本發(fā)明涉及昆蟲人工飼料領(lǐng)域，更具體地說涉及一種去除植食性昆蟲人工飼料中甾醇的方法。
背景技術(shù)：
甾醇是四元環(huán)類脂物質(zhì)的總稱，結(jié)構(gòu)大多數(shù)都相似，基本骨架為環(huán)戊烷多氫菲核，有三個六元環(huán)和一個五元環(huán)組成，不同甾醇的區(qū)別在于c-3位上連有的官能團(tuán)，c-17位連有的側(cè)鏈，以及側(cè)鏈上雙鍵的位置，如下所示：
甾醇包括動物甾醇(膽甾醇)和植物甾醇，目前，已鑒定出了250多種甾醇，它們主要以游離態(tài)、甾醇酯(脂肪酸酯和酚酸酯)、甾基糖苷和?；藁擒盏刃问酱嬖?。常見游離甾醇有膽甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等，具有雙鍵的甾醇有燕麥甾醇、菠菜甾醇、麥角甾醇等，常見的甾醇酯有β-谷甾醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯等。
膽甾醇廣泛存在于動物體內(nèi)，是昆蟲等各種真核細(xì)胞生物必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，是細(xì)胞膜的重要組成部分，也是合成昆蟲蛻皮激素的前體，對維持昆蟲的生長發(fā)育至關(guān)重要。但是昆蟲體內(nèi)缺少膽甾醇合成途徑中所必須的關(guān)鍵性酶，所以昆蟲不能像哺乳動物一樣用自身的脂類或碳水化合物合成膽甾醇，它們必須從植物中獲取植物甾醇，再轉(zhuǎn)化成膽甾醇，或從獵物中直接獲取膽甾醇。甾醇的種類雖然較多，但可被昆蟲利用的卻有限，有些還對昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。
因此，國內(nèi)外研究者提倡可以通過某種技術(shù)術(shù)降低作物中甾醇表達(dá)量或改變甾醇結(jié)構(gòu)來達(dá)到防治植食性害蟲的目的。同時(shí)，人和哺乳動物可自身合成膽甾醇，所以植物體內(nèi)甾醇種類和含量的改變，不會對人和哺乳動物產(chǎn)生太多的不利影響。但是，每種害蟲對食物中甾醇的最低需求量是多少？用此法防治害蟲時(shí)會對天敵昆蟲產(chǎn)生什么樣的影響？尚且不明確，都需要研究。
雖然可以采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來調(diào)控植物體內(nèi)甾醇的種類和含量，但是轉(zhuǎn)基因是個敏感的話題；采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對研究人員自身?xiàng)l件要求也較高；植物的生長周期長，采用轉(zhuǎn)基因法耗時(shí)也會較長；在眾多的甾醇類物質(zhì)及其類似物中，不是所有的對害蟲生長發(fā)育都有利，不同的害蟲生長發(fā)育過程中所需要的甾醇量也各有不同，采用轉(zhuǎn)基因的方法篩選耗時(shí)太長，急需一種快速簡便的脫甾醇方法。
采用人工飼料來飼養(yǎng)多種害蟲的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，可利用人工飼料來研究某種營養(yǎng)成分對害蟲的作用。作為大多數(shù)害蟲的食物，植物的種子和葉片中均含有植物甾醇，且種類和數(shù)量不等，若研究某種甾醇的含量對害蟲生長發(fā)育以及生理生化的影響，就必須先去除人工飼料原料(玉米籽粉、小麥粉、大豆粉、麥麩等)中的甾醇，再定量添加入某種甾醇。若進(jìn)行上述科學(xué)研究，采用國內(nèi)已報(bào)道的脫除甾醇的方法并不可行。因?yàn)?，這些脫除甾醇的方法只是粗放的用萃取劑將甾醇和一部分非甾醇的營養(yǎng)物質(zhì)一起萃取出來，而不再繼續(xù)分離，會造成原料中其他營養(yǎng)成分的改變。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種去除植食性昆蟲人工飼料中甾醇的方法,只脫除甾醇而不使其他營養(yǎng)成分流失。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
