本發(fā)明涉及1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

萜類化合物是以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單位的一類化合物，在自然界生命活動(dòng)中扮演重要的作用，眾多萜類化合物如胡蘿卜素、青蒿素(Artemisinin)、紫杉醇(Taxol)、人參皂苷(Ginsenoside)等具有重要的工業(yè)及醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值。還有一些化合物是重要的工業(yè)原料，如多萜化合物橡膠是汽車和飛機(jī)工業(yè)的重要原料。

自然界中萜類化合物大多數(shù)只是生物合成中間體，含量很低且分離純化操作復(fù)雜?；瘜W(xué)合成法工藝復(fù)雜，收率低，成本高，毒性大，大大限制了萜類化合物的應(yīng)用。隨著萜類化合物生物合成途徑的闡明，利用微生物代謝工程生產(chǎn)萜類化合物成為廉價(jià)而高效的方法。

所有萜類化合物都來(lái)自于兩種5碳前體：異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP和DMAPP通過(guò)聚合反應(yīng)產(chǎn)生不同的萜類化合物。5碳前體的合成有兩條途徑：甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP)途徑。MVA途徑主要存在于古生菌、真菌、植物的細(xì)胞液或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，MEP途徑主要存在于細(xì)菌和植物質(zhì)體中。

甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑生產(chǎn)異戊二烯的理論轉(zhuǎn)化率為25.2％，2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP)途徑生產(chǎn)異戊二烯的理論轉(zhuǎn)化率為30.2％。MEP途徑由于其具有更強(qiáng)的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)便受到了國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注并取得了顯著研究進(jìn)展。

該途徑由8步連續(xù)反應(yīng)催化，將底物丙酮酸和3-磷酸-甘油醛轉(zhuǎn)化為異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。第一步反應(yīng)是由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(Dxs)催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合生成1-脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)。該步驟是萜類物質(zhì)合成的第一個(gè)限速步驟，許多研究表明Dxs的過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)IPP&DMAPP及下游各種萜類化合物的積累，是MEP代謝途徑中最重要的遺傳操作靶位點(diǎn)。因此如何獲得性質(zhì)優(yōu)良的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶對(duì)萜類化合物的生產(chǎn)非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶及其編碼基因。

本發(fā)明所提供的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶，名稱為RsDxs，來(lái)源于類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明所提供的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的編碼基因，為如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；

3)與1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由1914個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由637個(gè)氨基酸殘基組成。

含有所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體中啟動(dòng)所述基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為araBAD啟動(dòng)子。將Rsdxs基因克隆到原核表達(dá)載體pSB1s上，得到的重組載體核苷酸序列是序列表中序列3。

所述重組菌為將所述編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌；所述編碼基因是通過(guò)所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌中的；所述宿主菌為大腸桿菌BW25113或BW25113Δpgi P_T5-idi。

擴(kuò)增所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶編碼基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述蛋白質(zhì)、所述編碼基因、所述重組載體或所述表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備萜類化合物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明以類球紅細(xì)菌總DNA為模板，用PCR擴(kuò)增獲得一個(gè)編碼1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的新基因Rsdxs。將Rsdxs基因克隆到原核表達(dá)載體pSB1s上，在大腸桿菌中進(jìn)行1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶蛋白(RsDxs)的高效表達(dá)。獲得的重組1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶蛋白可以催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，具有較高的酶活性，具有較高的應(yīng)用前景及開(kāi)發(fā)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為Rsdxs的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為重組載體pSB1s-Rsdxs的PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為基因工程菌pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI表達(dá)產(chǎn) 物的SDS-PAGE分析圖。

圖4為基因工程菌pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI的鏈孢紅素產(chǎn)物的特征吸收峰442nm峰值柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中，大腸桿菌BW25113(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry LWanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology(2006):1-11.)是一株非病原菌，遺傳背景清楚，世代時(shí)間短、容易培養(yǎng)且培養(yǎng)基原料低廉。大腸桿菌BW25113公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，CGMCC 1.1737。

本發(fā)明所提供的宿主菌，為對(duì)大腸桿菌BW25113進(jìn)行A1和A2改造得到，得到的宿主菌命名為BW25113Δpgi P_T5-idi(簡(jiǎn)稱PI)。

