本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)方法，屬于重組蛋白分離純化
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TG.2.3.2.13）通過?；D(zhuǎn)移反應(yīng)而引起蛋白質(zhì)內(nèi)部、蛋白質(zhì)之間的相互交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接作用以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)部谷氨酰胺基的轉(zhuǎn)移和水解作用，形成ε-(γ-谷胺酰)賴氨酸共價(jià)異肽鍵，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性，由于其卓越的交聯(lián)特性，TG被認(rèn)為是生產(chǎn)各種新型蛋白質(zhì)加工產(chǎn)品的重要酶源，在食品的加工、儲(chǔ)藏、保鮮等方面、化妝品、紡織、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。TGase最初從動(dòng)、植物組織中提取，動(dòng)物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶已經(jīng)商業(yè)化，但是由于來源稀少，工藝復(fù)雜、產(chǎn)品得率低、分離成本高，不利于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。自1989年Ando等從5000株菌株中篩選到幾株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)，在后期研究中將其分離得到微生物來源的TGase，由于其活性不依賴Ca2+、底物特異性低、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，且其生產(chǎn)周期短，分離純化工藝簡(jiǎn)單而受到廣大科學(xué)愛好者的青睞。目前，MTG已在大腸桿菌(E.coli)、谷氨酸棒桿菌、酵母、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌等宿主中成功表達(dá)，但普遍存在酶活低、產(chǎn)量少等問題。日本的味之素公司已經(jīng)成功利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，并應(yīng)用于商業(yè)化中，已經(jīng)取得了巨大經(jīng)濟(jì)效益，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基本被其所壟斷，國內(nèi)研究谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶主要集中于發(fā)酵條件優(yōu)化以及酶的應(yīng)用等方面。大腸桿菌遺傳背景清楚，生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)成本低，轉(zhuǎn)化率高并且可以大規(guī)模表達(dá)目的蛋白，其表達(dá)水平明顯高于其他表達(dá)系統(tǒng)。而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)與成熟的重組菌純化工藝是息息相關(guān)，不可逾越的，因此實(shí)現(xiàn)基因工程技術(shù)和工程菌的純化工藝的有機(jī)結(jié)合，無疑會(huì)為重組產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。盡管許多微生物在自然狀態(tài)下都能產(chǎn)TGase，但絕大多數(shù)酶的產(chǎn)量極低，而通過常規(guī)育種技術(shù)耗時(shí)費(fèi)力，難以篩選到TGase的高產(chǎn)菌株，這就造成了生產(chǎn)成本居高不下，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)技術(shù)，可大幅提高重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量和酶活性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：1）重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵：將含有谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的重組大腸桿菌于10L發(fā)酵罐37℃培養(yǎng)至OD600=2-3時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)；2）細(xì)胞的收集及裂解：將步驟1）的發(fā)酵液以管式離心機(jī)離心收集菌體，按1:10-15（m:v）的比例(單位為g/ml)，加入裂解緩沖液，利用高壓均質(zhì)機(jī)在4℃下將細(xì)胞裂解，裂解結(jié)束后將勻漿液于12500rpm，15℃離心20分鐘，保留沉淀；3）包涵體的純化：將步驟2）的沉淀按1:10-15（m:v）的比例加入包涵體洗滌緩沖液I，以步驟2）相同方法裂解，于6000rpm，15℃離心20分鐘，保留沉淀，然后再將沉淀按1:10-15（m:v）的比例加入包涵體洗滌緩沖液I，以步驟2）相同方法裂解，于6000rpm，15℃離心20分鐘，保留沉淀，然后再將沉淀按1:10-15（m:v）的比例加入包涵體洗滌緩沖液II，以步驟2）相同方法裂解，于6000rpm，15℃離心20分鐘，保留沉淀，最后將沉淀加入包涵體溶解液中以步驟2）相同方法裂解，于12500rpm，15℃離心20分鐘，保留上清，即可得純化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶包涵體；4）包涵體的復(fù)性：將步驟3）的上清透析于復(fù)性緩沖液中復(fù)性，復(fù)性結(jié)束將樣品透析與最終儲(chǔ)存緩沖液中。