本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及藥品和生物制品(包括基因工程制品)中熱原的檢測，具體一種用于檢測熱原的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法及細(xì)胞模型及檢測熱原的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

1.1熱原概述

眾所周知，在臨床治療中使用注射類藥物或醫(yī)療器材時往往導(dǎo)致患者出現(xiàn)發(fā)冷、寒戰(zhàn)、惡心、發(fā)熱、嘔吐、頭痛、白細(xì)胞下降、血管通透性增強(qiáng)、昏迷、休克等不良反應(yīng)而加重病情，不僅增加了患者的痛苦，影響搶救和治療的效果，甚至可能危及病人生命。1875年，Burdon-Sanderson(李增宏，王瑞東.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2007,25(3):43-45)研究表明，在腐敗的肉中分離出不帶活菌的物質(zhì)，其能引起上述一系列不良反應(yīng)的，稱其為熱原(Pyrogen)，并將上述一系列癥狀定義為熱原反應(yīng)。此后，隨著科學(xué)研究的深入發(fā)展，熱原也有了更為確切的定義，指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。1923年，Seibert肯定了熱原由微生物所產(chǎn)生，具有耐熱性、不揮發(fā)性、水溶性、濾過性和吸附性的特點(diǎn)，不易被截留，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，雖然經(jīng)過嚴(yán)格滅菌，但仍不能排除熱原反應(yīng)的發(fā)生。熱原可分為外源性熱原與內(nèi)源性熱原兩類，外源性熱原主要革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素和革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸，內(nèi)源性熱原主要包括機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子(如TNF-α，INF-β，IL-1，生長因子)，及激素(如類固醇、前列腺素)等。而通常我們通常所指的“熱原”，主要指細(xì)菌性熱原，它是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。其中致熱能力最強(qiáng)的是革蘭陰性G^-桿菌桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性G⁺桿菌類，革蘭陽性G⁺球菌則較弱，霉菌、酵母菌甚至病毒也能產(chǎn)生熱原(Charles A,Dinarello.Endotoxin Research,2004,10:201)。

細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotoxin)屬于外源性熱原，是革蘭氏陰性G^-菌細(xì)胞壁外壁層上的特有結(jié)構(gòu)，是磷脂、脂多糖(Lipopolysaceharide,LPS)與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物。LPS是復(fù)合物的主要成分及活性中心，致熱作用最強(qiáng)，但其化學(xué)組成因菌種不同而有所差異，分子量為5×10⁴～5×10⁵，分子量越大致熱作用則越強(qiáng)。細(xì)菌內(nèi)毒素不是細(xì)菌本身或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才 釋放出來的一種具有生物活性的毒性物質(zhì)，并且不能用普通滅菌方法清除，是迄今發(fā)現(xiàn)生物活性最為廣泛的物質(zhì)之一(劉宣亞.明膠科學(xué)與技術(shù),2013,33(1):45-48)。當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素通過消化系統(tǒng)進(jìn)入人體時，并不產(chǎn)生危害，但細(xì)菌內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入血液時，則會引起不同的疾病，最為典型的是熱原反應(yīng)。進(jìn)入人機(jī)體的細(xì)菌內(nèi)毒素不僅可直接對細(xì)胞生物膜產(chǎn)生毒性，而且可通過單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子及炎癥因子合成和釋放，過度表達(dá)的炎癥遞質(zhì)以自分泌、旁分泌或內(nèi)分泌方式作用于單核-巨噬細(xì)胞膜上的受體，進(jìn)一步激活炎癥遞質(zhì)的表達(dá)(Guha M,Mackman N.Cell Signal,2001,13(2):85-94.)。這些炎癥因子的失控性釋放影響細(xì)胞功能的完整性，造成機(jī)體代謝紊亂，血液凝固性升高，組織血液灌注不足，嚴(yán)重時造成多器官功能衰竭而死亡(Hotchkiss RS,Karl IE.N Engl J Med,2003,348(2):138-150.)。隨著藥品與醫(yī)療管理部門對臨床熱原反應(yīng)的重視程度日益加強(qiáng)，由于革蘭氏陰性菌的分布范圍極為廣泛，故對藥品及醫(yī)療器械中致熱原的檢測也成為了人們近期研究的焦點(diǎn)。

1.2現(xiàn)有主要熱原檢測方法及其局限性

對于熱原的檢測，目前我國藥典收錄的方法有家兔熱原試驗法和鱟試劑內(nèi)毒素檢測法，第七版歐洲藥典(2011版)還收錄了熱原檢查的第三種新方法--單核細(xì)胞激活檢查法。

家兔熱原試驗法。由于家兔對熱原的反應(yīng)與人基本相似，家兔法為各國藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法。將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。

家兔法仍然存在著許多局限性。首先，家兔法不能定量，無法標(biāo)準(zhǔn)化，靈敏性和重復(fù)性差，而且家兔對熱原的敏感性存在著個體差異，不同個體對熱原的敏感性相差10倍以上。其次，某些類型的藥品會干擾檢測結(jié)果，如一些解熱鎮(zhèn)痛藥、細(xì)胞毒性藥物或一些容易影響體溫中樞的藥品，不能夠使用家兔法。另外，許多已經(jīng)通過家兔熱原檢測的制品在臨床上仍然會發(fā)生熱原反應(yīng)。在細(xì)胞工程技術(shù)、新生物材料以及中藥制品發(fā)展迅猛、日新月異的今天，家兔法已不能完全代表人體的發(fā)熱反應(yīng)，其操作繁瑣費(fèi)時，不能用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控，且有些藥物不適用。

鱟試劑內(nèi)毒素檢測法。美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產(chǎn)生凝膠，美國、英國、歐洲、日本和中國藥典目前均收載了這一檢查法。鱟試劑內(nèi)毒素檢測法 系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。鱟試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為0.015EU/mL，比家兔法靈敏，操作簡單易行，試驗費(fèi)用低，結(jié)果迅速可靠，適用于注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細(xì)胞毒性藥物制劑。

但鱟試劑法受環(huán)境因素影響較大，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。且對于本身帶有顏色的制劑無法進(jìn)行檢測。鱟試劑法實際能夠檢測到的僅僅是內(nèi)毒素對鱟血細(xì)胞的凝集活性，而不是內(nèi)毒素對人體的發(fā)熱活性或化學(xué)概念上的含量，而且無法檢測除內(nèi)毒素以外的其他致熱源。該方法對一些酶抑制劑、鈣鎂離子鰲合劑也無法檢測，因此鱟試驗還無法完全取代家兔熱原試驗。我國制作鱟試劑的中華鱟是一種比恐龍還早的物種，近年由于填海造地，漁業(yè)活動，中華鱟面臨滅絕的危險。故根據(jù)實驗動物學(xué)的"3Rs原則"即減少(Reduction)、優(yōu)化(Refinement)和替代(Replacement)，對鱟試劑替代方法的研究迫在眉睫。

