本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：帕金森病和帕金森綜合征(parkinsondisease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征性的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失，進(jìn)而導(dǎo)致投射至紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的減少。遺傳因素、環(huán)境因素、年齡老化、氧化應(yīng)激以及炎癥等均參與帕金森氏病多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過程。其中，氧化應(yīng)激在各種神經(jīng)變性機(jī)制中處于主導(dǎo)地位，對多巴胺神經(jīng)元死亡起重要作用。目前該病仍無有效治療方法，隨著世界人口老齡化，其發(fā)病率日益增高，給患者、家庭甚至社會帶來巨大影響。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，將使神經(jīng)元再生、神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)退行性疾病的治愈成為可能。胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞雖然已在帕金森、多發(fā)性硬化等動物模型中應(yīng)用，但由于其來源有限以及倫理性和安全性問題難以解決，阻礙其在臨床的廣泛使用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)作為干細(xì)胞的一種，廣泛存在于機(jī)體的大部分組織中，可以從骨髓、脂肪、肌肉等組織中分離獲得，具有跨胚層分化的特性，可以分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，參與組織的再生修復(fù)和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持。與胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induciblepluripotentcells，iPS)不同的是，它兼具了組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的雙重特性，為實(shí)現(xiàn)帕金森氏病病人的神經(jīng)細(xì)胞再生和免疫紊亂回調(diào)帶來曙光。已有研究證實(shí)，MSCs對神經(jīng)退行性疾病具有明顯療效。例如，LeeJK將小鼠骨髓來源的MSCs腦室注射于阿爾茲海默的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)疾病小鼠的病理改變和認(rèn)知功能得到明顯改善。雖然MSCs在神經(jīng)退行性疾病模型中已證實(shí)有療效，但其具體機(jī)制尚無定 論。利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)觀察推測出MSCs可能具有的作用機(jī)制包含以下幾種：(1)分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，大量研究表明MSCs可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，并可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)生長因子的分泌。Crigler證明人源MSCs的特定亞群細(xì)胞表達(dá)BDNF和NGF，他們利用體外共培養(yǎng)體系證明，MSCs促進(jìn)SH-Sy5y細(xì)胞的存活和神經(jīng)突觸生長是部分依賴于BDNF的。(2)促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的遷移分化MSCs遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷部位后，可以改變其微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移分化。MunozJR發(fā)現(xiàn)將人源骨髓干細(xì)胞移植入SCID小鼠的海馬區(qū)后能夠促進(jìn)臨近內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化。(3)免疫調(diào)節(jié)作用研究發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的PGE2在MSCs緩解多發(fā)性硬化的小鼠疾病模型中起到了關(guān)鍵的作用。MSCs的發(fā)現(xiàn)和成功分離為PD疾病的治療帶來了新的希望。雖然，MSCs移植在PD上取得了明顯的治療效果，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞是炎癥因子預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述的炎癥因子是IFN-γ和TNF-α。在一個優(yōu)選例中，所述的預(yù)處理包括：將炎癥因子加入間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，使得炎癥因子IFN-γ的終濃度為：1ng/ml～1000μg/ml(較佳地為2ng/ml～200μg/ml；更佳地為3ng/ml～50μg/ml；更佳地為5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)；炎癥因子TNF-α的終濃度為1ng/ml～1000μg/ml(較佳地為2ng/ml～200μg/ml；更佳地為3ng/ml～50μg/ml；更佳地為5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)。