的相似性為48 %。
[0045] NES2測序載體為將序列表中的序列1插入T-easy載體得到的載體。
[0046] 實(shí)施例2、NES2的功能鑒定
[0047] -、NES2在合成萜烯類化合物芳樟醇和(E)-橙花叔醇中的應(yīng)用
[0048] 1、載體構(gòu)建
[0049] 以T-NES2測序載體為模板，利用高保真酶TranStartFastPfu DNA Polymerase及 引 物 NESF(5' - ACATTTAGAAGACTCTGGACAAACACTA-3, )/ΝΕ5Κ(5' -TTCTAAAAAATAAGTATTTTCAGAATTATA-3'），得到1920bp的帶有A末端的目的片段(具有序列表 中序列1的核苷酸）。將上述帶有A末端的目的片段參照全式金生物有限公司pEASY-El Expression Kit說明書與載體pEASY-El連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入普通大腸桿菌后涂于含 Amp (50mg/ml)的LB平板上過夜培養(yǎng)。
[0050] 挑取單克隆利用T7F (5 ' - TAATACGACTCACTATA - 3 '）及目的基因下游引物NESR進(jìn)行 檢測，得到陽性克隆（圖2)。將陽性克隆提取質(zhì)粒送去測序，該質(zhì)粒為將序列表中序列1自5' 末端第41 -1780位核苷酸利用TA克隆的方法插入載體pET28a的Xhol和Nhel酶切位點(diǎn)酶切位 點(diǎn)間得到的載體，命名為pET28a - NES2。
[0051 ] 將pET28a-NES2轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過程見全式金生物有限公司BL21 (DE3)Chemically Competent Cell說明書，得到BL21(DE3)/pET28a-NES2,將BL21(DE3)/ pET28a-NES2利用T7F及目的基因下游引物進(jìn)行PCR檢測，證明pET28a-NES2已轉(zhuǎn)入大腸桿菌 中。
[0052] 2、NES2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、分離及純化
[0053] 將BL21(DE3)/pET28a-NES2在加入lμM的IPTG的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為16°C 180rpm、誘導(dǎo)12h，得到培養(yǎng)產(chǎn)物，將培養(yǎng)產(chǎn)物于4°C，1000rpm離心10min收集上清液。
[0054]將上清液利用AKTA FPLC system(Amersham)，HiLoad_16/60_superdex_75_prep_ grade (global)分子篩預(yù)裝柱分離純化4ml上樣環(huán)，洗脫流速：1 ml/min，每1 ml收集一次； 洗脫液50mM Na2HP〇4,300mM NaCl，250mM imidazole，NaOH調(diào)pH至8.0,獲得純化的NES2蛋白 (圖3)(為收集2柱體積的洗脫液）。
[0055] 3、NES2蛋白酶活性鑒定
[0056]利用蛋白超濾膜離心管，將收集2柱體積的洗脫液（純化NES2蛋白）用pH為7.0， 50mM PBS(通過將39ml0.2M的NaH2P〇4、與61ml0.2M的Na2HP〇4、混勻后獲得）置換，并將蛋白 濃縮4μg/ml。為防止有機(jī)溶劑的污染，以下均采用玻璃器皿。按照表1的體系進(jìn)行反應(yīng)，體系 lmL，37°C，30min，得到反應(yīng)產(chǎn)物。以水替代純化NES2蛋白作為對照。
[0057]表1為NES2蛋白酶活性鑒定反應(yīng)體系
[0058]
[0059] ,, ^ ---------- v , "wn丄…丄-丄"八過?！贰瓉Aη, 抽提產(chǎn)物。小心吸取上清至新的玻璃瓶中，利用穩(wěn)定的氮?dú)饬鳎?4PSI)吹到只剩2ul (約 5min)，加入10μ1的二氯甲烷，待用。
[0060] 取 ΙμL 樣品進(jìn)樣，利用氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) GC-MS(HP6890/HP5973, Hewlett-Packard 公 司），色譜柱HP - 5MS (60m X 250μπι X 0 · 25μπι; Hewl e tt - Packard公司），GC-MS儀器進(jìn)行分析。升 溫程序?yàn)?40°C保持lmin，以5min5°C的增量升到2501€(1°(：/1^11)，最后250°(：保持171^11 (^ 檢測范圍為40-550Da，溫度為170°C。
[0061] GC-MS檢測兩組的反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示（A)芳樟醇標(biāo)樣的出峰時間 (11.97min)和質(zhì)譜圖；（B)NES2蛋白催化GPP產(chǎn)物的出峰時間（11.97min)和質(zhì)譜圖；（C)(E)_ 橙花叔醇標(biāo)樣的出峰時間（19.18 m i η)和質(zhì)譜圖；（D) N E S 2蛋白催化F P P產(chǎn)物的出峰時間 (19.18min)和質(zhì)譜圖。通過和標(biāo)樣的出峰時間和質(zhì)譜圖對比，說明純化NES2蛋白可催化香 葉草基焦磷酸（geranylpyrophosphate，GPP)合成芳樟醇和催化法尼基焦磷酸 (farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP)合成(E)-澄花叔醇。
