本發(fā)明涉及蛋白酶，具體涉及一種促進木瓜蛋白酶活性的方法。
背景技術：
木瓜蛋白酶是一種熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全的蛋白質水解酶，別名番木瓜酶或木瓜酶，分子量為23406，由一種單肽鏈組成，具有低特異性的特點，Cys25、His159和Asp158這三個氨基酸殘基存在于木瓜蛋白酶的活性中心部位?？蓮姆竟系母?、莖、葉和果實內(nèi)提取出木瓜蛋白酶。根據(jù)《GB 2760-2011食品安全國家標準食品添加劑使用標準》的規(guī)定，木瓜蛋白酶可用作食品工業(yè)的加工助劑，即酶制劑。
木瓜蛋白酶的提取方法有烘干法、單寧沉淀法、超濾法、絮凝法、鹽析法、超聲波法等，但大多數(shù)的提取方法存在降低酶活性，得到產(chǎn)品的純度低，污染環(huán)境等諸多問題。雖然木瓜蛋白酶使用時具有pH范圍廣，熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但卻受到提取工藝的限制。
染料木素是自然界中最常見的一種黃酮類化合物，本身具有抗氧化、抗腫瘤作用、對血管的防護作用、提高免疫力和抗菌消炎等作用。8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮是染料木素與1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪經(jīng)化學合成得到的一種染料木素衍生物，是對染料木素的改性。8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮分子式為C28H28N2O5，分子量472.52，其結構式如下：
目前，國內(nèi)外未見8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮在促進木瓜蛋白酶活性方面的應用報道。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種采用8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮作為酶促進劑，促進木瓜蛋白酶活性的方法，不僅縮短豌豆蛋白的酶解時間，提高酶解效率，而且得到的豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高。
本發(fā)明所述的促進木瓜蛋白酶活性的方法，是將木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮與木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，對豌豆蛋白粉進行酶解制備豌豆蛋白多肽粉。
其中：
木瓜蛋白酶促進劑的添加量為木瓜蛋白酶質量的2～4％，木瓜蛋白酶的添加量為豌豆蛋白粉質量的10～12％。
酶解的pH為6.3～6.5，酶解溫度為60～65℃，酶解時間為2～2.5h。
酶解之后進行滅酶，滅酶溫度為95～100℃，滅酶時間為5～10min。
具體步驟如下：
將豌豆蛋白粉溶解于磷酸緩沖溶液中，加入木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶促進劑，經(jīng)酶解、滅酶、冷卻過濾后得到豌豆多肽液，豌豆多肽液再經(jīng)冷凍干燥得到豌豆蛋白多肽粉。
將豌豆蛋白多肽粉以15～17.2mg/mL的濃度添加到普通飲料中，制成抗氧化、抗衰老的功能性飲料。
木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，為染料木素與1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪的化學合成物，具體制備過程如下：
在50mL圓底燒瓶中加入染料木素1mmol，無水乙醇25mL和37％甲醛水溶液0.08mL，加熱至55～60℃，反應液澄清后，加入1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪0.19mL，室溫攪拌48h，有固體析出，過濾，固體經(jīng)重結晶分離純化，得到本發(fā)明的酶促進劑。
本發(fā)明中木瓜蛋白酶促進劑與木瓜蛋白酶的一個精氨酸殘基以一個氫鍵相互結合，并以四個π鍵分別與另外兩個精氨酸殘基結合，這種結合導致了木瓜蛋白酶構象的改變，從而提高了木瓜蛋白酶的活性。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：
(1)本發(fā)明的木瓜蛋白酶促進劑提高了木瓜蛋白酶的活性，其與木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，具有協(xié)同作用，縮短了酶解時間，提高了酶解效率。
(2)豌豆蛋白粉酶解后經(jīng)冷凍干燥得到豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高；相比于未添加木瓜蛋白酶促進劑的豌豆蛋白多肽粉，羥基自由基清除率提高了5.3～18％，能夠用于抗衰老、抗氧化的功能性食品的開發(fā)。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
實施例1
將豌豆蛋白粉溶解于pH值為6.5的磷酸緩沖溶液中，形成豌豆蛋白粉質量濃度為7％的分散液，加入占豌豆蛋白粉質量12％的木瓜蛋白酶，同時加入占木瓜蛋白酶質量2％的木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，在pH值為6.5，溫度為65℃條件下水浴震蕩酶解2h，酶解結束后，酶解液在100℃維持5min滅酶，然后冷卻至室溫，過濾得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法測量水解度，發(fā)現(xiàn)加木瓜蛋白酶促進劑后，豌豆蛋白的酶解度提高33％，酶解時間縮短了25％。
將豌豆多肽液經(jīng)真空冷凍干燥得豌豆多肽粉。將豌豆多肽粉以16mg/mL的濃度添加到普通飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其羥基自由基清除率達65％，與未使用木瓜蛋白酶促進劑相比，清除率提高了18％。
實施例2
將豌豆蛋白粉溶解于pH值為6.3的磷酸緩沖溶液中，形成豌豆蛋白粉質量濃度為7％的分散液，加入占豌豆蛋白粉質量10％的木瓜蛋白酶，同時加入占木瓜蛋白酶質量4％的木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，在pH值為6.3，溫度為60℃條件下水浴震蕩酶解2.5h，酶解結束后，酶解液在95℃維持10min滅酶，然后冷卻至室溫，過濾得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法測量水解度，發(fā)現(xiàn)加木瓜蛋白酶促進劑后，豌豆蛋白的酶解度提高16％，酶解時間縮短了7％。
將豌豆多肽液經(jīng)真空冷凍干燥得豌豆多肽粉。將豌豆多肽粉以15mg/mL的濃度添加到普通飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其羥基自由基清除率達58％，與未使用木瓜蛋白酶促進劑相比，清除率提高了5.3％。
實施例3
將豌豆蛋白粉溶解于pH值為6.4的磷酸緩沖溶液中，形成豌豆蛋白粉質量濃度為7％的分散液，加入占豌豆蛋白粉質量11％的木瓜蛋白酶，同時加入占木瓜蛋白酶質量3％的木瓜蛋白酶促進劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，在pH值為6.4，溫度為63℃條件下水浴震蕩酶解2.3h，酶解結束后，酶解液在95℃維持10min滅酶，然后冷卻至室溫，過濾得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法測量水解度，發(fā)現(xiàn)加木瓜蛋白酶促進劑后，豌豆蛋白的酶解度提高25％，酶解時間縮短了15％。
將豌豆多肽液經(jīng)真空冷凍干燥得豌豆多肽粉。將豌豆多肽粉以17.2mg/mL的濃度添加到普通飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其羥基自由基清除率達61％，與未使用木瓜蛋白酶促進劑相比，清除率提高了11％。