在另一優(yōu)選例中，預(yù)處理的時間是30分鐘～96小時。在另一優(yōu)選例中，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞還過(高)表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的用途， 用于制備預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的藥物。在一個優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)退行性疾病是：帕金森病、帕金森綜合征。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物還用于：提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力；降低腦紋狀體區(qū)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，或提高腦組織病灶部位抗氧化應(yīng)激能力；或提高腦紋狀體區(qū)犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)或犬尿喹啉酸(Kynurenicacid，KYNA)的水平。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的藥物組合物，所述的藥物組合物中包含所述的間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備所述的間充質(zhì)干細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)的方法，所述的方法包括：將炎癥因子加入間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，使得炎癥因子IFN-γ的終濃度為：1ng/ml～1000μg/ml(較佳地為2ng/ml～200μg/ml；更佳地為3ng/ml～50μg/ml；更佳地為5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)；炎癥因子TNF-α的終濃度為1ng/ml～1000μg/ml(較佳地為2ng/ml～200μg/ml；更佳地為3ng/ml～50μg/ml；更佳地為5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)，預(yù)處理細(xì)胞30分鐘-96小時。在本發(fā)明的另一方面，提供炎癥因子的用途，用于制備間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，該間充質(zhì)干細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物能用于預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，所述的炎癥因子是IFN-γ和TNF-α。在本發(fā)明的另一方面，提供一種提高間充質(zhì)干細(xì)胞的預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病功能的方法，用炎癥因子處理間充質(zhì)干細(xì)胞；所述的炎癥因子是IFN-γ和TNF-α。在一個優(yōu)選例中，所述的方法還包括：在所述的間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶或提高吲哚胺2,3-雙加氧酶活性。在本發(fā)明的另一方面，提供一種吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)或其上調(diào)劑(包 括激動劑、促進(jìn)劑等)的用途，用于制備提高間充質(zhì)干細(xì)胞在預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中的功效的組合物。在一個優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)退行性疾病是：帕金森病、帕金森綜合征。在另一優(yōu)選例中，所述的吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的上調(diào)劑包括(但不限于)：過表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶的重組質(zhì)粒、炎癥因子。在本發(fā)明的另一方面，提供吲哚胺2,3-雙加氧酶的代謝產(chǎn)物的用途，用于制備預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的藥物，所述的代謝產(chǎn)物是犬尿喹啉酸(Kynurenicacid，KYNA)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選提高間充質(zhì)細(xì)胞在預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中的功效的潛在物質(zhì)的方法，包括：(1)將候選物質(zhì)與表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶的體系接觸；(2)檢測候選物質(zhì)對吲哚胺2,3-雙加氧酶的影響；若所述候選物質(zhì)可提高吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達(dá)、活性或分泌，則表明該候選物質(zhì)是可用于提高間充質(zhì)細(xì)胞在預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中的功效的潛在物質(zhì)。