1.一種去除植食性昆蟲人工飼料中甾醇的方法，其特征在于：包括如下步驟：
第一步，向盛有植物種子粉末的容器中加入無水乙醇，對所述容器中的混合液進(jìn)行攪拌、靜置、吸取上清液，下層沉淀留置在所述容器中待用；
第二步，向所述下層沉淀中加入正己烷，對所述容器中的混合液進(jìn)行攪拌、靜置、吸取上清液，得到不含甾醇的下層沉淀；
第三步，將所述第一步、所述第二步中的上清液蒸干，回收溶劑，將蒸干物重新溶解少量溶劑中，均勻地加在硅膠柱上面；
第四步，用多種洗脫劑來洗脫所述硅膠柱，其中，每一種所述洗脫劑用量與硅膠的體積比為2.5：1-3.5：1，所述洗脫劑的流速控制在55-65滴/分鐘，經(jīng)洗脫后的液體每23-28ml作為一組進(jìn)行收集，將不含甾醇與含有甾醇的液體樣本分離開；
第五步，對所述第四步中洗脫后含有甾醇的液體樣本蒸干，采用薄層分析法進(jìn)一步分離；
第六步，萃取出所述第五步中含有甾醇的樣本，采用柱層析法洗脫分離所述萃取出的含有甾醇的樣本，得到不含甾醇的混合液；
第七步，將所述第一步、所述第二步、所述第四步、所述第六步中不含甾醇的部分混合，采用蒸干溶劑、烘干固體，得到最終不含甾醇的人工飼料原料。
進(jìn)一步，所述第五步中薄層分析法，其步驟包括：1)將所述第四步中洗脫后仍含有甾醇的液體蒸干，重新溶于乙醚后作為樣品，與標(biāo)樣在距離層析板邊緣1-1.5cm處用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣的斑點(diǎn)直徑為0.1-0.4cm，相鄰所述斑點(diǎn)的間距為8-1.2cm；2)將層析板放入展開室中進(jìn)行樣品展開；3)使用固體碘單質(zhì)對所述步驟2)中展開的樣品進(jìn)行熏蒸著色；4)依據(jù)所述標(biāo)樣中各種甾醇的位置，在所述層析板上標(biāo)出所述樣品中對應(yīng)的點(diǎn)或條帶，得到含有甾醇與不含有甾醇的點(diǎn)或條帶。
進(jìn)一步，所述第六步萃取出所述第五步中含有甾醇的樣本后采用柱層析法洗脫分離的具體方法為：1)將所述第五步中含有甾醇的點(diǎn)或條帶的洗脫液待液體揮發(fā)干后，重新用1-2ml乙醚溶解萃取出所述第五步中含有甾醇的樣本，均勻地加在2-4ml的硅膠柱上；2)用多種洗脫劑來洗脫所述硅膠柱，其中，每一種所述洗脫劑的用量與硅膠的體積比為2.5：1-3.5：1，所述洗脫劑的流率控制在55-65滴/分鐘，將不含甾醇與含有甾醇的液體樣本分離開。
進(jìn)一步，所述第四步、所述第六步中洗脫硅膠柱時(shí)加入的洗脫劑依次為：正己烷、體積比為1:1的正己烷與甲苯的混合液、甲苯、乙醚、體積比為1:1的乙醚和甲醇的混合液、甲醇。
進(jìn)一步，所述第一步、所述第二步采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，所述磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為550-650r/min，攪拌時(shí)長為1.5-2.5h，靜置時(shí)間為2-4h。
進(jìn)一步，所述第三步中的硅膠柱由50g的200目硅膠填充進(jìn)一個內(nèi)徑為3.5cm、長度為30cm的玻璃柱內(nèi)制成。
