一種與萜烯類化合物合成相關的蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，特別涉及一種萜烯類化合物合成相關的蛋白， 編碼其的基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 植物的間接防御反應是在玉米上首次發(fā)現(xiàn)的，這種防御反應的特點是被植食性昆 蟲取食之后，植物依靠特異性揮發(fā)物的釋放來吸引昆蟲的天敵，從而達到防御植食性昆蟲 的目的。許多植物在被植食性昆蟲取食之后可以提高特異性揮發(fā)物釋放的量，一些植食性 昆蟲誘導的揮發(fā)物可以吸引植食性昆蟲的天敵(捕食性或寄生性），這些揮發(fā)物就成為植物 間接防御的媒介(信號)物質，所以植物間接防御研究的核心是植物特異性的揮發(fā)性信號物 質及其調控機制。相對于已經(jīng)有一定研究基礎的生態(tài)方面的研究，植物間接防御反應在分 子生物學方面的研究還很薄弱。利用分子生物學技術以及轉基因技術研究植物特異性的揮 發(fā)物可以最大程度的去除背景干擾，容易地找到植食性昆蟲誘導后表達量特異性上升的揮 發(fā)物。目前植物間接防御反應在分子生物學方面的研究主要進行以下兩方面:一方面是有 多少基因直接參與植食性昆蟲誘導后，植物特異性揮發(fā)物的生物合成；另一方面是這些基 因怎樣調控揮發(fā)物的合成，產物是什么以及這些產物具有什么樣的作用。
[0003] 植物萜烯(單萜烯、倍半萜烯、雙萜烯)類化合物是植物在被植食性昆蟲誘導后最 常見，最多樣的植物揮發(fā)物類群。萜烯類揮發(fā)物包括單萜類，倍半萜類，二萜類和萜烯同系 物（E)-4,8-二甲基-1，3,7-壬三烯（（E)-4,8-dimethyl-l，3,7-nonatriene，DMNT)和（E，E)-4,8，12-三甲基-l，3,7，ll-十三碳四烯（（E，E)-4,8，12-trimethyltrideca-l，3,7，ll-tetraen e，TMTT)等。DMNT和TMTT是植物花香揮發(fā)物和害蟲誘導揮發(fā)物中最常見的一類，這 兩種物質在單子葉植物和雙子葉植物中廣泛存在。DMNT和TMTT的前體分別為(E)-橙花叔醇 和(E，E)_香葉基芳樟醇。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)CYP450酶基因可催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_ 香葉基芳樟醇生成DMNT和TMTT。一些特定種類的萜烯化合物在植物間接防御方面的功能， 已經(jīng)通過人工合成標準化合物，從生態(tài)學方面進行了研究。在基因水平上，從調控植物萜烯 合成酶基因的表達出發(fā)，也驗證了部分萜烯化合物在植物間接防御方面的功能。所有的萜 烯化合物都是由萜烯合成酶調控合成的，萜烯合成酶是合成植物萜烯類揮發(fā)物末端合成 酶。因此，研究萜烯合成酶以及萜烯合成酶基因對于確定植食性昆蟲誘導的植物特異性揮 發(fā)物具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種與萜烯類化合物合成相關的蛋白及其編碼基因。
[0005] -種與萜烯類化合物合成相關的蛋白，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0006] 所述萜烯類化合物為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。
[0007] 上述蛋白的編碼基因。
[0008] 上述編碼基因，具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 1的5'末端第 41-1780位所示的核苷酸序列。
[0009] 含有上述編碼基因的重組載體或轉基因細胞系或重組菌。
[0010] 上述重組載體為將上述編碼基因插入到表達載體中，得到表達所述蛋白的載體， 所述表達載體為pET28a，編碼基因插入到表達載體的Xho I和Nde I間；所述重組菌為將上 述的重組載體導入目的菌得到的重組菌，所述目的菌為大腸桿菌。
[0011] 上述蛋白或上述編碼基因或上述重組載體或上述的重組菌在合成萜烯類化合物 和/或吸引二化螟盤絨繭蜂中的應用。
[0012] -種培育釋放萜烯類化合物轉基因植物的方法，為將上述蛋白的編碼基因導入目 的植物得到轉基因植物，使轉基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植物。
[0013] -種培育抗二化螟轉基因水稻的方法，為將上述蛋白的編碼基因導入目的植物得 到轉基因植物，使轉基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植物，從而使轉基因植 物的抗二化螟能力高于所述目的植物。
[0014]上述萜烯類化合物具體為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。
[0015] 上述蛋白的編碼基因具體通過上述的重組載體導入目的植物;上述目的植物具體 為單子葉植物。
[0016] 上述單子葉植物進一步具體為水稻。
[0017] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明得到的立馬豆呢是NES1基因在大腸桿菌中表達具有 FPP和GPP合成活性，可催化前體化合物香葉草基焦磷酸(geranylpyrophosphate，GPP)合成 芳樟醇和法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP)合成(E)-橙花叔醇;采用農桿菌介 導法體獲得轉NES1水稻，GC及GC - MS分析表明苗期轉NES1的水稻可是釋放出芳樟醇和(E)-橙花叔醇的降解產物DMNT;通過Y型嗅覺儀檢測二化螟盤絨繭蜂雌蟲對轉NES1的水稻揮發(fā) 物的反應表明，轉NES1的植株對二化螟盤絨繭蜂有極其顯著得吸引作用(P〈0.01)，與野生 型水稻相比，轉NES1的植株可顯著吸引二化螟盤絨繭蜂。表明立馬豆NES1的編碼區(qū)序列可 應用于通過轉基因技術提高水稻、玉米和蔬菜等農作物抗蟲性的研究。
