一種與萜烯類化合物合成相關(guān)的蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子生物學領(lǐng)域，特別涉及一種萜烯類化合物合成相關(guān)的蛋白， 編碼其的基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物的間接防御反應(yīng)是在玉米上首次發(fā)現(xiàn)的，這種防御反應(yīng)的特點是被植食性昆 蟲取食之后，植物依靠特異性揮發(fā)物的釋放來吸引昆蟲的天敵，從而達到防御植食性昆蟲 的目的。許多植物在被植食性昆蟲取食之后可以提高特異性揮發(fā)物釋放的量，一些植食性 昆蟲誘導(dǎo)的揮發(fā)物可以吸引植食性昆蟲的天敵(捕食性或寄生性），這些揮發(fā)物就成為植物 間接防御的媒介(信號)物質(zhì)，所以植物間接防御研究的核心是植物特異性的揮發(fā)性信號物 質(zhì)及其調(diào)控機制。相對于已經(jīng)有一定研究基礎(chǔ)的生態(tài)方面的研究，植物間接防御反應(yīng)在分 子生物學方面的研究還很薄弱。利用分子生物學技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究植物特異性的揮 發(fā)物可以最大程度的去除背景干擾，容易地找到植食性昆蟲誘導(dǎo)后表達量特異性上升的揮 發(fā)物。目前植物間接防御反應(yīng)在分子生物學方面的研究主要進行以下兩方面:一方面是有 多少基因直接參與植食性昆蟲誘導(dǎo)后，植物特異性揮發(fā)物的生物合成；另一方面是這些基 因怎樣調(diào)控揮發(fā)物的合成，產(chǎn)物是什么以及這些產(chǎn)物具有什么樣的作用。
[0003] 植物萜烯(單萜烯、倍半萜烯、雙萜烯)類化合物是植物在被植食性昆蟲誘導(dǎo)后最 常見，最多樣的植物揮發(fā)物類群。萜烯類揮發(fā)物包括單萜類，倍半萜類，二萜類和萜烯同系 物（E)-4,8-二甲基-1，3,7-壬三烯（（E)-4,8-dimethyl-l，3,7-nonatriene，DMNT)和（E，E)-4,8，12-三甲基-l，3,7，ll-十三碳四烯（（E，E)-4,8，12-trimethyltrideca-l，3,7，ll-tetraen e，TMTT)等。DMNT和TMTT是植物花香揮發(fā)物和害蟲誘導(dǎo)揮發(fā)物中最常見的一類，這 兩種物質(zhì)在單子葉植物和雙子葉植物中廣泛存在。DMNT和TMTT的前體分別為(E)-橙花叔醇 和(E，E)_香葉基芳樟醇。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)CYP450酶基因可催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_ 香葉基芳樟醇生成DMNT和TMTT。一些特定種類的萜烯化合物在植物間接防御方面的功能， 已經(jīng)通過人工合成標準化合物，從生態(tài)學方面進行了研究。在基因水平上，從調(diào)控植物萜烯 合成酶基因的表達出發(fā)，也驗證了部分萜烯化合物在植物間接防御方面的功能。所有的萜 烯化合物都是由萜烯合成酶調(diào)控合成的，萜烯合成酶是合成植物萜烯類揮發(fā)物末端合成 酶。因此，研究萜烯合成酶以及萜烯合成酶基因?qū)τ诖_定植食性昆蟲誘導(dǎo)的植物特異性揮 發(fā)物具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種與萜烯類化合物合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因。
[0005] -種與萜烯類化合物合成相關(guān)的蛋白，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0006] 所述萜烯類化合物為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。
[0007] 上述蛋白的編碼基因。
[0008] 上述編碼基因，具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 1的5'末端第 41 -1660位所示的核苷酸序列。
[0009] 含有上述編碼基因的重組載體或轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
[0010] 上述重組載體為將上述編碼基因插入到表達載體中，得到表達所述蛋白的載體， 所述表達載體為pET28a，編碼基因插入到表達載體的Xho I和Nde I間；所述重組菌為將上 述的重組載體導(dǎo)入目的菌得到的重組菌，所述目的菌為大腸桿菌。
[0011] 上述蛋白或上述編碼基因或上述重組載體或上述的重組菌在合成萜烯類化合物 和/或吸引二化螟盤絨繭蜂中的應(yīng)用。
[0012] -種培育釋放萜烯類化合物轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將上述蛋白的編碼基因?qū)肽?的植物得到轉(zhuǎn)基因植物，使轉(zhuǎn)基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植物。
