專利名稱：食物不耐受血清特異性IgG檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種食物不耐受血清特異性IgG檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病是現(xiàn)代社會中常見的一種疾病，它是由廣泛存在的變應(yīng)原引發(fā)的，我國大約有5-10%的人受變應(yīng)原的侵擾。引發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)稱為變應(yīng)原，其中食物是一種重要變應(yīng)原。人體對食物敏感可引起食物變態(tài)反應(yīng)，目前認為主要有兩種類型由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)，反應(yīng)通常發(fā)生迅速，病癥明顯；由IgG介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，此種反應(yīng)通常在接觸食物幾小時或幾天后才會出現(xiàn)反應(yīng)癥狀，如長期疲勞、關(guān)節(jié)炎、蕁麻疹、濕疹、頭痛、腸胃功能失調(diào)及其它慢性癥狀。通常情況下，將由食物引起，IgG介導(dǎo)的異常反應(yīng)稱之為食物不耐受。食物不耐受患者體內(nèi)會產(chǎn)生食物特異性IgG抗體，檢測血清特異性 IgG抗體對于確定不耐受食物鑒別和診斷具有重要價值。目前臨床上常采用檢測特異性抗體來確定引起患者不耐受的食物類型，而酶聯(lián)免疫吸附實驗是常用的檢測方法。傳統(tǒng)的食物變應(yīng)原IgG抗體酶聯(lián)免疫檢測法通常采用的都是直接包被模式，即由生產(chǎn)廠家預(yù)先將變應(yīng)原固相化于作為載體的聚苯乙烯微孔板上，供檢測人員直接使用。其原理是將變應(yīng)原成份包被于固相載體表面，用其結(jié)合患者血清中的特異性抗體，再通過進一步結(jié)合酶標記抗體進行顯色反應(yīng)來判斷結(jié)果，從而確定患者血清中是否存在包被抗原所對應(yīng)的特異性抗體。然而，引起食物過敏的物質(zhì)種類繁多，同一患者可對多種食物過敏，并且存在明顯的個體差異。在檢測時往往需要同時進行多種變應(yīng)原的檢測，而每一個患者所需的檢測組合又各不相同。傳統(tǒng)試劑常常由生產(chǎn)廠家將多種變應(yīng)原同時包被于微孔板制成類似套餐性質(zhì)的檢測組合，由于采用直接包被法，組合方式無法改變。而實際工作中，每一患者的檢測需要各不相同，食物過敏組合是個性化的，這往往與廠家提供的項目組合產(chǎn)生沖突，造成多余的檢測和漏檢，同時會增加檢測成本。例如目前國內(nèi)實驗室主要使用由BI0MERICA公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫法試劑盒，該試劑盒可同時檢測6例患者，每例患者可檢測(必須檢測)14種食物變應(yīng)原，組合方式不能改變。此外，該試劑盒在固定位置可測定2條標準曲線，對血清特異性IgG進行定量。因此，此試劑盒只能進行兩次測定，每次測定3例患者血清。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)直接包被模式制備的食物過敏酶標反應(yīng)板無法滿足患者個性化需求的不足，本發(fā)明引入生物素-鏈霉親和素間接包被模式，對酶標反應(yīng)板的包被制作環(huán)節(jié)進行改進。變應(yīng)原不需預(yù)先包被，而是標記上生物素，與包被了親和素的微孔反應(yīng)板同時提供給檢測人員。檢測人員可以根據(jù)被檢者的具體情況靈活選擇所需食物變應(yīng)原，將生物素標記變應(yīng)原和待測血清同時加入微孔板，實現(xiàn)即時包被，并且包被和檢測過程同步進行，大大降低了檢測成本，提高了檢測靈活性，真正實現(xiàn)個性化檢測。
