專(zhuān)利名稱(chēng)：：Mpl配體類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及帶有至少1個(gè)改變了的O-或N-連接糖基化位點(diǎn)的mpl配體類(lèi)似物。本發(fā)明還涉及編碼這些mpl配體類(lèi)似物的DNA序列，以及重組質(zhì)粒和表達(dá)類(lèi)似物的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：MGDF，或巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子是新近克隆到的一種細(xì)胞因子，它似乎是循環(huán)系統(tǒng)血小板水平的主要調(diào)節(jié)劑。見(jiàn)，Bartley，T．D．etal_Cell771117-1124(1994)；LokS．etal_Nature369565-568(1994)；desauvage，F(xiàn)．J．etal_Nature369533538(1994)；Miyazake，H．etal_Exp．Hematol．22838(1994)l；以及Kuter，D.J．etal_PNASUSA，9111104-11108(1994)。在Bartley，T．etal_Cell771117．1124(1994)的描述中MGDF又稱(chēng)為血小板生成素(TPO)、mpl配體和促巨細(xì)胞生成素(megapoietin)。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“mpl配體”一般是指能夠活化mpl受體的所有多肽，包括TPO和MGDF。mpl受體是一種細(xì)胞表面蛋白，其活化時(shí)，能引發(fā)巨核細(xì)胞和血小板的生成和／或發(fā)育。見(jiàn)WO92／07074?！癿pl配體類(lèi)似物”是不同于天然序列的多肽，能夠影響羧基連接位點(diǎn)的數(shù)目、定位或類(lèi)型。這類(lèi)多肽是本發(fā)明的一個(gè)方面。成熟的天然人mpl配體是一種全長(zhǎng)為332個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白的序列(連有一段長(zhǎng)21個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列)及相應(yīng)cDNA見(jiàn)本發(fā)明的圖1(SEQIDNos1和2)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和大腸桿菌生產(chǎn)的重組mpl配體具有下述生物學(xué)活性在小鼠、大鼠和猴子體內(nèi)能特異性地激活或增加巨核細(xì)胞和／或血小板。見(jiàn)，例如，Hunt，P．etal_Blood84(10)390A(1994)。被截短以致延伸至少151氨基酸的人mpl配體分子(從圖1中第22位氨基酸起始)保留了體內(nèi)生物活性。圖2(SEQIDNos．3和4)顯示的是截短的mpl配體分子的一個(gè)實(shí)例，它以成熟形式存在，長(zhǎng)174個(gè)氨基酸，具有生物活性。圖2中，顯示的是上述174個(gè)氨基酸的蛋白連接到一段長(zhǎng)21個(gè)氨基酸N-端前導(dǎo)序列上。在下面的實(shí)施例中，該分子用來(lái)制備幾種mpl配體類(lèi)似物。其他類(lèi)似物以圖1中第1～199位、1～191位以及1～183位氨基酸為基礎(chǔ)。去除人mpl配體成熟蛋白序列N-端的前6個(gè)氨基酸，仍可保留生物活性。因此，顯然生物活性是保留在如圖1所示的人mpl配體成熟氨基酸序列第7～151位氨基酸(兩端點(diǎn)包括在內(nèi))中。通常，真核細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞表面蛋白及分泌蛋白都修飾有1個(gè)或多個(gè)寡糖基團(tuán)。這種修飾稱(chēng)為糖基化，它能顯著地影響蛋白質(zhì)的生理特性，而且還能在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定分泌以及亞細(xì)胞定位中發(fā)揮重要作用。合適的糖基化對(duì)于生物活性是必不可少的。實(shí)際上，真核生物的一些基因在缺乏使蛋白糖基化的細(xì)胞處理過(guò)程的細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，生成的蛋白由于沒(méi)有進(jìn)行糖基化因而幾乎或根本不能恢復(fù)任何活性。糖基化發(fā)生在多肽骨架的特定位置或位點(diǎn)上，O-連接寡糖被連接到絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基上，而N-連接的寡糖(側(cè)鏈)則被連接到作為下列序列一部分的天冬酰胺(Asn)殘基Asn-X-Ser／Thr，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸。X優(yōu)選是除脯氨酸外的19種天然氨基酸中的一種。發(fā)現(xiàn)N-連接和O-連接寡糖以及糖基的結(jié)構(gòu)在每種類(lèi)型中都是不同的。在兩種連接中都常見(jiàn)的一種類(lèi)型的糖基是N-乙酰神經(jīng)氨酸(下稱(chēng)唾液酸)。通常，唾液酸是N-連接和O-連接寡糖的末端殘基，由于它帶有負(fù)電荷，所以可以賦予糖蛋白酸性。本發(fā)明中使用的糖基化“位點(diǎn)”是指結(jié)構(gòu)上能夠連接糖基的氨基酸殘基，盡管這類(lèi)位點(diǎn)可能實(shí)際連接或不連接糖基。如上所述，O-連接位點(diǎn)是Ser或Thr殘基，而N-連接位點(diǎn)是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中的X為除脯氨酸外的任一氨基酸(優(yōu)選為除脯氨酸外的19種天然氨基酸中的一種)。一個(gè)給定位點(diǎn)能否被糖基側(cè)鏈糖基化取決于表達(dá)該分子的宿主細(xì)胞、該位點(diǎn)的鄰近氨基酸以及其他因素。如本發(fā)明所述，一種給定的mpl配體類(lèi)似物連接的“側(cè)鏈”的數(shù)目是一種具體宿主細(xì)胞表達(dá)的給定mpl配體分子所連接碳水化合物(即，糖基)側(cè)鏈的平均數(shù)。值得注意的是，天然mpl配體和相應(yīng)的重組mpl配體二者的糖基化位點(diǎn)通常是相等的，但是可能會(huì)由于用于重組表達(dá)的特定宿主細(xì)胞是否在同樣的位點(diǎn)上連接了糖基側(cè)鏈，而使側(cè)鏈的數(shù)目與天然形式不同。其中，當(dāng)在重組及天然mpl配體類(lèi)似物之間進(jìn)行對(duì)比時(shí)，無(wú)論天然生成的mpl配體長(zhǎng)度如何，都要對(duì)相同數(shù)目的氨基酸進(jìn)行比較。因此，“天然”是指具體物種(例如人)中出現(xiàn)的序列，而非該天然來(lái)源真正表達(dá)的分子的長(zhǎng)度。天然生成的mpl配體是一種糖基化分子。天然mpl配體的糖基化方式涉及mpl配體已發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。成熟的人mpl配體的前151個(gè)氨基酸序列為該分子的活性部分，與促紅細(xì)胞生成素(EPO)具有顯著同源性，EPO是一種能刺激紅細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，因而上述序列被稱(chēng)為人mpl配體的“類(lèi)EPO”結(jié)構(gòu)域。在人mpl配體中，有6個(gè)包含在N-連接糖基化結(jié)構(gòu)域中的N-連接糖基化位點(diǎn)。這兩種結(jié)構(gòu)域中都包含有O-連接糖基化位點(diǎn)。該分子中估計(jì)有12～14個(gè)O-連接糖基化側(cè)鏈。CHO細(xì)胞重組表達(dá)人mpl配體DNA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在類(lèi)EPO結(jié)構(gòu)域中至少有兩個(gè)O-連接位點(diǎn)被糖基化，即第1位(Ser)和第37位(Thr)。mpl配體等糖蛋白可以利用等電聚焦(IEF)等技術(shù)分離為不同的電荷形式。例如，已經(jīng)有幾個(gè)團(tuán)體報(bào)道了粗制的以及特定純化的促紅細(xì)胞生成素制備物的IEF實(shí)驗(yàn)(lukowskyetal_J．Biochem．50909(1972)；Sheltonetal_Biochem．Med．1245(1975)；Fuhretal_Biochem．Biophy．Res．Comm．98930(1981))。盡管已經(jīng)獲得了上述有關(guān)mpl配體的信息，但是仍有需要制備具有不同糖基化形式的mpl配體分子，它們保留了或具有增強(qiáng)的生物活性。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供稱(chēng)作mpl配體類(lèi)似物的新型糖基化mpl配體分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有所述分子的藥用組合物以及用本發(fā)明的mpl配體類(lèi)似物治療可被mpl配體治療的疾病的方法。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配體類(lèi)似物即與相應(yīng)的天然序列mpl配體相比，該序列至少增加1個(gè)、至少減少了1個(gè)以及／或者同時(shí)至少增加1個(gè)或至少減少1個(gè)糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)的增加或減少可能會(huì)導(dǎo)致與相應(yīng)的天然序列mpl配體相比，具體地是與人mpl配體相比，碳水化合物側(cè)鏈數(shù)目的增多或減少，以及唾液酸含量增大或減小。例如，一種類(lèi)型的類(lèi)似物可以涉及在同一或另一位置上刪減1個(gè)或多個(gè)N-或O-連接位點(diǎn)，以及添加1個(gè)或多個(gè)N-或O-連接位點(diǎn)。在上述實(shí)施方案的另一方面，本發(fā)明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配體類(lèi)似物即用1個(gè)或多個(gè)非天然生成位點(diǎn)取代1個(gè)或多個(gè)N-或O-連接的糖基化位點(diǎn)。因此，一個(gè)N-連接位點(diǎn)可以被另一個(gè)不同的N-連接位點(diǎn)取代；一種N-連接位點(diǎn)可以被一個(gè)O-連接位點(diǎn)取代；一種O-連接位點(diǎn)可以被另一個(gè)不同的O-連接位點(diǎn)取代；以及一種O-連接位點(diǎn)可以被一個(gè)N-連接位點(diǎn)取代。本發(fā)明進(jìn)一步還包括上述變化的任一組合。本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼所述mpl配體類(lèi)似物的DNA序列，以及用于表達(dá)類(lèi)似物的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。在上述的所有情況中，所述糖基化位點(diǎn)的變化都會(huì)導(dǎo)致得到的mpl配體類(lèi)似物中糖基側(cè)鏈數(shù)目、量、定位或類(lèi)型的變化，而仍保留mpl配體的生物活性，即所述類(lèi)似物還能活化mpl受體。mpl受體的活化意味著巨核細(xì)胞生成的加強(qiáng)從而導(dǎo)致體內(nèi)血小板的增加。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示的是原始的人mpl配體的DNA及氨基酸序列，該配體包括一段信號(hào)肽(從第-21～1位氨基酸)和成熟形式的氨基酸序列(1-332)。圖2顯示的是下述操作制備而成的mpl配體的DNA及氨基酸序列把人成熟mpl配體序列第1-174位氨基酸連接到一段長(zhǎng)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽上。上述序列位于編碼區(qū)域的兩側(cè)，該編碼區(qū)域中已經(jīng)分別在5’和3’末端導(dǎo)入了XbaⅠ和SalⅠ克隆位點(diǎn)。圖3顯示的是大腸桿菌以及CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體的Western印跡結(jié)果。MK代表Met-Lys，大腸桿菌表達(dá)時(shí)它被加到mpl配體的N-末端，可以用組織蛋白酶C等二肽酶將其切去。MK已被去除的分子稱(chēng)為desMK。另外還標(biāo)明了糖苷酶神經(jīng)氨酸酶以及聚糖酶處理。圖4給出的是根據(jù)血小板量計(jì)算，大腸桿菌及CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體在正常小鼠體內(nèi)的生物活性。數(shù)據(jù)表明糖基化的mpl配體的活性(CHO表達(dá)的物質(zhì))比非糖基化形式(大腸桿菌表達(dá)的物質(zhì))強(qiáng)。這可能是由于糖基化物質(zhì)的半衰期的延長(zhǎng)引起的。例如，CHO332代表CHO細(xì)胞表達(dá)的人mpl配體氨基酸第1-332位(圖1)。圖5顯示的是對(duì)重組人mpl配體以及類(lèi)似物4、6、7、9、10和11的COS細(xì)胞上清液進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。構(gòu)建這些類(lèi)似物的描述見(jiàn)實(shí)施例4。類(lèi)似物4、7、10具有較慢的凝膠遷移率，所以它們具有至少1個(gè)附加碳水化合物鏈。類(lèi)似物的序號(hào)與表1中提供的類(lèi)似物序號(hào)對(duì)應(yīng)(例如，11對(duì)應(yīng)于類(lèi)似物N11)。對(duì)照物是表1中的N1。圖6顯示的是對(duì)重組人mpl配體以及類(lèi)似物4、5、13、14和15的COS細(xì)胞上清液進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。構(gòu)建這些類(lèi)似物的描述見(jiàn)實(shí)施例4。類(lèi)似物4、13、14和15具有較慢的凝膠遷移率，所以它們具有至少1個(gè)附加碳水化合物鏈。圖7顯示的是人mpl配體的COS細(xì)胞上清液和標(biāo)出的mpl配體類(lèi)似物在N-聚糖酶處理后的Western印跡分析結(jié)果。結(jié)果表明這些類(lèi)似物具有不同的糖基化特征。圖8給出的是用mpl配體類(lèi)似物進(jìn)行的人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)生物分析的結(jié)果。泳道A和D分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。泳道A顯示的孔中接受了37．5pg野生型(即天然序列)mpl配體1-174COS-1條件培養(yǎng)基，該孔表現(xiàn)出明顯的巨核細(xì)胞生長(zhǎng)。泳道D接受了1．5ulCOS-1模擬條件培養(yǎng)基，不表現(xiàn)任何生長(zhǎng)。圖8中的泳道B和C分別為mpl配體1-174類(lèi)似物7和10。泳道B接受了9．0pgmpl配體COS-1條件培養(yǎng)基，而泳道C接受了27pg，而且這兩者都表現(xiàn)出極好的巨核細(xì)胞生長(zhǎng)。圖9顯示的是對(duì)CHOmpl配體1-174及類(lèi)似物N4和N15(見(jiàn)表1)進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。較慢的凝膠遷移表明類(lèi)似物N4(4B)有1個(gè)附加寡糖而類(lèi)似物N15(15-8)有2個(gè)附加寡糖。圖10顯示的是對(duì)標(biāo)示出的已用及未用N-聚糖酶處理的CHO細(xì)胞表達(dá)mpl配體類(lèi)似物進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。用N-聚糖酶處理后凝膠遷移減慢表明存在著N-連接寡糖。圖11顯示的是用不同劑量的各種形式mpl配體處理小鼠后其體內(nèi)血小板計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表明N-和／或O-連接碳水化合物量的增加可以導(dǎo)致體內(nèi)活性的增強(qiáng)。圖12顯示的是對(duì)COS細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-174以及類(lèi)似物N10、N15、N33、N39、N31、N35和N40進(jìn)行western印跡分析的結(jié)果。添加的N-連接糖基化位點(diǎn)的數(shù)目也被標(biāo)明。該圖表明，由于增加N-連接碳水化合物的量，所以增加N-連接位點(diǎn)數(shù)目會(huì)減小mpl配體的遷移率。圖13顯示的是對(duì)COS細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-174以及類(lèi)似物N15、N29、N30和N38進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。N-連接糖基鏈的數(shù)目也被標(biāo)明。圖14顯示的是對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-174和1-199(N31)以及類(lèi)似物N40和N43(見(jiàn)表8)進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。凝膠遷移表明N40和N43有相同數(shù)目的附加寡糖。圖15顯示的是對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-174以及類(lèi)似物N38、N41和N42進(jìn)行Western印跡分析的結(jié)果。凝膠遷移表明每個(gè)類(lèi)似物都有1個(gè)附加寡糖。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了糖基化位點(diǎn)與具有相應(yīng)序列的天然mpl配體不同的mpl配體。優(yōu)選地，得到的分子具有另外的糖基化位點(diǎn)，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如COS、CHO以及人細(xì)胞)中表達(dá)時(shí)，這些位點(diǎn)為糖基側(cè)鏈所占據(jù)。