本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種戊型肝炎病毒毒株在體外成功純化并提高病毒純度的新方法。

背景技術(shù)：

戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是一種經(jīng)腸道傳播的病毒性肝炎病原體，可以跨種間感染人和多種動(dòng)物。HEV為無(wú)囊膜單股正鏈RNA病毒，球型病毒顆粒大小為27～34nm，表面有突起和缺刻，內(nèi)部密度不均勻，基因組全長(zhǎng)約為7.3 kb，由3個(gè)開(kāi)放閱讀框組成。全球HEV主要有4種基因型，在中國(guó)主要以IV型HEV毒株常見(jiàn)。HEV傳播途徑主要經(jīng)糞-口途徑，也可通過(guò)其他途徑傳播，包括血液傳播，接觸傳播，垂直傳播，以及器官移植進(jìn)行傳播。

HEV是導(dǎo)致許多發(fā)展中國(guó)家戊型肝炎暴發(fā)性流行的病原體，HEV感染后，一般患者在4-6周內(nèi)自愈，免疫缺陷病人及老年人易發(fā)展成為慢性肝炎。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年大約有2010萬(wàn)人感染HEV，造成70萬(wàn)人死亡和3000胎兒宮內(nèi)死亡，感染HEV的非孕婦和孕婦患者死亡率分別為1.9%和19.8%孕婦感染HEV，發(fā)病率高，病情嚴(yán)重，尤其以妊娠晚期最為嚴(yán)重，病死率可高達(dá)25%，常發(fā)生胎兒早產(chǎn)，流產(chǎn)，死胎及孕婦產(chǎn)后急性肝壞死等癥狀。戊型肝炎的防控形勢(shì)已經(jīng)迫在眉睫，發(fā)展有效的戊型肝炎疫苗已成為關(guān)系公眾健康的急為緊迫的問(wèn)題，而在這一過(guò)程中病毒培養(yǎng)至關(guān)重要。

病毒純化是指利用物理、化學(xué)的方法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃縮的病毒樣品。病毒提純是病毒學(xué)研究的重要前提，且病毒微細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究、病毒抗原蛋白的分離提純、病毒化學(xué)成分及其遺傳物質(zhì)的研究都需要高純度的病毒樣品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種戊型肝炎病毒（HEV）在體外純化的方法，該方法通過(guò)添加含有甲基纖維素的胎牛血清對(duì)較高滴度的HEV毒株維持在體外的細(xì)胞層面上，能夠使細(xì)胞發(fā)生病變，從而挑選出單個(gè)的戊肝病毒顆粒，為后續(xù)研發(fā)戊肝疫苗，深入研究HEV生物學(xué)、免疫學(xué)特性及致病性提供必不可少的前提。

本發(fā)明戊型肝炎病毒體外純化方法，采用如下步驟進(jìn)行：

（1）將HEV病毒溶液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后，經(jīng)Real-time qPCR測(cè)定其病毒拷貝數(shù)為2×10⁵～2×10⁶拷貝數(shù)/mL，加入400U/mL青霉素和1000U/mL鏈霉素4℃處理1h，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）將HepG2細(xì)胞按1×10⁴/孔接種至96孔板中，用含質(zhì)量百分比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞長(zhǎng)成單層；

（3）取100μL步驟（1）的HEV病毒懸液利用DMEM依次稀釋至10^-11，按每孔100μL接種至單層細(xì)胞中，置37℃孵育2小時(shí)，每15min 輕微搖勻一次，使病毒充分吸附到細(xì)胞上；棄上清，1×PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有質(zhì)量百分比1%甲基纖維素、質(zhì)量百分比2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

（4）待HepG2細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，利用噬斑法挑取病變的細(xì)胞，溶于150μL DMEM，取100μL病毒液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)HEV，剩余50μL于-80℃保存待用；