生物素(biotin，B)分子量為244. 31，現(xiàn)已能人工合成，制備方便。生物素基本結(jié)構(gòu)為雙環(huán)結(jié)構(gòu)1環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的部位環(huán)為噻吩環(huán)，含一個戊酸側(cè)鏈，其末端羧基可與生物大分子連接，形成生物素標記抗原、抗體等。生物素與生物大分子結(jié)合后并不影響生物大分子和生物素原有的生物活性，即生物素標記抗體同時具備與親和素和相應(yīng)抗原結(jié)合之特性。鏈霉親合素(streptavidin, SA),分子量65KD,由四條相同的肽鏈組成,一個鏈霉親合素分子能結(jié)合四個生物素分子。與親和素相比，鏈霉親和素對生物素具有高度親和カ(親和常數(shù)為IO1Vmol)，與生物素結(jié)合后形成非常穩(wěn)定復(fù)合物，很難解離?；谏锼嘏c鏈霉親和素相結(jié)合這一特性所建立的體系稱為生物素-親和素系統(tǒng)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，主要包括(I)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板；(2)生物素標記的食物變應(yīng)原；(3)生物素標記抗人IgG抗體；(4)人 IgG 標準品；(5)陽性質(zhì)控血清；(6)酶標記抗人IgG抗體(7)常規(guī)酶標清洗液(8)顯色液A :含0. 054% (VA)H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩沖液；(9)顯示液B :含0. 48g/L TMB的檸檬酸緩沖液；(10)終止液lmol/L H2SO4 溶液。本發(fā)明試劑盒的主要作用過程如下在微孔板(酶標反應(yīng)板)上包被連接了生物素的牛血清白蛋白，再進ー步連接鏈霉親和素，形成生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素通用反應(yīng)板，即預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板；將常見的多種食物變應(yīng)原分別標記生物素，使用時根據(jù)患者的病史等情況選擇所需的生物素標記的食物變應(yīng)原分別加入酶標反應(yīng)板，同時加入21倍稀釋的患者血清，血清中的特異性抗體(即特異性IgG)與相應(yīng)生物素標記的食物變應(yīng)原結(jié)合形成免疫復(fù)合物(變應(yīng)原-特異性抗體復(fù)合物)；由于該復(fù)合物含有生物素分子，它通過生物素和預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板上的鏈霉親和素結(jié)合，從而將復(fù)合物固定于微孔板上，之后的反應(yīng)過程和結(jié)果判讀過程同傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測模式，即洗板去除未結(jié)合成分，再加入酶標記的第二抗體(酶標抗人IgG抗體)同固定于微孔板的待測抗體結(jié)合，通過酶催化底物顯色而得出結(jié)果。如果血清中不含該特異性抗體，則反應(yīng)不能順利進行，最終不會顯色。特異性IgG含量可通過標準曲線獲得。標準曲線的制作需要5個測試孔，分別加入加入生物標記抗人IgG抗體和不同濃度的標準品；洗板去除未結(jié)合成分，再加入酶標記的第二抗體(酶標抗人IgG抗體)同固定于微孔板的待測抗體結(jié)合，通過酶催化底物顯色而得出結(jié)果并繪制標準曲線。陽性質(zhì)控測試孔加樣方式同待測血清標本。優(yōu)選的，所述試劑盒中，預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板的每個微孔中包被有O.75微克的生物素化牛血清白蛋白和O. 45微克的鏈霉親和素。生物素標記的食物變應(yīng)原的蛋白濃度為10-20微克/毫升，優(yōu)選15微克/毫升；生物素標記抗人IgG抗體的蛋白濃度為2-4微克/毫升，優(yōu)選3微克/毫升；用于做標準曲線的人IgG標準品含有六個濃度，分別是0U/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml” 和 “400U/ml ；酶標記抗人IgG抗體的稀釋比例I : 12000。優(yōu)選的，所述生物素標記的食物變應(yīng)原為牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小 麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原中的一種或幾種，更優(yōu)選的，所述試劑盒包括了上述八種食物變應(yīng)原。優(yōu)選的，所述酶標反應(yīng)板是可拆卸式96孔聚苯乙烯微孔板。