。在本發(fā)明范圍內(nèi)涉及的組織例如是肌肉、皮膚、腦、肺、肝臟、脾、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨、軟骨、胰、腎臟、膀胱、胃、腸、睪丸、卵巢、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼、腺體、結(jié)締組織等。
本發(fā)明的另一主題是動物或人體的治療方法，包括下列步驟(1)將核酸與如上所定義的轉(zhuǎn)移試劑接觸以形成一種復(fù)合物，和(2)將所述人或動物的細胞與(1)中形成的復(fù)合物接觸。
本發(fā)明還涉及向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，該方法包括下述步驟(1)讓核酸與如前面定義的轉(zhuǎn)移試劑接觸，以形成一種復(fù)合物，(2)讓細胞與(1)中生成的復(fù)合物接觸。
細胞與復(fù)合物的接觸可以通過細胞與所述復(fù)合物一起培養(yǎng)(體外或離體應(yīng)用)，或給生物體注入復(fù)合物(體內(nèi)應(yīng)用)來實現(xiàn)。優(yōu)選地，例如106個細胞可在0.01-1000微克核酸存在下進行培養(yǎng)。體內(nèi)使用時，可以使用的核酸劑量例如為0.01-10毫克。
在本發(fā)明組合物還含有一種或多種如前面定義的添加劑的情況下，一種或多種添加劑預(yù)先與本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑混合，和/或與核酸混合。
本發(fā)明因此提供了一種體內(nèi)轉(zhuǎn)移核酸、特別是治療疾病的特別有利的方法，包括體內(nèi)或體外給予編碼適于治療所述疾病的蛋白或可轉(zhuǎn)錄成適于治療所述疾病的核酸的核酸，所述核酸與通式(I)的化合物在以上定義的條件下結(jié)合。
本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移試劑對于向原代細胞或已建立的細胞系中轉(zhuǎn)移核酸特別有用。這特別涉及成纖維細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞(神經(jīng)元、星形細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞)、上皮細胞等，它們呈分化形式或多能形式(前體)。
除了前面的描述，本發(fā)明還包括由下述實施例和附圖得出的其他特點和優(yōu)點，這些實施例和附圖應(yīng)該認為是說明本發(fā)明而不是限制其保護范圍。具體地，申請人非限制性地提出可用于制備本發(fā)明通式(I)轉(zhuǎn)移試劑的各種操作方案以及反應(yīng)中間體。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在這些方案和/或中間體的啟示下能夠找到類似的方法，以便得到這些相同的化合物。對于合成通式(I)中的多陽離子體R，本領(lǐng)域技術(shù)人員似還可以參考上文引述的各種專利申請中描述的合成(WO96/17823、WO 97/18185、WO 97/31935等)。
附1用于細胞中DNA轉(zhuǎn)移實驗的質(zhì)粒pXL2774的示意圖。圖2在無輔助脂質(zhì)、或存在膽固醇或存在DOPE下從本發(fā)明化合物2形成的復(fù)合物在HeLa細胞中的體外基因轉(zhuǎn)移活性。縱坐標(biāo)表示螢光素酶的表達，pg/孔。橫坐標(biāo)表示轉(zhuǎn)移試劑/DNA的比值，nmol/ug DNA。圖3在小鼠后脛骨肌中直接注射在DOPE存在下從本發(fā)明化合物2(1∶1)形成的復(fù)合物后的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移活性?？v坐標(biāo)表示螢光素酶的表達，pg/肌肉。橫坐標(biāo)表示化合物2/DNA的比值，nmol/ug DNA。
-層析技術(shù)·用薄層層析(TLC)跟蹤反應(yīng)的動力學(xué)過程，用含有熒光指示劑的硅膠作為層析載體。通過噴灑茴香醛的醇溶液顯示層析結(jié)果。
·用硅膠60(0.05-0.02mm)作為固定相在壓縮空氣下進行柱層析。所用的流動相根據(jù)合成的類型而不同(中壓層析)。
·在裝有Applied Biosystem的C4型分析柱(長3厘米直徑0.46厘米的不銹鋼柱“Brownlee Columns”)和“Waters 486”220nm檢測器的Waters LC 4000儀器進行HPLC分析(高效液相層析)。固定相為7微米的aquapore buty，流動相為去離子水(2500毫升)或加有三氟乙酸(2.5毫升)的乙腈(2500毫升)。流量為每分鐘1毫升。B\轉(zhuǎn)染試劑的合成實施例1(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?15-十五烷基-16-十八烷基α-D-吡喃甘露糖苷(化合物1)的合成a)3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]乙酸(FRM 375)的合成向精胺(5g；24.96mmol)在甲醇(125ml)中的溶液加入氰基硼氫化鈉NaBH3CN(0.548g；8.74mmol)。然后將該溶液進行劇烈攪拌。通過容量瓶在100分鐘內(nèi)加入二羥乙酸(2.34g；25.46mmol)在甲醇(80ml)中的溶液。過夜后，向混合物中加入三乙胺(3.86ml；27.71mmol)和溶解在四氫呋喃(55ml)中的二碳酸二叔丁酯(27.67g；129.79mmol)。過夜后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后用乙酸乙酯(63ml)溶解，用硫酸氫鉀和鹽水洗滌。然后用硫酸鎂干燥并濃縮。所得產(chǎn)物經(jīng)層析純化(CH2Cl2/MeOH 9∶1)。收率為30％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.42(s，36H，C(CH3)3)，1.45(m，4H，CH2)，1.60(m，4H，CH2)，3.04-3.33(m，12H，CH2)，3.91(s，2H，NCH2COO)。b)15-羥基十五烷酸甲酯的合成向10g十五烷酸內(nèi)酯(41.60mmol)在41.60毫升甲醇中的溶液在0℃下加入6.66毫升2N(13.31mmol)甲醇鈉。9小時后，加入9.24毫升乙酸并攪拌15分鐘。然后將該溶液真空蒸發(fā)至干，隨后用二氯甲烷溶解，用碳酸氫鈉洗滌。用硫酸鎂干燥所得的有機相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑。在己烷/乙酸乙酯6∶4中純化。得到1-羥基十五烷酸甲酯，收率為80％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.26(m，12H，(CH2)10)，1.5-1.6(m，4H，H-2和H-13)，2.30(t，2H，J＝7.60Hz，H-14)，3.64(t，1H，J＝5.84Hz，H-1)，3.67(s，3H，H-16)。c)十五烷酸甲酯2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成0℃下30分鐘內(nèi)將5.26毫升氯化錫(44.94mmol)加入在8.72g五乙?；事短?22.47mmol)在56毫升二氯甲烷中的溶液中。然后加入7.34g前文a)中得到的1-羥基-十五烷酸甲酯(26.96mmol)。2小時后，用乙醚稀釋反應(yīng)混合物并倒入在磷酸氫鈉溶液(NaHPO4)中。水層用乙醚萃取，有機相相繼用碳酸鈉溶液、鹽水洗滌，然后用硫酸鎂干燥。真空蒸發(fā)至干后所得產(chǎn)物經(jīng)中壓層析純化，用庚烷/乙酸乙酯7∶3洗脫。收率為53％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.26(m，20H，(CH2)10)，1.59(m，4H，OCH2CH2和H-13)，2.01，2.05，2.12和2.17(s，3H，OCOCH3)，2.29(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3,40(m，1H，J＝7.89Hz，OCHaCH2)，3.66(m，1H，J＝7.89Hz，OCHbCH2)，3.67(s，3H，COOCH3)，4.05(ddd，1H，J＝9.56Hz和5.57Hz，H-5)，4.1(dd，1H，J＝5.57Hz和12.32Hz，H-6a)，4.29(dd，1H，J＝5.57Hz和12.32Hz，H-6b)，4.8(d，1H，J＝1.85Hz，H-1)，5.23(dd，1H，J＝1.85Hz和3.23Hz，H-2)，5.27(dd，1H，J＝9.97Hz和9.56Hz，H-4)，5.35(dd，1H，J＝9.97Hz和3.23Hz，H-3)。d)十五烷酸甲酯α-D-吡喃甘露糖苷的合成3.63g上步所得產(chǎn)物(6.01mmol)在12毫升甲醇中的溶液用3毫升2N甲醇鈉(6.01mmol)處理。