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配體類(lèi)似物即與相應(yīng)的天然序列mpl配體相比，該序列至少增加1個(gè)、至少減少了1個(gè)以及／或者同時(shí)至少增加1個(gè)或至少減少1個(gè)糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)的增加或減少可能會(huì)導(dǎo)致與相應(yīng)的天然序列mpl配體相比，具體地是與人mpl配體相比，碳水化合物側(cè)鏈數(shù)目的增多或減少，以及唾液酸含量增大或減小。同時(shí)增加1個(gè)和減少1個(gè)糖基化位點(diǎn)不會(huì)引起位點(diǎn)數(shù)目的凈變化，而是導(dǎo)致位點(diǎn)的定位和／或類(lèi)型的變化。這類(lèi)同時(shí)變化的類(lèi)似物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。上述實(shí)施方案的另一方面中，本發(fā)明涉及包括一段具有下述特征的氨基酸序列的mpl配體類(lèi)似物即用1個(gè)或多個(gè)非天然位點(diǎn)取代1個(gè)或多個(gè)N-或O-連接的糖基化位點(diǎn)。因此，一個(gè)N-連接位點(diǎn)可以被另一個(gè)不同的N-連接位點(diǎn)取代；一種N-連接位點(diǎn)可以被一個(gè)O-連接位點(diǎn)取代；一種O-連接位點(diǎn)可以被另一個(gè)不同的O-連接位點(diǎn)取代；以及／或者一種O-連接位點(diǎn)可以被一個(gè)N-連接位點(diǎn)取代。在基本同一位置上，用一種位點(diǎn)替代另一種位點(diǎn)可以提高該位點(diǎn)上的糖基化效率，或者其他效果。例如，本發(fā)明提供的證據(jù)，即用Thr殘基取代Ser殘基可以提高O-連接位點(diǎn)的糖基化效率。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“mpl配體”，包括天然生成的mpl配體、天然生成mpl配體的截短形式以及滿足下列條件的非天然生成多肽該多肽的氨基酸序列和糖基化與天然生成mpl配體之間的充分相同從而使其具有能特異性刺激巨核細(xì)胞和／或血小板生長(zhǎng)、發(fā)育以及／或者產(chǎn)生的生物活性。優(yōu)選以圖1中至少第7～151位氨基酸，以至1～332位氨基酸為基礎(chǔ)的mpl配體類(lèi)似物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，mpl配體是轉(zhuǎn)染到真核宿主細(xì)胞中的外源DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物。也就是說(shuō)，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述mpl配體是“重組mpl配體”。優(yōu)選的真核宿主為哺乳動(dòng)物，具體優(yōu)選CHO細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明以及本發(fā)明所引用的有關(guān)mpl配體克隆和表達(dá)的文獻(xiàn)中描述的方法，可以方便地生產(chǎn)出重組mpl配體。另外一些優(yōu)選的重組mpl配體分子具有下列以本發(fā)明圖1為基礎(chǔ)的氨基酸序列。mpl配體1-332氨基酸1-332圖1mpl配體1-199氨基酸1-199圖1mpl配體1-191氨基酸1-191圖1mpl配體1-183氨基酸1-183圖1mpl配體1-174氨基酸1-174圖1mpl配體1-163氨基酸1-163圖1mpl配體1-153氨基酸1-153圖1mpl配體1-152氨基酸1-152圖1mpl配體1-151氨基酸1-151圖1mpl配體7-332氨基酸7-332圖1mpl配體7-199氨基酸7-199圖1mpl配體7-191氨基酸7-191圖1mpl配體7-183氨基酸7-183圖1mpl配體7-174氨基酸7-174圖1mpl配體7-163氨基酸7-163圖1mpl配體7-153氨基酸7-153圖1mpl配體7-152氨基酸7-152圖1mpl配體7-151氨基酸7-151圖l應(yīng)該注意的是，例如，mpl配體1～183、1～191、7～183以及7～191包括C-端的1或2個(gè)附加的天然生成的糖基化位點(diǎn)。上述的每一種配體中，它們的N-端可以進(jìn)一步包括Met-Lys。本發(fā)明中提到的體外特異活性是對(duì)體外特異活性的相對(duì)測(cè)量值，而非體外特異活性的絕對(duì)測(cè)量值。有鑒于此，特異活性只用于對(duì)已用同一實(shí)驗(yàn)分析過(guò)的mpl配體類(lèi)似物的相對(duì)活性進(jìn)行比較，使用相同的條件包括同一種內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)物，對(duì)用于計(jì)算特異活性的數(shù)據(jù)進(jìn)行同樣的分析。本發(fā)明使用的“mpl配體的類(lèi)似物”或“mpl配體類(lèi)似物”是指具有下述特征的mpl配體與mpl配體氨基酸序列有1處或多處不同，從而導(dǎo)致碳水化合物連接位點(diǎn)的類(lèi)型(N-或O-連接，它們可以影響所連接的碳水化合物的量)、數(shù)目或定位發(fā)生變化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，糖基化位點(diǎn)的變化導(dǎo)致該mpl配體分子上連接的糖基側(cè)鏈的數(shù)目變化。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，糖基化位點(diǎn)變化增加了至少1個(gè)(通常為1～6個(gè)，優(yōu)選1～5個(gè)，特別優(yōu)選2～4個(gè))糖基側(cè)鏈，而且最優(yōu)選這個(gè)(或這些)糖基側(cè)鏈增加的方式為N-連接。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，在用實(shí)驗(yàn)測(cè)量生物活性時(shí)，所述的mpl配體類(lèi)似物至少保留了與天然序列的mpl配體(例如，人mpl配體)等效的體內(nèi)生物活性，而且可能具有明顯增強(qiáng)的體內(nèi)活性。這類(lèi)實(shí)驗(yàn)包括對(duì)巨核細(xì)胞或血小板的生成情況進(jìn)行檢測(cè)。為了制備出這類(lèi)mpl配體類(lèi)似物，它們優(yōu)選通過(guò)采用定點(diǎn)誘變引起氨基酸殘基的添加、缺失或取代，從而導(dǎo)致糖基化位點(diǎn)的增加、減少或改變?！案淖儭笔侵冈谝粋€(gè)糖基化位點(diǎn)缺失的同時(shí)在所缺失位點(diǎn)的同一或另一個(gè)位置上添加了另一個(gè)位點(diǎn)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，其他方法也能得到編碼同一種氨基酸序列的基因，這類(lèi)方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。與天然人／重組mpl配體相比，這樣得到的類(lèi)似物可以有更少或更多(優(yōu)選更多)的被連接的碳水化合物側(cè)鏈。向mpl配體上添加1個(gè)或多個(gè)碳水化合物(即糖基)側(cè)鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的一個(gè)重要目的。通過(guò)添加糖基化位點(diǎn)但不破壞二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，可以制備出碳水化合物側(cè)鏈比相應(yīng)的天然氨基酸序列(例如1～332或1～174)更多的mpl配體類(lèi)似物，二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)明顯地減弱生物活性。本發(fā)明中使用的“天然生成的”mpl配體是指與相關(guān)類(lèi)似物具有相應(yīng)數(shù)目氨基酸的氨基酸序列，即使這些種類(lèi)的mpl配體的具體長(zhǎng)度實(shí)際上在天然物種中是無(wú)法表達(dá)的。有利的是，mpl配體可以有多達(dá)6個(gè)的另外的N-糖基化或O-糖基化位點(diǎn)，從而可以添加1～6個(gè)另外的N-連接或O-連接糖基化側(cè)鏈(或其組合)。例如，第30位上的Pro被Asn取代以及第32位上的Val被Thr取代得到序列Asn-Glu-Thr，該序列可以作為一個(gè)新的N-糖基化位點(diǎn)(下面的類(lèi)似物N4，見(jiàn)表1)。還可以通過(guò)組合突變的方式，構(gòu)建具有2個(gè)或多個(gè)另外的N-連接側(cè)鏈的類(lèi)似物；例如，組合表1中描述的類(lèi)似物N4和N10可以生產(chǎn)出一種具有兩個(gè)碳水化合物添加位點(diǎn)的類(lèi)似物(即，表1中的類(lèi)似物N15)。可以用類(lèi)似的方式構(gòu)建具有3個(gè)或多個(gè)添加側(cè)鏈的類(lèi)似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明包括許多其他的具有不同糖基化位點(diǎn)(就位點(diǎn)的數(shù)目、類(lèi)型或定位而言)的mpl配體類(lèi)似物。所有情況下，本發(fā)明中所述的mpl配體類(lèi)似物都特別優(yōu)選以具有人氨基酸序列的mpl配體(見(jiàn)圖1和2)為基礎(chǔ)；但是，以其他物種(例如狗、豬、猴、小鼠或大鼠)的mpl配體序列為基礎(chǔ)的類(lèi)似物也在本發(fā)明的考慮范圍之內(nèi)。插入氨基酸制備糖基化位點(diǎn)也被考慮。例如，如同下面顯示的那樣，第57位上的Glu被Thr取代，在緊靠第55位Met的后面插入Asn這樣就添加了一個(gè)新的糖基化位點(diǎn)(第55’、56和57位氨基酸)。見(jiàn)下述類(lèi)似物N23。本發(fā)明的類(lèi)似物還包括從mpl配體的羧基末端向外延伸1個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的類(lèi)似物，其中羧基末端的延伸可以提供至少1個(gè)另外的糖基化位點(diǎn)。mpl配體的羧基末端將隨所用的mpl配體具體形式(例如，mpl配體第1～332位氨基酸，或mpl配體第1～163位氨基酸)而發(fā)生變化?？梢酝ㄟ^(guò)向羧基末端添加含有1個(gè)或多個(gè)N-或O-連接糖基化位點(diǎn)的氨基酸，在mpl配體的羧基末端上添加一個(gè)另外的糖基化位點(diǎn)。表1和6中列出了一些典型的mpl配體類(lèi)似物，它們具有附加的N-連接碳水化合物側(cè)鏈連接位點(diǎn)。為了制備N(xiāo)-連接位點(diǎn)，這些類(lèi)似物具有Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，該序列被包含在以人氨基酸序列為基礎(chǔ)的人mpl配體多肽的各種位置。表4和7列出的是添加了至少1個(gè)另外的N-連接碳水化合物側(cè)鏈的類(lèi)似物，見(jiàn)這些糖蛋白在SDS凝膠上遷移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)，實(shí)施例6以及圖3、5、6、7、9、10、12和13)。注意這些表中還包括了一些不是本發(fā)明所定義的“類(lèi)似物”的截短形式(即，N1、N16、N17和31)。將它們列于表中是為了顯示各種截短形式是如何制備的。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明公開(kāi)的mpl配體類(lèi)似物的DNA序列，優(yōu)選編碼具有另外的N-連接側(cè)鏈連接位點(diǎn)的類(lèi)似物的DNA序列。實(shí)施例4和14中公開(kāi)的方法可以用于把變化導(dǎo)入mpl配體DNA序列，從而制備、缺失和／或改變碳水化合物的連接位點(diǎn)。這些mpl配體類(lèi)似物可以是外源DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物，即通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的，它們也可以是化學(xué)合成產(chǎn)物或它們可以通過(guò)聯(lián)合方法制備。外源DNA序列包括編碼mpl配體類(lèi)似物的cDNA、基因組DNA或化學(xué)合成DNA。另外還提供了用于表達(dá)這類(lèi)類(lèi)似物的重組DNA質(zhì)粒和真核宿主細(xì)胞。表達(dá)載體包括能夠在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)克隆的DNA序列的任何載體，具體是那些在COS和CHO細(xì)胞中表達(dá)時(shí)使用的載體。這類(lèi)載體的實(shí)例包括質(zhì)粒pDSRα和pDSRα2，參見(jiàn)Mol．Cell．Biol．8466-472(1988)；WO91／13160(1991)；以及WO90／14363(1990)。表達(dá)mpl配體類(lèi)似物的COS及CHO細(xì)胞的培養(yǎng)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。改變mpl配體上連接的碳水化合物側(cè)鏈的數(shù)目、類(lèi)型、定位或量，可以賦予其有利的特性，例如增加穩(wěn)定性、增強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)水解的抗性、減弱免疫原性、延長(zhǎng)血清半衰期以及增強(qiáng)或改變生物活性。對(duì)來(lái)自表達(dá)mpl配體類(lèi)似物N2～N15(N1是人mpl配體1～174)的COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(conditionedmedia)進(jìn)行體外生物活性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)來(lái)自表達(dá)mpl配體類(lèi)似物／截短形式N15～N40的COS的條件培養(yǎng)基進(jìn)行體外生物活性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表7。各種形式的體內(nèi)生物活性的結(jié)果列于圖11(見(jiàn)實(shí)施例11)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及哺乳動(dòng)物(例如，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢，CHO)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞優(yōu)先合成每個(gè)分子連接著比特定量更多的唾液酸的mpl配體或mpl配體類(lèi)似物，例如比真核細(xì)胞中天然或重組生成的下列分子中發(fā)現(xiàn)的唾液酸含量更大mpl配體1～332、1～199、1～191、1～183、1～174、1～163、1～153、1～152或1～151。類(lèi)似物N4及N15的體外活性，與在CHO細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)以及各種截短形式一并顯示于表5。mpl配體分子的唾液酸含量可以影響它的體內(nèi)生物活性。例如，四觸角(4個(gè)側(cè)鏈)N-連接寡糖通常多數(shù)會(huì)提供4個(gè)可能的唾液酸連接位點(diǎn)，而可以在天冬氨酸-連接位點(diǎn)上替換四觸角形式的二觸角及三觸角寡糖，通常幾乎只連接有2或3個(gè)唾液酸。O-連接位點(diǎn)通常提供2個(gè)唾液酸連接位點(diǎn)。因此，如果N-連接寡糖是四觸角的，用N-連接碳水化合物替代O-連接碳水化合物的mpl配體分子，則可以在每個(gè)側(cè)鏈上再供給2個(gè)另外的唾液酸。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中篩選出具有下述特征的細(xì)胞這些細(xì)胞優(yōu)選向重組mpl配體上添加四觸角側(cè)鏈從而使唾液酸連接位點(diǎn)的數(shù)目達(dá)到最大。通常，用二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，用于生產(chǎn)包括重組mpl配體在內(nèi)的糖蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步還包括組合物，該組合物包括治療有效量的mpl配體類(lèi)似物，以及與其配套的有益于mpl配體治療的一種合適稀釋劑、佐劑和／或載體。本發(fā)明中使用的“治療有效量”是指能為特定病癥提供治療效果的用量以及服用方案。本發(fā)明的組合物可以采用腸道外系統(tǒng)給藥，替代地，該組合物可以靜脈內(nèi)或皮下給藥。當(dāng)系統(tǒng)給藥時(shí)，本發(fā)明使用的治療組合物可以采取無(wú)熱源腸道外可接受水溶液的形式。這類(lèi)藥用可接受蛋白溶液的制備，并對(duì)pH、等滲性、穩(wěn)定性等因素給予適當(dāng)考慮，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的范圍之內(nèi)。選擇的特定途徑取決于所治療的病癥。mpl配體或mpl配體類(lèi)似物的施用優(yōu)選作為制劑的一部分進(jìn)行，該制劑包括一種合適的載體，例如人血清白蛋白，一種合適的稀釋劑，例如緩沖鹽溶液，以及／或者一種合適的佐劑。所需劑量為足以能升高患者血小板水平的用量，而且所需劑量要根據(jù)所治療病癥的嚴(yán)重程度、選用的用藥方法等進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明所述的方法和組合物可用來(lái)治療下述病癥，即存在巨核細(xì)胞／血小板缺陷或者可以預(yù)料到以后會(huì)出現(xiàn)巨核細(xì)胞／血小板缺陷(例如，由于計(jì)劃的外科手術(shù))的病癥。這些組合物和方法也可以用于增加個(gè)體中循環(huán)系統(tǒng)血小板數(shù)目，增加供體可獲得血小板的數(shù)目。通常，這類(lèi)病癥起因于體內(nèi)活性mpl配體的缺陷(暫時(shí)或長(zhǎng)久)。血小板缺陷的通用術(shù)語(yǔ)是血小板減少，因此本發(fā)明的方法和組合物通常可用于治療血小板減少。血小板減少(血小板缺陷)可以有多種起因，包括化療、骨髓移植、以及其他使用多種藥物的治療、放療、手術(shù)、突發(fā)性失血以及其他特定病癥。