本發(fā)明還提供了一種制備所述試劑盒的方法，包括如下步驟(I)在酶標反應(yīng)板上包被生物素化牛血清白蛋白，再進一步連接鏈霉親和素，得到預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板；(2)用生物素標記的食物變應(yīng)原；(3)制備生物素標記抗人IgG抗體；(4)預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板、生物素標記的食物變應(yīng)原、生物素標記抗人IgG抗體、人IgG標準品、陽性質(zhì)控血清、酶標記抗人IgG抗體、常規(guī)酶標清洗液、顯色液A、顯示液B和終止液組裝成成品。本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是I、本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的直接包被模式不能滿足患者個性化檢測需求的不足，便于檢測人員根據(jù)需要靈活選擇項目組合，提高了檢測試劑的通用性和利用率，同時避免無關(guān)項目的檢測和試劑浪費，相當(dāng)于從“雕版印刷”改進為“活字印刷”，由于包被和檢測過程的同步進行，反應(yīng)時間和操作程序并未增加，并且使得操作更加方便。2、簡化試劑盒的制備工藝。現(xiàn)有產(chǎn)品需要將96孔酶標反應(yīng)板各孔分別包被不同的食物變應(yīng)原，并做好標記，然后根據(jù)需要進行組裝。本發(fā)明提供的酶標反應(yīng)板所包被的生物分子相同(生物素化牛血清白蛋白和鏈霉親和素)，且包被程序完全相同，如此改進大幅度簡化酶標板的制備工藝，且避免了由于變應(yīng)原組裝出現(xiàn)錯誤影響檢測結(jié)果的情況。3、傳統(tǒng)直接包被模式中，食物變應(yīng)原直接包被在固相材料表面，由于受空間位阻效應(yīng)的影響，會影響抗原與待測抗體結(jié)合。本發(fā)明所采取的間接包被模式，將生物素標記食物變應(yīng)原置于液相中，與液相中的待測抗體反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物后再通過生物素分子與酶標板的鏈霉親和素結(jié)合，此種方式由于食物變應(yīng)原在液相中保持原有空間構(gòu)象，利于與待測抗體結(jié)合。


圖I是直接包被和間接包被模式的比較，圖2是標準曲線測定和特異性IgG測定反應(yīng)原理示意圖，圖3是直接包被和間接包被反應(yīng)模式的比較。圖4是血清IgG定量劑量-反應(yīng)曲線。圖I-圖 3 中，
I、酶標反應(yīng)板的單個孔，2、食物變應(yīng)原(已知抗原)，3、生物素化牛血清白蛋白，4、鏈霉親和素，5、生物素標記的食物變應(yīng)原，6、待測抗體(特異性IgG)，7、酶標記抗人IgG抗體,8、生物素標記抗人IgG抗體，9、人IgG標準品。圖I中的a為直接包被模式,食物變應(yīng)原直接包被于固相載體表面,不同反應(yīng)孔包被不同食物變應(yīng)原；圖I中的b為間接包被模式，微孔板各孔分別包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素；食物變應(yīng)原不直接包被而是標記生物素，并置于液相中，檢測時生物素標記的食物變應(yīng)原與待測抗體結(jié)合后再借助生物素親和素系統(tǒng)結(jié)合于固相材料表面。圖2中，a顯示標準曲線定量測定IgG的原理生物素標記的抗人IgG抗體與不同濃度的人IgG標準品反應(yīng)形成免疫復(fù)合物(生物素抗人IgG抗體-人IgG)，借助生物素-親和素系統(tǒng)，此復(fù)合物被固定于固相材料表面；再加入酶標記抗人IgG抗體,形成雙抗體夾心復(fù)合物(生物素抗人IgG-人IgG-酶標抗人IgG)。
圖2中，b顯示特異性IgG測定原理生物素標記的食物變應(yīng)原(生物素抗原)與待測血清中特異性IgG反應(yīng)形成免疫復(fù)合物(生物素抗原-特異性IgG)，借助生物素-親和素系統(tǒng)，此復(fù)合物被固定于固相材料表面；再加入酶標記抗人IgG抗體,形成雙抗體夾心復(fù)合物(生物素抗原-特異性IgG-酶標抗人IgG)。此外，特異性IgG含量可通過標準曲線獲得。圖3中，a為直接包被模式，包被于固相材料的食物變應(yīng)原與液相中的待檢IgG結(jié)合形成免疫復(fù)合物，此過程為固相抗原與液相抗體之間的反應(yīng)。因食物變應(yīng)原已被固定于特定檢測孔，此孔只能用于檢測本抗原相對應(yīng)的IgG抗體。