所述A1為將所述宿主菌的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(pgi)基因敲除(參考Huaiwei Liu,Yuanzhang Sun,Kristine Rose M.Ramos,Grace M.Nisola,Kris Nin～oG.Valdehuesa,Won–Keun Lee,Si Jae Park,Wook-Jin Chung.Combination of Entner-Doudoroff Pathway with MEP Increases Isoprene Production in Engineered Escherichia coli.PLoS ONE(2013):12.)。

所述A2為將P_T5啟動(dòng)子整合到異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(idi)基因上游，使其啟動(dòng)異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)錄過(guò)程(參考Luke Z.Yuan,Pierre E.Rouvie`re,Robert A.LaRossa,Wonchul Suh.Chromosomal promoter replacement of the isoprenoid pathway for enhancing carotenoid production in E.coli.Metabolic Engineering(2006):79–90)。

實(shí)施例1

類球紅細(xì)菌基因組DNA的提取和Rsdxs基因的PCR擴(kuò)增。采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，產(chǎn)品目錄為DP302)提取類球紅細(xì)菌基因組DNA。以提取類球紅細(xì)菌基因組總DNA作為模板，以Rsdxs-F和Rsdxs-R為引物，用高保真TransStart FastPfu DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄為AP221) PCR擴(kuò)增Rsdxs基因。引物序列如下：

Rsdxs-F：

5'GGCTAACAGGAGGAATTAACCATGGTGACCGACAGACCCTGCACGC 3'

Rsdxs-R：

5'CACTAGTACCAGATCTACCCTCGAGTCAGGCGCGGCGGGCGAGGAC 3'

PCR程序?yàn)椋?/p>

PCR擴(kuò)增得到約為1914bp的片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，泳道M為DNA Marker，泳道1和2均為Rsdxs的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。膠回收后用Gibson組裝方法(參見(jiàn)Gibson,D.G.,Young,L.,Chuang,R.Y.,Venter,J.C.,Hutchison,C.A.,3rd,Smith,H.O..Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nature methods.(2009):343-5)連接到克隆載體上，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定；測(cè)序結(jié)果表明，克隆得到的DNA序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由1914個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由637個(gè)氨基酸殘基組成。將該基因命名為Rsdxs，將其編碼的蛋白命名為RsDxs。

實(shí)施例2

構(gòu)建含有Rsdxs的重組載體。將上述步驟一得到的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段；同時(shí)用NcoI和XhoI酶切載體pSB1s。回收載體大片段；將回收的目的片段與回收的載體大片段加入Gibson反應(yīng)液中，50℃孵育1小時(shí)，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒用CaCl₂法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄為CD201)。將其均勻涂布于含鏈霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)。挑取單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，用引物pBAD-F108：CGGCGTCACACTTTGCTATG和pBAD-R124：CGTTTCACTTCTGAGTTCGGC進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示，圖2中，泳道M為DNA Marker，泳道1-5為RCR鑒定結(jié)果，從圖中可知，獲得了大小約為2200bp的擴(kuò)增片段。將PCR驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，在載體pSB1s的NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)間插入了序列表中序列1所示的Rsdxs基因片段，證明載體構(gòu)建正確，將重組載體命名為pSB1s-Rsdxs。使用相同的方法將大腸桿菌的dxs基因(GenBank登記號(hào)：6059543)，整合到載體pSB1s上，即序列3的1312-3225位替換為大腸桿菌的dxs基因，得到的重組載體命 名為pSB1s-Ecdxs。

其中，pSB1s載體特性為pSC101復(fù)制子,araBAD啟動(dòng)子,鏈霉素抗性。pSB1s-Rsdxs為阿拉伯糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體，pSB1s-Rsdxs的核苷酸序列是序列表中序列3，其中序列3的第1312-3225位為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因的編碼序列，所述1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；序列3的第86-964位為araC閱讀框，序列3的第994-1266位為araBAD啟動(dòng)子，序列3的第3361-3518位為TrrnB終止子，序列3的第3527-5581位為pSC101復(fù)制子，序列3的第5685-6473位為鏈霉素閱讀框。