HEV檢測(cè)引物：

外套上游引物(P1): 5′-AATTATGCYCAGTAYCGRGTTG-3′ ；外套下游引物 (P2): 5′-CCCTTRTCYTGCTGMGCATTCTC-3′；

內(nèi)套上游引物(P3): 5′-GTWATGCTYTGCATWCATGGCT-3′；內(nèi)套下游引物(P4): 5′-AGCCGACGAAATCAATTCTGTC-3′；

逆轉(zhuǎn)錄程序：42℃，60min；72℃，10min；PCR程序：94℃，3 min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，30s；35個(gè)循環(huán)。總延伸72℃，2 min；

（5）檢測(cè)為陽(yáng)性病毒克隆剩余的50μL接種至鋪有單層HepG2細(xì)胞層的96孔板內(nèi)；

（6）待細(xì)胞發(fā)生病變后，按步驟（4）挑取病變細(xì)胞；

（7）重復(fù)步驟（4）、（5）兩次；

（8）蝕斑純化三輪后的HEV病毒液檢測(cè)其中是否存在腸道病毒（A群、B群和C群）的污染。

目前全世界僅有少數(shù)幾株HEV毒株可以進(jìn)行體外培養(yǎng)，因此尚無(wú)戊肝病毒純化的報(bào)道。本發(fā)明采用戊型肝炎病毒在HepG2細(xì)胞中培養(yǎng)，添加甲基纖維素起到半固定作用，防止病毒液向四周擴(kuò)散，使發(fā)生病變的細(xì)胞形成清晰的病毒蝕斑，便于挑取，純化。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明中使用的HepG₂細(xì)胞感染HEV的示意圖；其中A圖為正常HepG₂細(xì)胞，B圖為HEV（稀釋倍數(shù)為10^-1）感染2天后的HepG₂細(xì)胞，C圖為HepG₂細(xì)胞感染HEV的電鏡照片；

圖2是本發(fā)明中利用RT-nPCR法檢測(cè)第一輪挑取蝕斑HEV RNA的部分樣品檢測(cè)結(jié)果電泳示意圖；

圖3為部分HEV陽(yáng)性蝕斑是否存在腸道病毒A、B、C群污染的檢測(cè)結(jié)果電泳示意圖；

圖4為本發(fā)明中利用RT-nPCR法檢測(cè)接種人HEV挑取的蝕斑中HEV RNA檢測(cè)的部分PCR產(chǎn)物電泳示意圖；

圖5為部分人HEV陽(yáng)性蝕斑是否存在腸道病毒A、B、C群污染的檢測(cè)結(jié)果電泳示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容；實(shí)施例中主要采用常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)方法，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。按照以下實(shí)施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實(shí)施本發(fā)明，這些修改和變換均落在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)，實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明的百分比均為質(zhì)量百分比。

實(shí)施例1：

1、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

自液氮中取出HepG2細(xì)胞（購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)ATCC，編號(hào)CCL–185）迅速放入37℃的溫水中，使細(xì)胞懸液快速融化；然后加入含有10％胎牛血清DMEM（購(gòu)買(mǎi)于GIBCO Invitrogen Corporation公司）培養(yǎng)液，調(diào)pH至7.2于37℃培養(yǎng)4h左右，棄去全部培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)成致密單層后，用PBS（購(gòu)買(mǎi)于GIBCO Invitrogen Corporation公司）洗細(xì)胞，胰酶–EDTA（購(gòu)買(mǎi)于GIBCO Invitrogen Corporation公司）消化，加入上述培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，如圖1A正常HepG2細(xì)胞所示。

2、HEV接種HepG2細(xì)胞并維持培養(yǎng)

（1）將分離的HEV陽(yáng)性糞便制備重量體積比10% 的PBS（pH7.4）糞便懸液，劇烈震蕩，使糞便乳化，經(jīng)4℃，12000g離心10min，收集上清，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，加入病毒溶液體積2%的雙抗溶液（400U/mL青霉素和1000U/mL鏈霉素），4℃處理1h，-80℃保存?zhèn)溆?，?jīng)Real-time qPCR測(cè)定其病毒拷貝數(shù)為2×10⁶拷貝數(shù)/mL；