反應(yīng)結(jié)束時用Amberlite IR120樹脂(1當(dāng)量，重量/體積)中和，過濾并真空蒸發(fā)至干。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.28(m，20H，(CH2)10)，1.59(m，4H，OCH2CH2和H-13)，2.34(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3.41(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.74(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.67(s，3H，CH3OCO)，3.5-3.82(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5和H-6)，4.75(d，1H，J＝1.82Hz，H-1)。e)十五烷酸甲酯2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成向2g(4.56mmol)上步d)所得產(chǎn)物在20毫升無水二甲基甲酰胺(DMF)中相繼加入4.54g碘化鉀(27.36mmol)、1.09g 60％氫化鈉(27.36mmol)和3.25毫升芐基溴(27.36mmol)。12小時后，加入18.24毫升氯化銨飽和溶液，保持攪拌10分鐘。然后用水稀釋，有機相用乙酸乙酯萃取。然后用水和鹽水洗滌，最后用硫酸鎂干燥。另外在用硫代硫酸鈉飽和溶液洗滌，以消除碘離子。真空蒸發(fā)，并在庚烷/乙酸乙酯9∶1混合物中純化。所獲產(chǎn)物的收率為60％。1H NMR(CDCl3)d(ppm)1.28(m，20H，(CH2)10)，1.49(m，2H，OCH2CH2)，1.59(m，2H，H-13)，2.31(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.67(s，3H，CH3OCO)，3.75(m，1H，J＝8.97Hz和6.21Hz，H-5)，3.78(s，2H，CH2Phe)，3.90(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6a)，3.97(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6b)，4.07(s，2H，CH2Phe)，4.52(dd，J＝2.91Hz和7.83Hz，H-3)，4.57(s，2H，CH2Phe)，4.63(s，2H，CH2Phe)，4.69(dd，1H，J＝2.52Hz和2.91Hz，H-2)，4.74(1H，J＝2.52Hz，H-1)，4.85(dd，1H，J＝7.83Hz和8.97Hz，H-4)，7.35(m，20H，Phe)。f)十五烷酸2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成向0.50g(0.73mmol)上步e)所得產(chǎn)物在7毫升甲醇中的溶液加入4.68毫升25％氫氧化鈉溶液。將反應(yīng)化合物加熱回流30分鐘。然后用5％的鹽酸溶液在冷卻下中和。用乙酸乙酯萃取有機相，并真空蒸發(fā)至干。在庚烷/乙酸乙酯4∶6混合物中純化。以62％的收率獲得產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)d(ppm)1.28(m，20H，(CH2)10)，1.49(m，2H，OCH2CH2)，1.59(m，2H，H-13)，2.34(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.75(m，1H，J＝8.97Hz和6.21Hz，H-5)，3.78(s，2H，CH2Phe)，3.90(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6a)，3.97(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6b)，4.07(s，2H，CH2Phe)，4.52(dd，J＝2.91Hz和7.83Hz，H-3)，4.57(s，2H，CH2Phe)，4.63(s，2H，CH2Phe)，4.69(dd，1H，J＝2.52Hz和2.91Hz，H-2)，4.74(1H，J＝2.52Hz，H-1)，4.85(dd，1H，J＝7.83Hz和8.97Hz，H-4)，7.35(m，20H，Phe)。g)N-十八烷基-15-氨基甲?；?十五烷基2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成向0.29g(0.37mmol)上步f)所得產(chǎn)物在5毫升氯仿中的溶液中相繼加入0.23g BOP(0.52mmol)、0.21毫升二異丙基乙基胺(1.48mmol)和0.12g十八烷基胺(0.44mmol)。反應(yīng)結(jié)束時用二氯甲烷稀釋，用水洗滌。然后用硫酸鎂干燥并真空蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物經(jīng)中壓層析純化，用庚烷/乙酸乙酯6∶4混合物洗脫。以98％的收率獲得產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.47(m，4H，OCH2CH2和H-17)，1.58(m，2H，H-13)，2.13(t，2H，J＝7.92Hz，H-14)，3.23(m，2H，H-16)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.75(m，1H，J＝8.97Hz和6.21Hz，H-5)，3.78(s，2H，CH2Phe)，3.90(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6a)，3.97(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6b)，4.07(s，2H，CH2Phe)，4.52(dd，J＝2.91Hz和7.83Hz，H-3)，4.57(s，2H，CH2Phe)，4.63(s，2H，CH2Phe)，4.69(dd，1H，J＝2.52Hz和2.91Hz，H-2)，4.74(1H，J＝2.52Hz，H-1)，4.85(dd，1H，J＝7.83Hz和8.97Hz，H-4)，5，37(寬帶，1H，HNCO)，7.35(m，20H，Phe)。h)15-十八烷基氨基-十五烷基2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成向在15毫升無水四氫呋喃(THF)中的0.77g(0.75mmol)上步g)所得產(chǎn)物加入0.056g氫化鋰鋁AlLiH4(1.50mmol)。加熱回流10小時。然后將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，加入56微升水，10分鐘后加入112微升2N氫氧化鈉，最后再過10分鐘加入56微升水。過濾并真空蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物在二氯甲烷/甲醇/28％氨水的9∶2∶0.5混合物中純化。以86％的收率得到產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.4-1.6(m，9H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17和NH)，2.57(t，4H，J＝7.92Hz，H-15和H-16)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.75(m，1H，J＝8.97Hz和6.21Hz，H-5)，3.78(s，2H，CH2Phe)，3.90(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6a)，3.97(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6b)，4.07(s，2H，CH2Phe)，4.52(dd，J＝2,91Hz和7.83Hz，H-3)，4.57(s，2H，CH2Phe)，4.63(s，2H，CH2Phe)，4.69(dd，1H，J＝2.52Hz和2.91Hz，H-2)，4.74(1H，J＝2.52Hz，H-1)，4.85(dd，1H，J＝7.83Hz和8.97Hz，H-4)，7.35(m，20H，Phe)。i)(3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-吡喃甘露糖苷的合成向0.63g(0.61mmol)上步h)所得產(chǎn)物在10毫升氯仿中的溶液中加入0.38g BOP(0.85mmol)、0.425毫升二異丙基乙基胺(2.44mmol)和0.48g步驟a)所得3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]-乙酸(FRM 375)(0.73mmol)。