步驟1）所述的10L發(fā)酵罐中為TB培養(yǎng)基，裝液量為6L，培養(yǎng)基組分及各組分含量為：50ug/ml的卡那霉素，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·3H2O15.2g/L，KH2PO42.33g/L，培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速200-300rpm，罐壓為0.03-0.05Mpa，初始通氣量為1.5m3/h，通過調(diào)節(jié)通氣量維持DO大于25%，IPTG終濃度為0.2-0.5mM。步驟2）所述的裂解緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl（pH7.0-8.5）、0.1-0.5mol/LNaCl，0.5%-2%TritonX-100，1-2mMDTT(二硫蘇糖醇)，0.2-1mMPMSF(苯甲基磺酰氟)，1-2mMEDTA；加入低濃度DTT為了保護(hù)蛋白質(zhì)的二硫鍵不被破環(huán)，加入PMSF和EDTA(乙二胺四乙酸)是為了防止蛋白再裂解后被蛋白酶降解。步驟2）所述的均質(zhì)壓力為700-900Mpa，以菌液不再粘稠為結(jié)束標(biāo)志。步驟3）所述的洗滌緩沖液I為20-50mmol/LTris-HCl（pH7.0-8.5）、0.1-0.5mol/LNaCl，0.5%-2%TritonX-100，1-2mMDTT，2mol/L尿素。步驟3）所述的洗滌緩沖液II為20-50mmol/LTris-HCl（pH7.0-8.5）、0.1-0.5mol/LNaCl，1-2mMDTT，4mol/L尿素。洗滌緩沖液中分別加入2mol/L和4mol/L尿素是為了將包裹在包涵體外部的雜質(zhì)溶解，提高包涵體純度。步驟3）所述的包涵體溶解液為20-50mmol/LTris-HCl（pH7.0-8.5）、0.1-0.5mol/LNaCl，1-2mMDTT，8mol/L尿素。步驟4）所述的復(fù)性緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl（pH7.0-8.5）、0.1-0.5mol/LNaCl，0.2-0.4mMGSSG（氧化型谷胱甘肽），1-4mMGSH（還原型谷胱甘肽），1-2mMDTT，0.2-0.5ML-Arginine（L-精氨酸），復(fù)性溫度為4℃，復(fù)性時(shí)間為20-26h。利用GSH/GSSG氧化還原系統(tǒng)模擬蛋白質(zhì)的體內(nèi)折疊進(jìn)行蛋白質(zhì)的復(fù)性，并且在其中加入促溶劑L-Arginine或月桂酸肌氨酸鈉，提高了復(fù)性的成功率。步驟4）所述的儲(chǔ)存緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl（pH7.0-8.5）、0.1-0.5mol/LNaCl，10-20%甘油，溫度為-80℃。本發(fā)明中所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶重組大腸桿菌是將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中獲得的重組菌。例如構(gòu)建方法可以為：根據(jù)Fu,R.Y.報(bào)道的MTG基因（GenBank:DQ132977），以Streptomycesmobaraensis基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為：95℃，5min；(95℃30s，60℃60s，72℃45s，30個(gè)循環(huán))；72℃，10min。純化擴(kuò)增出的mtg基因，將mtg基因和表達(dá)質(zhì)粒分別用EcoRI和bamHI雙酶切、連接轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，使用EcoRI和bamHI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET30a-mtg，得到大小為1000bp左右的條帶，酶切結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET30a-mtg構(gòu)建成功，獲得重組質(zhì)粒pET30a-mtg，參考《分子克隆》將重組質(zhì)粒pET30a-mtg通過熱擊導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到重組的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大腸桿菌BL21(DE3)/mtg。有益效果本發(fā)明將重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大腸桿菌經(jīng)過高溫培養(yǎng)和誘導(dǎo)，得到以包涵體形式的目的蛋白，可以大幅提高發(fā)酵過程中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的的含量；相對(duì)于其他受體菌，大腸桿菌遺傳背景清楚，生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)成本低，轉(zhuǎn)化率高并且可以大規(guī)模表達(dá)目的蛋白。