專(zhuān)利名稱(chēng)：高水溶性釕金屬配合物單線態(tài)氧熒光探針及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水溶液中單線態(tài)氧(1O2)的測(cè)定，具體涉及一種含有蒽環(huán)衍生物配體的釕金屬配合物單線態(tài)氧熒光探針的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單線態(tài)氧是氧分子處于高能激發(fā)態(tài)的一種不穩(wěn)定的存在形式，其化學(xué)性質(zhì)很活潑，較基態(tài)氧更不穩(wěn)定，是通常所說(shuō)的活性氧物種之一。活性氧物種在正常的人體細(xì)胞中含量很少，在健康的人體中處于平衡狀態(tài)，而且這些體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧對(duì)生命活動(dòng)具有重要的作用，它們?cè)隗w內(nèi)參與多種多樣的生理活動(dòng)，如信號(hào)的傳導(dǎo)，神經(jīng)傳遞，肌肉緊張的調(diào)節(jié)、蠕動(dòng)，血小板的聚合以及血壓高低的調(diào)節(jié)，免疫系統(tǒng)的控制，學(xué)習(xí)記憶，能量的產(chǎn)生，細(xì)胞規(guī)律的分裂生長(zhǎng)等。但是一旦這一平衡被打破，它們就可能對(duì)人體產(chǎn)生傷害作用，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化或脫脂化，造成膜差別透性喪失、離子大量外滲、代謝紊亂等一系列生理變化， 嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。單線態(tài)氧作為有機(jī)化學(xué)中一種珍貴試劑，在許多光化學(xué)和光生物反應(yīng)，如光降解、污染物的光轉(zhuǎn)化、化學(xué)發(fā)光、生物體氧化老化、甚至是光致癌作用等過(guò)程中，都扮演著十分重要的角色。在有機(jī)合成中，單線態(tài)氧使得在高度立體專(zhuān)一的有機(jī)化合物中引入氧變得極為容易。在生物體系中，單線態(tài)氧對(duì)生命體系有著重大的影響。單線態(tài)的生理學(xué)氧化作用越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。單線態(tài)氧在細(xì)胞損傷和凋亡中起著重要的作用，它對(duì)機(jī)體可能造成強(qiáng)氧化性損傷，從而引起機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用的發(fā)生，導(dǎo)致生物膜、小動(dòng)脈、DNA、蛋白質(zhì)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，加快機(jī)體的衰老和死亡，因此被認(rèn)為是體內(nèi)重要的毒性物種，能引發(fā)與氧化損傷有關(guān)的疾病，如白內(nèi)障、肺水腫、糖尿病、肌肉萎縮、營(yíng)養(yǎng)缺乏、精神病和腫瘤萌生等[(a)K. Briviba, L. 0. Klotz, H. Sies, Toxic and signaling effects of photochemicalIy or chemically generated singlet oxygen in biological systems, Biol. Chem. ,1997,378,1259. b)J.R.Wagner, P. A. Motchnik, R. Stocker, H. Sies, B. N. Ames, The oxidation of blood plasma and low density lipoprotein components by chemically generated singlet oxygen, J. Biol. Chem., 1993,268,18502. c)A. Gomes, E. Fernandes,Jose L. F. C. Lima,Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species, J. Biochem. Biophys. Methods. ,2005,65, 45.]。單線態(tài)氧在細(xì)胞的增生、分化、凋亡等調(diào)控中也起重要作用，被認(rèn)為是一種新的第二信使[(a) R. W. Redmond, I. Ε. Kochevar, Spatially resolved cellular responses to singlet oxygen, Photochem. Photobiol. ,2006,82(5),1178-1186. (b)N. L. Oleinick, R.L.Morris， I.Belichenko, The role of apoptosis in response to photodynamic therapy :what，where, why, and how, Photochem. Photobiol. Sci.，2002，1，1-21. ] 0 相反， 也可以利用單線態(tài)氧的強(qiáng)氧化性來(lái)殺死體內(nèi)的病毒細(xì)胞?？