單核細(xì)胞激活檢查法。除了家兔法和鱟試劑法，第七版歐洲藥典(2011版)已收錄了熱原檢查的第三種新方法--單核細(xì)胞激活檢查法(monocyte activation test，MAT)。其原理是將人的全血與供試品一同孵育培養(yǎng)，根據(jù)血液中單核細(xì)胞釋放出的IL-6、IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子的量來評價供試品中熱原的活性。MAT可以檢測出熱原和促炎癥因子污染物，包括革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素及非內(nèi)毒素來源的污染物，包括來自于革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、病毒、真菌的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和制品相關(guān)的以及加工工藝相關(guān)的生物或者化學(xué)實體。而單核細(xì)胞激活檢查法也存在一定的局限性，不同來源的人血分離出的單核細(xì)胞反應(yīng)性可能不太一樣，另外新鮮的人血不易大批量獲得。所以這個方法除了不容易普及外還具有穩(wěn)定性差的缺陷。

由此可見應(yīng)用新的基因工程制備的體外熱原檢測方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法是該領(lǐng)域發(fā)展的國際大趨勢。對于熱原檢測的研究，正向著細(xì)胞和分子水平層面發(fā)展。我國對于這方面的研究尚處于初級階段，還沒有用于熱原檢測的細(xì)胞模型收錄入藥典。但可以預(yù)見的是應(yīng)用細(xì)胞模型檢測熱原已經(jīng)成為研究者的主要關(guān)注焦點(diǎn)，方法的簡易性與高效性成為研究的必然趨勢。

1.3熱原相關(guān)受體及信號通路

近年來，對革蘭氏陰性菌G-菌引起內(nèi)毒素反應(yīng)的的機(jī)制已有更為深入的了解，同時也認(rèn)識到LPS在激活機(jī)體免疫反應(yīng)應(yīng)答及導(dǎo)致熱原反應(yīng)過程中起主導(dǎo)用。LPS在多種病原體存在某些高度保守的病原結(jié)構(gòu)，這些保守的病原結(jié)構(gòu)形 式被稱作病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMP)。Toll樣家族受體作為先天性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，其作用被認(rèn)為與結(jié)構(gòu)識別受體(Pattern-recognition receptors,PRRs)相似，主要通過識別病原微生物表面的PAMP來啟動免疫反應(yīng)，進(jìn)而清除外來抗原。

在LPS所致的炎癥信號傳導(dǎo)通路中，有以下四種起關(guān)鍵作用的受體：脂多糖結(jié)合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)、Toll樣受體4(Toll like receptor-4,TLR4)、髓樣分化蛋白2(Myeloid differentiation protein-2,MD2)及白細(xì)胞分化抗原14(Monocyte differentiation antigen 14,CD14)。

LBP是一種廣泛存在于人和動物血清中的糖蛋白，嚴(yán)格來說，LPS結(jié)合蛋白并不是LPS的結(jié)合受體，但LPS介導(dǎo)細(xì)胞激活需要血漿或細(xì)胞表面能夠和LPS結(jié)合的蛋白參與，是LPS發(fā)揮生物學(xué)作用的重要載體。它對于細(xì)菌內(nèi)毒素及LPS中的類脂A具有很高的親和力。LBP與LPS結(jié)合，形成復(fù)合物并LPS傳遞給細(xì)胞膜上的CD14受體，結(jié)合TLR4-MD2復(fù)合物，通過一系列跨膜、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程使靶細(xì)胞活化并釋放炎癥前細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子。

TLR4屬于TLRs家族(Toll like receptors)成員，目前，人類相繼發(fā)現(xiàn)了10種TLRs家族的蛋白，分別命名為TLR1-10(Lemaitre B,Nicolas E,Miehaut L et a1.Cell,1996,86(6):973-983；HuangB.Zhao J.Unkeless J C et a1.Oneogene，2008,27(2)：218-224；劉興，馮文莉，康格非.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,2001,22(3):134-136；T Kawai,S Akira.Cell Death and Differentiation,2006,13:816-825)。不同的TLRs轉(zhuǎn)導(dǎo)信號由不同來源的微生物所刺激。所以不同TLR可以在一定程度上識別并區(qū)分入侵機(jī)體的病原體類型。在TLRs家族成員中，目前研究得最多的為TLR4、TLR2在機(jī)體先天免疫中的作用，其中又以TLR4在LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的機(jī)制研究的最為廣泛深入(秦玉新，張慶柱.中國藥理學(xué)通報,2003,19(12):1336-1339；Li-Yun Huang,James L.DuMontelle,et al.Clinlcal Microbiology,2009,47:3427-3434)。TLR4是炎癥反應(yīng)中最重要的一類模式識別受體，能夠特異性識別微生物進(jìn)化過程中的一些保守序列(如LPS)。TLR4是LPS誘導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最主要受體，主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞上，如外周血白細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、朗罕氏細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，其中以在骨髓單核細(xì)胞中表達(dá)最多(Medzhitov R,Preston Hurlburt P,Janeway Jr.CA.Nature,1997,388:394-79)。

MD2是一種分泌蛋白，利用表達(dá)TLR4和MD2的轉(zhuǎn)染子做免疫沉淀實驗證實，MD2伴隨TLR4表達(dá)，并分泌至細(xì)胞表面，通過物理作用于TLR4錨定 在細(xì)胞膜上。MD2有助于TLR4識別LPS，并將LPS鎖定在TLR4上的結(jié)合位點(diǎn)，對TLR4的向胞膜轉(zhuǎn)移和表達(dá)起到至關(guān)重要的作用；研究發(fā)現(xiàn)缺乏了MD2分子，TLR4對LPS的反應(yīng)性極低(Miyake K，R.Shimazu,J.Kondo,et al.Immunol.1998,161:1348-1353；Pugin J,Stem Voeffray S,Daubeuf B.Blood.2004,104(13):4071-4079；劉亞偉，劉靖華，唐靖，等.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,26(8):1101-1105；鐘田雨，劉靖華，姜勇.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2007,34(5):460-464)。