4小時后用二氯甲烷稀釋，用水洗滌。用硫酸鎂干燥并真空蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物經(jīng)中壓層析純化，用庚烷/乙酸乙酯6∶4混合物洗脫。以80％的收率獲得產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.4-1.6(m，17H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17，H-37，H-40，H-41和H-44)，1.46(m，36H，Boc)，2.8-2.9(m，6H，H-15，H-16和H-35)，3.09-3.33(m，12H，H-36，H-38，H-39，H-42，H-43和H-45)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.75(m，1H，J-8.97Hz和6.21Hz，H-5)，3.78(s，2H，CH2Phe)，3.90(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6a)，3.97(dd，1H，J＝6.21Hz和J＝11.82Hz，H-6b)，4.07(s，2H，CH2Phe)，4.52(dd，J＝2,91Hz和7.83Hz，H-3)，4.57(s，2H，CH2Phe)，4.63(s，2H，CH2Phe)，4.69(dd，1H，J＝2.52Hz和2.91Hz，H-2)，4.74(1H，J＝2.52Hz，H-1)，4.85(dd，1H，J＝7.83Hz和8.97Hz，H-4)，7.35(m，18H，Phe)。j)(3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基α-D-吡喃甘露糖苷的合成向0.63g(0.38mmol)上步i)所得產(chǎn)物在5毫升甲醇中的溶液加入10％炭載鈀(0.027g)。在室溫氫氣壓力下攪拌該溶液。6小時后過濾然后真空蒸發(fā)至干。該反應(yīng)是定量的。1H NMR(CD3OD)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.4-1.6(m，17H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17，H-37，H-40，H-41和H-44)，1.46(m，36H，Boc)，2.8-2.9(m，6H，H-15，H-16和H-35)，3.09-3.33(m，12H，H-36，H-38，H-39，H-42，H-43和H-45)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.5-3.82(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5和H-6)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，4.72(1H，J＝2.52Hz，H-1)。k)(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基α-D-吡喃甘露糖苷(化合物1)的合成向0.37g(0.28mmol)上步j(luò))所得產(chǎn)物中加入21.50毫升蒸餾的四氫呋喃(TFA)。1小時后將反應(yīng)混合物冷卻下濃縮并冷凍干燥。如“材料與方法”部分所述經(jīng)HPLC在甲醇溶液中驗證產(chǎn)物的純度。1H NMR(CD3OD)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，14H，(CH2)25)，1.4-1.6(m，17H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17，H-37，H-40，H-41和H-44)，2.8-2.9(m，6H，H-15，H-16和H-35)，2.92(m，2H，H-45)，2.92-3.17(m，12H，H-36，H-38，H-39，H-42，H-43)，3.34(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.5-3.82(m，6H，H-2，H-3，H-4，H-5和H-6)，3.63(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，4.72(1H，J＝2.02Hz，H-1)。實施例2(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷(化合物2)的合成a)3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]乙酸(FRM 375)的合成向精胺(5g；24.96mmol)在甲醇(125ml)中的溶液加入氰基硼氫化鈉NaBH3CN(0.548g；8.74mmol)。然后將該溶液進行劇烈攪拌。通過容量瓶在100分鐘內(nèi)加入二羥乙酸(2.34g；25.46mmol)在甲醇(80ml)中的溶液。過夜后，向混合物中加入三乙胺(3.86ml；27.71mmol)和溶解在四氫呋喃(55ml)中的二碳酸二叔丁酯(27.67g；129.79mmol)。過夜后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后用乙酸乙酯(63ml)溶解，用硫酸氫鉀和鹽水洗滌。然后用硫酸鎂干燥并濃縮。所得產(chǎn)物經(jīng)層析純化(CH2Cl2/MeOH 9∶1)。收率為30％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.42(s，36H，C(CH3)3)，1.45(m，4H，CH2)，1,60(m，4H，CH2)，3.04-3.33(m，12H，CH2)，3.91(s，2H，NCH2COO)。b)15-羥基-十五烷酸甲酯的合成向10g十五烷酸內(nèi)酯(41.60mmol)在41.60毫升甲醇中的溶液在0℃下加入6.66毫升2N(13.31mmol)甲醇鈉。9小時后，加入9.24毫升乙酸并攪拌15分鐘。然后將該溶液真空蒸發(fā)至干，隨后用二氯甲烷溶解，用碳酸氫鈉洗滌。用硫酸鎂干燥所得的有機相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑。在己烷/乙酸乙酯6∶4中純化。得到1-羥基十五烷酸甲酯，收率為80％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.26(m，12H，(CH2)10)，1.5-1.6(m，4H，H-2和H-13)，2.30(t，2H，J＝7.60Hz，H-14)，3.64(t，1H，J＝5.84Hz，H-1)，3.67(s，3H，H-16)。c)十五烷酸甲酯2，3，4-三-O-乙?；?6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷的合成0℃下30分鐘內(nèi)將2.49毫升氯化錫(21.30mmol)加入在3.55g四乙?；罄钐?10.65mmol)在27毫升二氯甲烷中的溶液中。然后加入3.48g前文中得到的1-羥基-十五烷酸甲酯(12.78mmol)。2小時后，用乙醚稀釋反應(yīng)混合物并倒入在磷酸鈉溶液(Na2PO4)中。水層用乙醚萃取，有機相相繼用碳酸鈉溶液、鹽水洗滌，然后用硫酸鎂干燥。真空蒸發(fā)至干，經(jīng)中壓層析純化，用庚烷/乙酸乙酯7∶3洗脫。以收率53％得到產(chǎn)物。1H NMR(CDOD3)δ(ppm)1.20(d，3H，J＝6.45Hz，H-6)，1.26(m，20H，(CH2)10)，1.59(m，4H，OCH2CH2和H-13)，1.98，2.04和2.16(s，3H，OCOCH3)，2.29(t，2H，J＝7,62Hz，H-14)，3,40(m，1H，J＝6,71Hz，OCHaCH2)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.67(s，3H，COOCH3)，3.88(m，1H，J＝6.45Hz和9.97Hz，H-5)，4.70(d，1H，J＝1.72Hz，H-1)，5.06(dd，1H，J＝9,97Hz和9.97Hz，H-4)，5.22(dd，1H，J＝1.72Hz和3.52Hz，H-2)，5.30(dd，1H，J＝3.52Hz和9.97Hz，H-3)。d)十五烷酸甲酯α-脫氧-L-6-吡喃甘露糖苷的合成5.08g上步所得產(chǎn)物(9.36mmol)在20毫升甲醇中的溶液用9.34毫升2N甲醇鈉(18.68mmol)處理。反應(yīng)結(jié)束時用Amberlite IR120樹脂中和反應(yīng)混合物，過濾并真空蒸發(fā)至干。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.20(d，3H，J＝6.45Hz，H-6)，1.26(m，20H，(CH2)10)，1.59(m，4H，OCH2CH2和H-13)，2.29(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.67(s，3H，CH3OCO)，3.6-3.9(m，4H，H-2，H-3，H-4和H-5)，4.70(d，1H，J＝7.72Hz，H-1)。