實(shí)施方式】
[0033]為使對(duì)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征及所達(dá)成的功效有更進(jìn)一步的了解與認(rèn)識(shí)，用以較佳的實(shí)施例及附圖配合詳細(xì)的說(shuō)明，說(shuō)明如下:
[0034]一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法，包括以下步驟:
[0035]A.玉米籽粒特異性表達(dá)載體構(gòu)建
[0036]通過(guò)PCR法克隆玉米globulin-Ι基因的啟動(dòng)子Glzml (GenBank: L22344.1)，在啟動(dòng)子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點(diǎn)，亞克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動(dòng)子；
[0037]在羊凝乳酶基因(GenBank:AY389343.1)編碼氨基酸的N端添加6個(gè)組氨酸，根據(jù)玉米密碼子偏好性對(duì)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點(diǎn)，序列設(shè)計(jì)好后進(jìn)行合成;合成后的序列替換植物表達(dá)載體上的GUS基因，最終成功構(gòu)建玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330-Gprochymos in ；
[0038]B.玉米遺傳轉(zhuǎn)化與PCR鑒定
[0039]凍融法將構(gòu)建好的玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330-Gprochymosin導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHAlOl中，以玉米品種幼胚作為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，并用3mg/L的雙丙氨膦進(jìn)行篩選，在啟動(dòng)子6121111上設(shè)計(jì)引物6121111?(5’60404461'了406401^1'11'3’)，在目的基因prochymosin上設(shè)計(jì)引物chyR(5 ’CTGCTGGATGTTGAGGAT3 ’)，對(duì)所獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，所獲得的陽(yáng)性植株在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，自花授粉，收取種子；
[0040]C.轉(zhuǎn)基因植株的southern雜交分析
[0041 ] CTAB法提取不同轉(zhuǎn)化事件Tl代植株總DNA，經(jīng)BamHI和HindII I (英國(guó)NEB公司)酶切，0.8 %瓊脂凝膠30V電泳8個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，紫外交聯(lián)兩次，每次30秒，間隔2分鐘，以地高辛標(biāo)記的GlzmlF和chyR的PCR產(chǎn)物為探針，TRANS15K marker(中國(guó)全式金生物技術(shù)有限公司，北京)為標(biāo)準(zhǔn)分子量，按照DIG High Prime DNA Labeling andDetect1n Starter Kit I(瑞士Roche公司)試劑盒提供的方法進(jìn)行Southern blot分析。
[0042]D.轉(zhuǎn)基因植株的western雜交分析
[0043]玉米籽粒經(jīng)烘干后研磨成粉末，按照1: 2的比例加入PBS緩沖液(137mM NaCl，2.7mM KCiaOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)，冰上撫育5分鐘，期間每隔30秒振蕩混勻一次。12000g離心5分鐘，取1uL上清液加入等體積的2 X蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸5分鐘，經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳后，用半干轉(zhuǎn)膜儀(200mA，30min，B1-Rad，USA)轉(zhuǎn)至尼龍膜上，經(jīng)5 % BSA(w/v)的TBS-Tween封閉后，以羊凝乳酶免疫小鼠制備的單克隆抗體為一抗(1:5000)，商業(yè)化的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗(1: 3000，ant 1-mouse IgG alkalinephosphatase con jugate，Novagen)進(jìn)行western雜交檢測(cè)不同轉(zhuǎn)化事件中羊凝乳酶的表達(dá)水平。
[0044]E.蛋白純化與活性分析
[0045]提取玉米軒粒的可溶性總蛋白，并用His Pur N1-NTA Resin and Kits(Thermo)純化帶his標(biāo)簽的羊凝乳酶。用SDS-page分析純化情況。
[0046]將直接提取自玉米籽粒的可溶性總蛋白和經(jīng)純化后的羊凝乳酶用HCl條件PH值至2.0，室溫孵育2小時(shí)后，再用IM的Tr is緩沖液(pH8.0)調(diào)節(jié)蛋白溶液PH值至6.3 ,western檢測(cè)活化情況。
[0047]凝乳酶酶活測(cè)定方法:采用Arima K的方法進(jìn)行凝乳酶活性的測(cè)定。用0.0lmol/LCaCl2溶液配制10 %脫脂乳。此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL10 %脫脂乳于35°C保溫lOmin，加入適量稀釋的酶制劑，振蕩均勻并開(kāi)始計(jì)時(shí)，觀察管壁上開(kāi)始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間(t)。在上述條件下，40min凝結(jié)lmL10%脫脂乳的酶量定義為一個(gè)Soxhlet單位(SU)。
[0048]凝乳酶活力=(實(shí)驗(yàn)用乳量/凝乳酶量)X(40/t)。
[0049]結(jié)果與分析
[°°50] 1.玉米轉(zhuǎn)基因植株的獲得及southern雜交檢測(cè)