涉及血小板減少并且可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的疾病有再生障礙性貧血、自發(fā)性血小板減少、會(huì)導(dǎo)致血小板減少的轉(zhuǎn)移性腫瘤、全身性紅斑狼瘡、脾腫大、范科尼綜合癥、維生素B12缺乏癥、葉酸缺乏癥、May-Hegglin異常、維一奧二氏綜合癥、以及陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿。另外，對(duì)于AIDS的某些治療也會(huì)導(dǎo)致血小板減少(例如，AZT)。某些傷口愈合異常也可受益于血小板數(shù)目的增加。當(dāng)預(yù)先考慮到血小板要減少時(shí)，例如由于即將進(jìn)行的手術(shù)或即將進(jìn)行的能引發(fā)血小板減少的治療，可以在需要血小板前幾天至幾小時(shí)施用本發(fā)明中的一種mpl配體類(lèi)似物。當(dāng)發(fā)生緊急情況時(shí)，例如突發(fā)性大出血，可以將一種mpl配體類(lèi)似物與血液或純化血小板一起施用。用于治療上述病癥的方法中涉及的給藥方案由臨床醫(yī)師考慮各種能改變藥物作用的因素后決定，例如，患者的年齡、病情、體重、性別及飲食，感染的嚴(yán)重程度，用藥時(shí)間以及其他臨床因素。通常，mpl配體類(lèi)似物的日用量應(yīng)該為0．01～1000mg／kg(體重)，優(yōu)選0．1～10mg／kg(體重)。本發(fā)明所述的治療方法、組合物以及多肽也可以單獨(dú)使用，或者與其他細(xì)胞因子、可溶性mpl(即mpl配體)受體、生血因子、白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子或抗體配合使用，治療以血小板減少以及其他癥狀為特征的疾病。在預(yù)料之中的是，mpl配體類(lèi)似物分子與IL-3、GM-CSF等通用的血小板減少刺激劑配合使用，證明可以有效地治療一些形式的血小板減少。其他的巨核細(xì)胞刺激因子，即meg-CSF、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、白細(xì)胞抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)或其他具有巨核細(xì)胞刺激活性的分子也可以與mpl配體一起使用。其他典型的細(xì)胞因子或生血因子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干擾素-α(IFN-α)、IFN-β或IFN-γ。另外，同時(shí)或隨后施用有效量的可溶性哺乳動(dòng)物mpl受體也有益處，該受體具有下述功效待巨核細(xì)胞一旦成熟，便將其破碎成為血小板。因此，預(yù)想在施用mpl配體類(lèi)似物(增加成熟巨核細(xì)胞的數(shù)目)后再施用可溶性mpl受體(滅活類(lèi)似物以及讓成熟的巨核細(xì)胞生成血小板)是一種特別有效的刺激血小板生成的方式?？梢詫?duì)上面列出的劑量進(jìn)行調(diào)整以補(bǔ)償所述治療組合物中的同類(lèi)的其他成分?？梢杂贸Ｒ?guī)方法監(jiān)測(cè)接受治療患者病情的發(fā)展情況。也可以對(duì)本發(fā)明類(lèi)似物進(jìn)行其他修飾，例如，增強(qiáng)活性、穩(wěn)定性、延長(zhǎng)半衰期等。例如，可以通過(guò)蛋白質(zhì)上的氨基或羧基把pegylation(多-或單-)加到mpl配體類(lèi)似物上。另外，也可以把脂肪酸或其他聚合體連接到蛋白質(zhì)或糖基上。提供下面的實(shí)施例是為了更充分說(shuō)明本發(fā)明，而非用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中生物分析使用的mpl配體標(biāo)準(zhǔn)物是一種重組的mpl配體標(biāo)準(zhǔn)物，該標(biāo)準(zhǔn)物在大腸桿菌中表達(dá)，然后重折疊成一種活性構(gòu)象并經(jīng)純化。因此，測(cè)量的只是相對(duì)的特異性活性。實(shí)施例1mpl配體1-174的構(gòu)建用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從人胎兒肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中制備出編碼圖2中第1～174位氨基酸(從S-P-A-P-P-A…)的人mpl配體基因(Bartleyetal_cell771117-1124(1994))。5’端PCR引物編碼人mpl配體的氨基末端、一個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)以及一段最佳的Kozak序列。3’端引物含有一個(gè)終止密碼子和一個(gè)SalⅠ限制酶切位點(diǎn)。用XbaⅠ和SalⅠ消化擴(kuò)增得到的DNA片段，然后將其連接到已經(jīng)用XbaⅠ和SalⅠ消化過(guò)的pDSRα2中。將得到的質(zhì)粒，pDSRα2mpl配體1～174用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)。得到的基因的序列(包括信號(hào)肽在內(nèi))見(jiàn)圖2。用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ消化含有mpl配體1～174的質(zhì)粒DNA，將消化得到的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用GeneCleanTM試劑盒和廠商提供的方法(BIO101，INC．)把長(zhǎng)為605nt的mpl配體1～174DNA片段從凝膠中分離出來(lái)。再用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ消化WO90／14363中描述的質(zhì)粒pDSRα2，回收載體片段。連接上述兩個(gè)片段，得到pDSRα2(mpl配體1～174)。實(shí)施例2mpl配體1～174在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及純化用pDSRα2-mpl配體1～174轉(zhuǎn)化二氫葉酸還原酶缺陷(DHFR-)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在感染的前一天，用生長(zhǎng)在CHOD-培養(yǎng)基(DMEM，10％胎牛血清、1％青霉素／鏈霉素／谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(Gibco)和1％HT添加物)中的1×106CHODHFR-細(xì)胞鋪板在100mm組織培養(yǎng)皿中。共進(jìn)行4組感染。對(duì)于每組感染，用PvuⅠ和緩沖液H(BoehringerMannheim)把質(zhì)粒DNA(50μg)消化成線性。然后形成DNA沉淀，按照哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(SpecialityMedia)的說(shuō)明將其滴加到平板上。在組織培養(yǎng)箱中溫育24小時(shí)后，用新鮮的CHOD-培養(yǎng)基替換已用的培養(yǎng)基。24小時(shí)后，按每孔100μlCHO選擇培養(yǎng)基(D-MEM、5％透析過(guò)的胎牛血清、1％青霉素／鏈霉素／谷氨酰胺、1％非必需氨基酸(Gibco))將細(xì)胞分布到96孔組織培養(yǎng)板中，選擇轉(zhuǎn)化體。每周更換培養(yǎng)基直至克隆出現(xiàn)。2周后，用下面描述的32D細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)實(shí)施例9)對(duì)mpl配體表達(dá)進(jìn)行篩選。將那些表達(dá)量超過(guò)1×105單位／ml的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并低溫凍存。將一個(gè)克隆轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲大約8升的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)。如上所述，用含有mpl配體1～174cDNA的質(zhì)粒pDSRα2轉(zhuǎn)染DHFR-缺陷CHO細(xì)胞。從以表達(dá)mpl配體1～174的CHO細(xì)胞為種子培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)瓶中取2升無(wú)血清CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基(50％DMEM、50％HAMS-F12，1％青霉素／鏈霉素／谷氨酸鹽、1％非必需氨基酸(Gibco))，用2LAmiconModel2000型細(xì)胞渦旋器以及10，000道爾頓分子量的截留膜(YM10，Amicon)將上述培養(yǎng)基濃縮15倍。然后，取45ml濃縮后的條件培養(yǎng)基，用Pharmacia快速蛋白液相層析(FPLC)以0．4ml／min的流速直接加樣到4mlhu-MPL-X親和柱上。親和柱通過(guò)按照廠商的建議在每毫升PharmaciaCNBr活化的瓊脂糖樹(shù)脂上偶合1．5～2．5mgmpl-X(mpl受體的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域)構(gòu)建而成。加樣后，用16ml磷酸鹽緩沖液(PBS；10mMNa·PO4pH6．8／150mMNaCl)洗滌柱體，然后再用10mMTris，pH8．0／1MNaCl洗滌。用40ml20mMCAPS(3-[環(huán)己基氨基]-1丙磺酸)pH10．5／1MNaCl／5mMCHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)二甲基胺]-1-丙磺酸鹽)將mpl配體(1～174)洗脫到6ml的級(jí)分中。第二個(gè)級(jí)分在14％SDS凝膠上只產(chǎn)生1個(gè)條帶。濃縮該物質(zhì)，并用0．9％NaCl鹽溶液緩沖置換，使之在體外及體內(nèi)均具有生物活性。以類(lèi)似方式純化表達(dá)mpl配體的其他形式的CHO細(xì)胞。實(shí)施例3重組人mpl配體的體內(nèi)生物活性對(duì)用各種形式mpl配體處理過(guò)的小鼠進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。生產(chǎn)出CHO-表達(dá)的mpl配體1～332、1～174、1～163和1～153，用常規(guī)層析技術(shù)進(jìn)行純化。圖4顯示的是用各種形式CHO細(xì)胞表達(dá)的(實(shí)線)或大腸桿菌表達(dá)的(虛線)重組人mpl配體處理過(guò)的小鼠的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。連續(xù)5天用標(biāo)明濃度的mpl配體皮下注射正常雌性Balb／c小鼠。最后一次注射后24小時(shí)，收集取自尾靜脈上一個(gè)小的側(cè)向切口的血樣。用Sysmex電子血細(xì)胞分析儀(BaxterDiagnostics，Inc．Irvine，CA)進(jìn)行血細(xì)胞測(cè)試。數(shù)據(jù)表示為4個(gè)動(dòng)物測(cè)定數(shù)值的平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差。其他血細(xì)胞參數(shù)，例如白細(xì)胞總數(shù)或紅細(xì)胞總數(shù)都未受這些處理的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果表明，CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體相對(duì)于大腸桿菌中表達(dá)的同一形式的mpl配體體內(nèi)活性更強(qiáng)。如實(shí)施例6中所述，CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體都含有N和／或O-連接碳水化合物，而大腸桿菌表達(dá)的mpl配體則不含有。這一結(jié)果表明碳水化合物能夠增強(qiáng)mpl配體的體內(nèi)活性。碳水化合物賦予的增強(qiáng)了的體內(nèi)活性可能是由于循環(huán)系統(tǒng)半衰期的延長(zhǎng)、穩(wěn)定性的增強(qiáng)或者二者兼而有之引起的。實(shí)施例4mpl配體類(lèi)似物N2～N15的構(gòu)建下面描述了用于制備mpl配體上附加糖基化位點(diǎn)的方法。合成下列寡核苷酸引物用于體外誘變制備類(lèi)似物N2～N14(這些類(lèi)似物的構(gòu)建見(jiàn)表1)N2-CCCATGTCAATCACAGCAGACTSEQIDNO．5N3-CTTCACAGCAACCTGAGCCAGTSEQIDNO．6N4-CAGTGCAACGAGACCCACCCTTTGSEQIDNO．7N5-GCCTACAAATGTCACGCTGCCTGCTSEQIDNO．8N6-CCCACTTGTAACTCATCCCTCSEQIDNO．9N7-CAACTGAACGCCACTTGTCTCTCASEQIDNO．10N8-ACTTGTCTCAACTCCACCCTGGGGGASEQIDNO．11N9-CTCCTGGGGAACCTTTCTGGASEQIDNO．12N10-GACCACAAATCACACCGATCCCAATSEQIDNO．13N11-ACCCTTTGTCTACAAATGTCACGCTGCCTGCTSEQIDNO．14N12-TCTCTCAAACCTCACGGGGGAGCTTSEQIDNO．15N13-TGGAAAAATCAGACGGAGGAGACSEQIDNO．16N14-TGGAGGAGAACAAGACACAGGACATSEQIDNO．17為了構(gòu)建m13mp18mpl配體1～174，將圖2中的基因?qū)氲接肵baI和SalⅠ消化過(guò)的m13mp18DNA中。按照Kunkeletal_methodsinenzymol．154367(1987)以及Messing，methodsinenzymol.10120(1983)中描述的方法，從被m13mp18(mpl配體1～174)感染過(guò)的大腸桿菌RZ1032株的上清液中回收單鏈DNA。取單鏈DNA約0．5μg和上述的一種合成引物0．125pM，將其與6μl緩沖液(250mMTrispH7．8，50mMMgCl2，50mM二硫蘇糖醇和1％牛血清白蛋白(BSA-Pharmacia))混合用于體外誘變。在加入以前先用ATP和T4多核苷酸激酶對(duì)上述引物進(jìn)行激酶化。用水將反應(yīng)體積調(diào)至1Oμl，將混合物65℃加熱5分鐘后再讓其冷卻至室溫，以使引物與模板之間發(fā)生退火。在延長(zhǎng)反應(yīng)中，dTTP，dATP，dGTP和dCTP每種各加入2．5μl和1mlATP(濃度都為10uM)，隨后加入1μl(1單位)大腸桿菌DNA聚合酶(Klenow片段)和1μl(1單位)T4DNA連接酶。然后按照文獻(xiàn)(Messing，上述)中描述的方法，將混合物在14℃下溫育過(guò)夜后，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株(Yanisch-Perronetal．Gene33，103(1985))。為了用示差雜交法對(duì)突變體克隆進(jìn)行鑒定，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的噬斑轉(zhuǎn)移到GeneScreen濾膜(NewEnglandNuclear)上。采用自動(dòng)交連的模式(Stratagene)用UVStratalinkerModel1800對(duì)它們進(jìn)行照射，從而使DNA交連到濾膜上。然后將其置于含1％SDS的6xSSC(0．9MNaCl／0．09M檸檬酸鈉)中60℃下溫育1小時(shí)。在雜交反應(yīng)中，用T4多核苷酸激酶和γ32p-標(biāo)記的ATP對(duì)上述寡核苷酸引物進(jìn)行末端標(biāo)記，然后將其與濾膜一起溫育在6xSSC，0．5％SDS和125ug／ml鯡精DNA中。根據(jù)寡核苷酸熔點(diǎn)的估計(jì)值，選定雜交溫度。通常，雜交溫度為比熔點(diǎn)低約10℃。第二天，在雜交溫度下用6XSSC／1％SDS洗滌濾膜兩遍，隨后再在雜交溫度下用6XSSC洗滌兩遍，然后進(jìn)行放射自顯影。如有必要，隨后再在較高的溫度下用6XSSC洗滌濾膜直到具有野生型mpl配體cDNA序列的噬斑上幾乎或根本檢測(cè)不到雜交為止。鑒定出這些情況下呈現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)的克隆，并將其再轉(zhuǎn)染JM109，從而分離出純的克隆。雙脫氧鏈終止法測(cè)序?qū)嶒?yàn)的結(jié)果表明有突變體存在。從按照廠商提供的方法用QIAGEN試劑盒(ChatsworthCA．)轉(zhuǎn)染的JM109中回收帶有期望變化的雙鏈m13mpl配體1-174DNAs。用XbaI和SalⅠ消化上述DNAs，分離得到長(zhǎng)為605bp的mpl配體DNA片段。用XbaⅠ和SalⅠ消化pDSRα2。分離載體片段，并將其與上述的mpl配體片段連接。用限制性酶切實(shí)驗(yàn)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。得到的質(zhì)粒(命名為mpl配體1-174-NX，其中的NX是類(lèi)似物的序號(hào))含有編碼mpl配體類(lèi)似物的DNA，該類(lèi)似物在指定位置上發(fā)生了氨基酸殘基的變化。對(duì)目的質(zhì)粒再次測(cè)序以確定期望突變的存在。構(gòu)建的類(lèi)似物N15在第30位和第120位殘基上具有兩個(gè)附加的N-連接糖基化位點(diǎn)。用XbaⅠ和PstⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化含有Asn30和Thr32突變的PDSRα2mpl配體174-N4，分離得到長(zhǎng)約385nt的DNA片段。用PstⅠ和SalⅠ消化含有Asn120和Thr122突變的PDSRα2mpl配體174-N10，分離分離得到長(zhǎng)約220nt的DNA片段。用XbaⅠ和SaⅡ消化pDSRα2。分離載體片段，并將其與上述的mpl配體片段相連接。在所得到的PDSRα2mpl配體174-N15中含有Asn30、Thr32、Asn120以及Thr122取代。用常規(guī)方法構(gòu)建表1中所示的mpl配體類(lèi)似物。每個(gè)類(lèi)似物的DNA序列變化全部列出；同時(shí)用于誘變的寡核苷酸引物的序列與人mpl配體的序列互補(bǔ)。表1類(lèi)似物／種類(lèi)No．