CD14是一種在胞漿和白細(xì)胞表面作為葡萄糖磷脂酞肌醇連接蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)，與LPS具有較高的親和力，但CD14分子缺乏胞漿區(qū)段，不能直接向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)LPS信號。LPS與CD14結(jié)合后，首先形成LPS-LBP-CD14配體和輔助因子復(fù)合物，然后再與TLR4結(jié)合，將信號傳遞進(jìn)入細(xì)胞(Saitoh S,Akashi S,Yamada T,et al.Endotoxin Res,2004,10(4):257-260；Nagai Y,Akashi S,Nagafuku M,et al.Nat Immunol,2002,3(7):667-672；Zielger,Heitbrock HWL and Ulevitch RJ.Immunol Today,1993,14(3):121-125)。

當(dāng)細(xì)菌侵入機(jī)體后，LPS由細(xì)菌裂解釋放入血，可以與血漿中游離的脂多糖結(jié)合蛋白LBP結(jié)合形成復(fù)合物，與CD14分子結(jié)合或直接與TLR4的附屬蛋白即髓樣分化蛋白MD2相結(jié)合，形成LPS-MD2/TLR4復(fù)合物，在這些分子的輔助下激活TLR4。

1.4CRISPR/CAS9系統(tǒng)的基本原理

CRISPR/Cas9(The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)and CRISPR Associated(Cas)system)是一種能快速、方便有效地靶向人類基因組任何基因的新方法。CRISPRs是一類廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)，指的是成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats)，這是細(xì)菌的適應(yīng)性免疫保護(hù)機(jī)制，是為了對付噬菌體(bacteriophages)病毒而進(jìn)化出的一種DNA片段。細(xì)菌表達(dá)Cas9蛋白，同時會轉(zhuǎn)錄出CRISPR RNA，這種RNA能夠與病毒的基因組互補(bǔ)配對。這種Cas9復(fù)合物就可以切割病毒的基因組，使病毒失活。研究表明，CRISPR與一系列相關(guān)蛋白、前導(dǎo)序列一起，能為原核生物提供對抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力。CRISPR-Cas9技術(shù)是利用一段與靶序列相同的單導(dǎo)向RNA(sgRNA)來引導(dǎo)Cas9核酸酶對特異靶向DNA進(jìn)行識別和切割，造成DNA的雙鏈或單鏈斷裂，然后，細(xì)胞會利用自身具備的兩種修復(fù)機(jī)制對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，即非同源性末端接合(NHEJ)或同源介導(dǎo)修復(fù)(HDR)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)為基因工程提供了一個強(qiáng)有力的應(yīng)用新工具，它將給基因組定向編輯的研究和應(yīng)用領(lǐng)域帶來突破性的技術(shù)革命，特別是在基因功能解析、人類疾病靶向治療等應(yīng)用中有巨大的潛力和廣闊的前景。更令人鼓舞的是，其操作簡單、實驗周期短、節(jié)約成本，有利于在普通實驗室推廣這一技術(shù)，因此，CRISPR/Cas系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用將對生物學(xué)研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯，將有助于人們更好地了解基因的功能。

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌引起熱原反應(yīng)的主要成分，是嚴(yán)重威脅藥品安全的關(guān)鍵因素，因此建立一種更合理、更適宜的熱原檢測方法就顯得尤為迫切。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測熱原的細(xì)胞模型，該細(xì)胞模型可用于藥品生物制品包括基因工程藥品的熱原檢測。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述用于檢測熱原的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種用于檢測熱原的試劑盒，該試劑盒中含有上述細(xì)胞模型。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種用于檢測熱原的方法，該方法使用上述試劑盒進(jìn)行檢測。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種用于檢測熱原的細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)將TLR4基因組裝到可表達(dá)綠色熒光的表達(dá)載體中，構(gòu)建含有TLR4基因的重組質(zhì)粒；

2)采用CRISPR/CAS9法將TLR4基因定點(diǎn)敲入細(xì)胞系一染色體上的一基因的內(nèi)含子中，獲得一穩(wěn)定表達(dá)TLR4基因的細(xì)胞系；

3)使用兩個不同的2A肽將CD14、MD2和紅色熒光RFP基因結(jié)構(gòu)隔開構(gòu)建含有CD14基因和MD2基因并可表達(dá)紅色熒光的重組質(zhì)粒；

4)采用CRISPR/CAS9法將CD14基因和MD2基因定點(diǎn)敲入步驟2)所獲得的細(xì)胞系的敲入該TLR4基因的染色體以外的另一染色體上的一基因的內(nèi)含子中，獲得一可穩(wěn)定表達(dá)TLR4基因、CD14基因和MD2基因，并可同時表達(dá)綠色熒光和紅色熒光的細(xì)胞株，即為所述的細(xì)胞模型。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞系為HEK293T、HEK293或NIH3T3。

更進(jìn)一步地，所述步驟2)中敲入TLR4基因的位置為第十九號染色體 PPR1R12C基因第一位內(nèi)含子。

更進(jìn)一步地，所述步驟4)中敲入CD14基因和MD2基因的位置為第三號染色體CCR5基因第一位內(nèi)含子。

本發(fā)明還提供一種采用上述的構(gòu)建方法構(gòu)建的細(xì)胞模型，所述細(xì)胞模型是在細(xì)胞系HEK 293T的十九號染色體PPR1R12C基因第一位內(nèi)含子內(nèi)定點(diǎn)敲入TLR4基因，在三號染色體CCR5基因第一位內(nèi)含子內(nèi)定點(diǎn)敲入CD14基因和MD2基因。

其中，所述細(xì)胞模型的分類名稱為人源胚胎腎細(xì)胞(HEK)變種293T/TLR4/CD14/MD2，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2016年05月19日，保藏編號：CGMCC No.12296。

本發(fā)明還提供一種用于檢測熱原的試劑盒，包括如下組成：1)如上述的構(gòu)建方法構(gòu)建的細(xì)胞模型，或上述的細(xì)胞模型，2)熱原標(biāo)準(zhǔn)品，3)IL6和/或TNFα對照品。

優(yōu)選地，所述熱原標(biāo)準(zhǔn)品為LPS凍干粉，IL6對照品為IL6凍干粉，TNFα對照品為TNFα凍干粉。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于檢測熱原的方法，包括如下步驟：

1)制備待測樣品溶液和熱原標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

2)將上述待測樣品溶液加入到含有采用上述的構(gòu)建方法構(gòu)建的細(xì)胞模型，或上述的細(xì)胞模型的培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)5h；

