一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種羊凝乳酶的表達(dá)方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]凝乳酶是一種從未斷奶的小牛皺胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，可以專一地切割乳中K-酪蛋白的Phe 105-Metl 06之間的肽鍵，破壞乳中的酪蛋白膠束引起蛋白質(zhì)凝聚，因此在乳制品尤其是在干酪加工制作中應(yīng)用廣泛。目前，凝乳酶的年均需求量約占全世界酶制劑總量的15%，居第二位。凝乳酶主要為動(dòng)物來(lái)源的凝乳酶，約占市場(chǎng)上凝乳酶總量的70%，同時(shí)還有植物來(lái)源的凝乳酶、微生物來(lái)源的凝乳酶和利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組凝乳酶。
[0003]動(dòng)物凝乳酶，除來(lái)源于小牛外，研究者還在乳豬、羔羊、小狗、海豹、駱駝、鱉魚(yú)、金槍魚(yú)等胃中提取出了凝乳酶。劉文宗等發(fā)現(xiàn)乳豬胃酶具有凝乳性;張富新等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)羔羊皺胃酶也有較低的凝乳性。植物凝乳酶，無(wú)論從植物種類(木瓜、無(wú)花果、波蘿、南瓜、朝鮮薊、大豆、銀杏、合歡樹(shù)、甘薯和生姜等)還是植物組織的部位(果實(shí)、葉、莖和根等)，植物凝乳酶來(lái)源都十分廣泛。許多植物蛋白酶能使牛乳凝固，張富新等利用木瓜蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶與小牛皺胃酶和羔羊皺胃酶制得了較理想的干酪。微生物凝乳酶的研究始于自20世紀(jì)50年代末，主要在美國(guó)、日本、西德、丹麥等國(guó)進(jìn)行，所用菌種主要有栗疫菌、毛霉、微小毛霉和錯(cuò)狀芽胞桿菌等；自1964年Arima發(fā)現(xiàn)MucorpusiIIus可產(chǎn)生高活力凝乳酶以來(lái)，已有許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)產(chǎn)凝乳酶的新菌種，到目前為止，發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)凝乳酶微生物達(dá)40余種。基因工程凝乳酶即將凝乳酶基因連接到合適載體并轉(zhuǎn)入宿主中所表達(dá)產(chǎn)生的酶。目前最常用的宿主是大腸桿菌(Esherichiacoli)，但是表達(dá)的凝乳酶主要以包涵體的形式，需要復(fù)性，因此增加了成本。Stefan利用在黑曲霉中表達(dá)，發(fā)酵產(chǎn)生單駝峰凝乳酶，經(jīng)過(guò)與小牛凝乳酶比較發(fā)現(xiàn)，重組單駝峰凝乳酶的凝結(jié)能力高于小牛凝乳酶70%，且有更高的的耐熱穩(wěn)定性。之后Bansa利用這一結(jié)論使用重組單駝峰凝乳酶加工Cheddar干酪，根據(jù)干酪特性與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，顯示出并無(wú)明顯差異。此外，絲狀真菌、微小毛霉、米黑根毛霉、構(gòu)巢曲霉都適用于轉(zhuǎn)入凝乳酶基因。
[0004]傳統(tǒng)的凝乳酶來(lái)源于小牛皺胃.但是隨著世界奶酪產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，單純靠宰殺大量的小牛獲取凝乳酶顯然與現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展不相符，植物凝乳酶雖然來(lái)源廣泛，但是其蛋白水解力強(qiáng)，并且受時(shí)間、地點(diǎn)等的限制難以發(fā)展。微生物凝乳酶從1965年起開(kāi)始取代小牛皺胃酶生產(chǎn)干酪以來(lái)，成功地彌補(bǔ)了小牛凝乳酶短缺的問(wèn)題，并在奶酪制造業(yè)與酪素產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。微生物蛋白酶存在著專一性不強(qiáng)、凝乳活性和分解活性比值低、對(duì)熱穩(wěn)定、乳中殘留量高等問(wèn)題，常常引起干酪產(chǎn)量降低，風(fēng)味不佳，而利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶可以避免上述缺陷。利用植物體(或細(xì)胞、組織、器官)所具有的生物功能在體外或體內(nèi)進(jìn)行生化反應(yīng)，而獲取特定產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，稱為植物生物反應(yīng)器，通常是指完整的轉(zhuǎn)基因植物體。