e)十五烷酸甲酯2，3，4-三-O-芐基-6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷的合成向在30毫升無水二甲基甲酰胺(DMF)中的2.09g(5.00mmol)上步d)所得產(chǎn)物相繼加入3.32g碘化鉀(20.00mmol)、0.80g 60％氫化鈉(20.00mmol)和2.38毫升芐基溴(20.00mmol)。12小時后，加入20毫升氯化銨飽和溶液，保持攪拌10分鐘。然后用水稀釋，有機相用乙酸乙酯萃取。然后用水和鹽水洗滌，最后用硫酸鎂干燥。另外再用硫代硫酸鈉飽和溶液洗滌，以消除碘離子。真空蒸發(fā)，并在庚烷/乙酸乙酯9∶1混合物中純化。所獲產(chǎn)物的收率為60％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.28(m，20H，(CH2)10)，1.33(d，3H，J＝6.21Hz，H-6)，1.59(m，4H，OCH2CH2和H-13)，2.31(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.61(dd，1H，J＝8.96Hz和9.5Hz，H-4)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.67(s，3H，CH3OCO)，3.68(m，1H，J＝9.5Hz和6.21Hz，H-5)，3.75(dd，1H，J＝2.01Hz和3.02Hz，H-2)，3.88(dd，J＝3.02Hz和8.96Hz，H-3)，4.64(s，6H，CH2Phe)，4.73(1H，J＝2.01Hz，H-1)，7.35(m，15H，Phe)。f)十五烷酸2，3，4-三-O-芐基-6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷向0.50g(0.73mmol)上步e)所得產(chǎn)物在7毫升甲醇中的溶液加入4.68毫升25％氫氧化鈉溶液。將反應(yīng)化合物加熱回流30分鐘。然后用5％的鹽酸溶液在冷卻下中和。用乙酸乙酯萃取有機相，并真空蒸發(fā)至干。在庚烷/乙酸乙酯4∶6混合物中純化。以72％的收率獲得產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.28(m，20H，(CH2)10)，1.33(d，3H，J＝6.21Hz，H-6)，1.59(m，4H，OCH2CH2和H-13)，2.34(t，2H，J＝7.62Hz，H-14)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.61(dd，1H，J＝8.96Hz和9.5Hz，H-4)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.68(m，1H，J＝9.5Hz和6.21Hz，H-5)，3.75(dd，1H，J＝2.01Hz和3.02Hz，H-2)，3.88(dd，J＝3,02Hz和8.96Hz，H-3)，4.64(s，6H，CH2Phe)，4.73(1H，J＝2.01Hz，H-1)，7.35(m，20H，Phe)。g)N-十八烷基-15-氨基甲?；?十五烷基2，3，4-三-O-芐基-6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷的合成向0.70g(1.04mmol)上步f)所得產(chǎn)物在13毫升氯仿中的溶液中相繼加入0.69g BOP(1.56mmol)、0.72毫升二異丙基乙基胺(4.16mmol)和0.34g十八烷基胺(1.25mmol)。反應(yīng)結(jié)束時用二氯甲烷稀釋，用水洗滌。然后用硫酸鎂干燥并真空蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物經(jīng)中壓層析純化，用庚烷/乙酸乙酯6∶4混合物洗脫。以84％的收率獲得產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm 0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.33(d，3H，J＝6.21Hz，H-6)，1.47(m，4H，OCH2CH2和H-17)，1.58(m，2H，H-13)，2.13(t，2H，J＝7.92Hz，H-14)，3.23(m，2H，H-16)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.61(dd，1H，J＝8.96Hz和9.5Hz，H-4)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.68(m，1H，J＝9.5Hz和6.21Hz，H-5)，3.75(dd，1H，J＝2.01Hz和3.02Hz，H-2)，3.88(dd，J＝3,02Hz和8.96Hz，H-3)，4.64(s，6H，CH2Phe)，4.73(1H，J＝2.01Hz，H-1)，5,37(寬帶，1H，HNCO)，7.35(m，15H，Phe)。h)15-十八烷基-氨基-十五烷基2，3，4-三-O-芐基-6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷的合成向在15毫升無水四氫呋喃(THF)中的0.81g(086mmol)上步g)所得產(chǎn)物加入0.065g氫化鋰鋁AlLiH4(1.72mmol)，加熱回流10小時。然后將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，加入65微升水，10分鐘后加入130微升2N氫氧化鈉，最后再過10分鐘加入65微升水。過濾并真空蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物在二氯甲烷/甲醇/28％氨水的9∶2∶0.5混合物中純化。以93％的收率得到產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.33(d，3H，J＝6.21Hz，H-6)，1.4-1.6(m，9H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17和NH)，2.57(t，4H，J＝7.92Hz，H-15和H-16)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.61(dd，1H，J＝8.96Hz和9.5Hz，H-4)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.68(m，1H，J＝9.5Hz和6.21Hz，H-5)，3.75(dd，1H，J＝2.01Hz和3.02Hz，H-2)，3.88(dd，J＝3.02Hz和8.96Hz，H-3)，4.64(s，6H，CH2Phe)，4,73(1H，J＝2.01Hz，H-1)，7.35(m，15H，Phe)。i)(3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基2，3，4-三-O-芐基-6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷的合成向0.78g(0.86mmol)上步h)所得產(chǎn)物在7毫升氯仿中的溶液中加入0.53g BOP(1.20mmol)、0.30毫升二異丙基乙基胺(1.72mmol)和0.62g步驟a)所得FRM 375(0.95mmol)。4小時后用二氯甲烷稀釋，用水洗滌。用硫酸鎂干燥并真空蒸發(fā)至干。所得產(chǎn)物經(jīng)“快速”層析純化，用庚烷/乙酸乙酯6∶4混合物洗脫。以72％的收率獲得產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.27(m，50H，(CH2)25)，1.33(d，3H，J＝6.21Hz，H-6)，1.4-1.6(m，17H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17，H-37，H-40，H-41和H-44)，1.46(m，36H，Boc)，2.8-2.9(m，6H，H-15，H-16和H-35)，3.09-3.33(m，12H，H-36，H-38，H-39，H-42，H-43和H-45)，3.40(m，1H，J＝6,71Hz，OCHaCH2)，3.65(s，2H，CH2Phe)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.68(m，1H，J＝9.5Hz和6.21Hz，H-5)，3.99(s，2H，CH2Phe)，4.02(dd，1H，J＝8.96Hz和9.5Hz，H-4)，4.32(s，2H，CH2Phe)，4.57(dd，1H，J＝2.01Hz和3.02Hz，H-2)，4.73(1H，J＝2.01Hz，H-1)，4.82(dd，J＝3.02Hz和8.96Hz，H-3)，7.35(m，18H，Phe)。