在破碎過程選擇高壓均質(zhì)破碎，由于其可以低溫控制，保持蛋白穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，并且破碎率良好，處理量大，管式離心機(jī)處理量大，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)速高，離心效果好，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)中大批量樣品的處理。在蛋白純化階段通過包涵體洗液清洗后的包涵體純度較高，易于后續(xù)復(fù)性操作，復(fù)性緩沖液中加入GSH/GSSG氧化對(duì)，以及促溶劑L-Arginine和月桂酸肌氨酸鈉，提高了復(fù)性成功率，蛋白回收率高，因此整個(gè)生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、高效快速，生產(chǎn)成本低，對(duì)以包涵體形式存在的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)方法中蛋白表達(dá)量低，復(fù)性回收率低的問題，適合規(guī)?；a(chǎn)，得到的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶純度好，質(zhì)量穩(wěn)定。附圖說明圖1：瓊脂糖凝膠電泳分析mtg基因（其中M為DNAMark，1為mtg基因）；圖2：SDS-PAGE分析包涵體純化結(jié)果（其中M為蛋白Mark，1為包涵體純化前，2為本發(fā)明純化結(jié)果，3、4、5為對(duì)照實(shí)驗(yàn)純化結(jié)果）；圖3：SDS-PAGE分析包涵體復(fù)性結(jié)果（其中M為蛋白Mark，1為標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（BSA），2為本發(fā)明純化結(jié)果，3、4、5為對(duì)照實(shí)驗(yàn)復(fù)性結(jié)果）。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明緩沖液中所述的百分比是體積比。實(shí)施例1本實(shí)施例說明谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶重組大腸桿菌的構(gòu)建1、設(shè)計(jì)合成帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的上游引物和帶有BamHI酶切位點(diǎn)的下游引物（下劃線部分為相應(yīng)的酶切位點(diǎn)），Primer1上游引物：5’-GGTCGTCAACAACTACATAC-3’；Primer2下游引物：5’-GTTCGCCAGTTCCTTCTT-3’。2、根據(jù)Fu,R.Y.報(bào)道的MTG基因（GenBank:DQ132977），以Streptomycesmobaraensis基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為：95℃，5min；(95℃30s，60℃60s，72℃45s，30個(gè)循環(huán))；72℃，10min。純化擴(kuò)增出的mtg基因（參照TakaraDNA片段純化試劑盒說明書）和表達(dá)質(zhì)粒pET30a（購自Takara公司）分別用EcoRI和bamHI雙酶切、連接轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞（購自德泰生物公司），使用EcoRI和bamHI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pET30a-mtg，得到大小為1000bp左右的條帶，酶切結(jié)果表明（圖1），重組質(zhì)粒pET30a-mtg構(gòu)建成功，獲得重組質(zhì)粒pET30a-mtg，參考《分子克隆》將重組質(zhì)粒pET30a-mtg通過熱擊導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到重組的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大腸桿菌BL21(DE3)/mtg。3、將步驟2）的表達(dá)載體熱擊導(dǎo)入大腸桿菌，熱擊條件：42℃90s，后冰浴3min，然后加入200ulLB培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)1h，取已培養(yǎng)好的大腸桿菌BL21用無菌水制成濃度大約為1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，吸取50μL在無菌條件下均勻涂布到加入50ug/ml的卡那霉素平板培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)12-24小時(shí)，即可獲得重組大腸桿菌。