[0005]利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)的酶是一種新興的技術(shù)，具有巨大潛力。相比傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)酶的工業(yè)規(guī)模的成本通常低得多，也消耗更少的能量。近年來(lái)，植物表達(dá)系統(tǒng)作為極具潛力的重組蛋白生產(chǎn)平臺(tái)，備受各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注，得到了廣泛和深入的研究。
[0006]利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白有很多優(yōu)點(diǎn):(I)生產(chǎn)的重組蛋白可進(jìn)行翻譯后修飾如糖蛋白和多亞基蛋白，與天然蛋白產(chǎn)物具有相同或相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；(2)具有本質(zhì)的安全性，不會(huì)傳播動(dòng)物病毒或是感染病原菌；(3)是符合成本效益的生物工藝，生產(chǎn)成本和下游純化成本都較低，生產(chǎn)使停工的風(fēng)險(xiǎn)最小化。直接使用表達(dá)重組蛋白如藥物蛋白或疫苗的植株或植物部分組織(如種子或果實(shí))可以進(jìn)一步減少生產(chǎn)成本，值得探索和研究。
[0007]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建植物生物反應(yīng)器平臺(tái)生產(chǎn)重組凝乳酶也有研究報(bào)道。如有研究者在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯葉片中表達(dá)凝乳酶基因，但只獲得了葉片總蛋白的0.1%-
0.5%的凝乳酶蛋白。Rooijen等在植物種子中重組表達(dá)牛凝乳酶基因，并提出了從種子中分離提純酶蛋白的方法，凝乳酶的積累量至少占種子中總蛋白的0.5%。因此，從植物體內(nèi)獲得具有活性的，高產(chǎn)量的凝乳酶，仍需進(jìn)一步研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法，通過(guò)將羊凝乳酶基因進(jìn)行了克隆然后轉(zhuǎn)入玉米基因組中，在玉米籽粒中過(guò)量表達(dá)，以期在玉米籽粒中得到具有凝乳活性的羊凝乳酶可溶性的融合蛋白，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)凝乳酶制劑的微生物發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0010]一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法，包括以下步驟:
[0011]A.玉米籽粒特異性表達(dá)載體構(gòu)建
[0012]通過(guò)PCR法克隆玉米globulin-Ι基因的啟動(dòng)子Glzml(GenBank:L22344.1)，在啟動(dòng)子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點(diǎn)，亞克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動(dòng)子；
[0013]在羊凝乳酶基因(GenBank:AY389343.1)編碼氨基酸的N端添加6個(gè)組氨酸，根據(jù)玉米密碼子偏好性對(duì)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點(diǎn)，序列設(shè)計(jì)好后進(jìn)行合成;合成后的序列替換植物表達(dá)載體上的GUS基因，最終成功構(gòu)建玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330-Gprochymos in ；
[0014]B.玉米遺傳轉(zhuǎn)化與PCR鑒定
[0015]凍融法將構(gòu)建好的玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330-Gprochymosin導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHAlOl中，以玉米品種幼胚作為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，并用3mg/L的雙丙氨膦進(jìn)行篩選，在啟動(dòng)子6121111上設(shè)計(jì)引物6121111?(5’60404461'了406401^1'11'3’)，在目的基因prochymosin上設(shè)計(jì)引物chyR(5 ’CTGCTGGATGTTGAGGAT3 ’)，對(duì)所獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，所獲得的陽(yáng)性植株在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，自花授粉，收取種子；
