本發(fā)明屬于生化分離技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種木瓜蛋白酶的分離提純方法，尤其涉及一種改性聚乙二醇-酒石酸鈉雙水相萃取分離提純木瓜蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶廣泛存在于番木瓜未成熟果實(shí)的乳汁中，它是由212個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)單鏈，具有耐高溫、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，蛋白質(zhì)水解能力強(qiáng)等特征，還具有凝乳、解脂和溶菌活力，是能作用于各類蛋白質(zhì)的純天然產(chǎn)物。對(duì)pH變化和金屬離子及去垢劑不敏感，其用途很多，目前已廣泛的應(yīng)用于食品、化工、輕紡工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等各個(gè)行業(yè)。在肉類加工中，木瓜蛋白酶是最好的肉類嫩化劑，這是因?yàn)槟竟系鞍酌概c其他蛋白酶相比，其熱穩(wěn)定性較高。將木瓜蛋白酶用于對(duì)冷凍貯存過程中啤酒處理，能水解啤酒內(nèi)蛋白質(zhì)，部分水解一些已形成的復(fù)合物，產(chǎn)生更多的多肽或氨基酸，保證啤酒在冷凍過程中的高清澈度，同時(shí)改善啤酒口感及原有多肽和氨基酸的組成和比例，有效地改良啤酒品質(zhì)。因此，研究、探討、尋求最佳提取工藝對(duì)木瓜蛋白酶的開發(fā)、制備和應(yīng)用具有極其重要的意義。提取木瓜蛋白酶的傳統(tǒng)方法有：超濾法、鹽析法、有機(jī)溶劑法、絮凝法、親和層析法等。
雙水相萃取技術(shù)近年來愈來愈得到研究者的青睞，其相對(duì)傳統(tǒng)的分離純化技術(shù)具有提純效率高、設(shè)備常規(guī)、操作簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，且不存在有機(jī)溶劑的殘留問題，易于放大和連續(xù)操作，各種參數(shù)可按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低。雙水相萃取是利用組分在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離的萃取技術(shù)。雙水相萃取中使用的雙水相是由兩種互不相溶的高分子溶液或者互不相溶的鹽溶液和高分子溶液組成。然而現(xiàn)有的雙水相萃取技術(shù)需要在體系分相后輔以離心等操作，從而加速系統(tǒng)分相，并向體系中加入中性鹽KCl增加目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和收率增加了操作難度和經(jīng)濟(jì)成本。因此，開發(fā)一種步驟簡(jiǎn)單，設(shè)備常規(guī)，分離效果好，分離效率高的雙水相萃取分離葛根素的方法是目前亟待解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種改性聚乙二醇-酒石酸鈉雙水相萃取分離提純木瓜蛋白酶的方法，所用設(shè)備常規(guī)，操作簡(jiǎn)便，分離效率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
一種高效分離提純木瓜蛋白酶的方法，包括如下步驟：
(1)粗提液制備：將木瓜乳汁加入水中浸泡4-6小時(shí)后，于-20℃下冷凍3-8小時(shí)后，再于25℃融化，如此反復(fù)凍融3～4次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液即為含木瓜蛋白酶的粗提液。
(2)雙水相萃取：向步驟(1)所得含木瓜蛋白酶的粗提液中加入改性聚乙二醇和酒石酸鈉，震蕩混合后，靜置15-30分鐘，收集上相，所述改性聚乙二醇為辛酸部分酯化聚乙二醇。雙水相萃取體系由互不相溶的改性聚乙二醇和酒石酸鈉構(gòu)成，利用木瓜蛋白酶在改性聚乙二醇和酒石酸鈉中的選擇性分配，使其與粗提液中其他雜質(zhì)分離，從而達(dá)到分離純化的目的。雙水相體系中兩相的極性差為分相速度的重要影響因素，采用聚乙二醇和酒石酸鈉的雙水相體系，兩相分離速度較慢，且木瓜蛋白酶純度不高，主要是由于聚乙二醇和酒石酸鈉的極性相差不大，對(duì)木瓜蛋白酶的選擇性分配不高。采用辛酸酯化改性聚乙二醇的部分端羥基，獲得改性聚乙二醇，使其在具有水溶性的同時(shí)，增大與酒石酸鈉的極性差，從而加快分相速度，不用離心即可成功分相，降低了操作難度，增加了純化效率。