[0013] -種培育抗二化螟轉(zhuǎn)基因水稻的方法，為將上述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参锏?到轉(zhuǎn)基因植物，使轉(zhuǎn)基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植物，從而使轉(zhuǎn)基因植 物的抗二化螟能力高于所述目的植物。
[0014]上述萜烯類化合物具體為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。
[0015] 上述蛋白的編碼基因具體通過上述的重組載體導(dǎo)入目的植物;上述目的植物具體 為單子葉植物。
[0016] 上述單子葉植物進一步具體為水稻。
[0017] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明得到的立馬豆呢是NES2基因在大腸桿菌中表達具有 FPP和GPP合成活性，可催化前體化合物香葉草基焦磷酸(geranylpyrophosphate，GPP)合成 芳樟醇，催化法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP)合成(E)-橙花叔醇和催化樾牛 兒基樾牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)生成（E，E)_香葉基芳樟醇， 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法體獲得轉(zhuǎn)NES2水稻，GC及GC-MS分析表明苗期轉(zhuǎn)NES2的水稻可是釋放出 芳樟醇、（E)-橙花叔醇的氧化降解產(chǎn)物DMNT和氧化降解產(chǎn)物TMTT;4通過Y型嗅覺儀檢測二 化螟盤絨繭蜂雌蟲對轉(zhuǎn)NES2的水稻揮發(fā)物的反應(yīng)表明，轉(zhuǎn)NES2的植株對二化螟盤絨繭蜂有 極其顯著得吸引作用(P〈〇.01)，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)NES2的植株可顯著吸引二化螟盤絨 繭蜂。表明立馬豆NES2的編碼區(qū)序列可應(yīng)用于通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水稻、玉米和蔬菜等農(nóng) 作物抗蟲性的研究。
[0018] 本發(fā)明提供的蛋白，是SEQ ID N02所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或者是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與萜 烯類化合物合成和/或吸引二化螟盤絨繭蜂相關(guān)蛋白的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述的蛋白可 人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(2)中的蛋白的編碼基因可 通過將SEQ ID N01所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或 幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5 '端和/或3 '端連上表2所示的標簽的編碼序列得到。上 述蛋白的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā) 生的變異引起的，有的是由人工誘變處理引起的。
[0019] 上述編碼基因是SEQ ID N01所示的DNA分子，或者自5'末端第41-1660位核苷酸所 示的DNA分子，或者在嚴格條件下與前述限定的DNA序列雜交且編碼與萜烯類化合物合成 和/或吸引二化螟盤絨繭蜂相關(guān)蛋白的DNA分子;或者前述限定的DNA序列至少具有70%、至 少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、 至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與萜烯類化合物合成和/或吸 引二化螟盤絨繭蜂相關(guān)蛋白的DNA分子。
【附圖說明】
[0020] 圖1.立馬豆NES2基因的PCR擴增 [0021] M:DNA分子量標準(D2000) ;P:PCR產(chǎn)物 [0022] 圖2.重組質(zhì)粒pet28a_NES2的PCR鑒定 [0023] 其中M:DNA分子量標準(D2000) ;P:PCR產(chǎn)物
[0024] 圖3.pET28a-NES2 純化的 SDS 電泳圖
[0025] Μ:蛋白 Maker，P:純化到的的 pET28a-NES2蛋白。
[0026]圖4.融合蛋白NES2體外酶活產(chǎn)物的GC-MS分析