[0062] 二、NES2在水稻揮發(fā)芳樟醇和DMNT中的應(yīng)用
[0063] 1、轉(zhuǎn)NES2水稻的獲得
[0064] 把NES2基因連接到pCAMBIA-1300-EPSPS載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)， 把NES2基因轉(zhuǎn)到水稻品種中花11，通過草甘膦篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。從To代轉(zhuǎn)NES2水 稻收獲種子、播種，得到T2代轉(zhuǎn)NES2水稻。提取Ti代轉(zhuǎn)NES2水稻和野生型水稻的cDNA為模板， 利用NES2RT - F: 5 ' - AGCACTTCCATTCCGTTTACT - 3 '，NES2RT - R: 5 ' - TCTTCACGTCTTCACCGTATTT -3'為引物對，進(jìn)行91^-?0時廣增；以水稻六(^111基因?yàn)閮?nèi)參，所用引物為六(^111 + :5'-TCCGGTGGATCTTCATGCTTACCT-3'，Actin-R:5'-ATGGACCATTGCGACGAGTCTTCT-3'
[0065] 在ABI PRISM7900實(shí)時熒光定量PCR儀升進(jìn)行操作，設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖5所示， NES2在野生型水稻葉片中沒有表達(dá)，在T2代轉(zhuǎn)NES2水稻中有表達(dá)。
[0066] 2、轉(zhuǎn)NES2水稻的產(chǎn)生萜烯類化合物芳樟醇和DMNT
[0067] A:水稻的氣體收集
[0068]為了避免土壤中揮發(fā)物的影響，利用ddH20將土洗凈后，將植物放入玻璃瓶中，并 灌滿ddH20以保證植物正常生長。利用頂端開小口的玻璃容器、密閉的鋁質(zhì)金屬底座以及金 屬夾子組裝成相對封閉的系統(tǒng)，對水稻進(jìn)行氣體收集。按照密閉的原則組裝裝置，使氣體利 用真空栗通過炭柱過濾后進(jìn)入裝置，含有吸附劑的玻璃管連接于出氣口。進(jìn)氣的流速 (60〇1111/111；[11)略大于出氣的流速(4001111/111；[11)。
[0069]選擇4周大的T2代轉(zhuǎn)NES2水稻進(jìn)行氣體采集。采用50mg Tenax TA聚合物進(jìn)行收 集。Tenax玻璃管使用前利用5ml重蒸乙醚清洗3次后，在持續(xù)的氮?dú)馔ㄟ^的條件下220°C加 熱2h; PorapaK Q玻璃管則使用前利用lmL超純乙醚清洗3次以上后，在持續(xù)的氮?dú)馔ㄟ^的條 件下132°C加熱2h。氣體收集完畢后，Tenax玻璃管直接用于GC-MS分析，PorapaK Q玻璃管則 需要利用250μ1重蒸乙醚洗脫2次(共500μ1)至安捷倫玻璃瓶中，待用。以野生型水稻為對 照。分別得到野生型水稻揮發(fā)物樣品和!^代轉(zhuǎn)NES2水稻揮發(fā)物樣品。
[0070] Β:轉(zhuǎn)NES2的水稻植株的揮發(fā)物GC-MS分析
[0071] 用GC-MS(Agilent公司6890Ν，色譜柱參數(shù)：長50mX內(nèi)徑0 · 32_X薄膜厚度0 · 52μπι 的非極性色譜柱；電離參數(shù):70^，220°(：;氣相色譜爐溫度保持在301€5分鐘，然后每分鐘5 °C升溫至250Γ攝氏度。對野生型水稻植株的揮發(fā)物樣品和!^代轉(zhuǎn)NES2水稻植株的揮發(fā)物 樣品進(jìn)行檢測，對標(biāo)準(zhǔn)樣品芳樟醇、DMNT和TMTT也按該條件進(jìn)行檢測，通過與標(biāo)樣的出峰時 間和質(zhì)譜進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，T 2代轉(zhuǎn)NES2水稻的揮發(fā)物明顯增多（圖6)，產(chǎn)物為芳樟醇，DMNT 和ΤΜΤΤ，同時用芳樟醇和DMNT構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行揮發(fā)物的定量研究，發(fā)現(xiàn)芳樟醇，DMNT和 TMTT的含量在野生型水稻植株和轉(zhuǎn)NES2水稻植株間差異顯著(p〈0.05)(圖7)。
[0072]三、NES2基因在吸引二化螟盤絨繭蜂中的應(yīng)用
[0073] 用Y型嗅覺儀檢測上述各植株揮發(fā)物對二化螟絨繭蜂雌蟲對的取食反應(yīng)的影響， 具體如下：