[0051 ]玉米幼胚經(jīng)侵染后，共培養(yǎng)3天，在抑菌培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7天，隨后轉(zhuǎn)到含有3mg/L雙丙氨膦的選著培養(yǎng)基上上篩選，約6周后出現(xiàn)抗性愈傷組織，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基I兩周后，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基Π繼續(xù)分化，共計(jì)獲得抗性再生植株31株。(如圖2所示:A，農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚;B，愈傷組織篩選;C，抗性植株再生;D，生根培養(yǎng);E，轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí);F，轉(zhuǎn)基因玉米籽粒)經(jīng)PCR檢測(cè)，共檢測(cè)出7株陽(yáng)性植株。對(duì)其進(jìn)行southern雜交分析，結(jié)果表明其中共含有3株單拷貝轉(zhuǎn)基因植株(如圖3所示:M，transl5k DNA Marker ; +，質(zhì)粒pC330_Gprochymosin;-，野生型植株;1-7，不同轉(zhuǎn)基因植株品系)。
[0052]2.玉米轉(zhuǎn)基因植株的western雜交檢測(cè)
[0053]Western雜交結(jié)果表明(如圖4所示，M，蛋白分子量;wt，野生型植株；1-3，不同轉(zhuǎn)基因植株品系)，野生型玉米籽粒中沒(méi)有目的條帶，而3株單拷貝轉(zhuǎn)基因植株籽粒中均含有大小約為40KDa的羊凝乳酶，其中第一條泳道內(nèi)的玉米轉(zhuǎn)化事件的籽粒總蛋白中重組羊凝乳酶原的表達(dá)量明顯高于其他兩株。對(duì)其進(jìn)行Elisa定量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊凝乳酶約占總可溶性蛋白的0.27 %。
[0054]3.蛋白純化與活性分析
[0055]SDS-page檢測(cè)結(jié)果(圖5:M，蛋白分子量；I，轉(zhuǎn)基因植株籽?？偟鞍?上樣液)；2，流出液;3，洗滌液;4，純化的羊凝乳酶原)表明，玉米籽粒中的總蛋白經(jīng)鎳柱純化試劑盒進(jìn)行純化后僅在42kDa處出現(xiàn)一條清晰的條帶，Elisa鑒定純化后的羊凝乳酶酶原占總蛋白的83%以上。Western結(jié)果(圖6:M，蛋白分子量;-，野生型植株；I，轉(zhuǎn)基因植株籽?？偟鞍?；2，活化處理的轉(zhuǎn)基因植株籽?？偟鞍?；3，純化的羊凝乳酶原；4，活化處理的羊凝乳酶原)表明，無(wú)論是轉(zhuǎn)基因植株總蛋白還是經(jīng)純化后的羊凝乳酶酶原在PH值2.0條件下室溫處理2h，均可將幾乎所有的羊凝乳酶由42kDa的酶原變?yōu)?6kDa，完成活化。將活化后的轉(zhuǎn)基因玉米籽?？偟鞍缀椭亟M羊凝乳酶純品進(jìn)行凝乳實(shí)驗(yàn)，證實(shí)他們均具有凝乳活性(圖7: +，商業(yè)化凝乳酶;_，PBS緩沖液;wt，野生型植株；I，轉(zhuǎn)基因植株籽粒總蛋白；2，活化處理的轉(zhuǎn)基因植株籽?？偟鞍?；3，純化的羊凝乳酶原;4，活化處理的羊凝乳酶原)ο按照ArimaK的方法進(jìn)行計(jì)算，純化后的重組羊凝乳酶活力可達(dá)到178.5U/mg。
[0056]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
[0057]本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法，其特征在于:包括以下步驟:通過(guò)PCR法克隆玉米globulin-Ι基因的啟動(dòng)子Glzml，在啟動(dòng)子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點(diǎn)，亞克隆到植物表達(dá)載體PCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動(dòng)子； 在羊凝乳酶基因編碼氨基酸的N端添加6個(gè)組氨酸，根據(jù)玉米密碼子偏好性對(duì)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點(diǎn)，序列設(shè)計(jì)好后進(jìn)行合成;合成后的序列替換植物表達(dá)載體上的GUS基因，最終成功構(gòu)建玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330-Gprochymosin02.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法，其特征在于:凍融法將構(gòu)建好的玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330_Gprochymosin導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHAlOl中，以玉米品種幼胚作為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，并用3mg/L的雙丙氨膦進(jìn)行篩選，在啟動(dòng)子GIzmI上設(shè)計(jì)引物GlzmlF，在目的基因prochymosiη上設(shè)計(jì)引物chyR，對(duì)所獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，所獲得的陽(yáng)性植株在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，自花授粉，收取種子。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)基因玉米種子中羊凝乳酶的表達(dá)方法，包括以下步驟：通過(guò)PCR法克隆玉米globulin-1基因的啟動(dòng)子Glzm1，在啟動(dòng)子上下游分別添加HindIII和NcoI酶切位點(diǎn)，亞克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA3301上，替換GUS基因前面的35S啟動(dòng)子；在羊凝乳酶基因編碼氨基酸的N端添加6個(gè)組氨酸，根據(jù)玉米密碼子偏好性對(duì)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在基因上下游分別添加NcoI和BstEII酶切位點(diǎn)，序列設(shè)計(jì)好后進(jìn)行合成；合成后的序列替換植物表達(dá)載體上的GUS基因，最終成功構(gòu)建玉米籽粒特異性表達(dá)載體pC330-Gprochymosin。本發(fā)明的有益效果為：(1)生產(chǎn)的重組蛋白可進(jìn)行翻譯后修飾如糖蛋白和多亞基蛋白，與天然蛋白產(chǎn)物具有相同或相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能；(2)具有本質(zhì)的安全性，不會(huì)傳播動(dòng)物病毒或是感染病原菌。
【IPC分類(lèi)】A01H5/10, C12N9/64, C12N15/82
【公開(kāi)號(hào)】CN105647895
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】劉文國(guó), 王云鵬, 路明, 張志軍, 王敏, 呂慶雪, 趙萬(wàn)慶, 岳堯海, 劉宏偉, 張建新, 馬英杰, 周旭東, 孟令聰, 李巖
【申請(qǐng)人】吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年4月12日