圖3中，b為間接包被模式，待測抗體和生物素標記的食物變應(yīng)原均處于液相中，此種反應(yīng)效率高于固相與液相之間的反應(yīng)；二者形成免疫復(fù)合物的同時借助生物素-親和素系統(tǒng)再用固相載體結(jié)合。此為，微孔板各孔均為通用孔，可根據(jù)檢測食物抗體種類不同，選擇相應(yīng)生物素標記的食物變應(yīng)原。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進ー步說明，但不限定本發(fā)明的保護范圍。實施例Iー種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括如下組分(I)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板(2)多種生物素標記的食物變應(yīng)原，包括生物素標記的牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原；(3)生物素標記抗人IgG抗體(羊抗人IgG抗體，ABCAM公司，貨號ab48386)(4)不同濃度的人IgG標準品(將純品IgG(ABCAM公司，貨號ab91102)用含1%小牛血清的PH 7. 40. IM PBS配制成5個不同濃度作為標準品，標準品濃度分別是“OU/ml”、“ 50U/ml ”、“ IOOU/ml ”、“ 200U/ml ”、“ 400U/ml ”，標準品經(jīng)國際質(zhì)控血清校準。)(5)陽性質(zhì)控血清(陽性質(zhì)控血清由50例食物特異性IgG中等輕度陽性血清(100 200U/ml)混合后獲得，此血清分別含有八種食物特異性IgG，使用時視為臨床標本一同檢測。)
(6)酶標記抗人IgG抗體(Southern Biotech公司，貨號6140-05 ;稀釋比例I 12000，用含10%小牛血清的pH 7. 40. IM PBS稀釋即可)(7)常規(guī)酶標清洗液(8)顯色液A :含O. 054% (VA)H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩沖液；(9)顯示液B :含O. 48g/L TMB的檸檬酸緩沖液；(10)終止液lmol/L H2SO 溶液。所述試劑盒通過如下方法制備得到(I)溶液配制(I)稀釋液 I
Tris (:」輕 Φ 麵· Φ 烷)6.06 g
NaCl (氣化_)8.77 g
Proclin 3000.5 腿i
ddH20 (雙蒸水)950 ml調(diào)pH 至 8.0，加 0.5ml Procilin 300，加 ddH20 定容至 1L。(2)生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液用稀釋液I將生物素化牛血清白蛋白稀釋，終濃度為5μ g/ml，充分攪拌混勻。(3)稀釋液 II
NaH2PO4* 2 H2O (磷 |—. 鈉)4.68 g
Na2HPO4 · 12H20 (_酸(4 .._ )7.16 g
L-Tryptophan (L-色Mjft)0.2 g
NaCl(M 化她)8.77g
CidH2O(雙蒸水)950 ml調(diào)pH 至 8. 0，加 ddH20 定容至 1L。(4)鏈霉親和素包被緩沖液用稀釋液II將鏈酶親和素稀釋，終濃度為3μ g/ml，充分攪拌混勻。(5)封閉溶液
NaH2PO4 · 2H20 (磷酸.—: 鈉) 0.145 g Na2HPO4 · HH2O (_酸鉍itt) I '45 g ACA(HilId酸) 1.5 g
NaCl()4.38 gCidH2O(雙蒸水)450 ml調(diào)pH 至 7. 3-7. 5BSA (牛血清白蛋白) 2. Og蔗糖17. 5gProcilin 300O. 25ml力卩ddH20 定容至 5OOml
(6)磷酸鹽緩沖液(0. lmol/L, pH7. 4)ddH20 (雙蒸水)3600mlNaH2PO4 2H20(磷酸ニ氫鈉)11. 84gNa2HPO4 12H20(磷酸氫ニ鈉)116g調(diào)pH 至 7. 3-7. 45，加 ddH20 定容至 4し(7)碳酸氫鈉緩沖液(0. lmol/L, pH9. 5)NaHCO3 (碳酸氫鈉) 8. 4g ddH20 (雙蒸水)800ml用lmol/L NaOH和6mol/L HCL調(diào)節(jié)pH值至9. 5,去離子水定容至1L。(8)顯色液A，市售商品，也可通過如下方法制備得到
JtiH2O(雙蒸水)450ml
I 酸鈉8.2g
檸f蒙酸1.58g
30%H2020.27ml調(diào)節(jié)pH至5. 3，ddH20定容至500ml，分裝，4°C儲存。(9)顯色液B，市售商品，也可通過如下方法制備得到