進(jìn)一步，所述第三步、所述第五步、所述第七步采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸干，回收蒸出的無水乙醇和正己烷用于重復(fù)脫除甾醇。
進(jìn)一步，所述第七步采用烘箱對蒸干的固體烘干，溫度為105-120℃，烘干時(shí)長為0.5-1.5h。
進(jìn)一步，所述標(biāo)樣為溶于乙醚中的豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇和膽甾醇的混合液。
進(jìn)一步，所述第一步至所述第七步使用的溶劑純度均為分析純。
本發(fā)明的有益效果為：用此法可去除多種粉末狀人工飼料原料中的甾醇，如玉米籽粉、小麥粉、大豆粉、麥麩等，適用范圍廣；
通過多次分離和萃取，使飼料原料中的甾醇和非甾醇成分最大程度的分離，只去除人工飼料原料中的甾醇，而不使原料中其他營養(yǎng)成分流失；
采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸干，回收蒸出的無水乙醇和正己烷可用于重復(fù)脫除甾醇，節(jié)約試劑；
按照本發(fā)明中柱層析和薄層層析的方法和用量，可以準(zhǔn)確地分離飼料中有甾醇和無甾醇的部分，提高分離效率；
采用本發(fā)明中脫除甾醇的方法比采用轉(zhuǎn)基因方法更易于掌握，所用試劑廉價(jià)，儀器較少，脫除周期更短，更精準(zhǔn)；
在研究甾醇類物質(zhì)對害蟲的影響時(shí)，能定量研究不同種類甾醇或不同含量的甾醇對昆蟲生長發(fā)育和代謝組學(xué)的影響。
附圖說明
圖1是本發(fā)明方法示意圖。
具體實(shí)施方式
下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1
以玉米籽粉為例，一種去除植食性昆蟲人工飼料中甾醇的方法，包括如下步驟：
第一步，稱取100g玉米籽粉置于900ml燒杯中，加入300ml純度為分析純的無水乙醇，再放入一個規(guī)格為4cm×0.8cm的磁棒，將所述燒杯置于磁力攪拌器上，以600r/min、攪拌2h后靜置3h，吸出上清液置于試劑瓶中；再向所述燒杯中加入300ml純度為分析純的無水乙醇，對混合液進(jìn)行攪拌、靜置、提取上清液，重復(fù)上述步驟共計(jì)四次；將五次取出的無水乙醇上清液體合并；
第二步，向所述第一步的下層沉淀中加入300ml純度為分析純的正己烷，使用所述第一步的提取上清液的方式，重復(fù)提取五次，將吸出的五次上清液合并，下層沉淀留置在所述燒杯中待用；
第三步，用50g的200目的硅膠填充進(jìn)一個內(nèi)徑3.5cm、長30cm的玻璃柱中，將所述第一步、所述第二步中提取出的上清液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，回收蒸出的無水乙醇和正己烷，用于重復(fù)脫除甾醇，將蒸干后的物質(zhì)用2ml無水乙醚重新溶解，均勻地加入硅膠柱上面；
第四步，依次用正己烷、體積比為1:1的正己烷與甲苯混合液、甲苯、乙醚、體積比為1:1的乙醚和甲醇混合液、甲醇作為洗脫劑來洗脫硅膠柱，其中，每一種所述洗脫劑用量與硅膠的體積比為3：1，所述洗脫劑的流率控制在60滴/分鐘，經(jīng)洗脫后的液體每25ml作為一份收集在一只錐形瓶中；將所述正己烷、所述正己烷與甲苯混合物、所述甲苯所洗脫下來的液體加入到所述第二步中含有所述下層沉淀的燒杯中；
第五步，所述乙醚、體積比為1:1的所述乙醚和甲醇混合液、所述甲醇所洗脫下來的液體中含有甾醇和其他營養(yǎng)成分，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干后，重新溶于少量乙醚中得到混合液樣品，同時(shí)從sigma公司購買純度較高的豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇和膽甾醇溶于乙醚中，作為標(biāo)樣，采用薄層層析法分離萃取，步驟包括：