3)收集培養(yǎng)后的上清液檢測其中IL-6和/或TNF-α的含量。

優(yōu)選地：步驟3)所述檢測IL-6和/或TNF-α的含量的方法采用Western Blot、ELISA、金標(biāo)法或質(zhì)譜法。

本發(fā)明采用CRISPR/CAS9方法在細(xì)胞中敲入3個基因，其中有兩個基因定點(diǎn)敲入到一條染色體上，另外一個基因敲入另外一條染色體。敲入的TLR4基因以綠色熒光GFP示蹤；定點(diǎn)敲入的CD14-MD2以紅色熒光RFP示蹤。應(yīng)用自我剪切2A肽多基因載體構(gòu)建策略使用兩個不同的2A肽將CD14、MD2和紅色熒光RFP基因結(jié)構(gòu)隔開，避免對蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響。

在本發(fā)明的實施例中使用了F2A和T2A兩種2A肽結(jié)構(gòu)，其中F2A為來源于口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease viruses，F(xiàn)MDV)的2A肽，T2A為來源于蒂勒氏鼠腦脊髓病毒(Theiler’s murine encephalitis virus，TMEV)的2A肽，避免了使用同一2A的基因序列在表達(dá)載體構(gòu)建時出現(xiàn)交叉反應(yīng)難以克隆進(jìn)目 的位點(diǎn)。

熱源刺激該模型細(xì)胞后，可以通過ELISA、Western Blot、質(zhì)譜、磁珠法等方法檢測到IL-6和/或TNF-α細(xì)胞因子的釋放。

本發(fā)明的特點(diǎn)在于：

1.使用CRISPR/CAS9技術(shù)定點(diǎn)敲入特定基因

本發(fā)明采用定點(diǎn)敲入的方式將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，而非采用病毒、慢病毒等載體形式進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，使得遺傳穩(wěn)定?，F(xiàn)有CRISPR/CAS9技術(shù)一般多應(yīng)用于基因敲除或基因突變，而對于基因敲入，現(xiàn)有方法中要克服脫靶效應(yīng)，同源重組效率低，敲入載體構(gòu)建過程繁瑣等重重困難，尤其進(jìn)行多個基因的敲入困難就更大。而本發(fā)明采用基因敲入，將多基因成功敲入細(xì)胞系，如HEK293T細(xì)胞，解決了CRISPR/CAS9技術(shù)基因敲入困難的問題。

2.將基因敲入不同染色體

本發(fā)明將TLR4基因、CD14基因和MD2基因這三個基因定點(diǎn)敲入兩條不同染色體，插入的位置為確?；蚯萌牒蟛粫绊懠?xì)胞本身的生理功能，保證細(xì)胞的正常存活和穩(wěn)定傳代的位點(diǎn)。如本發(fā)明實施例中TLR4基因插入HEK293T的十九號染色體PPR1R12C基因第一位內(nèi)含子內(nèi)，CD14基因和MD2基因插入HEK 293T的三號染色體CCR5基因第一位內(nèi)含子內(nèi)，這兩個位置都是可以確保基因敲入后不會影響細(xì)胞本身的生理功能，保證細(xì)胞的正常存活和穩(wěn)定傳代。同時，不將三個基因插入到同一染色體是由于插入同一染色體，會由于位阻效應(yīng)影響表達(dá)，同時三個基因的融合蛋白過大，會影響染色體上基因表達(dá)。在插入染色體的基因后面加入綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白，可以示蹤蛋白是否表達(dá)。在細(xì)胞傳代中也可以示蹤蛋白的表達(dá)。

3.檢測靈敏度高

本發(fā)明構(gòu)建的細(xì)胞模型，屬于工具細(xì)胞，在沒有LPS刺激的情況下無IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)。其他來源的細(xì)胞，如人單核細(xì)胞，在沒有LPS刺激時會有一定量的IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的本底表達(dá)，而本底表達(dá)會對后續(xù)的檢測產(chǎn)生影響，而本細(xì)胞模型在沒有LPS刺激時沒有細(xì)胞因子的表達(dá)，沒有本底的存在。同時，某些基因工程產(chǎn)品可能含有刺激細(xì)胞增殖的物質(zhì)，不同程度的細(xì)胞增殖，將對檢測的不確定性造成影響，而本發(fā)明的細(xì)胞模型不存在這種風(fēng)險。本發(fā)明細(xì)胞對于LPS的最低檢測限可達(dá)0.005EU/mL，而鱟試劑法的最低檢測限為0.025EU/mL，可以表明本發(fā)明的靈敏度遠(yuǎn)高于鱟試劑法。

4.解決現(xiàn)有熱原檢測中的不足

鱟是國家二級保護(hù)動物，其血液來源有限，使用鱟試劑會影響鱟的保護(hù)，不利于生物資源的可持續(xù)發(fā)展，并且不同廠家生產(chǎn)鱟試劑的方法不同，對同一產(chǎn)品的熱原檢測易產(chǎn)生不一致的結(jié)果。單核細(xì)胞激活檢查法由于需要使用人血，而不同人血來源的單核細(xì)胞反應(yīng)性不穩(wěn)定，造成該方法的穩(wěn)定性差。本發(fā)明提供的細(xì)胞模型通過將檢測基因插入染色體，使之可以穩(wěn)定傳代，對熱原檢測重復(fù)性好，反應(yīng)性好，模型穩(wěn)定，克服了傳統(tǒng)方法和新型人單核細(xì)胞激活檢查法的缺點(diǎn)。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供一種可以用于藥品生物制品包括基因工程藥品的熱原檢測的細(xì)胞學(xué)模型，其構(gòu)建方法及熱原檢測方法和試劑盒。該細(xì)胞模型利用CRISPR/CAS9誘導(dǎo)基因組特定位置形成雙鍵斷裂，并利用同源重組修復(fù)的原理在細(xì)胞系的兩個染色體分別定點(diǎn)敲入TLR4及CD14-MD2并以綠色熒光GFP和紅色熒光RFP分別示蹤最終我們成功構(gòu)建TLR4/CD14/MD2定點(diǎn)敲入熒光示蹤細(xì)胞模型，LPS刺激細(xì)胞模型可通過ELISA、Western Blot、質(zhì)譜及磁珠法檢測到IL-6、TNF-a細(xì)胞因子的釋放，該細(xì)胞模型穩(wěn)定性好，靈敏性高，最低檢測限可達(dá)0.005EU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鱟試劑法的0.025EU/mL。

附圖說明

圖1A為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中TLR4與pMD19-T連接的質(zhì)粒圖譜。

圖1B為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中CD14與pMD19-T連接的質(zhì)粒圖譜。

圖1C為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中MD2與pMD19-T連接的質(zhì)粒圖譜。

圖2A為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中TLR4與pCAG-GFP構(gòu)建的瞬時表達(dá)載體pCAG-TLR4-GFP的質(zhì)粒圖譜。