(JdH2O( 蒸水)400腿1
EDTA( Z..——————；胺_ 乙酸) 0.186g
朽:様酸0.96g
lOmol/L NaOH0.54ml
W -醇50ml
TMB-HCl (BJtf1II聯(lián)苯胺ニIfe酸Ife) 0.24g上述反應(yīng)注意避光，調(diào)節(jié)pH值3.0，用CldH2O定容至500ml，分裝，4°C儲存。(10)終止液用常規(guī)方法將98%的濃硫酸用ddH20配制成lmol/L的酶標終止液，4°C儲存。(11)0. 1M, pH 8. 0 的 Tris-HCl 溶液Tris (三羥甲基氨基甲烷) 12. 12克ddH20 (雙蒸水)70毫升充分溶解后，用HCl調(diào)節(jié)pH至8. 0，加ddH20定容至100毫升(2)生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標反應(yīng)板的制備(I)在空白酶標反應(yīng)板(可拆卸式96孔聚苯こ烯微孔板)的每個微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液，將酶標反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18-250C，溫浴16-18小時；(2)甩凈包被緩沖液，用稀釋液I洗酶標反應(yīng)板2次，300微升每孔，毎次需靜置10分鐘。(3)甩凈稀釋液，并在干凈的毛巾上拍干。(4)在酶標反應(yīng)板的每個微孔再加入150微升鏈霉親和素包被緩沖液，將酶標反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18-25°C，溫浴2小時；(5)甩凈包被緩沖液，用稀釋液II洗酶標板2次，300微升每孔，每次需靜置10分鐘。(6)重復(fù)(3)。(7)在酶標反應(yīng)板的每個微孔再加入250微升封閉溶液，將酶標反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，4°C，溫浴過夜；(8)甩凈封閉溶液，并在干凈的毛巾上拍干。將微孔板真空干燥至少6小時。取出后放置于干燥室及時真空包裝備用。(3)生物素標記的變應(yīng)原的制備
(I)將用常規(guī)方法將純化好的用于檢測特異性抗體的食物變應(yīng)原濃度調(diào)整為約5毫克每毫升，分別用O. I摩爾每升，PH9. 5的NaHCO3緩沖液透析，過夜，并于280nm處測吸光度值，計算蛋白總量，得蛋白溶液。(2)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素與變應(yīng)原的摩爾比為20 I的比例，將生物素緩慢、逐滴加入得蛋白溶液中，邊滴加邊攪拌，全加入后室溫攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)Ih ；。(3)將反應(yīng)后的液體用O. lmol/L磷酸鹽緩沖液于4°C透析24小時，其中換液數(shù)次，充分除去未結(jié)合的生物素，用O. 1M，pH 8. O的Tris-HCl溶液將生物素標記的食物變應(yīng)原的蛋白濃度稀釋至為10-20微克/毫升，優(yōu)選15微克/毫升；(4)將每種候選的變應(yīng)原標記生物素后，分別裝于試劑瓶中，與生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標反應(yīng)板配套使用。(4)生物標記的抗人IgG抗體的制備方法同生物素標記的變應(yīng)原的制備，用O. 1M，PH 8. O的Tris-HCl溶液將生物素標記抗人IgG抗體的蛋白濃度稀釋至2_4微克/毫升，優(yōu)
選3微克/暈升。(4)將以下組分組裝成試劑盒A預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈酶親和素酶標反應(yīng)板B生物素標記的食物變應(yīng)原C生物素標記的抗人IgGD人IgG標準品E陽性質(zhì)控血清F酶標記抗人I gG抗體G常規(guī)酶標清洗液H顯色液AI顯色液BG終止液。實施例2一種實施例I制備的試劑盒的使用方法，包括如下步驟I、根據(jù)檢測目的和患者病史等情況，檢測人員可從提供的生物素標記的食物變應(yīng)原中自由選擇出要檢測的一種或多種變應(yīng)原進行項目組合，如選擇牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原中的一種或幾種的組合物。