j)(3-[4-(3-叔丁氧羰基-氨基-丙基-叔丁氧羰基-氨基)-丁基-叔丁氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲酰基)-15-十五烷基-16-十八烷基6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷的合成向0.74g(0.48mmol)上步i)所得產(chǎn)物在10毫升甲醇中的溶液加入10％炭載鈀(0.034g)。在室溫氫氣壓力下攪拌該溶液。4小時后過濾然后真空蒸發(fā)至干。該反應(yīng)是定量的。1H NMR(CD3OD)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.20(d，3H，J＝6.45Hz，H-6)，1.27(m，14H，(CH2)25)，1.4-1.6(m，17H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17，H-37，H-40，H-41和H-44)，1.46(m，36H，Boc)，2.8-2.9(m，6H，H-15，H-16和H-35)，3.09-3.33(m，12H，H-36，H-38，H-39，H-42，H-43和H-45)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.6-3.9(m，4H，H-2，H-3，H-4和H-5)，4.73(1H，J＝2.01Hz，H-1).k)(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基]-亞甲基-氨基甲酰基)-15-十五烷基-16-十八烷基6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖苷(化合物2)的合成向0.40g(0.31mmol)上步j(luò))所得產(chǎn)物中加入24毫升蒸餾的四氫呋喃(TFA)。1小時后將反應(yīng)混合物冷卻下濃縮并冷凍干燥。經(jīng)HPLC在甲醇溶液中驗證產(chǎn)物的純度。1H NMR(CD3OD)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.36Hz，H-33)，1.20(d，3H，J＝6.45Hz，H-6’)，1.27(m，14H，(CH2)25)，1.4-1.6(m，17H，OCH2CH2，H-17，H-14，H-17，H-37，H-40，H-41和H-44)，2.8-2.9(m，6H，H-15，H-16和H-35)，2.92(m，2H，H-45)，2.92-3.17(m，12H，H-36，H-38，H-39，H-42，H-43)，3.40(m，1H，J＝6.71Hz，OCHaCH2)，3.66(m，1H，J＝6.71Hz，OCHbCH2)，3.6-3.9(m，4H，H-2，H-3，H-4和H-5)，4.73(1H，J＝2.01Hz，H-1)。實施例31-(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基-丙基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷(化合物3)的合成a){3-[4-(3-芐氧羰基-氨基-丙基-芐氧羰基-氨基)-丁基-芐氧羰基-氨基]-丙基氨基}乙酸的合成向精胺(10g；49.91mmol)在甲醇(200ml)中的溶液加入氰基硼氫化鈉NaBH3CN(1.10g；17.47mmol)。然后將該溶液進行劇烈攪拌。通過容量瓶在100分鐘內(nèi)加入二羥乙酸(4.59g；49.91mmol)在甲醇(120ml)中的溶液。過夜后，將反應(yīng)混合物中置于冰浴中，相繼加入2N氫氧化鈉(34ml)和分十份加入的氯甲酸芐酯(14.25ml；99.82mmol)。溫度保持在5-10℃，劇烈混和。室溫下2小時后，用乙醚萃取混合物，用5N鹽酸溶液中和。然后，有機相用硫酸鎂干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。所得產(chǎn)物經(jīng)層析純化(100％CH2Cl2，然后CH2Cl2/MeOH 9∶1)。收率為52％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.28(t，4H，CH2)，1.60(m，4H，CH2)，3.04-3.33(m，12H，CH2)，3.49(s，2H，NCH2COO)，5.07(s，8H，CH2)，7.27(m，20H，Phe)。b)15-羥基十五烷酸甲酯的合成向10g十五烷酸內(nèi)酯(41.60mmol)在41.60毫升甲醇中的溶液在0℃下加入6.656毫升2N(13.31mmol)甲醇鈉。9小時后，加入9.24毫升乙酸并攪拌15分鐘。然后將該溶液真空蒸發(fā)至干，隨后用二氯甲烷溶解，用碳酸氫鈉洗滌。傾析后，用硫酸鎂干燥所得的有機相并蒸發(fā)。在己烷/乙酸乙酯6∶4中純化，得到15-羥基十五烷酸甲酯，收率為80％。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)1.29(m，20H，(CH2)10)，1.5-1.6(m，4H，H-2和H-13)，2.30(t，2H，J＝7.60Hz，H-14)，3.64(t，1H，J＝5.84Hz，H-1)，3.67(s，3H，H-16)。c)N-十八烷基-15-羥基十五烷酸酰胺的合成真空下，于150℃將10克上步b)獲得的15-羥基十五烷酸甲酯(36.85mmol)和19.86克十八烷基胺(73.70mmol)熔化。24小時后，將混合物冷卻并用二氯甲烷稀釋。形成的沉淀用Buchner濾器過濾。然后將所得固體在甲醇中重結(jié)晶，以100％的收率獲得N-十八烷基-15-羥基十五烷酸酰胺。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.26(m，54H，(CH2)27)，1.4-1.6(m，6H，H-2，H-13和H-17)，2.30(t，2H，J＝7.60Hz，H-14)，3.25(m，2H，H-16)，3.64(t，2H，J＝5.84Hz，H-1)，5.39(寬帶，NHCO)。13C NMR(CDCl3)δ(ppm)14.48(C-33)，25.3和26.3(C-2和C-13)，29.72((CH2)27))，36.7和34.8(C-14和C-16)，63.6(C-1)，174.31(CO)。d)15-十八烷基氨基-十五烷醇的合成向20g上步c)獲得的N-十八烷基-15-羥基十五烷酸酰胺(39.22mmol)在無水四氫呋喃(250ml)中的溶液中，加入2.98g氫化鋰鋁LiAlH4(78.44mmol)?；亓鞣磻?yīng)10小時。冷卻反應(yīng)物后，相繼加入水(2.98ml)和2N氫氧化鈉(2.98ml)。10分鐘后，再加入水(2.98ml)。用Buchner過濾所形成的沉淀，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到15-十八烷基氨基-十五烷醇。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.26(m，54H，(CH2)27)，1.43-1.59(m，7H，H-2，H-14，H-17和寬帶NH)，1.5-1.6(m，4H，H-2和H-13)，2.60(t，4H，J＝6.50Hz，H-15和H-16)，3.64(t，2H，J＝5.84Hz，H-1)。13C NMR(CDCl3)δ(ppm)14.48(C-33)，25.3和26.3(C-2和C-14)，29.72((CH2)27))，51.7(C-15和C-16)，63.6(C-1)。e)N-[芐氧羰基]-15-十八烷基氨基-十五烷醇的合成向冷卻至0℃的上步d)所得15-十八烷基氨基-十五烷醇(13.71g；27.63mmol)和三乙胺(7.7ml；55.26mmol)在無水二氯甲烷(150ml)中的溶液中滴加7.89ml氯甲酸芐基酯(55.26mmol)。10分鐘后，檢驗混合物的pH值。然后室溫下將反應(yīng)混合物靜置過夜。然后用水洗滌溶液，用硫酸鎂(MgSO4)干燥并濃縮。層析純化反應(yīng)混合物(庚烷/AcOEt 6∶4)。以70％的收率得到N-[芐基氧羰基]-15-十八烷基氨基-十五烷醇。1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.88(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.26(m，54H，(CH2)27)，1.43-1.59(m，6H，H-2，H-14，H-17)，3.20-3.22(m，4H，H-15和H-16)，3.64(t，2H，J＝5.84Hz，H-1)，5.12(s，2H，OCH2Phe)，7.34(m，5H，Phe).13C NMR(CDCl3)δ(ppm)14.48(C-33)，25.8，26.9和31.94(C-2，C-14和C-17)，29.72((CH2)27))，47.26-48.04(C-15和C-16)，63.08(C-1)，66.79(OCH2)，128.40(Phe).f)15-[N-(芐氧羰基)-十八烷基氨基]-十五烷基2，3，4-三-O-乙?