(3)成品制備：將步驟(2)所得上相在截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000的透析膜中透析15-20小時(shí)后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15～-10℃冷凍干燥8～15小時(shí)得木瓜蛋白酶粉末。
作為優(yōu)選，步驟(1)中所述木瓜乳汁與水的質(zhì)量比為1:50-70。
作為優(yōu)選，步驟(2)改性聚乙二醇中的聚乙二醇平均分子量為600、1000或2000。雙水相體系中兩相的極性差為分相速度的重要影響因素，低分子量的PEG有利于木瓜蛋白酶分配系數(shù)的增加，但是雙水相系統(tǒng)對(duì)木瓜蛋白酶的選擇性會(huì)降低，同時(shí)低分子量的PEG與酒石酸鈉的極性差較低，因此導(dǎo)致體系分相困難，分相速度較慢；高分子量的PEG雖與酒石酸鈉的極性差較高，體系分相速度快，但隨著PEG平均分子量的增大，體系粘度增大，成相物質(zhì)分子間的自由體積減小，空間位阻作用增強(qiáng)，阻礙木瓜蛋白酶分子進(jìn)入PEG相。平均分子量為600、1000或2000的PEG所構(gòu)成的雙水相對(duì)木瓜蛋白酶的選擇性較好，采用辛酸酯化改性PEG的部分端羥基，獲得部分支化的PEG，使其在具有水溶性的同時(shí)，增大與酒石酸鈉的極性差，從而加快分相速度，不用離心即可成功分相，降低了操作難度，增加了純化效率。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述改性聚乙二醇質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的20-25％，酒石酸鈉質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的10-15％，含木瓜蛋白酶的粗提液的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的65-68％。不同濃度組成的雙水相體系萃取效果不同，改性聚乙二醇濃度過低，分相困難；隨著改性聚乙二醇濃度在一定范圍內(nèi)的增加，雙水相體系兩相差別較大，利于木瓜蛋白酶在上相中富集，其他水溶性雜質(zhì)在下相中富集，但是隨著改性聚乙二醇濃度繼續(xù)增大，更多的雜質(zhì)進(jìn)入上相，使上相中木瓜蛋白酶的純度降低。隨著酒石酸鈉濃度在一定范圍內(nèi)的提高，物質(zhì)在兩相中界面張力增大，有利于木瓜蛋白酶在上相富集，雜質(zhì)在下相富集；當(dāng)酒石酸鈉濃度更大時(shí)，上相體積逐漸減小，同時(shí)粘度逐漸增大，不利于木瓜蛋白酶在上相的富集。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述改性聚乙二醇的制備方法為：將辛酸、聚乙二醇和SO42-/ZrO2固體超強(qiáng)酸催化劑混合均勻后，于120～140℃下反應(yīng)，反應(yīng)過程中不斷除去生成的水，直至反應(yīng)液呈中性，停止反應(yīng)，冷卻至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得改性聚乙二醇。
更優(yōu)選，所述辛酸與聚乙二醇的的質(zhì)量比為1:6～10，所述固體超強(qiáng)酸催化劑的質(zhì)量為聚乙二醇質(zhì)量的0.1～0.15％。辛酸與聚乙二醇的摩爾比決定了聚乙二醇的酯化程度，酯化程度過高則改性聚乙二醇的水溶性下降；酯化程度過低則不足以改善雙水相體系的分相速度。
本發(fā)明的有益效果為：
1、改性聚乙二醇/酒石酸鈉雙水相體系對(duì)木瓜蛋白酶的選擇性高，體系分相速度快，不需借助離心機(jī)等設(shè)備即可快速分相。
2、采用本發(fā)明所述方法制得木瓜蛋白酶粉末中木瓜蛋白酶純度高達(dá)94.5％，總收率為86.2％。
3、本發(fā)明所采用的分離純化方法，操作簡(jiǎn)便，設(shè)備常規(guī)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
實(shí)施例1
(1)改性聚乙二醇的制備
將10g辛酸、60g PEG1000和0.1g SO42-/ZrO2固體超強(qiáng)酸催化劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，混合均勻后，于130℃下反應(yīng)，并減壓分水，PH試紙檢測(cè)反應(yīng)液呈中性后，停止反應(yīng)，冷卻至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得改性聚乙二醇65.3g。