2、通過如下方法使用所述試劑盒(I)準備根據(jù)需要取出酶標反應(yīng)板(預(yù)先包被有生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素)。測試孔數(shù)量為樣本數(shù)X系數(shù)+5個標準曲線點+陽性質(zhì)控血清，系數(shù)為每個樣本測定食物變應(yīng)原種類數(shù)。將生物素標記的食物變應(yīng)原試劑、酶標記抗人IgG抗體、顯色液A、顯色液B、終止液等放置室溫條件下平衡20min以上。(2)稀釋標本用pH7. 40. lmol/L PBS將血清標本稀做21倍稀釋，即10 U I待測血清加入200微升PBS溶液，血清稀釋可在稀釋微孔板中進行。(3)加樣與溫浴標準曲線測試孔分別加入100 ill生物標記的抗人IgG抗體和25ul不同濃度的人IgG標準品；樣品和質(zhì)控血清測試孔分別加入25 Ul已稀釋待檢樣本(或質(zhì)控血清)和100 u I生物素標記的食物變應(yīng)原溶液，充分混勻，置37°C水浴60min。
(4)洗板取出酶標反應(yīng)板，棄反應(yīng)液，用常規(guī)酶標洗液將微孔板洗滌5次，最后ー次拍干液體。(5)加酶標抗體加入酶標抗人IgG (標記抗體)，125 ii I/孔，置37°C中水浴30min。(6)洗板重復(fù)步驟“(4) ”。(7)顯色加入顯色液A和顯色液B,各50ii I/孔；室溫、避光條件下反應(yīng)15min ;各孔繼續(xù)加入終止液50 u I ;充分混勻后讀取A45(lnm。(8)結(jié)果判斷首先，以標準品濃度為橫坐標⑴，相應(yīng)濃度的A45tol縱坐標⑴，采用四參數(shù)擬合方式繪制劑量-反應(yīng)曲線，即特異性IgG定量標準曲線，并獲得數(shù)學(xué)函數(shù)模型。其次，應(yīng)用繪制劑量-反應(yīng)曲線或數(shù)學(xué)函數(shù)模型，通過測定的A45tol獲得相應(yīng)特異性IgG的濃度。特異性IgG定量標準曲線的制作如下分別以不同濃度的(“OU/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml”、“400U/ml”)人IgG標準品為橫坐標,吸光度(A450nm)為縱坐標,采用四參數(shù)Logistic曲線擬合方式，生物素標記抗IgG抗體稀釋度為I : 8000 (2-4微克/毫升)，酶標記杭-人IgG稀釋度為
I: 12000，標準曲線如所圖4所示。特異性IgG標準分為4級陰性小于等于50U/ml ;弱陽性大于50U/ml并小于等于100U/ml ；中等陽性大于100U/ml并小于等于200U/ml ；強陽性大于200U/ml ；實施例3本發(fā)明的試劑盒的性能檢測如下精密度測定以蛋、奶為例分別選取陰性血清、蛋清和牛奶陽性血清、強陽性血清，分別進行批內(nèi)測定和批間測定，各測定10次，獲得酶聯(lián)免疫法測定特異性IgG的批內(nèi)、批間精密度，如表I和表2所不。從表I和表2中結(jié)果可以看出，本發(fā)明的試劑盒具有較好的精密度，能夠達到酶聯(lián)免疫診斷試劑的基本要求。
表I蛋清特異性IgG精密度測試結(jié)果
Ij Λ_I JwJ,ψ4ψ·Λ ,J , φ·<τ JW*.· Α
吸光度mmm,；u
44ψ44r- j-1 %
(α,λ) BttJiiIiI,,, ι ι,,, Iittiiili RI1W ifit.,, . w . _M i11--IuUi I' M i11IuUI <Pl Ifr.lulii I HIfr.-I-Ulii I
I0. 184 0. .356 0.562 0. 192 0. 382 0.583
SI)0,027 0.038 0.048 0.020 0.032 0,0>M CV(1I)14.710.78.510.48.47.5表2牛奶特異性IgG精密度測試結(jié)果
ΠΙ ,, lfr批M粘密度批Λ精密度u,,P) wn±Mim 則件·沾則件愈沾剛件_沾陽性
X0.2210. ；MiS 0. S96 ().241{). : 1 0. SH2
SI)0.029 0. IW2 0. (M2 0.021 0. 29 0.02