；?6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷將1.5g四乙?；?4.52mmol)與0.634ml四氯化錫(5.42mmol)在無水乙腈(50ml)中反應(yīng)30分鐘。然后加入3.132g上步e)獲得的N-[芐氧羰基]-15-十八烷基氨基-十五烷醇(4.97mmol)。5小時后，萃取反應(yīng)混合物，所得產(chǎn)物經(jīng)層析純化(庚烷/乙酸乙酯6∶4)。收率為69％。1H NMRδ(ppm)0.87(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.2(d，3H，J＝6,51Hz，H-6)，1,25(m，54H，(CH2)27)，1.52(m，6H，OCH2CH2，H-14和H-17)，1.95，2.05和2.15(s，3H，OCOCH3)，3.14-3.25(m，4H，H-15和H-16)，3.44(m，1H，OCHaCH2)，3.63(m，1H，OCHbCH2)，3.79(m，1H，H-5)，4.41(d，1H，J＝7.98Hz，H-1)，4.99(dd，1H，J＝3.52Hz和10.46Hz，H-3)，5.09(s，2H，OCH2Phe)，5.16(dd，1H，J＝7.98Hz和10.46Hz，H-2)，5.23(dd，J＝3.52Hz和3.37Hz，H-4)，7.32(m，5H，Phe).13C NMR(CDCl3)δ(ppm)14.68(C-33)，17.31(C-2)，20.75(CH3COO)，27.29(C-6)，29.72((CH2)27))，25.89-31.98(OCH2CH2，C-14，C-17)，47.25-48.04(C-15和C-16)，66.91(CH2Phe)，69.63(OCH2CH2)，69.45(C-2)，70.57(C-5)，70.85(C-4)，71.44(C-3)，96.25(C-1)，128.43(Phe)，156.21 et171.30(CO)。g)15-十八烷基氨基-十五烷基2，3，4-三-O-乙酰基-6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷的合成向上步f)所得15-[N-(芐基氧羰基)-十八烷基氨基]-十五烷基2，3，4-三-O-乙?；?6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷(2.72g；4.23mmol)在甲醇(100ml)中的溶液中，在氫氣壓力下加入10％鈀/活性炭(0.5g)。該反應(yīng)是定量的。1H NMRδ(ppm)0.87(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.2(d，3H，J＝6.51Hz，H-6)，1.25(m，54H，(CH2)27)，1.52(m，6H，OCH2CH2，H-14和H-17)，1.88-1.93(bande NH)，1.95，2.05和2.15(s，3H，OCOCH3)，2.64(m，4H，H-15和H-16)，3.46(m，1H，OCHaCH2)，3.63(m，IH，OCHbCH2)，3.79(m，1H，H-5)，4.41(d，1H，J＝7.98Hz，H-1)，4.99(dd，1H，J＝3.52Hz和10.46Hz，H-3)，5.16(dd，1H，J＝7.98Hz和10.46Hz，H-2)，5.23(dd，J＝3,52Hz和3.37Hz，H-4).13C NMR(CDCl3)δ(ppm)14.68(C-33)，17.31(C-2)，20.75(CH3COO)，27.29(C-6)，29.72((CH2)27))，25.89-31.98(OCH2CH2，C-14，C-17)，47.75-48.04(C-15和C-16)，69.63(OCH2CH2)，69.45(C-2)，70.57(C-5)，70.85(C-4)，71.44(C-3)，96.25(C-1)，171.30(CO)。h)(3-[4-(3-(氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基-丙基-芐氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五烷基-16-十八烷基2，3，4-三-O-乙?；?6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷的合成向0.60g上步g)所得化合物(0.94mmol)在氯仿(15ml)中的溶液中，相繼加入二異丙基乙基胺(0.491ml；2.82mmol)、BOP(0.457g；1.03mmol)和上步a)獲得的{3-[4-(3-芐基氧羰基-氨基-丙基-芐氧羰基-氨基)-丁基-芐氧羰基-氨基]-丙基氨基}-乙酸(0.748g；0.94mmol)。生成的油經(jīng)層析純化(庚烷/乙酸乙酯4∶6)，得到45％收率的(3-[4-(3-(氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基-丙基-芐氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五碳烷基-16-十八烷基2，3，4-三-O-乙?；?6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷。1H NMRδ(ppm)0.87(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.2(d，3H，J＝6.51Hz，H-6)，1.24(m，54H，(CH2)27)，1.39-1.67(m，15H，OCH2CH2，H-14，H-17，NH，CH2)，1.95，2.05和2.15(s，3H，OCOCH3)，3.05-3.35(m，18H，H-15，H-16和CH2N)，3.43(m，1H，OCHaCH2)，3.67(m，1H，J＝6.74Hz，OCHbCH2)，3.79(m，1H，H-5)，4.41(d，1H，J＝7.98Hz，H-1)，4.99(dd，1H，J＝3.52Hz和10.46Hz，H-3)，5.05(s，8H，CH2Phe)，5.16(dd，1H，T＝7.98Hz和10.46Hz，H-2)，5.23(dd，J＝3,52Hz和3.37Hz，H-4)，5.47(寬帶CONH，1H)，7.32(m，20H，Phe).13C NMR(CDCl3)；δ(ppm)14.84(C-33)，20.75(CH3COO)，27.29(C-6’)，29.72((CH2)27))，25.89-31.98(OCH2CH2，C-14，C-17和CH2)，37.87-46.87(C-15，C-16和C-N)，66.84(CH2Phe)，68.63(OCH2CH2)，69.45(C-2)，70.57(C-5)，70.85(C-4)，71.44(C-3)，96.25(C-1)，128.31(Phe)，157.01和171.30(CO)。i)1-[-(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基-丙基-芐氧羰基-氨基]-亞甲基-氨基甲酰基-15-十五烷基-16-十八烷基6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷向含有上步h)獲得產(chǎn)物(0.60g；0.94mmol)的甲醇(3ml)溶液中加入氨的飽和甲醇(1ml)溶液。1小時后濃縮。1H NMRδ(ppm)0.87(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.2(d，2H，J＝6.51Hz，H-6)，1.24(m，54H，(CH2)27)，1.39-1.67(m，15H，OCH2CH2，H-14，H-17，NH，CH2)，3.05-3.35(m，18H，H-15，H-16和CH2N)，3.4-3.7(m，6H，OCH2CH2，H-3，H-4，H-5，H-2)，4.73(d，1H，J＝7.98Hz，H-1)，5.05(s，8H，CH2Phe)，5.47(寬帶CONH，1H)，7.32(m，20H，Phe).j)1-[-(3-[4-(3-氨基-丙基-氨基)-丁基-氨基-丙基-氨基]-亞甲基-氨基甲?；?-15-十五碳烷基-16-十八烷基6-脫氧-β-L-吡喃半乳糖苷(化合物3)的合成向上步i)所得產(chǎn)物(0.072g；0.05mmol)的溶液中，加入甲醇中的10％(0.032g)鈀/炭。過夜后，在玻璃漏斗中經(jīng)濾紙過濾，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。產(chǎn)物在C-4型制備性柱上經(jīng)HPLC純化。1H NMRδ(ppm)0.87(t，3H，J＝6.96Hz，H-33)，1.2(d，2H，J＝6.51Hz，H-6)，1.24(m，54H，(CH2)27)，1.39-1.67(m，15H，OCH2CH2，H-14，H-17，CH2)，2.92-3.19(m，18H，H-15，H-16和CH2N)，3.4-3.7(m，6H，OCH2CH2，H-3，H-4，H-5，H-2)，4.73(d，1H，J＝7.98Hz，H-1)。C\本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑的應(yīng)用實施例4用化合物2制備轉(zhuǎn)移試劑/核酸復(fù)合物并測定其大小本實施例說明本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑與核酸間復(fù)合物的制備和隨后對其大小的測定。