[0018] 本發(fā)明提供的蛋白，是SEQ ID N02所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或者是SEQID N0:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與萜烯 類化合物合成和/或吸引二化螟盤絨繭蜂相關蛋白的由1)衍生的蛋白質。上述的蛋白可人 工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(2)中的蛋白的編碼基因可通 過將SEQ ID N01所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾 個堿基對的錯義突變，和/或在其5 '端和/或3 '端連上表2所示的標簽的編碼序列得到。上述 蛋白的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā)生 的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起的。
[0019] 上述編碼基因是SEQ ID N01所示的DNA分子，或者自5'末端第41-1780位核苷酸所 示的DNA分子，或者在嚴格條件下與前述限定的DNA序列雜交且編碼與萜烯類化合物合成 和/或吸引二化螟盤絨繭蜂相關蛋白的DNA分子;或者前述限定的DNA序列至少具有70%、至 少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、 至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與萜烯類化合物合成和/或吸 引二化螟盤絨繭蜂相關蛋白的DNA分子。
【附圖說明】
[0020] 圖1為立馬豆NES1基因的PCR擴增 [0021] M:DNA分子量標準(D2000) ;P:PCR產物 [0022] 圖2為立馬豆pET28a_NESl重組質粒的檢測
[0023] M:DNA分子量標準(D2000) ;P:PCR產物
[0024] 圖3.pET28a-NESl 純化的 SDS 電泳圖
[0025] M:蛋白 Maker，P:純化到的的 pET28a-NESl 蛋白。
[0026]圖4.融合蛋白NES1體外酶活產物的GC-MS分析
[0027] 其中A:以GPP為底物的11.97min的酶活產物;B:芳樟醇標樣11.97min的質譜圖；C: 以GPP為底物的酶活產物;D: (E)-橙花叔醇標樣的質譜圖；
[0028]圖5.轉基因水稻和野生型水稻的NES1基因表達量分析 [0029]圖6.轉NES1基因水稻植株和野生型水稻植株的揮發(fā)物分析 [0030]其中 1.芳樟醇;2.DMNT;
[0031] 圖7.轉NES1基因水稻和野生型水稻的linalool和DMNT釋放量。
[0032]圖8.二化螟絨繭蜂雌蟲對轉NES基因水稻植株和野生型水稻植株的選擇。
【具體實施方式】
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0034] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] 下述實施例中野生型水稻中花11.公眾可從中國農業(yè)科學院植物保護研究所獲 得，種植于中國農業(yè)科學院植物保護研究所人工氣候箱中（溫度（22士2) °C，濕度60%-80%，光周期L:D=16:8)。下述實施例中二化螟盤絨繭蜂，公眾可從中國農業(yè)科學院植物保 護研究所獲得;將二化螟盤絨繭蜂接種到二化螟上(人工飼養(yǎng)），溫度(20 士 2)°C，濕度60%-80%，光周期 L:D = 16:8。
[0036]下述實施例中質粒提取試劑盒購自Biomega公司，內切酶購自NEB公司，高保真酶 pfu、T_easy載體、大腸桿菌菌株DH5a、反轉錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶 購自TaKaRa公司，總RNA的提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，底物FPP(Product Number :F6892)和GPP (Product Number :G6772)以及二氯甲燒等其他化學試劑均購自sigma 公司，其他化學試劑為國產分析純，引物和測序均由北京華大基因完成。
[0037] 實施例1
[0038] 1、立馬豆總RNA的提取和cDNA的合成
[0039] 立馬豆的總RNA的提取參照天根生化科技有限公司RNA simp 1 e總RNA提取試劑盒 中的說明手冊提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測并通過NanoDrop測定濃度。cDNA第一鏈的合成采 用TAKATA公司的primer scriptTM 1st strand cDNA Synthesis System反轉錄試劑盒，方 法參照試劑盒中的說明手冊。同時，為了獲得基因全長，用SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒， 進行cDNA的合成，方法參照試劑盒中的說明手冊。
[0040] 2、引物設計與基因克隆
[0041 ] 根據(jù)苜蓿MtTPS3(AY766249)，在菜豆基因組網(wǎng)站http:// phytozome. jgi . doe. gov/pz/portal .html# ； ! info?alias = Org_Pvulgaris VI · 0上進行 blast，獲得立馬豆TPS基因部分保守序列。用primer5.0分別設計5'及3'RACE引物，通過 RACE擴增得到全長序列
[0042] 5RACE primer1:TGCATCGACTGAACCGTGTCATAC;
[0043] 5RACE primer2：ACTTCAGGACTTAGGAGTGGTAGTGACA；
[0044] 3RACE primer1:TCCAAGGAGGAACAAAAGAGAGGTGA；
[0045] 3RACE primer2:TTTTTACACCTTCTTCCAAATCTGGAGA,
[0046] 引物由北京華大基因公司合成。通過巢氏PCR獲得基因全長。
[0047]立馬豆種子，公眾可從中國農業(yè)科學院植物保護研究所獲得。
[0048] 以立馬豆的cDNA為模板，通過RACE擴增，得到1908bp PCR產物（含40bp的5'UTR和 128bp的3 'UTR序列）（圖1)。目的片段利用TA克隆的方法連接到T-easy載體(購自北京全式 金公司）后，構建成T-NES1測序載體，經(jīng)過測序(序列如序列表中的SEQ ID N0:1)，該1908bp PCR產物含有的基因編碼區(qū)位于第41-1780位，將該基因命名為NES1，該基因編碼的蛋白命 名為NES1;該蛋白的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID N02,共579個氨基酸。經(jīng)過序列比對， NES1與苜蓿MtTPS3核苷酸的相似性為36%』Ε51測序載體為將序列表中的序列1插入T-easy載體得到的載體。
[0049]實施例2、NES1的功能鑒定