CV (I)_IUij_H1H_7J)_H1J_L6_I 6特異性測定以蛋奶為例，分別選取其他食物(蝦、蟹、豆類、羊肉、牛肉)等不耐受患者血清，應(yīng)用間接包被模式測定蛋清特異IgG和牛奶特異IgG，分別計算與這些物質(zhì)交叉反應(yīng)率(蛋清或牛奶IgG/交叉物質(zhì)IgG)。結(jié)果顯示用本發(fā)明的試劑盒測定蛋清特異IgG時，與蝦、蟹、豆類、羊肉、牛肉特異性IgG無交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率低于O. 5%);測定牛奶特異性IgG時，與蝦、蟹、豆類、羊肉等特異性IgG無交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率低于0.5%)，但發(fā)現(xiàn)與牛肉特異性IgG存在交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率為4. 2%。與參比試劑比對結(jié)果以美國Biomerica酶聯(lián)免疫(間接法)作為參比方法，間接包被酶聯(lián)免疫法分別測定牛奶特異性IgG和蛋清特異性IgG。結(jié)果如表3、表4所示蛋清特異性IgG測定結(jié)果敏感度為90. 7% (39/43)，特異度為95.0% (38/40)，準確度為92. 8% (77/83);陽性預(yù)測值為95. 1% (39/41)，陰性預(yù)測值為90. 5% (38/42)。同時，牛奶特異性IgG測定結(jié)果敏感度為92. 1% (35/38)，特異度為90.0% (36/40)，準確度為91. 0% (71/78);陽性預(yù)測值% 89. 7% (35/39)，陰性預(yù)測值為 92. 3% (36/39)。表3本發(fā)明試劑盒與參比試劑檢測結(jié)果(蛋清)
木發(fā)叫試劑mmm 酬忭__沽合汴iiifi 39 2 41
PJJf I·；43842
_fHl·_43_40_83表4本發(fā)明試劑盒與參比試劑檢測結(jié)果(牛奶)
權(quán)利要求
1.一種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括 (1)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板； (2)生物素標記的食物變應(yīng)原； (3)生物素標記抗人IgG抗體； ⑷人IgG標準品； (5)陽性質(zhì)控血清； (6)酶標記抗人IgG抗體； (7)常規(guī)酶標清洗液； (8)顯色液A:含0. 054% (VA)H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩沖液； (9)顯示液B:含0. 48g/L TMB的檸檬酸緩沖液； (10)終止液lmol/LH2SO4 溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于 預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板的每個微孔中包被有0. 75微克的生物素化牛血清白蛋白和0. 45微克的鏈霉親和素； 生物素標記的食物變應(yīng)原的蛋白濃度為10-20微克/毫升，優(yōu)選15微克/毫升； 生物素標記抗人IgG抗體的蛋白濃度為2-4微克/毫升，優(yōu)選3微克/毫升； 用于做標準曲線的人IgG標準品含有六個濃度，分別是0U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml 和 400U/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述生物素標記的食物變應(yīng)原為牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原中的一種或幾種。
4.一種制備權(quán)利要求1-3任一項所述試劑盒的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)在酶標反應(yīng)板上包被生物素化牛血清白蛋白，再進一步連接鏈霉親和素，得到預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板； (2)用生物素標記食物變應(yīng)原； (3)制備生物素標記抗人IgG抗體； (4)預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板、生物素標記的食物變應(yīng)原、生物素標記抗人IgG抗體、人IgG標準品、陽性質(zhì)控血清、酶標記抗人IgG抗體、常規(guī)酶標清洗液、顯色液A、顯示液B和終止液組裝成成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(I)包括如下步驟 [I]配制稀釋液I、稀釋液II、封閉溶液； 稀釋液I由如下組分制備得到Tris6.06 gNaCl8.77 g Proclin 3000.5mlddli20950 ml調(diào) pH 至 8. 