[0016]C.轉(zhuǎn)基因植株的southern雜交分析
[0017]CTAB法提取不同轉(zhuǎn)化事件Tl代植株總DNA，經(jīng)BamHI和HindII I (英國(guó)NEB公司)酶切，0.8 %瓊脂凝膠30V電泳8個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，紫外交聯(lián)兩次，每次30秒，間隔2分鐘，以地高辛標(biāo)記的GlzmlF和chyR的PCR產(chǎn)物為探針，TRANS15K DNA marker(中國(guó)全式金生物技術(shù)有限公司，北京)為標(biāo)準(zhǔn)分子量，按照DIG High Prime DNA Labeling andDetect1n Starter Kit I(瑞士Roche公司)試劑盒提供的方法進(jìn)行Southern blot分析。
[0018]D.轉(zhuǎn)基因植株的western雜交分析
[0019]玉米籽粒經(jīng)烘干后研磨成粉末，按照1: 2的比例加入PBS緩沖液(137mM NaCl，2.7mM KCiaOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)，冰上撫育5分鐘，期間每隔30秒振蕩混勻一次。12000g離心5分鐘，取1uL上清液加入等體積的2 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸5分鐘，經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳后，用半干轉(zhuǎn)膜儀(200mA，30min，B1-Rad，USA)轉(zhuǎn)至尼龍膜上，經(jīng)5 % BSA(w/v)的TBS-Tween封閉后，以羊凝乳酶免疫小鼠制備的單克隆抗體為一抗(1:5000)，商業(yè)化的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗(1: 3000，ant 1-mouse IgG alkalinephosphatase con jugate，Novagen)進(jìn)行western雜交檢測(cè)不同轉(zhuǎn)化事件中羊凝乳酶的表達(dá)水平。
[0020]E.蛋白純化與活性分析
[0021 ] 提取玉米軒粒的可溶性總蛋白，并用His PurN1-NTA Resin and Kits(Thermo)純化帶his標(biāo)簽的羊凝乳酶。用SDS-page分析純化情況。
[0022]將直接提取自玉米籽粒的可溶性總蛋白和經(jīng)純化后的羊凝乳酶用HCl條件PH值至2.0，室溫孵育2小時(shí)后，再用IM的Tr is緩沖液(pH8.0)調(diào)節(jié)蛋白溶液PH值至6.3 ,western檢測(cè)活化情況。
[0023]凝乳酶酶活測(cè)定方法:采用Arima K的方法進(jìn)行凝乳酶活性的測(cè)定。用0.0lmol/LCaCl2溶液配制10%脫脂乳。此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL10%脫脂乳于35°C保溫lOmin，加入適量稀釋的酶制劑，振蕩均勻并開(kāi)始計(jì)時(shí)，觀察管壁上開(kāi)始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間(t)。在上述條件下，40min凝結(jié)lmL10%脫脂乳的酶量定義為一個(gè)Soxhlet單位(SU) ο
[0024]凝乳酶活力=(實(shí)驗(yàn)用乳量/凝乳酶量)X(40/t)。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:(I)生產(chǎn)的重組蛋白可進(jìn)行翻譯后修飾如糖蛋白和多亞基蛋白，與天然蛋白產(chǎn)物具有相同或相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；(2)具有本質(zhì)的安全性，不會(huì)傳播動(dòng)物病毒或是感染病原菌；(3)是符合成本效益的生物工藝，生產(chǎn)成本和下游純化成本都較低，生產(chǎn)使停工的風(fēng)險(xiǎn)最小化。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330_Gprochymosin結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖2是玉米轉(zhuǎn)基因植株的獲得示意圖。
[0028]圖3是玉米轉(zhuǎn)基因植株的southern雜交圖。
[0029]圖4是玉米轉(zhuǎn)基因植株的western雜交圖之一。
[0030]圖5SDS-page檢測(cè)結(jié)果。
[0031 ] 圖6是玉米轉(zhuǎn)基因植株的western雜交圖之二。
[0032]圖7是羊凝乳酶活性檢測(cè)圖。
【具體