[0027] A:以GPP為底物的11.97min的酶活產(chǎn)物;B:芳樟醇標樣11.97min的質(zhì)譜圖；C:以 FPP為底物的19.18min的酶活產(chǎn)物;D: (E)-橙花叔醇標樣的19.18min的質(zhì)譜圖；E:芳樟醇標 樣11.97min的質(zhì)譜圖；C:以GGPP為底物的24.16min的酶活產(chǎn)物;F: (E，E)_香葉基芳樟醇標 樣的24.16min的質(zhì)譜圖。
[0028]圖5.轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻的NES2基因表達量分析。
[0029]圖6轉(zhuǎn)NES2基因水稻植株和野生型水稻植株的揮發(fā)物分析。
[0030] 1 ·芳樟醇；2 · DMNT; 3 · DMNT
[0031] 圖7.轉(zhuǎn)NES2基因水稻和野生型水稻的linalool、DMNT和TMTT釋放量。
[0032]圖8.二化螟絨繭蜂雌蟲對轉(zhuǎn)NES基因水稻植株和野生型水稻植株的選擇。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 下述實施例中野生型水稻中花11.公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所獲 得）種植于中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所人工氣候箱中（溫度（22士2) °C，濕度60%-80%，光周期 L:D = 16:8)。
[0037] 下述實施例中二化螟盤絨繭蜂，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所獲得； 將二化螟盤絨繭蜂接種到二化螟上(人工飼養(yǎng)），溫度(20士2) °C，濕度60 % - 80 %，光周期L: D = 16:8〇
[0038]下述實施例中質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司，內(nèi)切酶購自NEB公司，高保真酶 pfu、T_easy載體、大腸桿菌菌株DH5a、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶 購自TaKaRa公司，總RNA的提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，底物FPP(Product Number :F6892)、GPP (Product Number :G6772)和GGPP (Product Number :G6025)以及二氯甲 烷等其他化學試劑均購自sigma公司，其他化學試劑為國產(chǎn)分析純，引物和測序均由北京華 大基因完成。
[0039] 實施例1、立馬豆總RNA的提取和cDNA的合成
[0040] 立馬豆的總RNA的提取參照天根生化科技有限公司RNA simp 1 e總RNA提取試劑盒 中的說明手冊提取。瓊脂糖凝膠電泳檢測并通過NanoDrop測定濃度。cDNA第一鏈的合成采 用TAKATA公司的primer scriptTM 1st strand cDNA Synthesis System反轉(zhuǎn)錄試劑盒，方 法參照試劑盒中的說明手冊。同時，為了獲得基因全長，用SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒， 進行cDNA的合成，方法參照試劑盒中的說明手冊。
[0041] 2、引物設(shè)計與基因克隆
[0042] 根據(jù)苜蓿MtTPS3(AY766249)，在菜豆基因組網(wǎng)站http:// phytozome. jgi . doe. gov/pz/portal .html# ； ! info?alias = Org_Pvulgaris VI · 0上進行 blast，獲得立馬豆TPS基因部分保守序列。用primer5.0分別設(shè)計5'及3'RACE引物，通過 RACE擴增得到全長序列 5RACE primerl : TCCCATAAACGTCGAAGATGTCA ； 5RACE primer2TGAGTTCAATCCTTTGGTCTGAA；3RACE primer1:GAAGGAGCCAAGAAGAAAGATGAGA； 3RACEprimer2: AATGAGCACCAGCACGTGTCAGCTG，引物由北京華大基因公司合成。通過巢氏PCR 獲得基因全長。
[0043]立馬豆種子，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所獲得。
[0044] 以立馬豆的cDNA為模板，通過RACE擴增，得到1740bp PCR產(chǎn)物（圖1)，含40bp的5' UTR和80bp的3'UTR序列。目的片段利用TA克隆的方法連接到T-easy載體(購自北京全式金 公司）后，構(gòu)建成NES2測序載體，經(jīng)過測序(見SEQ ID N01)，該1740bp PCR產(chǎn)物含有的基因 編碼區(qū)位于第41-1660位，將該基因命名為NES2,該基因編碼的蛋白命名為NES2;該蛋白的 氨基酸序列為序列表中的SEQ ID N01，共539個氨基酸。經(jīng)過序列比對，NES2與苜蓿MtTPS3 核苷酸