釕配合物作為靶向細胞核核酸載體的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及釕配合物的新應(yīng)用，特別涉及釕配合物作為核酸載體的新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療（genetherapy)技術(shù)對腫瘤等疾病的治療日益受到研究者的重視和關(guān) 注。所謂基因治療是指把某些功能性遺傳物質(zhì)，包括siRNA，mRNA、miRNA、DNA、核酸適配體 以及癌癥基因的啟動區(qū)序列轉(zhuǎn)染（transfection)到細胞中，使其在細胞中表達，最終達到 治療疾病的目的。基因治療的關(guān)鍵是安全、高效的載體（vector)將治療基因轉(zhuǎn)染到細胞 中。通?？梢悦子貌《荆╲iral)載體如RNA病毒或DNA病毒，或者非病毒（non-viral)載 體包括磷酸1丐沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法等轉(zhuǎn)染治療基因（H.Yin,R.L.Kanasty, A.A.Eltoukhy,A.J.Vegas,J.R.Dorkin,D.G.Anderson,Non-viralvectorsfor gene-basedtherapy,NatureRev. , 15, 541-555, 2014;ViktoriyaSokolovaand MatthiasEpple,InorganicNanoparticlesasCarriersofNucleicAcidsinto Cells,Angew.Chem.Int.Ed. 2008, 47, 1382 - 1395;S.Huo,S.Jin,X.Ma,X. Xue,K.Yang,A.Kumar,P.C.Wang,J.Zhang,Z.Hu,X. -J.Liang,Ultrasmallgold nanoparticlesascarriersfornucleus-basedgenetherapyduetosize-dependent nuclearentry,ACSNANO, 8(6), 5852-5862, 2014)。但是這些方法由于各自的缺陷和 不足，在臨床上的應(yīng)用仍然受到較大限制。
[0003] 近年來，應(yīng)用釕（II)配合物作為基因載體的研究引起研究者的廣泛興趣。 Kumbhar等報道了一種應(yīng)用f了多吡啶配合物作為基因載體的應(yīng)用（S.S.Bhat,A.S. Kumbhar,A.K.Kumbhar,A.Khan,P.Lonnecke,Rutheium(II)polypyridylcomplexes ascarriersforDNAdelivery,Chem.Comm.，2011，47，11068-1070);巢輝等人 報道了多吡啶釕（II)配合物作為基因載體的方法（B.Yu，Y.Chen，C.Ouyang，Η. Huang,L.JiandH.Chao;Aluminescenttetranuclearruthenium(II)complexas atrackingnon-viralgenevector,Chem.Commun·，2013，49，810-812).但是這些 報道中所使用的釕配合物分子分子量相對較大，合成工藝相對復(fù)雜，其作為基因載體的效 果十分有限，且上述報道釕配合物及其光學(xué)異構(gòu)體均未報道作為靶向細胞核的基因載體的 應(yīng)用。由于基因的復(fù)制轉(zhuǎn)錄的主要場所為細胞核，因此將核酸靶向性的轉(zhuǎn)運到細胞核可以 提高基因的自我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄應(yīng)用效率，獲得更好的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供釕配合物作為核酸載體的應(yīng)用。
[0005] 實驗數(shù)據(jù)表明，具有下述通式的釕（II)配合物，可以與核酸序列有效地結(jié)合在一 起，并有效改變長序列(如50bp以上)核酸的形態(tài)，使得其可以有效地跨膜運輸至活細胞內(nèi)， 并很好地定位于細胞核中，大大提高了核酸的運載效率。利用這一特性，可以方便地轉(zhuǎn)運核 酸序列至細胞內(nèi)，進行基因治療，或進行熒光示蹤等。
[0006] 釕（II)配合物具有如下結(jié)構(gòu)通式：
R獨立選自取代烷基、取代苯基、取代吡啶基、取代呋喃基、取代噻唑和取代吡咯的取代 基任選自羥基、硝基、鹵素、氨基、羧基、氰基、巰基、碳原子數(shù)為3~8的環(huán)烷基、S03H、碳原 子數(shù)為1~6的烷基、碳原子數(shù)為2~6的鏈烯基、碳原子為2~6的鏈炔基、羥基（C「C6)烷 基、氨基（(：「(：6)烷基、〇)21?'、〇)謝'1?'、〇)1?'、30 21?'1?'、（(：「(：6)烷氧基、（(：「(：6)烷硫基、4=謝'、 NR'R'或三氟（CfC6)烷基；其中，所述R'選自H、碳原子數(shù)為1~6的烷基或苯基； 札獨立選自氫，羥基，三甲基硅基，碳原子數(shù)為1~6的烷基或碳原子為1~6的取代烷 基，苯基或取代苯基，吡啶基或取代吡啶基，呋喃基或取代呋喃基，吡咯基或取代吡咯基，噻 唑或取代噻唑基；式中&取代的乙炔基位置可以位于苯環(huán)的鄰位、間位或者對位；取代乙 炔基的數(shù)量為1個，2個或者是多個；R2獨立的選自甲基、甲氧基、硝基、鹵素；Y為使釕（II) 配合物整體呈電中性的離子或者酸根離子，η為使釕（II)配合物整體呈電中性的離子或者 酸根離子的數(shù)目； 核酸序列的長度至少為4bp。特別的，核酸的長度不超過3000bp。
[0007] 作為上述應(yīng)用的進一步改進，釕配合物為其單一手性異構(gòu)體。
[0008] 作為上述應(yīng)用的進一步改進，核酸的長度不超過3000bp。核酸選自cmyc啟動 區(qū)DNA,C-kit啟動區(qū)DNA,bcl-2 啟動區(qū)DNA,miR-21，AS1411 的DNA、SiRNA、microRNA、 核酸適配體以及mRNA。
[0009] 作為上述應(yīng)用的進一步改進，核酸上標(biāo)記有熒光基團。
[0010] 釕配合物-核酸復(fù)合物作為熒光探針的應(yīng)用，其中釕配合物如上所述。
[0011] 釕配合物-核酸復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：將釕配合物與核酸溶液混合 均勻，加熱至70~100°C并維持30S~30min;冷卻后去除游離的釕配合物，得到釕配合 物-核酸復(fù)合物；其中，釕配合物的結(jié)構(gòu)式如權(quán)利要求1~3任意一項所述，核酸的長度不 低于4bp。