氨基酸的取代序列變化N1(1-174)；Pro175→Gly332缺失CCA→TGA(終止密碼子)N2Leu22→Asn22CCT→AATN3Arg25→Asn25AGA→AACN4Pro30，Val32→Asn30，Thr32CCA，GTT→AAC，ACCN5Pro38，Leu40→Asn38，Thr40CCT，CTG→AAT，ACGN6Leu86→Asn86CTC→AACN7Gly82，Pro83→Asn82，Ala83GGA，CCC→AAC，GCCN8Ser87，Leu89→Asn87，Thr89TCA，CTC→AAC，ACCN9Gln92→Asn92CAG→AACN10Ala120，Lys122→Asn120，Thr122GCT，AAG→AAT，ACCN11Pro36，Pro38，Leu40→Ser36，Asn38，Thr40CCT，CCT，CTG→TCT，AAT，ACGN12Ser88，Leu90→Asn88，Thr90TCC，CTG→AAC，ACGN13Thr53，Met55→Asn53，Thr55ACC，ATG→AAT，ACGN14Thr58，Ala60→Asn58，Thr60ACC，GCA→AAC，ACAN15Pro30，Val32，Ala120，Lys122→Asn30，Thr32，AsCCA，GTT，GCT，AAG→AAC，n120，Thr122ACC，AAT，ACC注意在本發(fā)明中類(lèi)似物N2-N15也可以同義地稱(chēng)為類(lèi)似物2-15。另外，本發(fā)明中使用的，例如，[Asn22]mpl類(lèi)似物是指所考慮的特定mpl配體的第22位殘基被天冬酰胺所取代，所述的mpl配體優(yōu)選至少含有圖1中的第7-151位氨基酸的人序列(包括上述的優(yōu)選人mpl配體序列)。因此，用天冬酰胺取代mpl配體1-174(人序列)第22位上的亮氨酸生成的mpl配體類(lèi)似物可被表示為[Asn22]mpl配體1-174。通過(guò)把mpl配體DNA插入到pDSRα2中，構(gòu)建出被稱(chēng)為pDSRα21-174-NX(其中的NX是類(lèi)似物的序號(hào))的質(zhì)粒。表達(dá)載體pDSRα2的一般描述見(jiàn)WO90／14363(1990)。用XbaⅠ和SalⅠ消化質(zhì)粒pDSRα2，制備質(zhì)粒pDSRα2mpl配體1-174-NX。分離載體片段，并將其與長(zhǎng)為605bp的含期望序列的片段相連接。實(shí)施例5在COS細(xì)胞中表達(dá)mpl配體和mpl配體N1-N15通過(guò)電穿孔，把表1中描述的人mpl配體以及mpl配體類(lèi)似物cDNA克隆轉(zhuǎn)化到COS-1細(xì)胞(ATCCNo．CRL-1650)中。用培養(yǎng)基(含10％胎牛血清和1％L-谷氨酸鹽／青霉素／鏈霉素的Dulbecco改良基本培養(yǎng)基(IrvineScientific))洗滌半?yún)R合培養(yǎng)皿(semi-confluentdishes)收獲COS-1細(xì)胞，并將其以6×106細(xì)胞／ml的濃度重懸。將0．5ml細(xì)胞轉(zhuǎn)移到0．2cm的電穿孔小管(Bio-Rad)中，然后在650uF及130伏的低電壓下用BTX電穿孔系統(tǒng)Electrocell操作儀用50μg編碼mpl配體類(lèi)似物的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電穿孔。用10ml培養(yǎng)基將電穿孔后的細(xì)胞鋪板于100mm組織培養(yǎng)皿上。鋪板后20～24小時(shí)，用10ml新鮮培養(yǎng)基替換上述培養(yǎng)基。電穿孔后3～5天，收集條件培養(yǎng)基。實(shí)施例6Mpl配體以及Mpl配體N1-N15的特性A．碳水化合物添加的測(cè)定室溫下，用兔抗-mpl配體多克隆抗體免疫沉淀含有約30-60ngmpl配體或mpl配體類(lèi)似物的大量上清液，所述配體或配體類(lèi)似物來(lái)自按照實(shí)施例5中描述的方法用mpl配體類(lèi)似物cDNAs轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞。某些情況下，其中的表達(dá)水平較低，所以將約8～9ml的最大體積用于免疫沉淀。制備抗mpl配體1-163的抗體，該配體已在大腸桿菌中表達(dá)并純化。向免疫沉淀反應(yīng)物中加入含有0．1％疊氮鈉的蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠1∶1磷酸鹽緩沖液(PBS)30μl，室溫溫育1小時(shí)。離心上述樣品，用PBS洗滌，然后重懸于SDS樣品緩沖液(0．125MTris-HClpH6．8／4％SDS／20％甘油／10％β巰基乙醇／0．001％溴酚藍(lán))中。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)樣品進(jìn)行分析，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用抗合成mpl配體多肽(例如，對(duì)應(yīng)于圖1中所示第47～62位殘基的多肽)的鼠抗-mpl配體單克隆抗體按照文獻(xiàn)(Burnetteetal_Anal．Biochem．112195-203(1981)；Elliottetal_Gene79167-180(1989))中描述的方法進(jìn)行Western分析。用ECL試劑盒(Arnersham)對(duì)含mpl配體的條帶進(jìn)行顯色。圖5顯示，與人序列的mpl配體174(N1)相比，來(lái)自用類(lèi)似物N4、N7和N10DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的COS細(xì)胞上清液中的分子更大。圖6表明，來(lái)自用類(lèi)似物N13、N14和N4DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的COSA細(xì)胞上清液中的分子也比人序列的mpl配體更大。這種分子大小的增大表明有附加N-連接碳水化合物鏈的存在。N15含兩個(gè)附加N-連接糖基化位點(diǎn)。圖6表明這種類(lèi)似物比只含1個(gè)附加N-連接糖基化物的類(lèi)似物要大。蛋白質(zhì)的大小是從它們?cè)赟DS-PAGE上相對(duì)于分子量已知的蛋白標(biāo)準(zhǔn)物的遷移率估算出來(lái)的。從圖6中計(jì)算出來(lái)的較大條帶的大小估算值顯示于表2中。運(yùn)一結(jié)果表明N15中含有2個(gè)附加的N-連接鏈。其他選定類(lèi)似物的western印跡分析結(jié)果也顯示于圖6中。表2N-連接碳水化合物的估算值進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明mpl配體類(lèi)似物大小的增加是由于N-連接碳水化合物的添加引起的。按照上述方法，對(duì)含有mpl配體的COS細(xì)胞條件培養(yǎng)基進(jìn)行免疫沉淀，用PBS洗滌。然后，向每個(gè)試管中加入0．5％SDS10μl，并且將所有樣品煮沸3分鐘。然后，加入下列成分10．8μl0．5MNaPO4pH8．6、5ml7．5％NP40以及3ul250單位／mlN-聚糖酶(Genzyme)。N-聚糖酶的處理能夠除去N-連接碳水化合物。將樣品在37℃下溫育6小時(shí)。加入SDS-PAGE加樣緩沖液終止反應(yīng)，然后按照上述方法，使用抗-mpl配體單克隆抗體和抗-鼠ECLwestern檢測(cè)試劑盒(Amersham)來(lái)進(jìn)行SDS-PAGEWestern分析(12％丙烯酰胺)。用該方法對(duì)人mpl配體和mpl配體類(lèi)似物進(jìn)行N-連接鏈分析的結(jié)果見(jiàn)圖7。用N-聚糖酶處理后，N4、N7和N10在Western印跡中的遷移率都減小到N1的水平。正如預(yù)想的那樣，由于N1上沒(méi)有任何附加的N-連接碳水化合物位點(diǎn)，所以用N-聚糖酶處理N1后對(duì)其遷移率沒(méi)有任何影響。這些結(jié)果表明表觀分子量的增加是由于N-連接碳水化合物的添加引起的B．對(duì)mpl配體上的O-連接碳水化合物的分析為了分析O-連接碳水化合物對(duì)人mpl配體的影響，用上述方法從CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基中純化出各種形式的蛋白質(zhì)。每一形式都用O-聚糖酶(糖肽α-N-乙酰半乳糖-aminidase，OxfordGlycoSystems)進(jìn)行+／-處理。O-聚糖酶從糖蛋白中除去O-連接的碳水化合物。每種形式的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物用作未糖基化對(duì)照。為了確定O-連接碳水化合物對(duì)分子量的不同影響，需要首先除去N-連接碳水化合物。由于全長(zhǎng)形式mpl配體1-332中含有N-連接碳水化合物，所以對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)的全長(zhǎng)樣品進(jìn)行N-聚糖酶處理，具體操作除N-聚糖酶處理過(guò)夜溫育外其他與對(duì)上述COS細(xì)胞表達(dá)的mpl配體類(lèi)似物的處理相同。在用O-聚糖酶對(duì)全長(zhǎng)(1-332)mpl配體處理之前，先用1／15體積的100mM、pH2．2乙酸將樣品的范圍調(diào)至pH6．0～pH7．0。取1毫克蛋白質(zhì)置于SDS中變性煮沸3分鐘，然后在1mM、pH6．8乙酸鈣以及20mM、pH6．8磷酸鈉中用1U／ml神經(jīng)氨酸酶(唾液酸酶，來(lái)自產(chǎn)脲節(jié)桿菌，BoehringerMannheirn)37℃溫育60分鐘。隨后，在100μl的終體積中加入5mU的酶進(jìn)行O-聚糖酶處理，37℃溫育過(guò)夜。SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)分離蛋白質(zhì)(0．2μg／泳道)。然后將其轉(zhuǎn)移到0．2μm硝酸纖維素膜上，用抗-mpl配體的多克隆抗體過(guò)夜溫育，用抗-鼠ECLWestern檢測(cè)試劑盒(Arnersham)觀察mpl配體蛋白。圖3顯示的是4種不同形式的人mpl配體的Western印跡結(jié)果。泳道1～3為全長(zhǎng)的mpl配體1-332，泳道4～6為mpl配體1-174，泳道7～9為mpl配體1-163，泳道10～12為mpl配體1-153。用神經(jīng)氨酸酶和O-聚糖酶處理后，泳道2、5、8和11都顯示其中的分子量都減小到與泳道3、6、9和12中未糖基化物質(zhì)相同的水平。所有的情況下，遷移率增加到大腸桿菌表達(dá)的非糖基化形式的水平。這些結(jié)果表明泳道1、4、7中的條帶較大是由于O-連接碳水化合物引起的。每個(gè)條帶分子量都是通過(guò)與分子量已知蛋白質(zhì)的遷移率比較估算得到的。從顯示不同蛋白質(zhì)的分子量估算值的表3中的內(nèi)容可以看出，遷移率的表觀變化可以從mpl配體1-332上的14條、mpl配體1-174上的9條、mpl配體1-163上的4條、mpl配體1-153上的2條O-連接碳水化合物鏈(每條鏈約為950Da)中得到解釋。泳道2中的樣品為全長(zhǎng)mpl配體1-332。這種蛋白質(zhì)出現(xiàn)了降解，可能是由于37℃下糖基化酶的過(guò)度溫育引起的。因此，泳道3中的大腸桿菌表達(dá)的非糖基化形式被用來(lái)計(jì)算添加到CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-332上的O-連接碳水化合物的近似分子量。這些結(jié)果與被測(cè)試的mpl配體的所有CHO細(xì)胞表達(dá)形式中存在碳水化合物一致。用單糖組成直接分析確證了CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-332、1-174以及1-163上存在著O-連接碳水化合物。通過(guò)酸水解，從糖蛋白中釋放出唾液酸、GalNAc和Gal。用高壓陰離子交換層析以及脈沖式電流檢測(cè)法檢測(cè)上述單糖。對(duì)每種形式的mpl配體都進(jìn)行所有3種單糖的檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明存在著含O-連接碳水化合物的唾液酸。這一結(jié)果與圖4中給出的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中mpl配體的CHO細(xì)胞表達(dá)形式的體內(nèi)活性都比大腸桿菌表達(dá)的對(duì)等形式高。因此，碳水化合物的存在能夠增強(qiáng)mpl配體的體內(nèi)活性。表3O-連接碳水化合物的計(jì)算實(shí)施例7mpl配體的ELISA分析多克隆抗體的制備--在3個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)，用大腸桿菌表達(dá)的重組人mpl配體1-163超免疫新西蘭大白兔。從6只表現(xiàn)高抗體滴度的大白兔中收集抗血清，親和純化特異性抗-mpl配體的抗體。親和純化--按照廠商提供的說(shuō)明書(shū)，將重組人mpl配體1-163共價(jià)偶聯(lián)到Actigel-ALD(SterogeneBioseparations，Inc．)上。將1等份兔抗血清加到mpl配體親和凝膠上，將該漿液置于震蕩平臺(tái)上4～8℃輕輕地震蕩過(guò)夜。用PBS從凝膠床上洗去未結(jié)合的血清蛋白，然后用ImrnunoPureGentleAg／Ab洗脫緩沖液(PierceChemicalCo．)把特異性結(jié)合的抗-mpl抗體洗脫出來(lái)。PBS數(shù)次換液透析回收得到抗體，然后用Amicon攪拌細(xì)胞超濾裝置濃縮抗體溶液，這樣得到的抗體濃縮液是隨后用于孔包被和酶偶聯(lián)物制備的特異性抗-mpl配體抗體的來(lái)源。ELISA試劑--用親和純化的抗-mpl配體抗體包被Immulon4RemovawellStrips(DynatechLaboratories，Inc．)。用0．1M碳酸氫鈉(新鮮制備的pH約為8．2)將親和純化的抗體稀釋到2．5ug／ml。每孔中加入100ul抗體，將平板置于密封增濕器內(nèi)室溫繼續(xù)溫育24小時(shí)。然后，向每孔中加入200ul由下列成分組成的封閉液1％胎牛血清5％蔗糖TEN溶液(50mMTris7．4／10mMEDTA／150mMNaCl)，再置于密封增濕器內(nèi)室溫繼續(xù)溫育24小時(shí)。一并除去孔內(nèi)的混合包被和封閉液。另外的外包被／封閉步驟包括向每孔中加入300ul溶解于PBS中的SuperBlock封閉緩沖液(PierceChemicalCo．)。室溫靜置5分鐘后，除去該溶液，讓這些孔室溫下空氣中晾干24小時(shí)。將包被后的多孔板密封保存于塑料袋內(nèi)4～8℃以備mpl配體ELISA使用。在來(lái)自兔抗血清庫(kù)的親和純化的抗-mpl配體抗體上偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)用作發(fā)生信號(hào)的抗體。用iminothiolaneHCl(FlukaChemicalCorp．)衍生化上述親和純化后的抗體。單獨(dú)地，用N-琥珀?；?-馬來(lái)己酸鹽(N-succinimidyl6-maleimidocaproate)(FlukaChemicalCorp．)讓上述兩種活化蛋白組合在一起發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)。然后，將反應(yīng)混合物通過(guò)FPLCSuperose6(Pharmacia)柱層析，分離抗體具有目的分子量(即約200kD)的HRPO偶聯(lián)物。混合含有目的偶聯(lián)物的級(jí)分，用Centricon30(AmiconDivision，W．R．Grace&amp;Co．)濃縮，制成50％甘油溶液-20℃保存。將該抗-mpl配體AbHRPO濃縮物稀釋到2％胎牛血清PBS中，用于ELISA實(shí)驗(yàn)。ELISA中使用的偶聯(lián)物終濃度為250-500ng／ml。大腸桿菌表達(dá)的重組人mpl配體1-163用于制備標(biāo)準(zhǔn)物。將該mpl配體稀釋到2％胎牛血清(SigmaChemicalCo．)TEN緩沖液中，該緩沖液中含有0．05％乙基汞硫代水楊酸鈉作為防腐劑。制備的標(biāo)準(zhǔn)物中含1．0、0．5、0．25、0．125以及0．062ng／mlmpl配體。分析-將100ulmpl配體標(biāo)準(zhǔn)物或樣品加入孔中，然后置于密封增濕器內(nèi)室溫溫育18～24小時(shí)。然后，除去孔中內(nèi)容物和殘液，用洗液(0．05％Tween20inTENbuffer)洗滌孔1次。向每孔中加入抗-mpl配體AbHRPO偶聯(lián)物溶液(100ul)，然后，置于密封增濕器內(nèi)室溫溫育2小時(shí)。然后除去孔中內(nèi)容物，用0．05％Tween20TEN緩沖液洗滌4次。顯色-加入TMB／過(guò)氧化氫底物溶液(Kirkegaard&amp;Perry溶液A&amp;B1∶1混合)，室溫溫育20分鐘。加入100ul終止液(0．5N硫酸)終止反應(yīng)，用微量滴定板讀數(shù)器讀取450nm下的吸光度。從用曲線擬作程序生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出mpl配體的濃度。實(shí)施例8用短期液相培養(yǎng)物巨核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析Mpl配體1-174類(lèi)似物的生物活性用上述方法制備mpl配體1-174的類(lèi)似物，并對(duì)它們刺激液體培養(yǎng)物中巨核細(xì)胞生長(zhǎng)的能力進(jìn)行分析。從人白細(xì)胞除去裝置(nicholetal_stemcells12494-505(1994))中分離CD34選擇細(xì)胞，用培養(yǎng)基(IMDM／1％青霉素-鏈霉素-谷氨酸鹽／1％非必需氨基酸／1％MEM丙酮酸鈉／1％MEM維生素／10％去離子BSA／10％正常人AB血漿／10uMα-硫代?；视停?0ug／mlL-天冬酰胺)以2×105／ml鋪板。此外，向每孔中加入1．5ul含有mpl配體(1-174)或mpl配體1-174類(lèi)似物的COS-1細(xì)胞條件培養(yǎng)基。Terasaki-style微量滴定組織培養(yǎng)板(VangardInternational)中的反應(yīng)終體積為15ul。將細(xì)胞置于裝有5％CO2增濕器中37℃溫育8天，用1％戊二醛直接固定到培養(yǎng)孔中，然后用由抗-GPIb，抗-GPIIb，(Biodesign)和抗-GPlb(Dako，Carpinteria，CA)組成的單克隆抗體雞尾酒溫育。用鏈霉親和素-β-半乳糖苷酶檢測(cè)系統(tǒng)(HistoMark，KirkegaardandPerry)顯色免疫反應(yīng)。