1)先用鉛筆在層析板上距離下端1.5cm處輕輕畫一條橫線，用玻璃毛細(xì)管吸取在靠近所述層析板左側(cè)邊緣的橫線上輕輕點(diǎn)樣，再用毛細(xì)管吸取所述混合液樣品在橫線上其他多點(diǎn)輕輕快速點(diǎn)樣，同一樣品或標(biāo)樣在同一位置重復(fù)點(diǎn)樣多次，點(diǎn)樣的斑點(diǎn)直徑為0.1-0.4cm，相鄰所述斑點(diǎn)的間距為1cm；
2)將點(diǎn)樣后的所述層析板放在盛有展開劑(甲苯:乙酸乙酯＝9:1，分析純)的玻璃展開室中，將所述層析板點(diǎn)樣的一端浸入所述展開劑中，另一端靠在所述玻璃展開室的室壁上，用毛玻璃片蓋住所述展開室的開口。由于毛細(xì)作用，展開溶劑在所述層析板上緩慢前進(jìn)，前進(jìn)至距離所述層析板頂端1cm左右，取出所述層析板；
3)將所述層析板放在通風(fēng)櫥內(nèi)，待展開劑揮發(fā)完后，再將所述層析板放入另一新的展開室中，在所述展開室底部加入兩粒固體碘單質(zhì)，再密封所述展開室。待所述層析板上出現(xiàn)黃色或棕色的斑點(diǎn)后，取出，依據(jù)標(biāo)樣中各種甾醇的位置，迅速用鉛筆標(biāo)出樣品中對應(yīng)的點(diǎn)或條帶；
4)依據(jù)所述標(biāo)樣中各種甾醇的位置，在所述層析板上標(biāo)出所述樣品中對應(yīng)的點(diǎn)或條帶，得到含有甾醇與不含有甾醇的點(diǎn)或條帶；
第六步，萃取出所述第五步中含有甾醇的樣本、采用柱層析法洗脫分離所述萃取出的含有甾醇的樣本，方法如下：
1)將所述第五步中含有甾醇與不含有甾醇的點(diǎn)或條帶分別刮下存放，然后用20ml正己烷和甲醇分別洗脫兩次，所述不含有甾醇的點(diǎn)或條帶的洗脫液放入所述第二步的下層沉淀中，待所述含有甾醇點(diǎn)或條帶的洗脫液液體蒸干后，重新用1-2ml乙醚溶解，均勻地加在3ml硅膠柱上；
2)依次用正己烷、體積比為1:1的正己烷與甲苯混合液、甲苯、乙醚、體積比為1:1的乙醚和甲醇混合液、甲醇作為洗脫劑來洗脫硅膠柱，其中，每一種所述洗脫劑用量與硅膠的體積比為3：1，所述洗脫劑的流率控制在60滴/分鐘，經(jīng)洗脫后的液體每25ml作為一份收集在一只錐形瓶中；將所述正己烷、所述正己烷與甲苯混合液、所述甲苯所洗脫下來的液體加入到所述第二步中含有所述下層沉淀的燒杯中。
第七步，將所述第一步至所述第六步中不含甾醇的部分混合，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸干，采用烘箱對蒸干的固體烘干，溫度為115℃，烘干時(shí)長為1h。稱量所得固體質(zhì)量，計(jì)算產(chǎn)率。
在進(jìn)一步配制人工飼料時(shí)，根據(jù)所配人工飼料中原料的種類和比例，加入其他不含有甾醇的原料，如葡萄糖和維生素c等，也可根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)定量加入某種甾醇以檢測甾醇的作用。
實(shí)施例2
以小麥粉為原料按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行脫甾醇試驗(yàn)。
實(shí)施例3
以大豆粉為原料按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行脫甾醇試驗(yàn)。
三次試驗(yàn)中，甾醇的去除率如表1：
表1甾醇去除率
以上對本發(fā)明的三個實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。