[0012] 作為上述方法的進一步改進，使用微波進行加熱。
[0013] 作為上述方法的進一步改進，核酸上標(biāo)記有熒光基團。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明釕配合物-核酸復(fù)合物的制備方法，能夠高效率地制備得到穩(wěn)定的釕配合 物-核酸復(fù)合物，獲得更好的效果。
【附圖說明】
[0015] 圖1~41分別是實施例1~41所使用的釕配合物的結(jié)構(gòu)式(如有)及其與DNA復(fù) 合得到的復(fù)合物的??Μ圖； 圖42熒光顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物（Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2細胞中的分布與定位； 圖43熒光顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物（Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在宮頸癌Hela細胞中的分布與定位； 圖44熒光顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物（Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在乳腺癌MCF-7細胞中的分布與定位； 圖45激光共聚焦顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物 (/l-Ru(bpy)2pBEPIP](C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2細胞中的分布與定 位； 圖46激光共聚焦顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物 (/l-Ru(bpy)2pBEPIP](C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌MCF-7細胞中的分布與定 位； 圖47熒光顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物(』-Ru(bpy)2pBEPIP](C104)2: FAM-c-myc pu22 DNA=1:1)在肝癌HepG2細胞中的分布與定 位； 圖48熒光顯微鏡下觀察釕配合物-核酸（FAM熒光標(biāo)記）復(fù)合物（/1-Ru(bpy) 2pEPIP] (C104)2:FAM-AS1411DNA=1:1)在肝癌!fepG2細胞中的分布與定位。
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明所使用的釕配合物，可參照本發(fā)明人之前的專利申請（CN103709202A、 CN103788134A)或其他公知的方法合成得到。
[0017] 下面結(jié)合實施例，進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0018] 以下實施例中使用的核酸序列如下： c-myc Pu22:5, - TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3'（SEQIDN0:1) Bcl-2 Pu27 :5' - CGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGGAGC-3' （SEQID N0:2) c-Kit 1：5, -GGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3' (SEQID NO：3) K-ras：5,-GCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGGCAG-3, (SEQ ID NO：4) 端粒DNA序列：5' -TTAGGG-3' AS1411 序列：5,-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'(SEQIDNO:5)miR-21RNA序列：5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'（SEQIDNO:6) PAR-1siRNA: 5' -AGAUUA⑶CUCCAUCAUA-3'（SEQIDNO:7)。
[0019]實施例 1: [Ru(bpy)pBEPIP] (C104)2-c-myc啟動區(qū)DNA復(fù)合物的制備 實驗方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2 (圖 1A)與 1mMc-mycPu22 溶液按 1:1 均勻混合，加熱至90°C維持0. 5~lOmin，然后自然冷卻至室溫，4°C靜置24小時。將反應(yīng) 混合物用蒸餾水進行透析，除去未負載到核酸里的多吡啶釕（II)配合物，得多吡啶釕（II) 配合物-核酸復(fù)合物，TEM檢測發(fā)現(xiàn)釕配合物促進了c-mycPu22序列發(fā)生自組裝形成了納 米管結(jié)構(gòu)（圖1B)。
[0020]實施例 2:[Ru(bpy) 2pBEPIP] (C104) 2-端粒DNA復(fù)合物的制備 實驗方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2與 1mM端粒DNA(5' -TTAGGG-3'）溶液按 1:1均勻混合，溶液按1:1均勻混合，加熱至90°C，維持0. 5~lOmin，然后自然冷卻至室溫， 4°C靜置24小時。將反應(yīng)混合物用蒸餾水進行透析，除去未負載到核酸里的多吡啶釕（II) 配合物，得多吡啶釕（II)配合物-核酸復(fù)合物，TEM檢測發(fā)現(xiàn)釕配合物促進了端粒DNA序 列發(fā)生自組裝形成了類似納米管結(jié)構(gòu)（圖2)。
[0021] 實施例3: [Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2與bcl-2啟動區(qū)DNA復(fù)合物的制備 實驗方法：lmM[Ru(bpy)2pBEPIP](C10 4)2與lmMBcl-2pu27溶液按l:l均勻混合， 加熱至