專利名稱：一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素甾醇的樣品前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是一類多輕基化的甾醇類化合物,在植物體內(nèi)含量極低，但調(diào)控著植物的一系列生理學(xué)和代謝過程。近年來，關(guān)于油菜素留醇的生理學(xué)機(jī)能，例如BRs的生物合成，降解以及代謝路徑的研究收到廣泛關(guān)注。但由于植物提取液中基質(zhì)復(fù)雜且油菜素留醇含量極低，這些研究的開展受到一定限制。因此，建立高效的樣品前處理方法并結(jié)合靈敏的檢測(cè)手段是內(nèi)源性BRs檢測(cè)的關(guān)鍵。目前已報(bào)道的植物中油菜素甾醇的前處理方法包括液液萃取、固相萃取、固相微萃取、磁固相萃取和液相色譜純化方法等。這些方法多數(shù)要求幾十克鮮重植物組織，如此大的樣品量對(duì)于部分珍貴的樣品難以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)也給前處理過程帶來溶劑消耗大和成本高等問題。此外，上述前處理方法僅僅通過BR和雜質(zhì)的疏水性差異實(shí)現(xiàn)除雜，會(huì)不可避免地造成雜質(zhì)與BRs的共洗脫，必然為后續(xù)的液相分離帶來負(fù)擔(dān)，從而降低BRs的質(zhì)譜離子化效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是對(duì)現(xiàn)有的油菜素留醇前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，提供一種高選擇性且簡便快速的植物樣品前處理方法，并實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理。本發(fā)明解決上述問題而采用的技術(shù)方案是:一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素甾醇的樣品前處理方法，包括以下步驟:1-1準(zhǔn)確稱量植物樣品后將其置于研缽中，液氮冷凍研磨至粉末狀后，加入同位素內(nèi)標(biāo)[2H3]油菜素內(nèi)酯和[2H3]油菜素留酮，然后加入溶劑提取，靜置，離心取上清液，得到未除雜的樣品溶液；2-1去除上一步得到的樣品溶液中的溶劑，以緩沖溶液溶解樣品溶液，用活化后的硼親和材料萃取樣品溶液，清洗硼親和材料，再以解吸液解吸硼親和材料上的油菜素甾醇，收集解吸液，去除解吸液中的有機(jī)溶劑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理。所述步驟2-1中，硼親和材料依次以能夠與水互溶的有機(jī)溶劑和緩沖溶液活化。本發(fā)明步驟1-1與2-1之間插入有下列步驟1-2:1-2對(duì)步驟1-1得到的樣品溶液除水；以活化后的材料萃取步驟1-2除水后的樣品溶液，解吸、收集并合并上樣流出液和解吸液，得到初步除雜后的樣品溶液。樣品中的水分會(huì)對(duì)后續(xù)除雜過程產(chǎn)生不利影響，因此，除水步驟很重要。本發(fā)明所指的除水過程包括化學(xué)除水法和物理除水法?；瘜W(xué)除水法，其特征在于，使用化學(xué)試劑消耗體系內(nèi)的水分；物理除水法，其特征在于使用物理手段將體系內(nèi)的水分揮干，包括凍干，氮?dú)獯蹈傻确椒ā?br> 植物組織提取溶劑的作用是:在有效地提取出分析物的前提下，盡可能少地提取雜質(zhì)等干擾物。所述步驟1-1中提取所用的溶劑為甲醇、乙腈、異丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸中的一種或幾種。所述步驟2-1中的硼親和材料為含有硼酸基團(tuán)的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱中的一種。所述的初步除雜是指初步除去提取液中含有的大量色素、脂質(zhì)和親水雜質(zhì)。因此，
本發(fā)明步驟1-2中所用的材料是采用由碳材料、親水材料、疏水材料通過C31, Cf或者C33方
式組合以化學(xué)或物理方式構(gòu)建的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱均可以達(dá)到初步除雜的目的。硼親和色譜是選擇性捕獲分離含順式羥基化合物的有效手段，已被成功用于糖蛋白、RNA和糖類的富集分離。在堿性環(huán)境中，硼酸可與順式二醇形成穩(wěn)定的五元或六元環(huán)狀硼酸酯，在酸性條件下，順式二醇類物質(zhì)又能通過開環(huán)而被釋放。BRs在C2，C3和C22，C23位上的兩對(duì)順式羥基使得油菜素留醇十分適合硼親和萃取。本發(fā)明所述的硼親和除雜是指，由含硼酸基團(tuán)的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱實(shí)現(xiàn)對(duì)油菜素甾醇的萃取。檢測(cè)油菜素甾醇的儀器是指，液相色譜-光學(xué)檢測(cè)器、液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-光學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用，或者毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜儀聯(lián)用。本發(fā)明方法簡單、快速、省溶劑、易操作。此外，方法在去除植物提取液內(nèi)源性雜質(zhì)方面表現(xiàn)出高選擇性，可實(shí)現(xiàn)低含量的內(nèi)源性油菜素留醇的富集純化。