(2)木瓜蛋白酶粗提液的制備
將10g木瓜乳汁加入500g去離子水中浸泡6小時(shí)后，于-20℃下冷凍3小時(shí)，再于25℃融化，如此反復(fù)凍融3次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液得18g含木瓜蛋白酶的粗提液，純度為51.4％，收率為92.5％。
(3)雙水相萃取
取13g含木瓜蛋白酶的粗提液、4g改性聚乙二醇和3g酒石酸鈉加入分液漏斗中，震蕩混合后，靜置10分鐘后分相，收集上相，將上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000的透析膜中透析20小時(shí)后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷凍干燥10小時(shí)得12.6g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的純度為94.3％，回收率為91.7％，總收率為84.8％。
實(shí)施例2
(1)改性聚乙二醇的制備
將10g辛酸、80g PEG6000和0.12g SO42-/ZrO2固體超強(qiáng)酸催化劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，混合均勻后，于140℃下反應(yīng)，并減壓分水，PH試紙檢測(cè)反應(yīng)液呈中性后，停止反應(yīng)，冷卻至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得改性聚乙二醇82.9g。
(2)木瓜蛋白酶粗提液的制備
將10g木瓜乳汁加入600g去離子水中浸泡4小時(shí)后，于-20℃下冷凍5小時(shí)，再于25℃融化，如此反復(fù)凍融3次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液得17.4g含木瓜蛋白酶的粗提液，純度為53.8％，收率為93.4％。
(3)雙水相萃取
取12.8g含木瓜蛋白酶的粗提液、5g改性聚乙二醇和2.4g酒石酸鈉加入分液漏斗中，震蕩混合后，靜置8分鐘后分相，收集上相，將上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000的透析膜中透析15小時(shí)后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷凍干燥8小時(shí)得13.2g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的純度為90.9％，回收率為93.8％，總收率為87.6％。
實(shí)施例3
(1)改性聚乙二醇的制備
將10g辛酸、100g PEG2000和0.15g SO42-/ZrO2固體超強(qiáng)酸催化劑置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，混合均勻后，于150℃下反應(yīng)，并減壓分水，PH試紙檢測(cè)反應(yīng)液呈中性后，停止反應(yīng)，冷卻至常溫后，過濾，濾液蒸餾去除水分后即得改性聚乙二醇104.9g。
(2)木瓜蛋白酶粗提液的制備
將10g木瓜乳汁加入700g去離子水中浸泡5小時(shí)后，于-20℃下冷凍8小時(shí)，再于25℃融化，如此反復(fù)凍融3次破壁，再將所得溶液離心處理后，收集上清液得16.6g含木瓜蛋白酶的粗提液，純度為55.0％，收率為91.2％。
(3)雙水相萃取
取13.6g含木瓜蛋白酶的粗提液、4.4g改性聚乙二醇和2g酒石酸鈉加入分液漏斗中，震蕩混合后，靜置15分鐘后分相，收集上相，將上相置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為10000的透析膜中透析24小時(shí)后得木瓜蛋白酶水溶液，再于-15℃冷凍干燥15小時(shí)得13.8g木瓜蛋白酶粉末，其中木瓜蛋白酶的純度為93.1％，回收率為94.5％，總收率為86.2％。
比較例1
采用與實(shí)施例3步驟(2)和(3)相同的操作方法，不同的是采用聚乙二醇替代改性聚乙二醇，在雙水相萃取過程中需要靜置4-6小時(shí)，并輔助以離心體系才能完全分層。
通過對(duì)比比較例1和實(shí)施例3，可以發(fā)現(xiàn)，部分酯化的聚乙二醇能夠加快雙水相萃取體系的分相速度，提高產(chǎn)品純度和收率。
以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。