圖2B為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中CD14與pCAG-GFP構(gòu)建的瞬時表達(dá)載體pCAG-CD14-GFP的質(zhì)粒圖譜。

圖2C為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中MD2與pCAG-GFP構(gòu)建的瞬時表達(dá)載體pCAG-MD2-GFP的質(zhì)粒圖譜。

圖3為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中TLR4定點(diǎn)敲入的載體構(gòu)建策略。

圖4為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中TLR4定點(diǎn)敲入細(xì)胞的原理示意圖。

圖5A為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中TLR4定點(diǎn)敲入細(xì)胞后照射白光的照片。

圖5B為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中TLR4定點(diǎn)敲入細(xì)胞后經(jīng)激發(fā)顯示綠色熒光的照片。

圖6為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中MD2-CD14定點(diǎn)敲入的載體構(gòu)建策略。

圖7為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中MD2-CD14定點(diǎn)敲入細(xì)胞的原理示意圖。

圖8為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中MD2-CD14定點(diǎn)敲入細(xì)胞后的熒光檢測圖。

圖9為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中四種細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

圖10為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中四種細(xì)胞通過共聚焦顯微鏡觀察到的表達(dá)情況。

圖11A為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中四種細(xì)胞PCR鑒定敲入TLR4的策略示意圖。

圖11B為圖11A的PCR結(jié)果電泳圖。

圖11C為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中四種細(xì)胞PCR鑒定敲入CD14/MD2的策略示意圖。

圖11D為圖11C的PCR結(jié)果電泳圖。

圖12為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中四種細(xì)胞Western blot檢測蛋白表達(dá)情況結(jié)果圖。

圖13A為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用ELISA檢測四種細(xì)胞系經(jīng)LPS刺激細(xì)胞后IL-6釋放情況。

圖13B為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用ELISA檢測四種細(xì)胞系經(jīng)LPS刺激細(xì)胞后TNFα釋放情況。

圖14為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用ELISA檢測293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞系經(jīng)LPS刺激后IL-6釋放情況與時間的關(guān)系圖。

圖15為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用ELISA檢測不同細(xì)胞數(shù)293T/TLR4/CD14/MD2經(jīng)LPS刺激后IL-6釋放量。

圖16為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用ELISA檢測293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞系經(jīng)不同量LPS刺激后IL-6釋放敏感性。

圖17A為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用Western blot法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞對LPS刺激的TNF-α的反應(yīng)性。

圖17B為本發(fā)明一優(yōu)選實施例中使用Western blot法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞對LPS刺激的IL-6的反應(yīng)性。

具體實施方式

下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。

儀器和材料：

1.限制性內(nèi)切酶均購自加拿大Fermentas公司。

2.pMD19-T購買自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)。

3.pCAG-GFP、pCAG-RFP、pX330、pMCS.DT-A和pAAV-CAG-RFP均購自Addgene公司。

4.人單核細(xì)胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物制品公司。

5.RPMI1640培養(yǎng)基(無血清)和DMEM培養(yǎng)基(無血清)購自GIBCO公司，胎牛血清購自Hyclone公司。

6.HEK293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫。

7.測序：采用通用或特異引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

需要說明的是，本發(fā)明中未提供詳細(xì)步驟的部分均采用常規(guī)分子生物學(xué)的方法實現(xiàn)或按照相應(yīng)試劑說明書實現(xiàn)。

實施例1細(xì)胞模型的構(gòu)建

1.人外周血單核細(xì)胞cDNA的制備

1.1人外周血單核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取5mL正常人新鮮抗凝全血，按照人單核細(xì)胞分離液試劑盒自帶說明書進(jìn)行操作，提取人外周血單核細(xì)胞，再加入RPMI1640培養(yǎng)基洗滌離心1次，1500r/min離心10min，棄上清。按每毫升血液標(biāo)本加3～4mL含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重新混懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)2×10⁷/mL培養(yǎng)于10cm²培養(yǎng)皿中，放置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h后去除上清，得到貼壁的人單個核細(xì)胞。然后吸取10μL按需要稀釋比例稀釋后的細(xì)胞懸液與10μL臺盼藍(lán)染液(0.4％)混合，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞濃度控制在2×10⁷/mL左右。

1.2人外周血單核細(xì)胞cDNA的制備

將步驟1.1制備的人外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用PBS溶液沖洗3遍，在六孔板中每孔加入200μL TRIzol Reagent(Gibco BRL)，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞。收獲裂解后的細(xì)胞于1.5mL離心管中，室溫放置5min。加入0.1mL氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置2～3min。經(jīng)12,000g，4℃離心15min后，吸出水相轉(zhuǎn)移至另一1.5mL離心管中。加入250μL異丙醇，混勻，室溫放置10min。4℃，12,000g離心10min沉淀RNA，加入1mL 75％乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥5～10min。加入適量不含RNase的DEPC水溶解RNA，55～60℃水浴10min以使RNA充分溶解。用紫外分光光度計測定RNA樣品的濃度(OD₂₆₀)和純度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，然后將RNA濃度調(diào)整至1μg/μL待用。

RNA樣品70℃水浴變性5min后，于冰上放置5min。按照下列反應(yīng)體系進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總反應(yīng)體積為20μL。

表1RT反應(yīng)體系

混勻，37℃60min，70℃10min滅活，加水至100μL，-20℃儲存待用。

2.TLR4，CD14，MD2基因的載體構(gòu)建和鑒定

2.1TLR4，CD14，MD2原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

2.1.1TLR4，CD14，MD2基因DNA片段的獲得

利用NCBI檢索得到人類基因組TLR4、MD2和CD14的mRNA序列。使用Primer premier5.0軟件，參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計RT-PCR引物，分別在MD2和CD14上游引物的5’端引入限制性核酸內(nèi)切酶識別序列EcoRI，在下游引物的5’端引入限制性核酸內(nèi)切酶識別序列KpnI和及保護(hù)堿基，在TLR4上游引物的5’端引入限制性核酸內(nèi)切酶識別序列KpnI，在下游引物的5’端引入限制性核酸內(nèi)切酶識別序列SmaI及保護(hù)堿基引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。循環(huán)數(shù)則通過循環(huán)曲線圖來確定，以使PCR過程處于指數(shù)增長期。其中所使用的酶切位點(diǎn)均為相應(yīng)基因不含的酶切位點(diǎn)。

表2.PCR引物序列和PCR產(chǎn)物長度

表3.PCR反應(yīng)體系

表4PCR反應(yīng)條件

反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物大小，經(jīng)鑒定TLR4基因位于2500bp左右，CD14基因位于1100bp左右，MD2基因位于500bp左右，均與預(yù)期相符。將TLR4基因、CD14基因和MD2基因分別使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒或回收，于-20℃保存。