通過(guò)較黑顏色(實(shí)際照片中為蘭色)鑒定出的巨核細(xì)胞見(jiàn)圖8。圖8中的泳道A和D分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。泳道A顯示的孔中接受了37．5pg野生型mpl配體1-174COS-1條件培養(yǎng)基，該孔表現(xiàn)出明顯的巨核細(xì)胞生長(zhǎng)。泳道D接受了1．5ulCOS-1模擬條件培養(yǎng)基，不表現(xiàn)任何生長(zhǎng)。圖8中的泳道B和C分別為mpl配體1-174類(lèi)似物N7和N10。泳道B接受了9．0pgmpl配體COS-1條件培養(yǎng)基，而泳道C接受了27pg，而且這兩者都表現(xiàn)出極好的巨核細(xì)胞生長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)表明被測(cè)試的mpl配體類(lèi)似物能夠刺激人巨核細(xì)胞體外生長(zhǎng)。實(shí)施例9體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中Mpl1-174類(lèi)似物的生物活性用上述方法制備mpl配體1-174的類(lèi)似物，并對(duì)它們刺激32D-mpl細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行分析。為了構(gòu)建32D-mpl細(xì)胞，把人全長(zhǎng)mpl受體序列(vigon，I_etal_PNAS895640-5644(1992))亞克隆到含莫洛尼氏鼠肉瘤病毒轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。使用CaPO4哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene)，把6ug上述構(gòu)建體和6ug兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到3×106293細(xì)胞中。2天后對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行再轉(zhuǎn)染，4天后再進(jìn)行1次。最后一次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后次日，將其與IL-3依賴(lài)性鼠細(xì)胞系(32D，克隆23；Greenbergeretal_PNAS802931-2936(1983))共培養(yǎng)。24小時(shí)后，拯救32D細(xì)胞并用BSA梯度(Path-o-cyte；MilesInc．)分離。用1ng／ml鼠IL-3擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞，然后用20％APK9血清選擇培養(yǎng)(Bartleyetal_Cell771117-1124(1994))。儲(chǔ)存細(xì)胞用于使用多克隆兔抗肽(MPL)血清用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)進(jìn)行的受體細(xì)胞表面表達(dá)。這些細(xì)胞因子依賴(lài)性鼠32D-mpl細(xì)胞對(duì)mpl配體敏感。用含10％胎牛II系克隆血清(HycloneLaboratories)以及1．0ng／mlmuIL3的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)32D-MPL細(xì)胞至細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞／毫升。離心(約500XG)收集細(xì)胞，用不含muIL3的生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌2次，以1×105細(xì)胞／ml的濃度重懸。用mpl配體1-163在5000～1pg／ml的范圍內(nèi)制備一個(gè)延長(zhǎng)的12點(diǎn)的mpl配體標(biāo)準(zhǔn)曲線。向96孔微量滴定組織培養(yǎng)板的適當(dāng)孔中加入100ul的mpl配體或分析試樣的每種稀釋液，所述孔中含100ul重懸細(xì)胞(10，000細(xì)胞／孔)，將加樣后的培養(yǎng)板置于增濕溫育器中37℃及10％CO2溫育。48小時(shí)后，每孔中加入40ulMTS試劑(含水非放射性細(xì)胞增殖試劑盒，Promega)，14～18小時(shí)后在平板閱讀器上490nm處對(duì)平板進(jìn)行讀數(shù)。從每個(gè)試樣的劑量應(yīng)答曲線中計(jì)算出樣品的體外活性。將每個(gè)試樣中引起50％最大刺激所需的mpl配體的量定義為1個(gè)單位。通過(guò)用生物活性單位／ml除以mpl配體ELISA測(cè)定的mpl配體濃度，計(jì)算出特異性活性。轉(zhuǎn)染并表達(dá)于COS細(xì)胞中的mpl配體類(lèi)似物的特異性生物活性顯示于表4。另外還總結(jié)了氨基酸取代碳水化合物的效果。用上述方法測(cè)定得到的純化人序列mpl配體的體外活性為200～300單位／ng。從表4中可以明顯地看出，含附加N-連接碳水化合物的mpl配體類(lèi)似物可以同天然序列mpl配體表達(dá)的一樣好，即使當(dāng)它們含有附加碳水化合物鏈，例如N4和N10也同樣如此(正如在實(shí)施例6的A部分中測(cè)定的那樣)。上述這兩類(lèi)類(lèi)似物也都保留了全部的體外生物活性。因此，正常情況下，也可以用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)含N-連接碳水化合物的mpl配體類(lèi)似物，而且這些類(lèi)似物具有正?；蛟鰪?qiáng)的體外生物活性。表4</tables>注釋(a)根據(jù)實(shí)施例6中描述的類(lèi)似物多肽在SDS凝膠中的遷移率估算出的附加N-連接鏈的數(shù)目。(b)用實(shí)施例描述的ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)CHO細(xì)胞上清液中mpl配體類(lèi)似物的定量測(cè)定結(jié)果。(c)通過(guò)測(cè)量mpl配體依賴(lài)性的32D細(xì)胞胸腺嘧啶的攝入對(duì)生長(zhǎng)的刺激測(cè)定出的體外活性。(d)增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)量的mpl配體類(lèi)似物體外活性與用mpl配體ELISA測(cè)量的mpl配體量之間的比值。N．A．未獲得實(shí)施例10CHO細(xì)胞的表達(dá)以及Mpl配體1-174、N4和N15的純化對(duì)實(shí)施例2描述的方法進(jìn)行下列改進(jìn)后，將含mpl配體1-174、N4和N15cDNA的pDSRα2轉(zhuǎn)染到DHFR-缺陷的CHO細(xì)胞中。對(duì)每種類(lèi)似物都進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染3周后，用mpl配體ELISA篩選mpl配體表達(dá)物。每種形式類(lèi)似物各取3個(gè)表達(dá)克隆凍存于低溫存儲(chǔ)器。將每種類(lèi)似物的最大表達(dá)克隆用轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。對(duì)于N4，制備得到7．4升條件培養(yǎng)基(50％DMEM、50％HAMS-F12、1％青霉素／鏈霉素∥谷氨酸鹽、1％非必需氨基酸(Gibco))，對(duì)于N15，制備得到4．6升條件培養(yǎng)基。從以表達(dá)mpl配體1-174(2．9L)、N4(7．4L)、N15(4．4L)的CHO細(xì)胞為種子培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)瓶中取出無(wú)血清CHO細(xì)胞條件培養(yǎng)基，用SlY10(10，000Da分子量分離點(diǎn))Amicon螺旋超濾筒相應(yīng)地分別濃縮12-、19-和12-倍。然后取150微升濃縮條件培養(yǎng)基以0．3ml／min速度直接加樣到3．3mlhu-MPL-X(受體)親和柱上。該親和柱是按照廠商提供的方法在每毫升PharmaciaCNBr活化瓊脂糖樹(shù)脂偶聯(lián)1．0～1．5毫克Mpl-X(Mpl受體的可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)。加樣后，用30ml磷酸鹽緩沖液(PBS；10mMNaPO4pH6．8／150mMNaCl)洗滌柱體，然后用60ml10mMTris，pH8．0／1MNaCl／1mMCHAPS洗滌。用30ml20mMCAPS(3-[環(huán)己胺]-l丙磺酸)pH10．5／lMNaCl／1mMCHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)二甲胺]-1-丙磺酸鹽)洗脫Mpl配體1-174。向每種洗脫級(jí)分中加入0．6mL1MTrispH7．0對(duì)級(jí)分進(jìn)行中和。SDS-PAGE分析顯示1-174mpl配體在10mMTris，pH8．0／1MNaCl1mMCHAPS洗滌過(guò)程中出現(xiàn)明顯的“傷流”。用SDS-PAGE分析洗脫級(jí)分。收集含mpl配體1-174的級(jí)分。然后改進(jìn)該親和純化，做下列改動(dòng)后重復(fù)進(jìn)行親和純化0．5mL／min加樣和洗脫，并省去10mMTris，pH8．0／1MNaCl／1mMCHAPS洗脫這一步驟。取所有含有單個(gè)mpl配體條帶的級(jí)分，在50mL攪拌細(xì)胞，轉(zhuǎn)到濃縮裝置中用YM10(10，000Da分子量分離點(diǎn))膜濃縮。取該濃縮液0．5mL以0．25mL／min直接加樣到PBS平衡的PharmaciaSuperdex200HR10／30凝膠過(guò)濾柱，收集0．25mL級(jí)分。收集所有含單個(gè)mpl配體條帶的級(jí)分(根據(jù)SDS-PAGE分析的結(jié)果)。用類(lèi)似方式對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體的其他形式進(jìn)行純化(收集2批親和純化產(chǎn)物，并在Superdex200凝膠過(guò)濾柱上過(guò)柱)。實(shí)施例11測(cè)定CHO細(xì)胞表達(dá)的N4和N15上的碳水化合物添加物為了測(cè)定CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體形式中是否含有N-連接碳水化合物，對(duì)實(shí)施例6中描述的方法進(jìn)行下列改動(dòng)后，用SDS-PAGEWestern印跡法對(duì)條件培養(yǎng)基進(jìn)行分析。使用從轉(zhuǎn)瓶中取出的CHOD-條件培養(yǎng)基。將樣品加入Centricon-10離心濃縮儀(Amicon，Beverly，MA．)中，在BeckmanJ2-HS離心機(jī)中用固定角度轉(zhuǎn)子(JA20．1)以6000RPM轉(zhuǎn)速離心1小時(shí)。將一定體積含約100ngmpl配體類(lèi)似物的濃縮樣品與SDS樣品緩沖液(見(jiàn)實(shí)施例6的描述)一起上樣到SDSPAGE凝膠上。圖9顯示的是與碳水化合物預(yù)期量相關(guān)的碳水化合物的遷移率差異。遷移最快的種類(lèi)為Met--Lys(1-174)大腸桿菌mpl配體，隨后依次為mpl配體1-174(CHC)、N4(CHC)、以及N15(CHC)。見(jiàn)圖9，與非糖基化mpl配體相比分子變大的最合理解釋為，mpl配體1-174(CHO)上有附加O-連接碳水化合物，N4(CHO)上有附加O-連接碳水化合物和1個(gè)附加N-連接寡糖，以及N15(CHO)上有附加O-連接碳水化合物和2個(gè)附加N-連接寡糖。為了證實(shí)分子量的增加確實(shí)是由于N-連接碳水化合物鏈的添加引起的，按實(shí)施例6中描述的方法用N-聚糖酶處理樣品除去任一N-連接碳水化合物。從條件培養(yǎng)基中純化出含約100ngmpl配體類(lèi)似物的各種樣品。用N-聚糖酶處理后，N4(CHO)和N15(CHO)的遷移率減小到同mpl配體1-174(CHO)一樣的水平。用N-聚糖酶處理mpl配體MK1-174(大腸桿菌)或mpl配體1-174(CHO)不影響遷移率，這是因?yàn)檫@兩種形式預(yù)料都不含N-連接碳水化合物。將用N-聚糖酶處理過(guò)的樣品與未處理樣品相比發(fā)現(xiàn)，N4大小的變化對(duì)應(yīng)于1條N-連接碳水化合物鏈的大小，N15大小的對(duì)應(yīng)于2條碳水化合物鏈的大小。因此，這兩種mpl配體形式上N-連接糖基化位點(diǎn)的添加導(dǎo)致當(dāng)這些種類(lèi)的配體在CHO細(xì)胞表達(dá)時(shí)出現(xiàn)了附加N-連接碳水化合物。見(jiàn)圖10。實(shí)施例12CHO細(xì)胞中制備的Mpl配體類(lèi)似物的體外生物活性除活性是從用CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-332作標(biāo)準(zhǔn)物制備的曲線中計(jì)算出的外，按照實(shí)施例9描述的方法，用因子依賴(lài)性細(xì)胞系32D-MPL，分析從CHO細(xì)胞或大腸桿菌中表達(dá)和純化出來(lái)的純化mpl配體及類(lèi)似物的體外生物活性。表5中列出了各種形式的特異性體外生物活性。從該表中可以明顯地看出，用CHO細(xì)胞表達(dá)的含附加碳水化合物的mpl配體類(lèi)似物具有體外生物活性。表5MPL配體的體外活性MPL配體形式N-連接鏈的數(shù)目體外活性U／mg×10E6MK174(E．coli)0131-163(CHO)0861-174(CHO)085N4(CHO)160N15(CHO)2921-332(CHO)641實(shí)施例13Mpl配體類(lèi)似物的體內(nèi)生物活性計(jì)算用各種形式mpl配體處理過(guò)的小鼠的血小板的量，結(jié)果見(jiàn)圖11。用mpl-受體親和層析制備和純化出CHO表達(dá)的mpl配體1-332、1-174、N4和N15。用常規(guī)層析方法，制備和純化大腸桿菌表達(dá)的Met-Lys-mpl配體1-174。同時(shí)給正常、雌性Balb／c小鼠施用規(guī)定濃度的每種形式，每天1次，共5天。最后一次注射后，從尾靜脈上一個(gè)小的側(cè)向切口收取血樣。用Sysmex帶電血細(xì)胞分析儀(BaxterDiagnostics，Inc．Irvine，CA)對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表示為測(cè)定4個(gè)動(dòng)物的平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。白細(xì)胞總數(shù)或紅細(xì)胞總數(shù)等其他血細(xì)胞指數(shù)未受上述這些處理的影響(數(shù)據(jù)未列出)。受激的所有形式都可以引起血小板量的增加。但是，不同形式的活性各不相同。相對(duì)的體內(nèi)活性為mpl配體MK1-174(大腸桿菌)＜mpl配體1-174(CHO)＜N4(CHO)＜mpl配體1-332(CHO)＜N15(CHO)。結(jié)果表明非天然生成N-連接碳水化合物的添加可以導(dǎo)致體內(nèi)活性的增高。進(jìn)一步還表明碳水化合物數(shù)目的增大可以導(dǎo)致體內(nèi)活性成比例的增強(qiáng)。實(shí)施例14用重疊PCR構(gòu)建Mpl配體類(lèi)似物以及截短形式N16-N40用從Chengetal_PNAS91，5695(1994)改良而來(lái)的方法，通過(guò)重疊PCR(聚合酶鏈反應(yīng))構(gòu)建出類(lèi)似物N16～N40。典型地，向每個(gè)構(gòu)建體中導(dǎo)入1～2處突變。合成下列寡核苷酸引物用于制備類(lèi)似物N16～N405′FCCCTCTAGACCACCATGGAACTGACTGAATTGCTCCTCSEQIDNO．183′R(1-174)CCCGTCGACTCAGAGCTCGTTCAGTGTGSEQIDNO．19N16-3′RCCCGTCGACTCACTCCAACAATCCAGAAGSEQIDNO．20N17-3′RCCCGTCGACTTATCTGGCTGAGGCAGTGASEQIDNO．21N18-FCACGTCCTTAACAGCAGCCTGAGCCAGTGSEQIDNO．22N18-RCACTGGCTCAGGCTGCTGTTAAGGACGTGSEQIDNO．23N19-FCCCTTTGCCTAACGGTTCCCTGCTGCCTGCTGTSEQIDNO．24N19-RACAGCAGGCAGCAGGGAACCGTTAGGCAAAGGGSEQIDNO．25N20-FTGCCTACACCTAACCTGTCGCCTGCTGTGGASEQIDNO．26N20-RTCCACAGCAGGCGACAGGTTAGGTGTAGGCASEQIDNO．27N21-FGGAAAACCAATATGTCGGAGACCAAGGCACASEQIDNO．28N21-RTGTGCCTTGGTCTCCGACATATTGGTTTTCCSEQIDNO．29N22-FTGGGAGAATGGAACACCACGATGGAGGAGACCSEQIDNO．30N22-RGGTCTCCTCCATCGTGGTGTTCCATTCTCCCASEQIDNO．31N23-FAAAACCCAGATGAACGAGACGACCAAGGCACASEQIDNO．32N23-RTGTGCCTTGGTCGTCTCGTTCATCTGGGTTTTSEQIDNO．33N24-FCCCAGATGGAGAACACCTCGGCACAGGACATSEQIDNO．34N24-RATGTCCTGTGCCGAGGTGTTCTCCATCTGGGSEQIDNO．35N25-FCACGGGGACAAAACGGAACCACTTGCCTCTCASEQIDNO．36N25-RTGAGAGGCAAGTGGTTCCGTTTTGTCCCCGTGSEQIDNO．37N26-FCAGGGCAGGAACACATCTCACAAGGATCCCASEQIDNO．38N26-RTGGGATCCTTGTGAGATGTGTTCCTGCCCTGSEQIDNO．39N27-FGGGCAGGACCAACGCTAGCAAGGATCCCAATSEQIDNO．40N27-RATTGGGATCCTTGCTAGCGTTGGTCCTGCCCSEQIDNO．41N29-FPair1CAGTGCAACGAGTCCCACCCTTGGSEQIDNO．42N29-RPair1CAAAGGGTGGGACTCGTTGCACTGSEQIDNO．43N29-FPair2GACCACAAATCACTCCGATCCCAASEQIDNO．44N29-RPair2TTGGGATCGGAGTGATTTGTGGTCSEQ1DNO．