在一個優(yōu)選例中，步驟(1)包括：在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶的體系中；和/或步驟(2)包括：檢測測試組的體系中吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達(dá)或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶的體系；如果測試組中吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達(dá)、活性或分泌在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高于，如高20％以上，較佳的高50％以上；更佳的高80％以上)對照組，就表明該候選物質(zhì)是可用于提高間充質(zhì)細(xì)胞在預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中的功效的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自：細(xì)胞體系(或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對于抑制炎癥性疾病有用的組合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯 而易見的。附圖說明圖1、細(xì)胞移植前后阿樸嗎啡誘導(dǎo)的帕金森病小鼠旋轉(zhuǎn)行為變化。a、干細(xì)胞移植PD小鼠的實(shí)驗(yàn)流程圖。b、細(xì)胞移植后阿樸嗎啡誘導(dǎo)的PD小鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。c、免疫組化方法檢測酪氨酸羥基化酶(TH)在紋狀體(STR)和黑質(zhì)區(qū)(SN)內(nèi)的表達(dá)水平。圖2、促炎因子預(yù)處理的MSCs及其細(xì)胞上清對SH-Sy5y人神經(jīng)元細(xì)胞系的神經(jīng)保護(hù)作用。利用Transwell，將促炎因子預(yù)處理的MSCs與SH-Sy5y共培養(yǎng)過夜后，加入6-OHDA孵育8h，再進(jìn)行檢測。a，b，CCK8檢測SH-Sy5y細(xì)胞的存活率。c，采用AnnexinV和7-AAD檢測SH-Sy5y的細(xì)胞調(diào)亡。圖3、GFP標(biāo)記的MSCs在小鼠腦內(nèi)的追蹤。DAPI用來標(biāo)記腦組織內(nèi)的細(xì)胞核。圖4、促炎因子預(yù)處理的MSCs(pMSCs)移植降低PD小鼠腦組織紋狀體區(qū)的氧自由基(a)和一氧化氮的水平(b)。圖5、pMSCs對PD小鼠抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性，谷胱甘肽(GSH)含量為指標(biāo)。圖6、pMSCs對神經(jīng)細(xì)胞SH-sy5y的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。將神經(jīng)細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)過夜后，加入6-OHDA孵育18小時后，利用CellROXTM染料檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積(a)，利用試劑盒檢測神經(jīng)細(xì)胞SOD的酶活以及GSH的含量(b)。圖7、色氨酸代謝通路。圖8、色氨酸代謝通路關(guān)鍵酶在人源MSCs中的表達(dá)及代謝產(chǎn)物的水平。a.realtime-PCR檢測炎癥因子IFN-γ和TNF-α刺激后，色氨酸代謝通路中關(guān)鍵酶在MSCs中的表達(dá)水平。b.炎癥因子刺激后色氨酸通路的代謝產(chǎn)物在MSCs培養(yǎng)上清中的濃度。圖9、pMSCs移植后PD小鼠腦組織病損部位色氨酸代謝產(chǎn)物水平的變化。提取PD小鼠腦黑質(zhì)和紋狀體的組織樣品，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測色氨酸代謝產(chǎn)物KYN的水平。通過腦右側(cè)與左側(cè)的數(shù)值比例來比較治療組與對照組的變化。圖10、pMSCs與神經(jīng)細(xì)胞SH-sy5y共培養(yǎng)后色氨酸代謝產(chǎn)物(KYN、KYNA、AA、3HAA、3HK)水平的變化。圖11、IDO敲低逆轉(zhuǎn)pMSCs對PD小鼠及神經(jīng)細(xì)胞SH-Sy5y(Sh-sy5y)的神經(jīng)保護(hù)作用。a.MSCs轉(zhuǎn)染了IDO1siRNA后顯著降低IDO1的表達(dá)。b.IDO敲低的MSCs(hMSCIDOKD)在炎癥因子刺激后色氨酸代謝產(chǎn)物KYN、KYNA的分泌水平顯著降低。c.IDO敲低的MSCs逆轉(zhuǎn)了pMSCs對PD小鼠疾病的緩解作用。d，e.IDO敲低使MSCs對神經(jīng)細(xì)胞的抗凋亡及抗氧化應(yīng)激作用顯著減弱。圖12、iNOS-/-鼠源MSCs過表達(dá)人源IDO后能夠顯著緩解小鼠帕金森疾病。a.MSC-IDO受到炎癥因子IFN-γ和TNF-α刺激后可以表達(dá)人的IDO；CM表示未用炎癥因子刺激的本底水平。b.高效液相色譜-質(zhì)譜分析表明，MSC-IDO在炎癥因子刺激下能夠產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物KYN和KYNA。c.過表達(dá)IDO后mMSC-IDO細(xì)胞能夠顯著緩解小鼠PD疾病。圖13、KYN(a)和KYNA(b)對小鼠PD疾病的緩解作用。圖14、KYNA對神經(jīng)細(xì)胞系SH-sy5y的保護(hù)作用。