2.1.2TLR4，CD14，MD2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

將回收的DNA片段分別連接到pMD19-T克隆載體中，其中TLR4插入到Kpn I和Sma I之間，CD14插入到EcoR I和Kpn I之間，MD2插入到EcoR I和Kpn I之間，獲得三種克隆載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，酶切，電泳鑒定陽性克隆。

將挑選出的陽性克隆，命名為pMD19-T-TLR4(如圖1A所示)，pMD19-T-CD14(如圖1B所示)、pMD19-T-MD2(如圖1C所示)測序，并從Pubmed基因數(shù)據(jù)庫中檢索相匹配的基因克隆。

2.2TLR4，CD14，MD2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

2.2.1TLR4，CD14，MD2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將測序正確的pMD19-T-TLR4陽性克隆質(zhì)粒和pCAG-GFP真核表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行SmaI和KpnI雙酶切反應(yīng)，酶切片段進(jìn)行電泳分離，并回收目的片段和載體臂。

將TLR4片段與pCAG-GFP片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，酶切，電泳鑒定陽性克隆。

將獲得的重組陽性質(zhì)粒，命名為pCAG-TLR4-GFP(如圖2A所示)，測序，并從Pubmed基因數(shù)據(jù)庫中檢索相匹配的基因克隆。

MD2，CD14真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法基本同于TLR4基因表達(dá)載體，將測序正確的pMD19-T-MD2、pMD19-T-CD14陽性克隆質(zhì)粒和pCAG-GFP真核表達(dá)載體質(zhì)粒應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和KpnI進(jìn)行雙酶切并連接，轉(zhuǎn)化后挑 單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，質(zhì)粒小量提取后再次進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察，選出目的片段插入且大小正確的陽性克隆，分別命名為pCAG-MD2-GFP(如圖2B所示)，pCAG-CD14-GFP(如圖2C所示)，測序，并在Pubmed基因數(shù)據(jù)庫中Blast，查看基因克隆是否相匹配。

3.CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TLR4定點(diǎn)敲入細(xì)胞模型

3.1敲入靶點(diǎn)的確定

利用NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫搜索得到人類基因組第十九號染色體PPPR1R12C的基因組DNA序列。人PPP1R12C基因位于19q13.42，GeneID：54776?；蚪MDNA全長26688bp，第一位外顯子序列為1-378bp，第一位內(nèi)含子序列為378-4806bp，將PPPR1R12C第一位內(nèi)含子序列輸入到http://crispr.mit.edu/評估合適的CRISPR敲入靶點(diǎn)，根據(jù)上述網(wǎng)站給出的結(jié)果得到guideRNA合適靶點(diǎn)。sgRNA位點(diǎn)位于1849bp使用Primer premier5.0生物軟件設(shè)計引物擴(kuò)增1849bp上游1000bp左右，下游1000bp左右的長短臂。

本實施例中選擇第十九號染色體PPPR1R12C的基因組DNA序列的第一內(nèi)含子位置作為TLR4基因定點(diǎn)敲入部位，有報道證實位置插入的外源基因?qū)τ诩?xì)胞本身的生理功能沒有影響。TLR4基因也可以插入到其他不影響細(xì)胞生理功能的染色體位點(diǎn)上，插入到不同基因中，其靶點(diǎn)引物的設(shè)計可進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整變化。

3.2CRISPR/Cas 9質(zhì)粒的設(shè)計及構(gòu)建

3.2.1CRISPR/Cas 9質(zhì)粒的構(gòu)建

以pX330質(zhì)粒為骨架，合成互補(bǔ)的靶點(diǎn)sgRNA序列，并在兩端引入BbsI酶切位點(diǎn)。sgRNA合成序列如表5。

表5PPPR1R12C靶向sgRNA合成序列

Bbs I酶切消化pX330，酶切片段的電泳分離，并回pX330單酶切片段?；パa(bǔ)的兩段sgRNA片段退火并磷酸化，將sgRNA連入酶切好的線性化pX330中。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后用BbsI單酶切進(jìn)行反應(yīng)，酶切鑒定后經(jīng)電泳檢查插入片段是否存在，獲得重組陽性質(zhì)粒，命名為pPsg-Cas9，測序。

3.2.2打靶載體的構(gòu)建

提取HEK 293T(簡稱293T)基因組DNA，在PPPR1R12C基因sgRNA位點(diǎn)上游、下游各選擇1000bp左右的序列，作為打靶載體的長短臂。用Primer premier5.0設(shè)計引物，如表6所示。PCR長臂、短臂、凝膠回收、連入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化、鑒定、測序，獲得pMD19-T-long arm質(zhì)粒和pMD19-T-short arm質(zhì)粒。

表6PPPR1R12C基因長短臂引物及產(chǎn)物長度

將長臂、短臂分別酶切并連入pMCS.DT-A打靶載體，具體方法為：將pMCS.DT-A質(zhì)粒和測序正確的pMD19-T-long arm質(zhì)粒進(jìn)行Sal I和Hind III雙酶切反應(yīng)，電泳、回收、用T4連接酶連接長臂片段和載體片段，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。進(jìn)行重組質(zhì)粒的酶切電泳鑒定和測序鑒定，得到DTA-long arm；將測序正確的DTA-long arm質(zhì)粒和pMD19-T-short arm質(zhì)粒進(jìn)行Sal I和Hind III雙酶切反應(yīng)，電泳、回收、用T4連接酶連接短臂片段和DTA-long arm酶切片段，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。進(jìn)行重組質(zhì)粒的酶切電泳鑒定和測序鑒定，得到DTA-long arm-short arm，測序。

將測序正確的DTA-long arm-short arm質(zhì)粒(DONOR)和pCAG-TLR4-GFP質(zhì)粒按進(jìn)行Spe I和Not I雙酶切反應(yīng)，電泳、回收、用T4連接酶連接CAG-GFP-TLR4片段和DTA-long arm-short arm酶切片段，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。進(jìn)行重組質(zhì)粒的酶切電泳鑒定和測序鑒定，得到DTA-short arm-CAG-TLR4-GFP-long arm打靶載體(TLR4-DONOR)，構(gòu)建策略如圖3所示，TLR4定點(diǎn)敲入細(xì)胞的原理示意圖如圖4所示。