0，加 0. 5ml Procilin 300，加 ddH20 定容至 IL ； 稀釋液II由如下組分制備得到NaH2PO4 2H204,68 g Na2HPO4 * 12H20 7,16 g L-Tryptophan 0.2 g NaCl8.7 g CldH2O950 ml 調(diào)pH至8. 0，加ddH20定容至IL ； 封閉溶液由如下組分制備得到 NaH2PO4 * 2H20 0.145 g Na2HPO4 12H20 1.45 g ACA1.5 g NaCl4.38 gCldH2O450 ml 調(diào) pH 至 I. 3-7. 5 BSA 2. Og 鹿糖 17. 5g Procilin 300 0. 25ml 加ddH20定容至500ml ； [2]配制生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液 用稀釋液I將生物素化牛血清白蛋白稀釋至5 y g/ml ； [3]配制鏈霉親和素包被緩沖液 用稀釋液I將鏈霉親和素稀釋至3 u g/ml ； [4]制備預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板 ①在空白酶標反應(yīng)板的每個微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液，將酶標反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18_25°C，溫浴16-18小時；②甩凈包被緩沖液，用稀釋液I洗酶標反應(yīng)板2次，300微升每孔，每次靜置10分鐘； ③甩凈稀釋液，并拍干； ④在酶標反應(yīng)板的每個微孔再加入150微升鏈霉親和素包被緩沖液，將酶標反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18-25°C，溫浴2小時；⑤甩凈包被緩沖液，用稀釋液II洗酶標反應(yīng)板2次，300微升每孔，每次靜置10分鐘； ⑥甩凈稀釋液，并拍干； ⑦在酶標反應(yīng)板的每個微孔再加入250微升封閉溶液，將酶標反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，4°C，溫浴過夜； ⑧甩凈封閉溶液，并拍干，將酶標反應(yīng)板真空干燥至少6小時，得預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于用生物素標記食物變應(yīng)原包括如下步驟 ①將純化好的用于檢測特異性抗體的變應(yīng)原調(diào)整為5毫克每毫升，分別用0. I摩爾每升，pH9. 5的NaHCO3緩沖液透析，過夜，并于280nm處測吸光度值，計算蛋白蛋白總量，得蛋白溶液；②將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與變應(yīng)原的摩爾比為20 I的比例，將生物素緩慢滴入蛋白溶液中，邊滴加邊攪拌，全加入后室溫攪拌條件下繼續(xù)反應(yīng)Ih ； ③將反應(yīng)后的液體用0.I摩爾每升的PBS于4°C透析24小時，充分除去未結(jié)合的生物素后，即得到所述生物素標記的變應(yīng)原。
全文摘要
本發(fā)明提供一種食物不耐受血清特異性IgG檢測試劑盒及其制備方法。所述試劑盒包括(1)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標反應(yīng)板、(2)生物素標記的食物變應(yīng)原、(3)生物素標記抗人IgG抗體、(4)人IgG標準品、(5)陽性質(zhì)控血清、(6)酶標記抗人IgG抗體、(7)常規(guī)酶標清洗液、(8)顯色液A、(9)顯示液B和(10)終止液。本發(fā)明的試劑盒使得檢測人員可以根據(jù)被檢者的具體情況靈活選擇所需檢測的食物變應(yīng)原，將生物素標記變應(yīng)原和待測血清同時加入微孔板內(nèi)，實現(xiàn)即時包被，并且包被和檢測過程同步進行，大大降低了檢測成本，提高了檢測靈活性，實現(xiàn)個性化檢測。
文檔編號G01N33/68GK102809657SQ20121031395
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者李會強, 王高升, 相平 申請人:沃克(天津)生物科技有限公司