具體實(shí)施方式本發(fā)明人利用動物模型及細(xì)胞模型，首次揭示了利用炎癥因子處理間充質(zhì)干細(xì)胞后，能夠顯著地促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞對于神經(jīng)退行性疾病的緩解作用。本發(fā)明還揭示了吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)在間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病上的核心作用。炎癥因子處理的間充質(zhì)干細(xì)胞及其用途及藥物組合物基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種MSCs，其是炎癥因子預(yù)處理的MSCs，其制備方法簡單，無需轉(zhuǎn)基因操作，不涉及外源基因的插入，給藥時不會存在安全性問題。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的MSCs是經(jīng)炎癥因子預(yù)處理的MSCs，所述的炎癥因子是IFN-γ和TNF-α；較佳地，所述的預(yù)處理包括：將IFN-γ和TNF-α加入MSCs的培養(yǎng)體系中，使得IFN-γ的終濃度可以為1ng/ml～1000μg/ml；使得TNF-α的終濃度可以為1ng/ml～1000μg/ml。所述的炎癥因子作為本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)(多肽)，其可以是重組多肽、合成多肽。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的炎癥因子是IFN-γ，其可以具有GenBank登錄號NG_015840.1所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的炎癥因子是TNF-α，其可以具有GenBank登錄號AB103618.1所示的氨基酸序列。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、但保留了本發(fā)明實(shí)施例中所用炎癥因子相同功能的炎癥因子變體或生物活性片段也包括在本發(fā)明中。炎癥因子變體或生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見 Watson等，MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。任何一種炎癥因子的生物活性片段都可以被應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，炎癥因子的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的炎癥因子的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長炎癥因子的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長的炎癥因子的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的炎癥因子，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的炎癥因子。也就是說，任何不影響炎癥因子的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種炎癥因子預(yù)處理的MSCs的用途，用于制備預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病的藥物。所述的神經(jīng)退行性疾病例如是帕金森氏癥。其還用于：保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，或提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力；降低腦紋狀體區(qū)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，或提高腦組織病灶部位抗氧化應(yīng)激能力；或提高腦紋狀體區(qū)犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)或犬尿喹啉酸(Kynurenicacid，KYNA)的水平?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了炎癥因子的用途，用于制備MSCs(或細(xì)胞培養(yǎng)物)，該MSCs能用于制備預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病。較佳地，所述的炎癥因子是IFN-γ和TNF-α。本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；較佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的炎癥因子預(yù)處理的MSCs，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將所述細(xì)胞配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。如本文所用，術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物 產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)在間充質(zhì)干細(xì)胞治療中的作用本發(fā)明人在研究中還發(fā)現(xiàn)，IDO在MSCs緩解或治療神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了核心作用，能夠上調(diào)IDO表達(dá)的激動劑、因子可以緩解或治療神經(jīng)退行性疾病的方法。