[0074] 二化螟盤絨繭蜂在光照培養(yǎng)箱中用二化螟飼養(yǎng)，挑選二化螟盤絨繭蜂雌蟲進(jìn)行行 為研究。Y形嗅覺儀主臂20cm，兩側(cè)臂15cm，側(cè)臂間夾角60°。通過LS-2800型氣栗推動空氣進(jìn) 入系統(tǒng)，氣流經(jīng)活性炭、蒸餾水凈化加濕后通過玻璃轉(zhuǎn)子流量計進(jìn)入Y形管兩側(cè)，流速控制 在0.5L/min。測試時，把轉(zhuǎn)基因水稻每株放到一個玻璃罐中，作為氣味源，放入某一側(cè)臂，以 野生型水稻作為對照放入另一側(cè)臂。從基管端部接入寄生蜂，每頭寄生蜂觀察5min，如寄生 蜂爬過側(cè)壁1/3處并停留lmin以上記為對該物質(zhì)有反應(yīng)，否則記為無反應(yīng)。測試溫度為(25 ± 2) °C。重復(fù)3次，每次測試30頭寄生蜂。
[0075]結(jié)果如圖8所示，為Y型嗅覺儀檢測轉(zhuǎn)NES2的水稻揮發(fā)物對二化螟絨繭蜂雌蟲對的 取食反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)卡方測驗(yàn)轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照植株差異極其顯著(x2 = 28.75，？〈0.01)。說明1'2代轉(zhuǎn)呢52水稻揮發(fā)物樣品對二化螟盤絨繭蜂具有顯著的吸引作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與萜烯類化合物合成相關(guān)的蛋白，具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，所述萜烯類化合物為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。3. 權(quán)利要求1或2所述的蛋白的編碼基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或者SEQ ID NO: 1的5 '末端第51 -1860位所示的核苷酸序列。5. 含有權(quán)利要求3或4所述的編碼基因的重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，為將權(quán)利要求3或4所述的編碼基因插入到表達(dá)載 體中，得到表達(dá)蛋白的載體，所述表達(dá)載體為pET28a，編碼基因插入到表達(dá)載體的Xho I和 Nde I間；或者所述重組菌為將上述的重組載體導(dǎo)入目的菌得到的重組菌，所述目的菌為大 腸桿菌。7. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述的編碼基因或權(quán)利要求5所述的重組載 體或所述的重組菌在合成萜烯類化合物和/或吸引二化螟盤絨繭蜂中的應(yīng)用。8. -種培育釋放萜烯類化合物轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1所述的蛋白的編碼 基因?qū)肽康闹参锏玫睫D(zhuǎn)基因植物，使轉(zhuǎn)基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植 物。9. 一種培育抗二化螟轉(zhuǎn)基因水稻的方法，為將權(quán)利要求1所述的蛋白的編碼基因?qū)?目的植物得到轉(zhuǎn)基因植物，使轉(zhuǎn)基因植物的萜烯類化合物釋放量高于所述目的植物，從而 使轉(zhuǎn)基因植物的抗二化螟能力高于所述目的植物。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，所述萜烯類化合物為芳樟醇和(E)-橙花叔醇。11. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，所述蛋白的編碼基因具體通過權(quán)利要求5所述的重 組載體導(dǎo)入目的植物，所述目的植物具體為單子葉植物。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，所述單子葉植物為水稻。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種與萜烯類化合物合成相關(guān)的蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，具有如SEQID？NO2所示的氨基酸序列，編碼基因具有SEQ？ID？NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，大腸桿菌中表達(dá)的NES2蛋白具有FPP和GPP合成活性；采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法體獲得轉(zhuǎn)NES2基因水稻，結(jié)果表明轉(zhuǎn)NES2的植株可顯著吸引二化螟絨繭蜂雌蟲，為生物防治提供了一種新方法。
【IPC分類】C12R1/19, C12P7/04, C12N15/70, C12N15/60, C12N9/88, A01H5/00, C12N1/21, C12N15/82
【公開號】CN105647896
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王桂榮, 李峰奇, 楊婷, 劉楊
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月4日