本實施例以及隨后實施例中所用的糖脂是濃度為10mg/ml的化合物2的氯仿溶液。在一些情形下，將中性輔助脂膽固醇或DOPE與化合物2預(yù)先混合。
按以下方法制備脂溶液取出所需量的樣品，在氬氣流下蒸發(fā)溶劑，風(fēng)干1小時。然后在4℃用含有5％葡萄糖和10mM氯化鈉的溶液再水化過夜。第二天，將脂溶液加熱到60℃ 5分鐘，然后超聲1分鐘。重復(fù)該操作，直到脂顆粒的大小穩(wěn)定。
所用的DNA是質(zhì)粒pXL3031(

圖1)在5％葡萄糖和10mM氯化鈉混合物中的溶液，濃度為0.5mg/ml或1.0mg/ml。該質(zhì)粒含有編碼螢光素酶的luc基因，該基因處于巨細胞病毒CMV P/E啟動子的控制之下。其大小為3671bp。該質(zhì)粒的示意圖見圖1。按專利申請WO97/35002中所述的方法純化了質(zhì)粒pXL3031。
在室溫下快速混合適當(dāng)體積的質(zhì)粒DNA溶液和化合物2(根據(jù)所希望的電荷比)制備化合物2/DNA復(fù)合物。轉(zhuǎn)移試劑的量在0.25nmol/ugDNA到12nmol/ug DNA之間變化。
用Coulter N4Plus儀器通過動力學(xué)光散射(動力學(xué)激光散射)測定流體動力學(xué)直徑，從而分析復(fù)合物的大小。用含5％葡萄糖和20mM氯化鈉的溶液稀釋樣品20倍，以避免多次散射。
在3nmol脂/ugDNA的比例下，得到如下結(jié)果
術(shù)語“膠束”指化合物2單獨使用，即沒有加入中性輔助脂，因此形成一種膠束溶液。
該表表明所得復(fù)合物的大小在約130-150nm之間，這與藥物應(yīng)用、特別是注射相適應(yīng)。實施例5從化合物2形成的不同電荷比的復(fù)合物的表現(xiàn)本實施例表明改變電荷比時本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑/核酸復(fù)合物的表現(xiàn)。還證明了加入輔助脂(膽固醇或DOPE)的影響。
按常規(guī)，當(dāng)評述轉(zhuǎn)移試劑/DNA電荷比時，區(qū)分3種物理-化學(xué)相(B.Pitard等，質(zhì)粒DNA與陽離子膠束間病毒大小的自聚集層狀復(fù)合物可以促進基因轉(zhuǎn)移，PNAS，Vol.94，14412-14417頁，1997)。這三個相決定著轉(zhuǎn)移試劑的治療潛力。
電荷比小時，DNA沒有被轉(zhuǎn)移試劑所飽和。還剩余沒有被復(fù)合的DNA，復(fù)合物總體帶負電荷，而且尺寸較小。該相穩(wěn)定，稱為“A相”。DNA沒有被轉(zhuǎn)移試劑完全飽和表明DNA沒有被完全保護。因而DNA可能遭受核酸酶的降解。另外，由于復(fù)合物總體帶負電，難以通過細胞膜。因此，A相核脂復(fù)合物相對為非活性的。
中等電荷比時，DNA被轉(zhuǎn)移試劑完全飽和，復(fù)合物總體為中性或略帶正電。該相不穩(wěn)定，因為離子排斥很小，可能產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。這種顆粒的大小遠在動力學(xué)光散射檢測的檢測限之上(遠大于3微米)。該相不穩(wěn)定，稱為“B相”。這種復(fù)合物的大小不適于注射使用，盡管這并不說明復(fù)合物在B相中無活性它們只是處于一種不適合藥物注射目的的制劑形式。
電荷比更高時，DNA被轉(zhuǎn)移試劑過飽和，復(fù)合物總體為正電性。由于正電荷間的強排斥力，該相是穩(wěn)定的，稱為“C相”。與A相不同，所得復(fù)合物中DNA被很好地保護，不受核酸酶破壞，復(fù)合物的總體正電荷有利于與陰離子性的細胞膜結(jié)合和通過該膜。因此C相的復(fù)合物適于細胞中的核酸轉(zhuǎn)移應(yīng)用。
還用本發(fā)明的化合物2作為轉(zhuǎn)移試劑顯示了A、B、C三個區(qū)
如上表所示，B區(qū)(不穩(wěn)定區(qū))特別小，位于低電荷比部分。當(dāng)化合物2與輔助脂(膽固醇或DOPE)一起使用時C區(qū)從2nmol脂/ug DNA開始，當(dāng)僅使用化合物2時從3nmol脂/ug DNA開始。如上文所述，該區(qū)對于藥物應(yīng)用特別有利。
作為對比，用專利申請WO97/18185中公開的陽離子脂表明，根據(jù)溶液中氯化鈉的濃度，從電荷比至少2開始形成C區(qū)(見B.Pitard等，PNAS USA，94，14412-14417頁，1997的圖3A)。
因此，化合物2是一種特別有利的轉(zhuǎn)移試劑，因為它在低電荷比下穩(wěn)定，這得以與小量的糖脂形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而具有毒性方面的有利效果。實施例6化合物2體外轉(zhuǎn)移核酸的應(yīng)用本實施例證明本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑在無或有中性輔助脂(膽固醇或DOPE)存在下以不同的電荷比體外向細胞中轉(zhuǎn)移DNA的能力。
在24孔微板上接種HeLa細胞，每孔60000個細胞，并生長過夜。過夜后，即轉(zhuǎn)染時的細胞數(shù)為100000個細胞/孔。
將每個孔與0.5毫升無血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco/BRL)中的含有l(wèi)微克質(zhì)粒DNA的從化合物2形成的復(fù)合物接觸。這些細胞在37℃培養(yǎng)5小時。然后抽取含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，用DMEM培養(yǎng)基和10％胎牛血清的混合物更換。然后這些細胞再培養(yǎng)24小時。最后，使用螢光素酶檢驗試劑盒盒(Promega)和Dynex MLX熒光儀，溶解并檢測這些細胞。
所得結(jié)果以棒圖顯示在圖2中。轉(zhuǎn)移的效率用螢光素酶的表達(pg)/孔表示。發(fā)現(xiàn)最高轉(zhuǎn)染為約500皮克/孔。
結(jié)論，這個實施例清楚地表明，可以利用本發(fā)明化合物2形成用于促進體外向細胞中轉(zhuǎn)移DNA的復(fù)合物。實施例7化合物2體內(nèi)轉(zhuǎn)移DNA的應(yīng)用本實施例證明本發(fā)明轉(zhuǎn)移試劑體內(nèi)向細胞轉(zhuǎn)染DNA的能力。
通過氣管內(nèi)、靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥在Balb/C鼠上進行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。
在肌肉內(nèi)注射的情況下，每只鼠在前脛骨肌肉中注入30微升含有15微克質(zhì)粒DNA的配制品。在注射7天后取出這些組織，冷凍并儲存在-80℃下，等待進行螢光素酶活性試驗。
在通過靜脈內(nèi)注射的情況下，每只鼠注射200微升含有50微克質(zhì)粒DNA的配制品。在注射24小時后取出這些組織，然后冷凍并以與前面相同的方式儲存。
圖3表示與化合物2形成的復(fù)合物肌內(nèi)注射時體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的活性。這些結(jié)果清楚地表明本發(fā)明化合物2與DNA間復(fù)合物的形成可以促進所述DNA在體內(nèi)向細胞中的轉(zhuǎn)移。
同樣，可以利用本發(fā)明定義的任何轉(zhuǎn)移試劑促進向任何組織類型細胞中的DNA轉(zhuǎn)移。
權(quán)利要求
1.核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于它包含一個一方面與多陽離子體另一方面與至少一個親水取代基化學(xué)結(jié)合的疏水間隔臂。
2.權(quán)利要求1的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述疏水間隔臂由2條或3條線性脂肪烴鏈構(gòu)成，每條鏈含10-20個碳原子，每條鏈可以有不同的長度，或者所述疏水間隔臂由一個含有20-50個碳原子的很長的線性脂肪烴鏈構(gòu)成。
3.權(quán)利要求1的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述親水取代基選自羥基、氨基、多元醇、糖、或親水性肽。