45N30-FGTCCCCACCAACACCTCTCTAGTCCTCSEQIDNO．46N30-RGAGGACTAGAGAGGTGTTGGTGGGGACSEQIDNO．47N31-3′RCCCGTCGACTCACTTCAGAAGCCCAGAGCCAGTSEQIDNO．48N36(1)-FGAAAACCCAGAACGAGACCACCAAGGCACAGSEQIDNO．49N36(1)-RCTGTGCCTTGGTGGTCTCGTTCTGGGTTTTCSEQIDNO．50N36(2)-FCACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGSEQIDNO．51N36(2)-RCTCCCAGAATGTCCTGTGCCTTGGTGSEQIDNO．52N37-FGAAAACCCAGATGAACGAGACCAAGGCACAGSEQIDNO．53N37-RCTGTGCCTTGGTCTCGTTCATCTGGGTTTTCSEQIDNO．54N38-FGTCCCCACCAACACCACTCTAGTCCTCSEQIDNO．55N38-RGAGGACTAGAGTGGTGTTGGTGGGGACSEQIDNO．56F=正向引物R=反向引物用兩個(gè)連續(xù)步驟制備出導(dǎo)入1個(gè)新糖基化位點(diǎn)的構(gòu)建體。步驟1中，用4段不同寡核苷酸實(shí)施2個(gè)反應(yīng)。這些寡核苷酸包括有一個(gè)5’正向引物、一個(gè)反向誘變引物、一個(gè)正向誘變引物(通常與反向誘變引物互補(bǔ))和一個(gè)反向3‘引物。反向3‘引物中包括這樣的序列，其中導(dǎo)入了后跟有SalⅠ限制酶切位點(diǎn)的終止密碼子。導(dǎo)入終止密碼子的位置為第175、184、192和200位殘基。因此，能夠制備出長(zhǎng)度為1-174、1-183(N16)、1-191(N17)和1-199(N31)的形式。PCR1使用模板DNA(含mpl配體1-174序列或全長(zhǎng)mpl配體1-332序列的pDSRα2)、5’正向引物和反向誘變引物。PCR2使用模板DNA、3’反向引物和正向誘變引物。然后，進(jìn)行這兩個(gè)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增得到的DNA片段。從凝膠中切割出含有大小正確的DNA片段的凝膠塊。合并來(lái)自PCR1和PCR2的DNA片段，第3個(gè)PCR反應(yīng)只用5’正向和3’反向引物來(lái)完成。因此，擴(kuò)增到了含插入到mpl配體中的目的突變的全長(zhǎng)DNA片段。再次用瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增到的片段，用GenecleanTM試劑盒和廠商(Bio101，Inc)提供的方法純化大小正確的DNA片段。用XbaI和SalⅠ消化純化后的DNA，然后用GenecleanTM試劑盒再次純化。然后，將片段連接到XbaⅠ和SalⅠ切割過(guò)的pDSRα2中。用2倍體積乙醇將連接后的DNA沉淀在存在載體tRNA的0．3MNaOAcpH5．2中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。限制性酶切分析對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)試，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定出含有大小正確DNA插入片段的克隆。然后制備出純化質(zhì)粒DNA，對(duì)mpl配體插入片段測(cè)序確證存在目的突變而且確保沒(méi)有導(dǎo)入任何另外的氨基酸改變。在幾種情況下，同時(shí)結(jié)合了2個(gè)或多個(gè)突變，例如，見(jiàn)N29、N33、N34、N35、N39和N40。這可以通過(guò)向已經(jīng)含有1個(gè)變化的DNA中導(dǎo)入一個(gè)新的取代來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，N33就是通過(guò)把N23的變化導(dǎo)入到N15中制備而成的。在這種情況下，上述方法的操作可以采用N23誘變引物和N15模板DNA。另一種策略中，是同時(shí)把兩個(gè)變化導(dǎo)入到模板DNA中。該模板DNA可以包含天然序列或者也可以包含編碼已含有變化的mpl配體配體形式的序列。這些情況中的第1步涉及3個(gè)PCR反應(yīng)和6段寡核苷酸。這些寡核苷酸中包括一個(gè)正向引物、2對(duì)正向及反向誘變引物以及一個(gè)反向3’引物。每對(duì)引物相互間互補(bǔ)，其中含有一段經(jīng)設(shè)計(jì)導(dǎo)入了1個(gè)新糖基化位點(diǎn)的序列。PCR1包括模板DNA、5’正向引物以及引物對(duì)1中的反向誘變引物。PCR2包括模板DNA、引物對(duì)1中的正向誘變引物以及引物對(duì)2中的反向誘變引物，其中引物對(duì)2的引物是從3’末端到引物對(duì)1的引物。PCR3包括模板DNA、引物對(duì)2中的正向引物以及反向3’引物。用瓊脂糖凝膠電泳分離每個(gè)PCR反應(yīng)得到的DNA片段，并按照上述方法將其切割出來(lái)。然后將這3個(gè)DNA片段合并在一起，只用5’正向及3’反向引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照上述方法，純化編碼因含有2個(gè)新糖基化位點(diǎn)的序列的整個(gè)目的基因的DNA片段，用XbaⅠ和SalⅠ切割，然后將其連接到事先用XbaⅠ和SalⅠ切割過(guò)的pDSRα2中。也可以通過(guò)采用已含有突變的模板的PCR反應(yīng)把多個(gè)突變結(jié)合在一起。例如，N39可以通過(guò)把N36和N38的變化導(dǎo)入到N15的模板DNA中來(lái)制備。完成其所用的是一套與制備N(xiāo)36(N36(1))所用引物不同的引物(N36(2))。參見(jiàn)上述引物對(duì)。這兩套引物導(dǎo)入的是同一突變。也可以制備出較長(zhǎng)的mpl配體形式。因此，用類(lèi)似于N39的方式來(lái)制備N(xiāo)40，不同之處是PCR3中使用的3’反向引物(步驟1)以及步驟2中的PCR引物是制備N(xiāo)31所用的引物。該引物可以在SalI限制性酶切位點(diǎn)前的第200位上導(dǎo)入1個(gè)終止密碼子。此外，用于PCR3的模板DNA中包含有編碼全長(zhǎng)mpl配體(1-332)的序列。典型的PCR反應(yīng)混合物包括正向及反向引物各4ul(5pm／ul)、1ul模板(50ng)、10ulof5XLP緩沖液(100mMTricinepH8．7／25％甘油／425mMKOAc)、10uldNTP原液(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各1mM)、0．8ulrtTh聚合酶(PerkinElmer；2．5U／ul)，and2ulVent聚合酶(NEB；用1XLP緩沖液1∶100新鮮稀釋后的濃度為0．01U／ul)。加入H2O使終體積為50ul。所有成分按給出的順序加入到一起，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)循環(huán)中的溫度高于60℃時(shí)加入1ul50mMMgOAc啟動(dòng)PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為2個(gè)循環(huán)94℃，10sec／45℃，1min／68℃，5min，隨后的25個(gè)循環(huán)為94℃，10sec／55℃，1min／68℃，5min。用這些常規(guī)方法構(gòu)建表6中列出的mpl配體類(lèi)似物以及截短形式N16～N40。每種形式的DNA序列變化也同時(shí)給出。表6具有連接N-連接碳水化合物鏈的位點(diǎn)的Mpl配體類(lèi)似物類(lèi)似物／種類(lèi)No．氨基酸的取代序列變化N16(1-183)；Thr184→Gly332ACA→TGA(終止密碼子)缺失N17(1-191)；Thr192→Gly332ACT→TAA(終止密碼子)缺失N18His23，Arg25→Asn23，Ser25CAC，AGA→AAC，AGCN19Thr37，Pro38，Val39→Asn37，Gly38，Ser39ACA，CCT，GTC→AAC，GGT，TCCN20Val39，Leu41→Asn39，Ser41GTC，CTG→AAC，TCGN21Gln54，Glu56→Asn54，Ser56CAG，GAG→AAT，TCGN22Lys52，Gln54→Asn52，Thr54AAA，CAG→AAC，ACGN23Glu57→Asn55′(1)，Thr57GAG→AAC(i)，ACGN24Glu57，Lys59→Asn57，Ser59GAG，AAG→AAC，TCGN25Leu81，Pro83→Asn81，Thr83CTG，CCC→AAC，ACCN26Thr118，Ala120→Asn118，Ser120ACC，GCT→AAC，TCTN27Thr119，His121→Asn119，Ser121ACA，CAC→AAC，AGCN29Pro30，Val32，Ala120，Lys122→Asn30，Ser32，Asn120，Ser122CCA，GTT，GCT，AAG→AAC，TCC，AAT，TCCN30Ser163，Arg164→Thr163，Asn164AGC，AGA→ACC，AACN31(1-199)；Trp200→Gly332TGG→TGA(終止密碼子)缺失N33Pro30，Val32，Glu57，Ala120，Lys122→CCA，GTT，GAG，GCT，AAG→Asn30，Thr32，Asn55'(1)，Thr57，Asn120，Thr122AAC，TCC，AAC(i)，ACG，AAT，TCCN34Pro30，Val32，Glu57，Ser163，Arg164→CCA，GTT，GAG，AGC，AGA→Asn30，Thr32，Asn55′(1)，Thr57，Thr163，Asn164AAC，TCC，AAC(i)，ACG，ACC，AACN35N4+N23+N30+N31(1-199)-N36Met55，Glu57→Asn55，Thr57ATG，GAG→AAC，ACCN37Glu56→Asn56GAG→AACN38Ser163，Arg164，Ser166→Thr163，Asn164，Thr166AGC，AGA，TCT→ACC，AAC，ACTN39N4+N10+N36+N38(1-174)-N40N4+N10+N36+N38+N31(1-199)-上表中的符號(hào)“(i)”代表已插入的參比氨基酸。例如，Glu57-＞Asn55′(i)、Thr57(表6中的類(lèi)似物N23)是指第57位上的Glu已經(jīng)被Thr所取代，以及緊接第55位Met后已另插入1個(gè)Asn，將Asn編號(hào)為55’以便隨后的氨基酸能夠保留原來(lái)設(shè)定的序號(hào)。包括上述實(shí)施例中所有變化的實(shí)施例用特定類(lèi)似物序號(hào)加上符號(hào)“+”。例如N35、N39及N40。用括號(hào)給出了這些類(lèi)似物氨基酸鏈的長(zhǎng)度。因此，類(lèi)似物N35同時(shí)含有制備類(lèi)似物N4、N23、N30和N31涉及的所有變化。指定為N31的變化是指類(lèi)似物N35長(zhǎng)為199個(gè)氨基酸。除標(biāo)明了不同長(zhǎng)度(或者，已經(jīng)插入了氨基酸，使得總長(zhǎng)度因插入的氨基酸而增大)外，表6中的所有類(lèi)似物長(zhǎng)度都為174個(gè)氨基酸。實(shí)施例15Mpl配體類(lèi)似物以及截短形式N16～N40的特性A．Mpl配體類(lèi)似物表達(dá)水平及體外活性的測(cè)定。用電穿孔法(實(shí)施例5)或CaPO4法(哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒；專(zhuān)用介質(zhì))將N16到N40轉(zhuǎn)染進(jìn)COS細(xì)胞。3～4天后，收集無(wú)細(xì)胞條件培養(yǎng)基，分裝并于-70℃儲(chǔ)存。用實(shí)施例7中描述的ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定表達(dá)水平。另外，除1處改動(dòng)外用實(shí)施例9描述的方法測(cè)定上清液中的生物活性。從用純化CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-332作標(biāo)準(zhǔn)物制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算活性。結(jié)果見(jiàn)表7。如表7中顯示的那樣，大部分mpl配體類(lèi)似物被表達(dá)和分泌。一些類(lèi)似物似乎增加了表達(dá)量。這些樣品的生物測(cè)定表明，大多數(shù)類(lèi)似物的特異性活性也與非修飾形式相仿。一些類(lèi)似物中含有多條N-連接碳水化合物鏈(見(jiàn)下表)。這一結(jié)果表明碳水化合物的添加可以導(dǎo)致類(lèi)似物分泌量的增加以及體外活性的正常。表7注釋(a)根據(jù)類(lèi)似物多肽在SDS凝膠上的遷移率估算出附加N-連接鏈的數(shù)目。(b)EIA測(cè)定COS細(xì)胞上清液中mpl配體類(lèi)似物的量。(c)通過(guò)測(cè)量32D-MPL細(xì)胞的增殖測(cè)定體外活性，該細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)于mpl配體。(d)增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)量的mpl配體類(lèi)似物體外活性與用mpl配體ELISA測(cè)量的mpl配體量之間的比值。i-插入片段NA未獲得B．碳水化合物添加物的測(cè)定。用實(shí)施例6描述的方法，測(cè)定表6中列出的類(lèi)似物是否添加了N-連接碳水化合物。還用改良法對(duì)一些類(lèi)似物(N21、N22、N30、N33和N36)進(jìn)行了測(cè)試。這之所以必要是因?yàn)橛糜赪estern印跡顯色的單克隆抗體是針對(duì)包括第47～62位殘基的多肽，并且表6中描述的一些類(lèi)似物包括的取代影響了與該抗體之間的免疫反應(yīng)能力，例如N21。因此，為了分析這些類(lèi)似物，使用用小鼠制備的抗大腸桿菌表達(dá)的mpl配體的單克隆抗體來(lái)對(duì)上清液進(jìn)行免疫沉淀。典型地，15ug的抗體用于免疫沉淀50ng的mpl配體類(lèi)似物。除使用與兔抗-mpl配體多克隆抗體(典型地為1ug／ml；抗大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-163)溫育以及抗兔ECL試劑盒(Amersham)使免疫沉淀的條帶顯色外，按照實(shí)施例6描述的方法對(duì)免疫沉淀物質(zhì)進(jìn)行Western印跡分析。各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表7。一些類(lèi)似物的大小增大表明存在著N-連接碳水化合物(N21，N22，N23，N29，N30，N31，N33，N34，N35，N36，N38，N39，N40)。這些類(lèi)似物中的一部分具有多于1條的N-連接鏈，例如，N29、N33、N34、N35、N39和N40。這些類(lèi)似物以正?；蚋叩乃椒置冢w外生物活性與mpl配體1-174相仿。這一結(jié)果表明，可以向mpl配體中導(dǎo)入多個(gè)有功能的N-連接糖基化位點(diǎn)，而不會(huì)對(duì)表達(dá)或生物活性造成不利影響。為了說(shuō)明可以向mpl配體加入多個(gè)寡糖鏈，用實(shí)施例6中描述的方法對(duì)COS細(xì)胞表達(dá)的各種類(lèi)似物進(jìn)行Western印跡分析。圖12顯示類(lèi)似物遷移率隨附加N-連接糖基化位點(diǎn)的數(shù)目增加而減小。給出的N39和N40是具有4個(gè)新位點(diǎn)的類(lèi)似物。N-連接位點(diǎn)最多的類(lèi)似物遷移得最慢。這一結(jié)果從mpl配體的1-174和1-199這兩種形式都可以觀察到。這表明可以用多個(gè)N-連接碳水化合物鏈把至少4個(gè)類(lèi)似物合并在一起生成新的類(lèi)似物。實(shí)施例16含Asn-X-Ser與含Asn-X-Thr的糖基化位點(diǎn)的比較N-連接糖基化位點(diǎn)包括Asn-X-Thr或Asn-X-Ser，其中X是除脯氨酸外20種天然氨基酸中任意一種。我們想要測(cè)定第3位上是否優(yōu)選Ser或Thr。因此，對(duì)具有以下特征的兩套類(lèi)似物進(jìn)行測(cè)定看是否會(huì)對(duì)N-連接糖基化位點(diǎn)的占據(jù)百分比產(chǎn)生影響每套引物包括一個(gè)在密碼子序列(sequon)第3位是Ser或Thr的mpl配體糖基化類(lèi)似物。N15包括2個(gè)Asn-X-Thr位點(diǎn)，而N29在完全相同的位置上包括2個(gè)Asn-X-Ser。類(lèi)似地，N30包括1個(gè)Asn-X-Ser，而N38在同樣位置上包括1個(gè)Asn-X-Thr。為了比較這兩套類(lèi)似物，用COS細(xì)胞表達(dá)它們，并用實(shí)施例6描述的方法對(duì)分泌的mpl配體進(jìn)行Western印跡分析。圖13給出了這些結(jié)果。與N29相比，N15具有的糖基化mpl配體的比例明顯增加。相反地，對(duì)N30和N38進(jìn)行比較時(shí)，糖基化和非糖基化mpl配體之間的比例幾乎沒(méi)有任何差別。這些結(jié)果表明Asn-X-Ser和Asn-X-Thr這兩者都可以導(dǎo)入mpl配體，而且二者都可以作為N-連接碳水化合物附加物的位點(diǎn)。此外，一些情況下可能優(yōu)選Asn-X-Thr密碼子序列(即，它可能被更有效地糖基化)。實(shí)施例17用重疊PCR構(gòu)建mpl配體類(lèi)似物以及截短形式N41～N43用從ChengetalPNAS91，5695(1994)改進(jìn)而來(lái)的方法，通過(guò)重疊PCR(聚合酶鏈反應(yīng))構(gòu)建類(lèi)似物N41、N42和N43(這些類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表8)。合成下列寡核苷酸引物用于制備類(lèi)似物N41～N435′FCCCTCTAGACCACCATGGAACTGACTGAATTGCTCCTCSEQIDNO．183′R(1-174)CCCGTCGACTCAGAGCTCGTTCAGTGTGSEQIDNO．193′R(1-199)CCCGTCGACTCACTTCAGAAGCCCAGAGCCAGTSEQIDNO．57N41-FTCCCCAGCAACACCTCTCTAGTCSEQIDNO．