3.2.3電轉(zhuǎn)打靶載體和CRISPR/Cas9質(zhì)粒

電轉(zhuǎn)前24hr，在6孔板中接種293T細(xì)胞0.5-1.0×10⁵細(xì)胞，至轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度達(dá)到90-95％；打靶載體DTA-shortarm-CAG-TLR4-GFP-longarm在同源重組臂的短臂5’端用BstBI單酶切線性化；用PBS清洗細(xì)胞，胰酶消化，800rpm離心3min收集細(xì)胞；用電轉(zhuǎn)緩沖液(無血清DMEM)重懸293T細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×10⁷/mL。選用4mm的電擊杯，每次電擊細(xì)胞300μL，25ng打靶載體，25ng pPsg-Cas質(zhì)粒。室溫操作，電擊，260v、30ms，后將細(xì)胞種與6孔板內(nèi)， 補(bǔ)加2mL培養(yǎng)液于37℃培養(yǎng)；細(xì)胞電轉(zhuǎn)后48hr，觀察熒光。

3.2.4有限稀釋法挑選綠色熒光單克隆

收集長勢良好的細(xì)胞，制成懸液；按細(xì)胞計數(shù)方法準(zhǔn)確計得細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)；梯度稀釋法將細(xì)胞制成10/mL細(xì)胞懸液，即每0.1毫升1個細(xì)胞；細(xì)胞懸液種于96孔板，每孔0.1毫升；96孔板置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱，4天后取出觀察，做好記錄并統(tǒng)計結(jié)果；選擇單克隆生長孔，生長良好，綠色熒光陽性強(qiáng)者，轉(zhuǎn)移到24孔板再做克隆經(jīng)培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)多次傳代，可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，命名為293T/TLR4細(xì)胞克隆，從圖5A和圖5B中可以看出，當(dāng)293T/TLR4用白光照射時不顯示熒光，當(dāng)用激發(fā)光照射時顯出綠色熒光。

4CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CD14-MD2定點(diǎn)敲入細(xì)胞模型

4.1構(gòu)建pCAG-MD2-2A-CD14-2A-RFP質(zhì)粒

以pAAV-CAG-RFP為模板，PCR擴(kuò)增RFP片段，并在5’端設(shè)計引物時引入F2A序列(如表7所示)，ageI酶切位點(diǎn)，在3’端引入Not I酶切位點(diǎn)。用AgeI和Not I酶消化pCAG-CD14-GFP質(zhì)粒切掉綠色熒光GFP片段，并連入F2A-RFP片段，引物序列如表8；酶切測序鑒定得到pCAG-CD14-F2A-RFP質(zhì)粒，瞬時轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞看熒光表達(dá)；PCR擴(kuò)增MD2片段，在3’端T2A序列(如表7所示)引入Age I酶切位點(diǎn)，用Kpn I酶消化pCAG-CD14-F2A-RFP質(zhì)粒，并用abm必克隆試劑盒使用同源重組的方法連入MD2-T2A片段，引物序列如表8；酶切測序鑒定得到pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP質(zhì)粒。

表7F2A和T2A的序列

表8F2A-RFP和MD2-T2A引物及產(chǎn)物長度

4.2敲入靶點(diǎn)的確定

利用NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫搜索得到人類基因組第三號染色體CCR5的基因組DNA序列。將CCR5基因第一位內(nèi)含子序列輸入到http://crispr.mit.edu/評估合適的CRISPR敲入靶點(diǎn)，根據(jù)上述網(wǎng)站給出的結(jié)果得到guideRNA合適靶點(diǎn)。

本實施例中選擇第三號染色體CCR5的基因組DNA序列的第一內(nèi)含子位置作為CD14基因和MD2基因定點(diǎn)敲入部位，有報道證實該位置插入的外源基因?qū)τ诩?xì)胞本身的生理功能沒有影響。CD14基因和MD2基因也可以插入到其他不影響細(xì)胞生理功能的染色體位點(diǎn)上，插入到不同基因中，其靶點(diǎn)引物的設(shè)計可進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整變化。

4.3CRISPR/Cas 9質(zhì)粒的設(shè)計及構(gòu)建

4.3.1CRISPR/Cas 9質(zhì)粒的構(gòu)建

以pX330質(zhì)粒為骨架，合成互補(bǔ)的靶點(diǎn)sgRNA序列，并在兩端引入BbsI酶切位點(diǎn)。sgRNA合成序列如表9。

表9CCR5靶向sgRNA合成序列

Bbs I酶切消化pX330，酶切片段的電泳分離，并回pX330單酶切片段?；パa(bǔ)的兩段sgRNA片段退火并磷酸化，將sgRNA連入酶切好的線性化pX330中。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后用BbsI單酶切進(jìn)行反應(yīng)，酶切鑒定后經(jīng)電泳檢查插入片段是否存在，獲得重組陽性質(zhì)粒，命名為pCsg-Cas，測序。

4.3.2CCR5基因打靶載體的構(gòu)建

在CCR5基因sgRNA位點(diǎn)上游、下游各選擇1000bp左右的序列，作為打靶載體的長短臂。用Primer premier5.0設(shè)計引物，如表10所示。PCR長臂、短 臂、凝膠回收、連入pM19-T載體，轉(zhuǎn)化、鑒定、測序。

表10PCR長短臂序列

將長臂、短臂分別酶切并連入pMCS.DT-A打靶載體，具體方法參照步驟3.2.2，其中在pMCS.DT-A載體Sal I和HindIII中間連入短臂，Sac II和Sac I之間連入長臂，最終得到DTA-long arm-short arm。

然后將pCAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP質(zhì)粒酶切并連入DTA-long arm-short arm載體，具體方法參照步驟3.2.2，最終獲得DTA-short arm-CAG-MD2-T2A-CD14-F2A-RFP-long arm打靶載體，構(gòu)建策略如圖6所示，MD2和CD14定點(diǎn)敲入細(xì)胞的原理示意圖如圖7所示。

4.3.3電轉(zhuǎn)打靶載體和CRISPR/Cas9質(zhì)粒

參考步驟3.2.3的方法將打靶載體和pCsg-Cas電轉(zhuǎn)到293T和293T/TLR4中，并用步驟3.2.4的方法篩選單克隆，得到兩種紅色熒光克隆細(xì)胞，293T/CD14/MD2細(xì)胞和293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞，如圖8所示，可以看出兩個細(xì)胞克隆都可以發(fā)出紅色熒光。其中293T/CD14/MD2細(xì)胞作為對照，293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞為目的細(xì)胞系。

5細(xì)胞模型鑒定

5.1熒光鑒定和共聚焦顯微鏡鑒定

5.1.1熒光鑒定

將293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細(xì)胞系都傳代3次后照熒光，如圖9所示。結(jié)果顯示293T無綠色熒光及紅色熒光表達(dá)，293T/TLR4有穩(wěn)定綠色熒光表達(dá)，293T/CD14/MD2有穩(wěn)定紅色熒光表達(dá)，293T/TLR4/CD14/MD2既有穩(wěn)定綠色熒光，又有穩(wěn)定紅色熒光表達(dá)。