4.權(quán)利要求1或3的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于至少一個親水取代基是糖。
5.權(quán)利要求1的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其具有通式(I) 其中-R代表多陽離子體，-Z代表氫原子或氟原子，不同的Z互相獨立，-x和y相互獨立地代表10-22的整數(shù)，而X和Y相互獨立地代表氫原子、其中Alk代表1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基的-OAlk基團、羥基、氨基、多元醇、糖、親水或非親水肽、或寡核苷酸，條件是X和Y至少一個代表選自羥基、氨基、多元醇、糖或親水肽的親水基團，-或者，x等于0或1，y為20-50的整數(shù)，而X為氫原子或其中Alk代表1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基的-OAlk基團，Y為選自羥基、氨基、多元醇、糖或親水肽的親水基團，視情況其呈異構(gòu)體形式，以及它們的混合物、或可能時呈它們的鹽形式。
6.權(quán)利要求1或5的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其具有通式(III) 其中-R代表多陽離子體，-x和y相互獨立地代表10-22的整數(shù)，而X和Y相互獨立地代表氫原子或糖，條件是X和Y至少一個代表糖，-或者，x等于0或1，y為20-50的整數(shù)，而X為氫原子，Y為糖，視情況其呈異構(gòu)體形式，以及它們的混合物、或可能時呈它們的鹽形式。
7.權(quán)利要求6的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于x和y相互獨立地代表10-22的整數(shù)，而X和Y之一代表氫原子，另一個代表糖。
8.權(quán)利要求1和5-7之一的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述多陽離子體為直鏈或支鏈多胺，每個氨基被一個或多個亞甲基分隔開。
9.權(quán)利要求8的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述多陽離子體具有通式(II) 其中-R1、R2和R3獨立地代表氫原子或(CH2)qR’R”基團，q為1-6的整數(shù)，其在不同的R1、R2和R3基團間是獨立的，條件是R1、R2和R3中至少一個不是氫原子，-R和R”獨立地代表氫原子或(CH2)qNH2基團，q如上所定義，-m代表1-6的整數(shù)，-n和p獨立地代表0-6的整數(shù)，當(dāng)n大于或等于2時，m可以取不同的值，通式(II)中R3的意義可以不同，當(dāng)n等于0時，取代基R1和R2中至少一個不是氫原子。
10.權(quán)利要求1和5-7之一的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述多陽離子體選自精胺、亞精胺、尸胺、腐胺、六亞甲基四胺(六胺)、甲基丙烯酰氨基丙基-三甲基氯化銨(AMBTAC)、3-丙烯酰氨基-3-甲基丁基三甲基氯化銨(AMBTAC)、聚乙烯胺、聚乙烯亞胺、或紫羅烯。
11.權(quán)利要求3-7之一的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述糖是單糖、寡糖或多糖分子。
12.權(quán)利要求11的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述糖選自葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、巖藻糖、纖維二糖、阿洛糖、昆布二糖、龍膽二糖、2-葡糖-β-葡糖苷、蜜二糖、葡聚糖、α-直鏈淀粉、支鏈淀粉、果聚糖、甘露聚糖、木聚糖和阿聚糖。
13.權(quán)利要求5的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述寡核苷酸是含有一個或多個核苷酸、脫氧核苷酸、核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸的鏈，任選地與一個或多個具有不同性質(zhì)的分子偶聯(lián)。
14.權(quán)利要求5的核酸轉(zhuǎn)移試劑，其特征在于所述肽指任何含有由肽鍵相互連接的一個或多個氨基酸的鏈，任選地被一個或多個飽和或不飽和、直鏈、支鏈或環(huán)狀脂肪基團取代。
15.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)移試劑，其為下式化合物
16.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)移試劑，其為下式化合物
17.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)移試劑，其為下式化合物
18.含有權(quán)利要求1-17中所定義核酸轉(zhuǎn)移試劑和核酸的組合物。
19.權(quán)利要求18的組合物，其特征在于核酸為脫氧核糖核酸或核糖核酸。
20.權(quán)利要求18或19的組合物，其特征在于所述核酸包含調(diào)控序列控制下的一個或多個具有治療意義的基因。
21.權(quán)利要求18-20之一的組合物，其特征在于所述核酸是一種反義基因或序列。
22.權(quán)利要求18的組合物，其特征在于它還含有一種或多種添加劑。
23.權(quán)利要求22的組合物，其特征在于所述添加劑為一種或多種中性脂。
24.權(quán)利要求23的組合物，其特征在于所述中性脂為具有兩條脂肪鏈的脂。
25.權(quán)利要求23或24的組合物，其特征在于所述中性脂為在生理條件下為兩性離子或無離子電荷的天然或合成脂類，選自二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、油?；貦磅；字Ｒ掖及?POPE)、二硬脂?；?、二棕櫚?；?、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺以及它們的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂?；视?、二?；视?、糖基二?；视?、腦苷脂(具體如半乳糖腦苷脂)、鞘脂(具體如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(具體如脫唾液酸GM1和GM2)。
26.權(quán)利要求22的組合物，其特征在于所述添加劑為直接或間接參與核酸濃集的化合物。
27.權(quán)利要求26的組合物，其特征在于所述添加劑全部或部分衍生自魚精蛋白、組蛋白、核仁蛋白和/或它們的衍生物，或全部或部分由肽基元(KTPKKAKKP)和/或(ATPAKKAA)構(gòu)成，基元數(shù)可以是2-10，這些基元可以連續(xù)地或不連續(xù)地重復(fù)。
28.權(quán)利要求18-27的組合物，其特征在于它包含注射制劑的藥物可接受的載體。
29.權(quán)利要求18-27的組合物，其特征在于它包含權(quán)利要求18-27的組合物，其特征在于它包含用于皮膚或粘膜應(yīng)用的藥物可接受的載體。
30.權(quán)利要求1-17所定義的轉(zhuǎn)移試劑制備用于治療疾病的藥物的應(yīng)用。
31.動物或人體的治療方法，包括下列步驟(1)將核酸與權(quán)利要求1-17所定義的轉(zhuǎn)移試劑接觸以形成一種復(fù)合物，和(2)將所述人或動物的細胞與(1)中形成的復(fù)合物接觸。
32.向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，該方法包括下述步驟(1)讓核酸與所定義的轉(zhuǎn)移試劑接觸，以形成一種復(fù)合物，和(2)讓細胞與(1)中生成的復(fù)合物接觸。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)移試劑和/或所述核酸預(yù)先與權(quán)利要求22-27中所定義的一種或多種添加劑混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于體外、體內(nèi)或離體向細胞中轉(zhuǎn)移核酸的新轉(zhuǎn)移試劑、含有它們的組合物及其應(yīng)用。更具體地說,本發(fā)明涉及含有一個一方面與多陽離子體另一方面與至少一個親水取代基化學(xué)結(jié)合的疏水間隔臂的新核酸轉(zhuǎn)移試劑。
文檔編號C12N15/00GK1348498SQ9981364
公開日2002年5月8日 申請日期1999年12月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月3日
發(fā)明者J·赫斯科維絲, H·霍夫蘭德, C·杰科賓, D·謝爾曼 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司