茖W(xué)家已經(jīng)利用單線態(tài)氧這種強(qiáng)氧化性來(lái)治療腫瘤，實(shí)驗(yàn)表明惡性細(xì)胞獲取并結(jié)合單線態(tài)氧的敏化劑藥物的能力顯著地大于正常組織分子，這樣通過(guò)光照后，藥物分子產(chǎn)生的單線態(tài)氧就能選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，這種光動(dòng)力學(xué)治療技術(shù)在腫瘤的診斷和治療中具有廣泛的應(yīng)用前景，目前已應(yīng)用于下生殖道癌前病變、原位癌和晚期惡性腫瘤，如外陰癌和卵巢癌等許多部位的診斷和治療[a) D. G. J. E. J. D. Dolmans, R. K. J. Fukumura, timeline :Photodynamic therapy for cancer, Nat. Rev. Cancer,2003,3,380.b)A.P.Castano, P. M.Mroz, R.Hamblin, Photodynamic therapy and anti-tumour immunity.Nat. Rev. Cancer,2006,6,535. c)N. Nishiyama, W. D.Jang, K.Kazunori, Supramolecular nanocarriers integrated with dendrimers encapsulating photosensitizers for effective photodynamic therapy and photochemical gene delivery. New J. Chem. ,2007,31,1074. d)T. Oba, Photosensitizer nanoparticles for photodynamic therapy. Curr. Bioact. Comp.，2007，3，239.]。醫(yī)學(xué)上，用亞甲基藍(lán)(methylene blue, MB)光敏化法產(chǎn)生的1O2來(lái)對(duì)血漿消毒和腫瘤的光動(dòng)力學(xué)診斷[L. C. Harber, A. S. Fleischer, R. L. Baer, Erythropoietic protoporphyria and photohemolysis. J. Am. Med. Assoc.，1964，189，191.]。這種光動(dòng)力學(xué)治療技術(shù)在腫瘤的診斷和治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。單線態(tài)氧與人類(lèi)健康和疾病密切相關(guān)，是當(dāng)前生命科學(xué)和化學(xué)科學(xué)交叉研究的熱點(diǎn)。由于單線態(tài)氧在光化學(xué)和光生物過(guò)程中具有如此重要的地位，1O2檢測(cè)倍受關(guān)注， 特別是生物體系中1O2的檢測(cè)越來(lái)越引起科研工作者的關(guān)注。研發(fā)高靈敏度和選擇性好的單線態(tài)氧的小分子熒光探針具有重要意義，它能實(shí)時(shí)地給出單線態(tài)氧靶向細(xì)胞體系內(nèi)生物大分子的重要空間分布信息，能夠適時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)體內(nèi)單線態(tài)氧的含量，對(duì)于某些疾病的預(yù)防、診斷以及病理的研究都有十分重要的指導(dǎo)意義[K. Tanaka, T. Miura, N. Umezawa, Y. Urano, K. Kikuchi, T. Higuchi, T. Nagano, Rational design of fluorescein-based fluorescence probes，Mechanism—based design of a maximum fluorescence probe for singlet oxygen, J. Am. Chem. Soc.，2001，123 (11)，2530.]。目前已報(bào)道的用于檢測(cè)單線態(tài)氧的方法主要有以下幾種(1)磷光光度法。磷光光度法的原理是處于激發(fā)態(tài)氧分子的單線態(tài)氧，其能量高于基態(tài)氧分子，電子由激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)，以光的形式釋放能量而發(fā)出磷光。它利用單線態(tài)氧自身淬滅在1268nm處產(chǎn)生的近紅外磷光進(jìn)行檢測(cè)，此法最直接，對(duì)生物體無(wú)侵害，選擇性高，被認(rèn)為是檢測(cè)單線態(tài)氧的標(biāo)準(zhǔn)方法。但靈敏度低、檢出信號(hào)弱、無(wú)法用于很低濃度 1O2 的檢測(cè)[K. Andersen, Ζ. Cao, P. R. Ogilby, L. Poulsen, I. Zebger, J. Phys. Chem. A. 2002， 106,8488.]。(2)化學(xué)捕獲吸光光度法。此方法是利用9，10- 二苯基蒽(DPA)與1O2的特征性反應(yīng)生成穩(wěn)定的內(nèi)過(guò)氧化物引起DPA吸收光譜的變化，通過(guò)檢測(cè)DPA吸收光譜的變化來(lái)測(cè)量1O2,此法選擇性好，靈敏度比1268nm磷光探測(cè)高[M. J. Steinbeck, Α. U. Khan, Μ.J.Karnovsky, Extracellular production of singlet oxygen by stimulated macrophages quantified using 9,10-diphenylanthracene and perylene in a polystyrene film, J. Biol. Chem.，1993,268(21)，15649.]。該方法已被用于測(cè)定刺激性吞噬細(xì)胞中的單線態(tài)氧的含量[a)M. J. Steinbeck,Α. U. Khan,Μ. J. Karnovsky, Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particles coated with a chemical trap. J. Biol. Chem. , 1992, 267, 13425. b)M. J. Steinbeck, A.U.Khan, M.J.Karnovsky, Extracellular production of singlet oxygen by stimulated macrophages quantified using 9,10-diphenylanthracene and perylenein a polystyrene film. J. Biol. Chem.