實(shí)施例2本實(shí)施例說明重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大腸桿菌的發(fā)酵控制過程將實(shí)施例1得到的重組的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大腸桿菌BL21(DE3)/mtg的平板上挑取單克隆接種在含4mlLB培養(yǎng)液試管37℃，200rpm培養(yǎng)16h，再將培養(yǎng)好的一級(jí)種液按2%的接種量接種于含200mlLB培養(yǎng)液的三角燒瓶中37℃培養(yǎng)16h,作為發(fā)酵用種子液，種子液以2%接種量接種于含有6LTB培養(yǎng)液（含50ug/ml的卡那霉素，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·3H2O15.2g/l，KH2PO42.33g/l）10L發(fā)酵罐中37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)為300rpm，罐壓維持在0.03-0.05Mpa，初始通氣量為1.5m3/h，通過調(diào)節(jié)通氣量維持DO大于25%，培養(yǎng)至OD600在2-3之間加入終濃度為0.375mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)OD600增至2穩(wěn)定兩小時(shí)后停止發(fā)酵，將發(fā)酵液緩慢加入管式離心機(jī)離心后收集菌體，最終獲得濕菌體為26.7g/L。在目前的文獻(xiàn)中通常在高溫37℃培養(yǎng)后在低溫下（15℃或者28℃）誘導(dǎo)，這樣可以讓蛋白表達(dá)在上清，但是這樣表達(dá)的蛋白量少，本發(fā)明采用37℃培養(yǎng)和誘導(dǎo)，蛋白以包涵體形式大量表達(dá)，表達(dá)量高。實(shí)施例3本實(shí)施例說明重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶蛋白的純化將收集的細(xì)胞取26.7g加入10倍體積（260ml）的50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.15mol/LNaCl，0.5%TritonX-100，1mMDTT，0.2mMPMSF，1mMEDTA攪勻后，緩慢流加到高壓均質(zhì)機(jī)中，壓力控制在800Mpa，循環(huán)兩次后將勻漿液在6000rpm，4℃離心，將沉淀加入10倍體積的50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.15mol/LNaCl，0.5%TritonX-100，1mMDTT，2mol/L尿素?cái)噭蚝螅徛骷拥礁邏壕|(zhì)機(jī)中，壓力控制在800Mpa，循環(huán)兩次后將勻漿液在6000rpm，4℃離心，再將得到的沉淀加入10倍體積的50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.15mol/LNaCl，0.5%TritonX-100，1mMDTT，4mol/L尿素?cái)噭蚝?，緩慢流加到高壓均質(zhì)機(jī)中，壓力控制在800Mpa，循環(huán)兩次后將勻漿液在6000rpm，4℃離心，將最后的到的沉淀加入10倍體積的50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.15mol/LNaCl，1mMDTT，8mol/L尿素中溶解，并以高壓均質(zhì)輔助，最后在12500rpm，4℃離心15min，即可得到純化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶包涵體，同時(shí)在純化過程中分別將不加入DTT、PMSF、和尿素作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，最終得到的純化包涵體質(zhì)量和純度見表1以及SDS-PSGE見圖2。表1本發(fā)明無DTT無PMSF無尿素純度>90%<70%<70%<70%包涵體重量3.96g3.752.854.23實(shí)施例4本實(shí)施例說明重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶蛋白的復(fù)性將純化好的包涵體蛋白0.502g透析到10倍體積的50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.15mol/LNaCl，0.4mMGSSG，4mMGSH，1mMDTT，0.4ML-Arginine中4℃復(fù)性22h后將蛋白再透析至5倍體積的50mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.15mol/LNaCl，10%甘油中8h，其中換液4次，最終得到可溶的活性蛋白0.224g，因此每升發(fā)酵液可以得到1.78g谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，復(fù)性回收率為44.6%，顯然高于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的36.3%，分裝于-80℃保存后取樣品于冰浴凍融，并且進(jìn)行SDS-PAGE比對(duì)，SDS-PAGE圖顯示蛋白未發(fā)生降解，說明蛋白穩(wěn)定性良好，蛋白純度大于90%。同時(shí)在復(fù)性過程中分別將不加入DTT、GSSG/GSH、和L-Arginine作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其余按本發(fā)明操作，結(jié)果如下表2和圖3。表2本發(fā)明無DTT無GSSG/GSH無L-Arginine純度>90%<70%<70%0回收率44.6%10.1%6.05%0穩(wěn)定性澄清部分渾濁部分渾濁渾濁<110>南京工業(yè)大學(xué)<120>一種重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)方法<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ggtcgtcaacaactacatac20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2gttcgccagttccttctt18當(dāng)前第1頁1 2 3