實(shí)施例3

1.重組表達(dá)RsDxs蛋白的基因工程菌的構(gòu)建。用氯化鈣法進(jìn)行載體轉(zhuǎn)化，將重組載體pSB1s-Rsdxs和載體pLY036(其特性為p15A復(fù)制子,tac啟動(dòng)子,氯霉素抗性,含有菌株Anabaena sp的crtEB基因,菌株Rhodobacter sphaeroides的crtI基因,菌株E.coli的idi基因，可將前體IPP&DMAPP轉(zhuǎn)化為鏈孢紅素，公開(kāi)于專利2014101671944高生物量和/或高生長(zhǎng)速度重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用)導(dǎo)入受體菌PI，得到的產(chǎn)鏈孢紅素重組菌命名為pSB1s-Rsdxs036/PI。將載體pSB1s和載體pLY036導(dǎo)入受體菌PI，得到的產(chǎn)鏈孢紅素重組菌命名為pSB1s036/PI。將載體pSB1s-Ecdxs和載體pLY036導(dǎo)入受體菌PI，得到的產(chǎn)鏈孢紅素重組菌命名為pSB1s-Ecdxs036/PI。

2.RsDxs蛋白的表達(dá)。使用LB培養(yǎng)基，對(duì)pSB1s036/PI、pSB1s-Ecdxs036/PI和

pSB1s-Rsdxs036/PI進(jìn)行鏈霉素和氯霉素雙抗性篩選培養(yǎng)，挑取單菌落37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜以獲得飽和培養(yǎng)，1％接種于含鏈霉素(50g/ml)和氯霉素(17g/ml)雙抗性的ZYM-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含終濃度0.2％的阿拉伯糖)中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)后，離心收集菌體，制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

結(jié)果如圖3，泳道M為Page Ruler；泳道1，4，7分別為pSB1s036/PI的全細(xì)胞、細(xì)胞破碎上清和細(xì)胞破碎沉淀；泳道2，5，8分別為pSB1s-Ecdxs036/PI的全細(xì)胞、細(xì)胞破碎上清和細(xì)胞破碎沉淀；泳道3，6，9分別為pSB1s-Rsdxs036/PI的全細(xì)胞、細(xì)胞破碎上清和細(xì)胞破碎沉淀。RsDxs在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，表達(dá)量大，且蛋白多以可溶的形式表達(dá)，大小約65kDa。同時(shí)以重組菌pSB1s036/PI以及重組表達(dá)大腸桿菌EcDxs的工程菌pSB1s-Ecdxs036/PI作為對(duì)照，對(duì)照菌pSB1s036/PI中沒(méi)有得到目的蛋白，

pSB1s-Ecdxs036/PI中有大小約為70kD的EcDxs的表達(dá)蛋白。

其中，含有鏈霉素和氯霉素雙抗性的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E+1mL F(以下均為質(zhì)量百分比濃度)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；

D.1M MgSO₄；

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM；

F.20％阿拉伯糖。

實(shí)施例4

對(duì)類球紅細(xì)菌RsDxs蛋白的酶活性與大腸桿菌EcDxs蛋白的酶活性進(jìn)行比較。將過(guò)夜培養(yǎng)的工程菌株pSB1s036/PI，pSB1s-Ecdxs036/PI和pSB1s-Rsdxs036/PI按1％接種量接種于含5ml ZYM-5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)到OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導(dǎo)16小時(shí)后，取出1mL培養(yǎng)液留待測(cè)試。在剩余的4mL培養(yǎng)液中加入500μL的40％葡萄糖和500μL的10×PBS進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。分別測(cè)定轉(zhuǎn)化0小時(shí)和24小時(shí)的OD₆₀₀，并取含1×10⁸cfu細(xì)胞的培養(yǎng)液離心收集菌體，用雙蒸水洗滌一次，于菌體中加入1ml丙酮，于冰上萃取2h，12000rpm/min離心10min，取上清液得到待測(cè)樣品，進(jìn)行掃描340-550nm波長(zhǎng)掃描，讀取特征吸收峰442nm的峰值。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

結(jié)果如圖4所示，pSB1s-Rsdxs036/PI的鏈孢紅素產(chǎn)量為pSB1s-Ecdxs036/PI的1.8倍，即RsDxs蛋白具有較EcDxs更強(qiáng)的酶活性。

其中，10×PBS(pH7.4)的配方如下：

磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄)：14.4g；磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)：2.4g；氯化鈉(NaCl)：80g；氯化鉀(KCl)：2g。溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L。