，1993，268，15649.]。但是，此法是基于吸收光譜， 所以靈敏度仍然較低。(3)有機(jī)熒光探針?lè)?。典型的有機(jī)熒光探針9，10-Dimethylanthracene (DMA)， DMA是一種熒光化合物(λ λ M = 375/436)，能選擇性地與單線態(tài)氧反應(yīng)生成其內(nèi)過(guò)氧化物，本身熒光消失。近年來(lái)，利用熒光信號(hào)為檢出手段的有機(jī)熒光探針?lè)ò▋深?lèi) (a)利用1O2與帶有蒽環(huán)的熒光素類(lèi)探針?lè)肿訉?zhuān)一性反應(yīng)，使得探針由原來(lái)的非熒光性分子變?yōu)閺?qiáng)熒光性分子，從而用于1O2的檢測(cè)[N. Umezawa, K. Tanaka, Y. Urano, K. Kikuchi, T. Higuchi, T. Nagano, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38, 2899 ；K. Tanaka, Τ. Miura, N. Umezawa, Y. Urano, K. Kikuchi, Τ. Higuchi, Τ. Nagano, J. Am. Chem. Soc. 2001,123, 2530.]。 該方法檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高，但不適用于低PH值環(huán)境和實(shí)時(shí)檢測(cè)。(b)利用熒光探針?lè)肿娱g的能量傳遞，激發(fā)探針?lè)肿影l(fā)出強(qiáng)的遲滯熒光，進(jìn)而用于檢測(cè)1OJA. A. Krasnovskii, C. Schweitzer, H. Leismann, C. Tanielian, Ε. A. Luk' yanets, Quantum Electron. , 2000, 30, 445 ；A. A. Krasnovskii, Μ. E. Bashtanov, N. N. Drozdova, 0. A. Yuzhakova, E. A. Luk' yanets, Quantum Electron.，2002，32，83.]。這類(lèi)探針主要有酞菁染料和紫菜嗪衍生物等，當(dāng)接收到單線態(tài)氧的能量后能在700nm附近發(fā)出熒光用于檢測(cè)。(4)化學(xué)發(fā)光探針?lè)ā＿@是一類(lèi)基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)理的單線態(tài)氧熒光探 # [X. H. Li, G. X. Zhang, H. Μ. Ma, D. Q. Zhang, J. Li, D. B. Zhu, J. Am. Chem. Soc. 2004,126, 11543.]，這類(lèi)探針檢測(cè)速度快且具有很高的靈敏度和很好的選擇性，但水溶性差，不利于生物體系中1O2的測(cè)定。(5)稀土熒光探針。袁景利小組基于稀土熒光配合物的長(zhǎng)壽命熒光特征，制備了一系列稀土熒光探針，利用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)測(cè)定單線態(tài)氧已取得較好的效果[袁景利，宋波，王桂蘭，譚明乾，一種基于銪配合物的單線態(tài)氧熒光探針及其應(yīng)用，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?00510130851. 9 ；袁景利，宋波，王桂蘭，一種單線態(tài)氧銪配合物熒光探針及其應(yīng)用，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?00510045768. 1 ；袁景利，宋波，王桂蘭，一種鋱配合物單線態(tài)氧熒光探針及其應(yīng)用，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?00510045767. 7]，這類(lèi)配合物的激發(fā)波長(zhǎng)處于紫外區(qū)，測(cè)定1O2時(shí)，對(duì)生物體系有損傷[B. Song. G. L. Wang. Μ. Q. Tan. J. L. Yuan. New J. Chem. 2005，29，1431.]。我們最近報(bào)道了一個(gè)錸(I)配合物的單線態(tài)氧熒光探針[Y.J.Liu，K. Ζ. Wang, Eur. J. Inorg. Chem.，2008，5214.]和兩個(gè)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)[王科志，劉艷菊，陳春輝， 釕和銥金屬配合物單線態(tài)氧熒光探針的制備及其應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?00810M0591.4;王科志，李奇，劉燕菊，尹紅菊，Hdppz配體的釕配合物作為單線態(tài)氧熒光探針的應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)?201110159371.0.]。這些配合物雖可在可見(jiàn)光激發(fā)下檢測(cè)單線態(tài)氧，但無(wú)單線態(tài)氧存在時(shí)該配合物表現(xiàn)出較大的背景熒光，且水溶性、單線態(tài)氧的檢測(cè)靈敏度與選擇性仍需進(jìn)一步改進(jìn)。因此進(jìn)一步制備具有水溶性好、靈敏度高、選擇性好，適用范圍廣，可見(jiàn)光激發(fā)的單線態(tài)氧熒光探針具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)水溶性好、可見(jiàn)光激發(fā)、背景熒光低、選擇性好、靈敏度高的新型1O2熒光探針。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種含有蒽環(huán)衍生物配體的釕配合物，其結(jié)構(gòu)通式為[RuAmLn]&，其中X為抗衡離子；L為蒽環(huán)衍生物配體，其結(jié)構(gòu)如式I所示；A為N~N輔助配體；m = 0或2，n = 1或3， 且 m+n = 3 ;k = 1 或 2。