圖1為本發(fā)明方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的總離子流對(duì)比圖，其中，A是植物樣品以文獻(xiàn)法所得的總離子流圖，B是以本發(fā)明法處理后的總離子流色譜圖，C是標(biāo)準(zhǔn)樣品以硼親和萃取法處理后的總離子流色譜圖。圖2為本發(fā)明法檢測(cè)到的內(nèi)源性油菜素甾醇的多反應(yīng)監(jiān)控色譜圖。其中A是水稻裕泰A葉樣品；B是水稻裕泰B葉樣品；C是油菜葉樣品；D1 D4是油菜花的花苞樣品；E1 E3 是油菜花的樣品。I 為 28-norbrassinolide, 2 為 28_norcastasterone, 3 為brassinolide, 4 為 castasterone。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做詳細(xì)說明。實(shí)施例1準(zhǔn)確稱取Ig植物組織，液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至IOmL離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)[2H3]油菜素內(nèi)酯和[2H3]油菜素甾酮各2ng，放置片刻后，加入5mL乙腈混合均勻。放入_18°C的冰箱內(nèi)提取12小時(shí)。離心取上清液，向上清液中加入0.5克氯化鈉促使溶液分層，棄去水相。再加入0.5克無水硫酸鎂除去剩余水分。離心取除水后的上清液，棄去不溶物。將上清液通過預(yù)先活化的石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅膠雙層固相萃取，以甲醇/乙腈(l/l，v/v，2mL)解吸；收集上樣流出液和解吸液并吹干。以緩沖溶液(磷酸緩沖溶液，20mM，pH9.0, ImL)溶解吹干的樣品殘?jiān)?，將該溶液通過預(yù)先活化的硼親和固相微萃取整體柱，以緩沖溶液(磷酸緩沖溶液，20mM，pH9.0, ImL)清洗整體柱，最后以含3%雙氧水的解吸液(H2O/乙腈，l/9，v/v，ImL)解吸，收集解吸液并吹干其中的有機(jī)溶劑。最終，將樣品溶液定容至100微升，其中80微升進(jìn)入高效液相色譜-電噴霧-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析。將上述方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的總離子流對(duì)比，如圖1所示。與文獻(xiàn)法相比，本方法可大大降低樣品的基質(zhì)，其基質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品類似，表明本發(fā)明具有良好的選擇性除雜效果。本發(fā)明法檢測(cè)到的幾種內(nèi)源性油菜素甾醇:28-降油菜素內(nèi)酯(28-norbrassinolide), 28-降油菜素甾麗(28-norcastasterone)，油菜素內(nèi)酷(brassinolide)，油菜素留麗(castasterone)的多反應(yīng)監(jiān)控色譜圖如圖2所示。五種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇檢測(cè)結(jié)果如表I所示。表1.五種實(shí)際樣品中內(nèi)源性油菜素甾醇的含量
權(quán)利要求
1.一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟: 1-1準(zhǔn)確稱量植物樣品后將其置于研缽中，液氮冷凍研磨至粉末狀后，加入同位素內(nèi)標(biāo)[2H3]油菜素內(nèi)酯和[2H3]油菜素留酮，然后加入溶劑提取，靜置，離心取上清液，得到未除雜的樣品溶液； 2-1去除上一步得到的樣品溶液中的溶劑，以緩沖溶液溶解樣品溶液，用活化后的硼親和材料萃取樣品溶液，清洗硼親和材料，再以解吸液解吸硼親和材料上的油菜素留醇，收集解吸液，去除解吸液中的有機(jī)溶劑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，所述步驟2-1中，硼親和材料依次以能夠與水互溶的有機(jī)溶劑和緩沖溶液活化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，步驟1-1與2-1之間插入有下列步驟1-2: 1-2對(duì)步驟1-1得到的樣品溶液除水；以活化后的材料萃取步驟1-2除水后的樣品溶液，解吸、收集并合并上樣流出液和解吸液，得到初步除雜后的樣品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，所述步驟1-1中提取所用的溶劑為甲醇、乙腈、異丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，所述步驟2-1中的硼親和材料為含有硼酸基團(tuán)的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，所述步驟1-2中所用的材料是由碳材料、親水材料、疏水材料通過句，C32或者句方式組合后以化學(xué)或物理方法構(gòu)建的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物樣品中內(nèi)源性油菜素甾醇的樣品前處理方法。該方法先以溶劑提取內(nèi)源性油菜素甾醇，然后以硼親和材料為萃取介質(zhì)對(duì)上一步所得溶液進(jìn)一步除雜，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性油菜素甾醇的樣品前處理。該方法簡單、快速、省溶劑、易操作。此外，方法在去除植物提取液內(nèi)源性雜質(zhì)方面表現(xiàn)出高選擇性，可實(shí)現(xiàn)低含量的內(nèi)源性油菜素甾醇的富集純化。
文檔編號(hào)G01N1/28GK103207103SQ20131013142
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者馮鈺锜, 丁俊, 毛利菁 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)