分離自中國(guó)云南昆明市HEV RNA陽(yáng)性豬糞便樣品，基因型為4型，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為 No.JF747598；

（2）將步驟1中細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）按1×10⁴/孔接種至96孔板中，用質(zhì)量百分比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層的70~80%，棄上清培養(yǎng)基，如圖1A所示，每孔加入100μL HEV病毒稀釋液（10^-1-10^-11），置37℃孵育2小時(shí)，每隔15min 輕微搖晃一次，使病毒充分吸附到細(xì)胞上，同時(shí)添加終濃度為0.01mM MgCl₂增加病毒的吸附能力；棄上清，1×PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有質(zhì)量百分比1%甲基纖維素、質(zhì)量百分比2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；HEV感染2天后稀釋倍數(shù)為10^-1孔板內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生病變（如圖1B所示），利用噬斑法挑取病毒顆粒，溶于150 μL DMEM溶液中，收獲病毒。

3、對(duì)應(yīng)用上述培養(yǎng)方法獲得的HEV病毒進(jìn)行以下系統(tǒng)鑒定：①運(yùn)用RT-nPCR檢測(cè)挑取蝕斑中是否存在陽(yáng)性HEV顆粒（參見(jiàn)圖2），并且篩選出未被腸道病毒污染的病毒顆粒（參見(jiàn)圖3）；

取100μL上述挑取的蝕斑病毒液，利用Trizol法提取總RNA，經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2℃，60min；72℃，10min。取5μl cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，各加入1μl HEV檢測(cè)引物，按照下述PCR程序檢測(cè)HEV RNA，剩余50μL于-80℃保存待用；

HEV檢測(cè)引物：

外套上游引物(P1): 5′-AATTATGCYCAGTAYCGRGTTG-3′ ；外套下游引物 (P2): 5′-CCCTTRTCYTGCTGMGCATTCTC-3′；

內(nèi)套上游引物(P3): 5′-GTWATGCTYTGCATWCATGGCT-3′；內(nèi)套下游引物(P4): 5′-AGCCGACGAAATCAATTCTGTC-3′；nPCR程序?yàn)椋?4℃，3 min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，30s；35個(gè)循環(huán)，總延伸72℃，2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA marker作為參考，出現(xiàn)348 bp目的條帶的蝕斑判定為陽(yáng)性，同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

將檢測(cè)為HEV RNA陽(yáng)性的病毒液對(duì)應(yīng)的50μL接種至長(zhǎng)成單層HepG2細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，待細(xì)胞發(fā)生病變后，挑取病變細(xì)胞并檢測(cè)；重復(fù)上述步驟蝕斑純化病毒兩次；蝕斑純化三輪后仍為HEV陽(yáng)性的病毒液檢測(cè)是否存在腸道病毒的污染；

表1. 腸道病毒檢測(cè)引物

②利用電鏡觀察，確認(rèn)在HepG2細(xì)胞形成的蝕斑中存在HEV子代病毒（參見(jiàn)圖1C HEV電鏡照片，箭頭所示）；總之，從感染HEV的HepG2細(xì)胞發(fā)生明顯細(xì)胞病變、挑取蝕斑中HEV RNA陽(yáng)性、電鏡觀察到蝕斑挑取的病毒顆粒中存在HEV子代病毒等方面對(duì)蝕斑純化的HEV進(jìn)行了不同層次的鑒定；結(jié)果證實(shí)，噬斑法可應(yīng)用于HEV的純化。