58N41-RAGGTGTTGCTGGGGACAGCTGTGSEQIDNO．59N42-FTCCCCAACAGAACCTCTCTAGTCSEQIDNO．60N42-RAGGTTCTGTTGGGGACAGCTGTGSEQIDNO．61N37-FGAAAACCCAGATGAACGAGACCAAGGCACAGSEQIDNO．53N37-RCTGTGCCTTGGTCTCGTTCATCTGGGTTTTCSEQIDNO．54F=正向R=反向按照實(shí)施例14中描述的2-步PCR法，用上述相應(yīng)的PCR引物對(duì)以及SEOIDNO．18和SEQIDNO．19外部引物構(gòu)建mpl配體N41和N42。每個(gè)構(gòu)建體的步驟2使用了能夠產(chǎn)生1-174這種形式的5’引物(SEQIDNO．18)和3’引物(SEQIDNO．19)。同時(shí)用實(shí)施例14中描述的2步法，通過(guò)PCR把2個(gè)N-連接位點(diǎn)導(dǎo)入到已包括有其他N-連接糖基化位點(diǎn)的模板中，構(gòu)建出N43。在3個(gè)單獨(dú)PCR反應(yīng)的第1步驟中使用的是3種不同的DNA模板(N15、N10和1-332)。PCR反應(yīng)1使用的是模板N15以及SEQIDNO．18和SEQIDNO．54所示引物。該反應(yīng)把N37的取代導(dǎo)入到已含有N4中取代的DNA區(qū)段中。PCR反應(yīng)2使用的是模板N10以及SEQIDNO．53和SEQIDNO．59所示引物。該反應(yīng)把N37和N41中的突變導(dǎo)入到已含有N10中取代的DNA區(qū)段中。PCR反應(yīng)3使用的是模板1-332以及SEOIDNO．58和SEQIDNO．57所示引物。該反應(yīng)把N41中的取代導(dǎo)入到已含有1-199C末端的DNA片段中。用瓊脂糖凝膠電泳純化每個(gè)DNA片段。然后把上述3個(gè)DNA片段合并在1個(gè)試管中，并通過(guò)PCR反應(yīng)用SEQIDNO．18和SEQIDNO．57所示引物把它們連接在一起。這就制備出了一段在mpl配體1-199形式中含有N4、N37、N10和N41取代的DNA片段。然后，用實(shí)施例14描述的方法把該DNA片段克隆到PDSRa2中。N41、N42以及對(duì)于N43步驟1中的前3個(gè)反應(yīng)所需的重疊PCR反應(yīng)條件是1循環(huán)94℃4min；25循環(huán)94℃，10sec／68℃2min；l循環(huán)68℃5min。N43最后的PCR反應(yīng)的條件為1循環(huán)94℃．4min5循環(huán)94℃10sec／44℃，30sec；25循環(huán)94℃，10sec／68℃，2min；1循環(huán)68℃，5min。首先，用集落(colony)PCR對(duì)mpl配體類(lèi)似物克隆N41-N43進(jìn)行篩選，鑒定出含大小和類(lèi)型正確的DNA插入片段的克隆。用一個(gè)滅菌接種環(huán)挑取轉(zhuǎn)化細(xì)菌(大腸桿菌)的克隆，并將其重懸于1×Tag緩沖液(BoehringerMannheim)中。在含下列成分的50ul反應(yīng)體積中加入1．25UTag聚合酶終濃度為0．2mMdNTP混合物和終濃度為0．2uM的2種載體引物。該集落PCR的反應(yīng)條件為1循環(huán)95℃；35循環(huán)94℃，30sec／52℃，30sec／72℃，30sec；1循環(huán)72℃，5min。用凝膠電泳和測(cè)序分析PCR產(chǎn)物。表8具有N-連接碳水化合物鏈連接位點(diǎn)的mpl配體類(lèi)似物類(lèi)似物／種類(lèi)氨基酸取代序列變化N41Arg164→Asn164AGA→AACN42Ser163→Asn163AGC→AACN43N4+N10+N37+N41+N31-(1-199)實(shí)施例18Mpl配體類(lèi)似物以及截短形式N41～N43的特性A．Mpl配體類(lèi)似物表達(dá)水平及體外生物活性的測(cè)定。對(duì)實(shí)施例5描述的電穿孔法作如下改動(dòng)后，利用其把N41～N43轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中。使用了25ug編碼mpl配體類(lèi)似物的質(zhì)粒DNA。用7ml培養(yǎng)基將電穿孔后的細(xì)胞在100mm組織培養(yǎng)皿上鋪板。電穿孔3天后，收集條件培養(yǎng)基，分裝并儲(chǔ)存于-70℃。用實(shí)施例7描述的ELESA實(shí)驗(yàn)測(cè)定表達(dá)水平。另外，還對(duì)實(shí)施例9描述的方法做了1處改動(dòng)后，利用其測(cè)定上清液的生物活性。從用純化CHO細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-332作標(biāo)準(zhǔn)物制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算活性。結(jié)果見(jiàn)表9表9注釋(a)根據(jù)類(lèi)似物多肽在SDS凝膠上的遷移率估算出附加N-連接鏈的數(shù)目。(b)EIA測(cè)定COS細(xì)胞上清液中mpl配體類(lèi)似物的量。(c)通過(guò)測(cè)量32D-MPL細(xì)胞的增殖測(cè)定體外活性，該細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)于mol配體。(4)增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)量的mpl配體類(lèi)似物體外活性與用mpl配體ELISA測(cè)量的mpl配體量之間的比值。B．碳水化合物添加物的測(cè)定。測(cè)定表8中列出的類(lèi)似物是否附加了N-連接碳水化合物。將來(lái)自用類(lèi)似物cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的約0．5ngmpl配體或mpl配體類(lèi)似物與含β-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液混合，并煮沸。用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并進(jìn)行Western印跡分析。通過(guò)與兔抗-mpl配體多克隆抗體(典型地為1ug／ml；抗大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)的mpl配體1-163)以及抗兔ECL試劑盒(Amersham)溫育，顯色免疫沉淀的條帶。圖15顯示的是mpl配體的3種不同突變體，即使他們?cè)谔腔稽c(diǎn)周?chē)奈恢煤托蛄猩喜煌?，但是它們都能被糖基化。N38含T163、N164和T166突變。N41只含有N164突變。由于在第166位上存在的Ser導(dǎo)致產(chǎn)生序列Asn-X-Ser，所以該類(lèi)似物具有1個(gè)N-連接位點(diǎn)。類(lèi)似物N38和N41以類(lèi)似的方式糖基化。這表明mpl配體的一些位置上可以耐受序列真實(shí)變化但仍能被有效糖基化。如表9所示，這兩種都保留了類(lèi)似的體外生物活性。相反，N42具有Asn163取代。由于在第165位上存在的Thr導(dǎo)致產(chǎn)生序列Asn-X-Thr，所以該類(lèi)似物包括1個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)。它也被糖基化但效率不及N38和N41。圖14顯示的是對(duì)N40和N43的比較。這兩個(gè)mpl配體類(lèi)似物都含有6個(gè)糖基化位點(diǎn)。它們?cè)谟糜趯?dǎo)入N-連接位點(diǎn)時(shí)所改變的氨基酸數(shù)目(N43改變了6個(gè)氨基酸而N40改變了9個(gè))以及位點(diǎn)定位上不同。N43的凝膠遷移率與N40相同。這表明這兩種mpl配體糖基化的程度相似。如圖9所示，這兩種類(lèi)似物的體外活性也是相近的。這表明可以將不同的類(lèi)似物聯(lián)合在一起生成新的mpl配體，生成的新mpl配體具有類(lèi)似的N-連接鏈數(shù)目等性能以及近似的體外生物活性。本發(fā)明已經(jīng)描述的內(nèi)容應(yīng)該理解為是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而并非限制對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案，相反，這些內(nèi)容是用來(lái)涵蓋屬于所附權(quán)利要求實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)的各種改良或等效方案，所附權(quán)利要求的范圍應(yīng)做最廣泛的理解，從而把所有改良或等效方案都包括于其中。序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人AmgenInc．(ⅱ)發(fā)明題目mpl配體類(lèi)似物(ⅲ)序列數(shù)61(ⅳ)通信地址(A)收信人AmgenInc．(B)街道OneAmgenCenterDrive(C)城市ThousandOaks(D)州CA(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼91320-1799(Ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1．0，Version#1．30(ⅵ)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08／927，855(B)申請(qǐng)日1997年9月11日(C)分類(lèi)號(hào)(ⅷ)律師／代理人信息(A)姓名COOK，ROBERTR(B)注冊(cè)號(hào)31，602(C)資料／文檔號(hào)A-337C(2)SEQIDNO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1342個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞CDS(B)位置36…1094(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置99…1094(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞sin-peptide(B)位置36…98(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO1CAGGGAGCCACGCCAGCCAAGACACCCCGGCCAGAATGGAGCTGACTGAATTGMetGluLeuThrGluLeuCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGC101LeuLeuValValMetLeuLeuLeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSer-15-10-51CCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGT149ProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArg51015GACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCAC197AspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluValHis202530CCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGA245ProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSerLeuGly354045GAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGA293GluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeuGly50556065GCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTG341AlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGlnLeu707580GGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTC389GlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnVal859095CGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCT437ArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeuPro100105110CCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATCTTCCTG485ProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlaIlePheLeu115120125AGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTA533SerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeuVal130135140145GGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTC581GlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAlaVal150155160CCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGG629ProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsnArg165170175ACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACT677ThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThrAlaSerAlaArgThrThr180185190GGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAGATTCCT725GlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLysIlePro195200205GGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATAC773GlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnIleProGlyTyr210215220225CTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGTGGACTCTTTCCT821LeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPhePro230235240GGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACA869GlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaProAspIleSerSerGlyThr245250255TCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTCCAGCCTGGATATTCTCCT917SerAspThrGlySerLeuProProAsnLeuGlnProGlyTyrSerPro260265270TCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTCTTCCCTCTTCCA965SerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPheProLeuPro275280285CCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGAC1013ProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeuLeuProAsp290295300305CCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCC1061ProSerAlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThrSer310315320TACACCCACTCCCAGAATCTGTCTCAGGAAGGGTAAGGTTCTCAGACACTGCC1114TyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGluGly325330GACATCAGCATTGTCTCGTGTACAGCTCCCTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACT1174GGACAAGATTTCCTACTTTCTCCTGAAACCCAAAGCCCTGGTAAAAGGGATACACAGGAC1234TGAAAAGGGAATCATTTTTCACTGTACATTATAAACCTTCAGAAGCTATTTTTTTAAGCT1294ATCAGCAATACTCATCAGAGCAGCTAGCTCTTTGGTCTATTTTCTGCA1342(2)SEQIDNO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度353個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO2MetGluLeuThrGluLeuLeuLeuValValMetLeuLeuLeuThrAla-21-20-15-10ArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgVal-51510LeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSer152025GlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAla303540ValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLys455055AlaGlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMet60657075AlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGly808590GlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu95100105LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAsp110115120ProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysVal125130135ArgPheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAla140145150155ProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeu160165170AsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr175180185AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGly190195200PheArgAlaLysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeu205210215AspGlnIleProGlyTyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGly220225230235ThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaPro240245250AspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeu255260265GlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyr270275280ThrLeuPheProLeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeu285290295HisProLeuLeuProAspProSerAlaProThrProThrProThrSer300305310315ProLeuLeuAsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGlu320325330Gly(2)SEQIDNO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度605個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞CDS(C)位置12…596(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位置75…596(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞sig-peptide(B)位置12…74(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO3TCTAGACCACCATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTC50MetGluLeuThrGluLeuLeuLeuValValMetLeuLeu-21-20-15-10CTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGAC98LeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAsp-515CTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCACGTCCTTCACAGC146LeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSer101520AGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTG194ArgLeuSerGlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeu25303540CTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAG242LeuProAlaValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGlu455055GAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAG290GluThrLysAlaGlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGlu606570GGAGTGATGGCAGCACGGGG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基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…33)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO25GGGAAACGGATTGCCAAGGGACGACGGACGACA(2)SEQIDNO26的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO26TGCCTACACCTAACCTGTCGCCTGCTGTGGA(2)SEQIDNO27的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO27ACGGATGTGGATTGGACAGCGGACGACACCT(2)SEQIDNO28的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO28GGAAAACCAATATGTCGGAGACCAAGGCACA(2)SEQIDNO29的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO29CCTTTTGGTTATACAGCCTCTGGTTCCGTGT(2)SEQIDNO30的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO30TGGGAGAATGGAACACCACGATGGAGGAGACC(2)SEQIDNO31的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…32)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO31ACCCTCTTACCTTGTGGTGCTACCTCCTCTGG(2)SEQIDNO32的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO32AAAACCCAGATGAACGAGACGACCAAGGCACA(2)SEQIDNO33的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…32)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO33TTTTGGGTCTACTTGCTCTGCTGGTTCCGTGT(2)SEQIDNO34的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO34CCCAGATGGAGAACACCTCGGCACAGGACAT(2)SEQIDNO35的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO35GGGTCTACCTCTTGTGGAGCCGTGTCCTGTA(2)SEQIDNO36的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO36CACGGGGACAAAACGGAACCACTTGCCTCTCA(2)SEQIDNO37的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…32)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO37GTGCCCCTGTTTTGCCTTGGTGAACGGAGAGT(2)SEQIDNO38的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO38CAGGGCAGGAACACATCTCACAAGGATCCCA(2)SEQIDNO39的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO39GTCCCGTCCTTGTGTAGAGTGTTCCTAGGGT(2)SEQIDNO40的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO40GGGCAGGACCAACGCTAGCAAGGATCCCAAT(2)SEQIDNO41的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO41CCCGTCCTGGTTGCGATCGTTCCTAGGGTTA(2)SEQIDNO42的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO42CAGTGCAACGAGTCCCACCCTTGG(2)SEQIDNO43的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…24)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO43GTCACGTTGCTCAGGGTGGGAAAC(2)SEQIDNO44的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO44GACCACAAATCACTCCGATCCCAA(2)SEQIDNO45的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…24)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO45CTGGTGTTTAGTGAGGCTAGGGTT(2)SEQIDNO46的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO46GTCCCCACCAACACCTCTCTAGTCCTC(2)SEQIDNO47的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…27)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO47CAGGGGTGGTTGTGGAGAGATCAGGAG(2)SEQIDNO48的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…33)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO48TGACCGAGACCCGAAGACTTCACTCAGCTGCCC(2)SEQIDNO49的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO49GAAAACCCAGAACGAGACCACCAAGGCACAG(2)SEQIDNO50的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO50CTTTTGGGTCTTGCTCTGGTGGTTCCGTGTC(2)SEQIDNO51的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO51CACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAG(2)SEQIDNO52的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…26)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO52GTGGTTCCGTGTCCTGTAAGACCCTC(2)SEQIDNO53的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO53GAAAACCCAGATGAACGAGACCAAGGCACAG(2)SEQIDNO54的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…31)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO54CTTTTGGGTCTACTTGCTCTGGTTCCGTGTC(2)SEQIDNO55的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO55GTCCCCACCAACACCACTCTAGTCCTC(2)SEQIDNO56的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…27)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO56CAGGGGTGGTTGTGGTGAGATCAGGAG(2)SEQIDNO57的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…33)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO57TGACCGAGACCCGAAGACTTCACTCAGCTGCCC(2)SEQIDNO58的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO58TCCCCAGCAACACCTCTCTAGTC(2)SEQIDNO59的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO59GTGTCGACAGGGGTCGTTGTGGA(2)SEQIDNO60的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO60TCCCCAACAGAACCTCTCTAGTC(2)SEQIDNO61的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型其他核酸(A)描述／desc=“核酸”(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)／關(guān)鍵詞(B)位置互補(bǔ)(1…23)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO61GTGTCGACAGGGGTTGTCTTGGA權(quán)利要求1．一種mpl配體類(lèi)似物，其中(a)所述mpl配體包括一段氨基酸序列，該氨基酸序列選自SEQIDNO1中的氨基酸序列7～151到1-332，(b)所述mpl配體類(lèi)似物在所述氨基酸序列上具有至少1個(gè)附加N-連接糖基化位點(diǎn)，(c)所述mpl配體類(lèi)似物具有能特異性刺激或增加巨核細(xì)胞及血小板的生物活性，(d)所述的至少1個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)選自[Asn164]；[Asn163]；以及[Asn30，Thr32，Asn56，Asn120，Thr122，Asn164]。2．權(quán)利要求1的類(lèi)似物，其中所述的mpl配體具有一段選自下列序列的氨基酸序列mpl配體1-332SEQIDNO1中的第1～332位氨基酸；mpl配體1-199SEQIDNO1中的第1～199位氨基酸；mpl配體1-191SEQIDNO1中的第1～191位氨基酸；mpl配體1-183SEQIDNO1中的第1～183位氨基酸；mpl配體1-174SEQIDNO1中的第1～174位氨基酸；mpl配體7-332SEQIDNO1中的第7～332位氨基酸；mpl配體7-191SEQIDNO1中的第7～191位氨基酸；mpl配體7-199SEQIDNO1中的第7～199位氨基酸；mpl配體7-183SEQIDNO1中的第7～183位氨基酸；以及mpl配體7-174SEQIDNO1中的第7～174位氨基酸。3．權(quán)利要求2的類(lèi)似物，其中所述的mpl配體具有一段由SEQIDNO1中的第1～174位氨基酸組成的氨基酸序列。4．權(quán)利要求2的類(lèi)似物，其中所述的mpl配體具有一段由SEQIDNO1中的第1～199位氨基酸組成的氨基酸序列。5．根據(jù)權(quán)利要求2的mpl配體類(lèi)似物，該類(lèi)似物為[Asn30，Thr32，Asn56，Asn120，Thr122，Asn164]1-199。6．根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的類(lèi)似物，該類(lèi)似物是外源DNA序列在真核細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物。7．根據(jù)權(quán)利要求6的類(lèi)似物，其中所述的真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。8．根據(jù)權(quán)利要求7的類(lèi)似物，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。9．一種組合物，該組合物包括治療有效量的權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的mpl配體類(lèi)似物以及藥物學(xué)上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。全文摘要與天然mpl配體序列的對(duì)應(yīng)序號(hào)氨基酸相比,本發(fā)明公開(kāi)的mpl配體類(lèi)似物具有1個(gè)或多個(gè)變化了的糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及編碼所述mpl配體類(lèi)似物的DNA序列,用于類(lèi)似物表達(dá)的重組質(zhì)粒和宿主細(xì)胞,以及包括該類(lèi)似物的治療組合物。文檔編號(hào)C12N15/09GK1278866SQ98811054公開(kāi)日2001年1月3日申請(qǐng)日期1998年9月9日優(yōu)先權(quán)日1997年9月11日發(fā)明者S·G·埃利奧特申請(qǐng)人:安姆根有限公司