權(quán)利要求
1. 一種含有蒽環(huán)衍生物配體的釕配合物，其結(jié)構(gòu)通式為[RuAmLn])(k，其中X為抗衡離子；L為蒽環(huán)衍生物配體，其結(jié)構(gòu)如式I所示；A為N~N輔助配體；m = 0或2，n = 1或3，且 m+n = 3 ;k = 1 或 2 ；
2.如權(quán)利要求1所述的釕配合物，其特征在于，所述A為聯(lián)吡啶或鄰菲咯啉。
3.如權(quán)利要求1所述的釕配合物，其特征在于，所述X選自Cl_，PF6-,ClO4-, N03_，BF4_， CF3SOf和SO廣中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的釕配合物，其特征在于，式I中R1為氫或C1-C6的直鏈或支鏈烷基，R2為C1-C6的直鏈或支鏈烷基磺酸鈉基或者C1-C6的直鏈或支鏈烷基磺酸鉀基。
5.如權(quán)利要求4所述的釕配合物，其特征在于，式I中R1為氫或C1-C4的直鏈或支鏈烷基，R2為C1-C4的直鏈或支鏈烷基磺酸鈉基或者C1-C4的直鏈或支鏈烷基磺酸鉀基。
6.權(quán)利要求1 5任一所述釕配合物的制備方法，將水合三氯化釕或RuA2Cl2與配體L 在溶劑中加熱至100-140°C進(jìn)行配位反應(yīng)，當(dāng)X興Cl_時(shí)還需在配位反應(yīng)結(jié)束后冷卻，并加入抗衡陰離子X(jué)攪拌反應(yīng)一定時(shí)間，得到粗產(chǎn)品，然后通過(guò)重結(jié)晶或是柱層析分離純化，獲得所述釕配合物。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，根據(jù)下述方法制備配體L氮?dú)獗Ｗo(hù)下， 將式(1)所示配體與NaH或KH在有機(jī)溶劑中進(jìn)行回流反應(yīng)，然后冷卻至室溫，加入式(2) 所示的磺酰內(nèi)酯或MO3SCiH2iBr室溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間后再緩慢升溫進(jìn)行回流反應(yīng)，析出沉淀， 冷卻至室溫后抽濾，將所得沉淀進(jìn)行重結(jié)晶，得到配體L ；
8.權(quán)利要求1 5任一所述釕配合物作為單線態(tài)氧熒光探針的用途。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，利用所述釕配合物測(cè)定中性或堿性水溶液中單線態(tài)氧的含量，包括以下步驟1)在已知的能有效產(chǎn)生單線態(tài)氧的中性或堿性溶液體系中加入所述釕配合物，在一系列的單線態(tài)氧濃度條件下，通過(guò)可見(jiàn)光激發(fā)測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度和吸光度，得到相對(duì)應(yīng)的熒光量子效率，獲得熒光量子效率相對(duì)于單線態(tài)氧濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)在含所述釕配合物的中性或堿性緩沖溶液中加入一定量的待測(cè)溶液，通過(guò)可見(jiàn)光激發(fā)測(cè)定其熒光強(qiáng)度和吸光度，計(jì)算出熒光量子效率；3)根據(jù)步驟幻測(cè)得的熒光量子效率的值，通過(guò)步驟1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測(cè)溶液中單線態(tài)氧的含量。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述步驟1)和2)中熒光量子效率通過(guò)如下公式計(jì)算得出φ3 = φStd(Astd/As) (is/Istd) (ns/nstd)2其中，下標(biāo)S和Std分別表示待測(cè)體系和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，Φ為熒光量子效率，A為激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度，I為發(fā)射的熒光強(qiáng)度，η為溶液的折光率。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高水溶性釕金屬配合物單線態(tài)氧熒光探針及其制備和應(yīng)用。該釕配合物以過(guò)渡金屬釕為中心離子，以帶有磺酸鈉(或鉀)基的蒽環(huán)衍生物為配體，具有單線態(tài)氧熒光探針的性能，相對(duì)于現(xiàn)有的蒽環(huán)衍生物配體釕配合物水溶性更好，適用于中性和堿性體系的水溶液中1O2定性或定量測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102344464SQ20111020428
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者劉艷菊, 尹紅菊, 李奇, 王克志 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)