采用本實(shí)施例方法對(duì)分離自中國(guó)云南昆明市HEV RNA陽(yáng)性豬糞便樣品的一株HEV病毒，基因型為4型，GenBank No.JF747598的純化；該毒株能在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)上清中未經(jīng)濃縮的病毒滴度達(dá)2×10⁶基因拷貝數(shù)/mL，病毒在-80℃冰箱保存6年生物活性不變，仍能感染豬和恒河猴。

實(shí)施例2：

1、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

自液氮中取出HepG2細(xì)胞（購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)ATCC，編號(hào)CCL–185）迅速放入37℃的溫水中，使細(xì)胞懸液快速融化；然后加入含有10％胎牛血清DMEM（購(gòu)買(mǎi)于GIBCO Invitrogen Corporation公司）培養(yǎng)液，調(diào)pH至7.2于37℃培養(yǎng)4h左右，棄去全部培養(yǎng)液，加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)成致密單層后，用PBS（購(gòu)買(mǎi)于GIBCO Invitrogen Corporation公司）洗細(xì)胞，胰酶–EDTA（購(gòu)買(mǎi)于GIBCO Invitrogen Corporation公司）消化，加入上述培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2、HEV接種HepG2細(xì)胞并維持培養(yǎng)

（1）經(jīng)ELISA檢測(cè)IgM陽(yáng)性，且RT-PCR檢測(cè)HEV RNA陽(yáng)性的人血清，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

毒株為分離自中國(guó)云南昆明市HEV RNA陽(yáng)性血清樣品，基因型為4型，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為KR872417。

（2）將步驟（1）中細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）按1×10⁴/孔接種至96孔板中，用質(zhì)量百分比10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層的70~80%，棄上清培養(yǎng)基，每孔加入100μL HEV病毒稀釋液（10^-1），置37℃孵育2小時(shí)，每隔15min 輕微搖晃一次，使病毒充分吸附到細(xì)胞上，同時(shí)添加終濃度為0.01mM MgCl₂增加病毒的吸附能力；棄上清，1×PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有質(zhì)量百分比1.5%甲基纖維素、質(zhì)量百分比2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；維持5d后細(xì)胞發(fā)生病變后收獲病毒。

（3）將RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的毒株擴(kuò)大培養(yǎng)。

3、對(duì)應(yīng)用上述培養(yǎng)方法獲得的HEV病毒進(jìn)行以下系統(tǒng)鑒定：

運(yùn)用RT-nPCR檢測(cè)挑取蝕斑中是否存在陽(yáng)性病毒（參見(jiàn)圖4），并且篩選出未被腸道病毒污染的病毒顆粒（參見(jiàn)圖 5）；

取100μL上述挑取的蝕斑病毒液，利用Trizol法提取總RNA，經(jīng)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2℃，60min；72℃，10min。取5μL cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，各加入1μLHEV檢測(cè)引物，按照下述PCR程序檢測(cè)HEV RNA，剩余50μL于-80℃保存待用；

HEV檢測(cè)引物、nPCR程序同實(shí)施例1；

將檢測(cè)為HEV RNA陽(yáng)性的病毒液對(duì)應(yīng)的50μL接種至長(zhǎng)成單層HepG2細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，待細(xì)胞發(fā)生病變后，挑取病變細(xì)胞并檢測(cè)；重復(fù)上述步驟蝕斑純化病毒兩次；蝕斑純化三輪后仍為HEV陽(yáng)性的病毒液檢測(cè)是否存在腸道病毒的污染；腸道病毒檢測(cè)引物如表1，PCR程序同實(shí)施例1。

采用本實(shí)施例方法對(duì)分離自中國(guó)云南昆明市HEV RNA陽(yáng)性人血清樣品的一株HEV病毒，基因型為4型，GenBank No. KR872417的純化；該毒株能在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)上清中未經(jīng)濃縮的病毒滴度達(dá)2×10⁶基因拷貝數(shù)/mL，病毒在-80℃冰箱保存2年生物活性不變，仍能感染豬和恒河猴。