5.1.2共聚焦顯微鏡鑒定

將上述四種細(xì)胞系進(jìn)一步進(jìn)行共聚焦顯微鏡鑒定，如圖10所示，可以看出293T無綠色熒光及紅色熒光表達(dá)，293T/TLR4有穩(wěn)定綠色熒光表達(dá)，293T/CD14/MD2有穩(wěn)定紅色熒光表達(dá)，293T/TLR4/CD14/MD2既有穩(wěn)定綠色熒光，又有穩(wěn)定紅色熒光表達(dá)。將上述兩圖重合時293T/TLR4/CD14/MD2(Merge 模式)可顯現(xiàn)出綠色熒光和紅色熒光的重合，而293T/TLR4和293T/CD14/MD2在重合時分別顯現(xiàn)綠色熒光和紅色熒光，其結(jié)果與熒光鑒定一致。并且可以看出，TLR4的綠光聚集于細(xì)胞膜和胞漿，而CD14-MD2紅光聚集于胞漿。

5.2PCR鑒定

對293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細(xì)胞系提取基因組DNA，在基因組不同位點(diǎn)設(shè)計引物，看敲入是否正確，引物序列如表11所示。其中，野生型用primer 1+primer2以及primer4+primer5可以擴(kuò)增出片段，而用primer 1+primer 3，primer 4+primer 6不能擴(kuò)增片段。TLR4敲入的細(xì)胞用primer 1+primer 3可擴(kuò)增出片段，CD14-MD2敲入的細(xì)胞用primer 4+primer 6可擴(kuò)增出片段。如圖11A至圖11D所示，通過PCR鑒定，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2敲入位點(diǎn)正確。

表11PCR鑒定的引物序列

5.3Western blot鑒定蛋白表達(dá)情況

對293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細(xì)胞系裂解細(xì)胞提取總蛋白。以Actin作為內(nèi)標(biāo)Western blot鑒定TLR4、CD14、MD2三種蛋白表達(dá)情況。如圖12所示，293T細(xì)胞無TLR4、CD14、MD2表達(dá)，293T/TLR4有TLR4表達(dá)、無CD14、MD2表達(dá)，293T/CD14/MD2有TLR4、CD14、MD2表達(dá)，293T/TLR4/CD14/MD2有TLR4、CD14、MD2表達(dá)。

根據(jù)分析，293T/CD14/MD2由于CD14/MD2的存在可能激活了細(xì)胞內(nèi)源性的TLR4使得有少量的有TLR4表達(dá)。

實施例2使用細(xì)胞模型檢測熱原標(biāo)志物L(fēng)PS

1ELISA鑒定細(xì)胞對LPS刺激的反應(yīng)性，檢測IL-6和TNFα的表達(dá)

對293T，293T/TLR4，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2四種細(xì)胞系用LPS進(jìn)行刺激，ELISA檢測上清中IL-6和TNFα細(xì)胞因子的釋放情況，293T，293T/TLR4對LPS刺激無反應(yīng)，293T/CD14/MD2，293T/TLR4/CD14/MD2經(jīng)LPS 刺激后釋放IL-6或TNFα但293T/CD14/MD2釋放的量不如293T/TLR4/CD14/MD2多，如圖13A和圖13B所示。

繼續(xù)選用293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)試驗。檢測LPS刺激后不同時間點(diǎn)IL-6的釋放情況。發(fā)現(xiàn)5～6h左右IL-6釋放達(dá)到高峰，如圖14所示。檢測不同細(xì)胞數(shù)293T/TLR4/CD14/MD2用5EU/mL LPS刺激后6h IL-6釋放量，如圖15所示，可以看出，10⁴的細(xì)胞量即可對5EU/mL LPS產(chǎn)生反應(yīng)釋放IL-6。檢測293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞對LPS刺激的檢測最低限，從圖16可以看出，0.005EU/mL LPS即可刺激293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞釋放IL-6，優(yōu)于鱟試劑的最低檢測限。

2.Western blot法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞對LPS刺激的反應(yīng)性，檢測IL-6和TNFα的表達(dá)

使用高濃度(4EU/mL)，中濃度(1EU/mL)，低濃度(0.5EU/mL)的LPS刺激1×10⁶個293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞，6h后取1mL培養(yǎng)上清，濃縮至200μL，Western blot法鑒定結(jié)果表明培養(yǎng)上清中IL-6，TNF-a有釋放，如圖17A和圖17B所示。

3.質(zhì)譜法鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞對LPS刺激的反應(yīng)性，檢測IL-6和TNFα的表達(dá)

293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞系LPS刺激5小時后，取1000μL培養(yǎng)液上清，純化后，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI.TOF-MS)分析、校正，將獲得每個蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋，圖譜用Mascot Distiller軟件識別單同位素信號峰，將獲得的肽片段質(zhì)荷比(m/z)數(shù)值導(dǎo)入Mas—cot查詢系統(tǒng)，檢索IPI.HUMAN.v3.53蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，Mascot分?jǐn)?shù)>61分(P<0.05)判定為陽性。

4.膠體金試紙法(金標(biāo)法)鑒定293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞對LPS刺激的反應(yīng)性，檢測IL-6和TNFα的表達(dá)

膠體金試紙檢測法是利用納米級的膠體金作為示蹤物和檢測劑，應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的檢測方法，檢測時將293T/TLR4/CD14/MD2細(xì)胞系LPS刺激5小時后，待測樣品與模型細(xì)胞共培養(yǎng)5小時后(與Western Blot，和ELISA法使用的樣品及培養(yǎng)方法相同)，取培養(yǎng)液的上清50μL分別加入IL-6和TNFα的膠體金試紙條(該試紙條為市售或定制)，根據(jù)檢測帶的反應(yīng)判定是否為IL-6和TNFα的表達(dá)陽性。

從上述實施例可以看出，本發(fā)明提供的細(xì)胞模型，對熱原刺激可實現(xiàn)反應(yīng)，不僅可以檢出革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素及非內(nèi)毒素來源的污染物，包括來自于革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、病毒、真菌的病原相關(guān)分子模式(PAMPs) 和制品相關(guān)的以及加工工藝相關(guān)的生物或者化學(xué)實體，并且其最低檢測限低于鱟試劑，其敏感性更強(qiáng)，其穩(wěn)定性又比利用人全血檢測更高。