同時，IDO表達(dá)的升高可以作為篩選治療效果更強(qiáng)的MSCs的一種方法；IDO代謝物KynurenicAcid也能夠治療帕金森。所述的IDO包括全長的IDO或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的IDO的氨基酸序列可以與GenBank登錄號：NG_028155所示的序列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的IDO的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。IDO或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等，MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。任何一種IDO的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，IDO的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的IDO的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50％的全長IDO的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長IDO的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的IDO，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的IDO。本發(fā)明還提供了一種吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)或其上調(diào)劑的用途，用于制備提高間充質(zhì)細(xì)胞在預(yù)防、緩解或治療神經(jīng)退行性疾病或保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中 的功效的組合物。如本文所用，所述的IDO的激動劑包括了促進(jìn)劑、上調(diào)劑等。任何可提高IDO蛋白的活性、維持IDO蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)IDO蛋白的表達(dá)、促進(jìn)IDO蛋白的分泌、延長IDO蛋白有效作用時間、或促進(jìn)IDO的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于上調(diào)IDO的有效物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的IDO蛋白的上調(diào)劑包括(但不限于)：在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可表達(dá)(優(yōu)選過表達(dá))IDO的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建物。通常，所述表達(dá)載體包含一基因盒，所述的基因盒含有編碼IDO的基因及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。材料和方法試劑實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6品系小鼠，雄性，12～16周，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-Sy5y：購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。人臍帶來源的MSCs的制備：臍帶取自足月健康孕婦，無菌條件下采集臍帶后置于冰上保存并立即送于實(shí)驗(yàn)室制備。采取組織塊貼壁培養(yǎng)法，將新鮮臍帶放入大培養(yǎng)皿中，去除羊膜及血管。將分離好的臍帶用眼科剪剪成約1mm3大小的組織塊，取適量放入無菌培養(yǎng)皿中，覆蓋70％培養(yǎng)皿的底面積，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)9-11天，可見有長梭形細(xì)胞從組織塊邊緣長出，每2天更換一次培養(yǎng)液，連續(xù)換液2次。待貼壁細(xì)胞長到瓶底的90％時進(jìn)行消化傳代并進(jìn)行細(xì)胞鑒定。MSCs培養(yǎng)方法：細(xì)胞培養(yǎng)液為低糖DMEM加入10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10ng/mlbFGF。待細(xì)胞長到瓶底的90％時按1：3進(jìn)行傳代，每2天換一次液。用6-OHDA構(gòu)建帕金森病單側(cè)損毀小鼠模型100μl生理鹽水溶解6-OHDA，制備50μg/μl6-OHDA，避光分裝-20℃儲存。使用前用0.2％維生素C/生理鹽水稀釋到4μg/μl，并避光置冰上備用。通過6-OHDA立體定向損毀紋狀體(STR)來構(gòu)建PD小鼠模型。通過腹腔注射3％戊巴比妥鈉(1.5ml/kg)將小鼠麻醉后，固定于腦立體定向儀上，調(diào)節(jié)齒桿至合適高度，常規(guī)備皮、消毒后，剪開頭皮，剝離骨膜，暴露前囟。確定右側(cè)STR損毀坐標(biāo)：前囟前1.0mm，矢狀縫右側(cè)2.0mm，顱骨骨膜下3.0mm。采用小型磨鉆在坐標(biāo)點(diǎn)鉆顱，用10μl的微量注射器注射2μl的6-OHDA(4μg/μl濃度)，注射速度1μl/min，留針5min，緩慢退針，縫合手術(shù)創(chuàng)口。阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)6-OHDA立體定向注射小鼠右側(cè)STR三周后，腹腔注射阿樸嗎啡(0.5mg/kgapomorphine/生理鹽水)，2分鐘后開始觀察并記錄小鼠的旋轉(zhuǎn)行為，表現(xiàn)為以左側(cè)后肢為支撐點(diǎn)，向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，頭尾相接，身體彎曲成環(huán)狀的快速旋轉(zhuǎn)行 為。共記錄10分鐘。小鼠帕金森疾病的治療人臍帶來源的MSCs以2×104/μl密度用PBS重懸，在疾病誘導(dǎo)后第7天每只小鼠注射2.5μl細(xì)胞懸液于小鼠紋狀體區(qū)。同樣，在疾病誘導(dǎo)后第7天每只小鼠注射50nmol/5μl的kynurenicacid(KYNA)于紋狀體區(qū)。紋狀體注射坐標(biāo)：前囟前1.0mm，矢狀縫右側(cè)2.0mm，顱骨骨膜下3.0mm。注射速度1μl/min，留針5min，緩慢退針，縫合手術(shù)創(chuàng)口。將kynurenine(KYN)和anthranilicacid(AA)溶解于1NNaOH溶液中，并將pH回調(diào)至10，在疾病誘導(dǎo)后第7天開始以75mg/kg分別腹腔注射于帕金森小鼠體內(nèi)，每天注射一次，連續(xù)兩周。小鼠灌注固定取腦及腦組織冰凍切片制備小鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉后，剪開胸廓，暴露搏動的心臟，將圓潤的灌注針頭從心尖處插入，稍斜行向右上方插入升主動脈，血管夾將灌注針頭固定在升主動脈，剪開右心耳，開放靜脈血流出道。首先注入50ml生理鹽水，待小鼠肝臟及四肢末端變白后，再注入4％多聚甲醛(PFA)/磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffer，PB)50ml，此時可觀察到小鼠在多聚甲醛刺激下全身肌肉抽搐，待抽搐停止并肢體及尾巴僵硬后即可取腦。切除小腦，再將大腦的頭端及尾端各切除約2mm，從剩余大腦的前后中點(diǎn)處冠狀位垂直切開，前半部分包含雙側(cè)紋狀體區(qū)，后半部分則包含中腦黑質(zhì)部，分別置于4％PFA/PB中4℃固定過夜。次日取出，用PBS沖洗后，重新浸入30％蔗糖/PBS中脫水24小時，待組織塊完全沉底后即可取出進(jìn)行冰凍切片檢查。冰凍切片免疫熒光染色采用懸浮法染色。切片懸浮在PBS中清洗2次×3min后，懸浮于0.15％TritonX-100/3％BSA/PBS稀釋的合適濃度的一抗，4℃過夜。第二天PBS中懸浮洗去一抗，3次×5min，然后懸浮于PBS稀釋的合適濃度的熒光標(biāo)記二抗中，室溫避光孵育1小時，PBS3次×5min洗去二抗。小心將切片吸附到APES涂膠玻片上，室溫放置干燥，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，置于4℃保存。冰凍切片免疫組化染色同免疫熒光染色，采用切片懸浮法染色，一抗4℃孵育過夜后，PBS3次×5min清洗，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，PBS3次×5min清洗后再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的生物素卵白素復(fù)合物37℃孵育1h，PBS3次×5min清洗，加入DAB顯色室溫1～5min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察。熒光定量PCR檢測基因的表達(dá)情況抽提細(xì)胞中的RNA使用Qiagen公司RneasyMiniKit。cDNA的合成使用Qiagen公司的SensiscriptRTKit。獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-cDNA之后，進(jìn)行熒光定量PCR檢測基因的表達(dá)情況。引物序列如表1。表1、Real-timePCR引物序列hu-IDO1-FW912ATTTGTCTGGCTGGAAAGGCASEQIDNO:1hu-IDO1-RV914CAAAGCACTGAAAGACGCTGCSEQIDNO:2hu-KAT1-FW595GTCGTCCTGTGTTTGTGTCCCTSEQIDNO:3hu-KAT1-RV696GCTTTGGTGCGTGATGTGAASEQIDNO:4hu-KAT2-FW469TGGCAGCCAACAAGGTCTTTSEQIDNO:5hu-KAT2-RV599CCCACTTTCATCACTGGCAACSEQIDNO:6hu-KYNase-FW870TTGGCTTTGATCTAGCACATGCSEQIDNO:7hu-KYNase-RV985CATGAATGAAGGCACCAGCASEQIDNO:8hu-KYNOHase-FW1165TGCGAGCACATGTCAACTCAASEQIDNO:9hu-KYNOHase-RV1303TTTGCCAATGCCAACGCTSEQIDNO:10hu-3HAO-FW200CCAGGAAGGACTATCACATCGASEQIDNO:11hu-3HAO-RV301TATCTCTCCCTGCCGAATGACSEQIDNO:12hu-QPRTase-FW950CTCCAGTGCCCAAAATCCACTSEQIDNO:13hu-QPRTase-RV1061AGTGCCAAATGTGCCCCATSEQIDNO:14高效液相色譜/質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測犬尿氨酸途徑代謝產(chǎn)物流動相：A：0.1％甲酸-水；B：0.1％甲酸-乙腈；梯度：10min；t(min)流速(ml/min)％B0.000.255.000.2506.000.2907.000.2908.000.2510.000.25柱溫：25℃。質(zhì)譜儀參數(shù)：Sheathgasflow(arb)：30；Auxiliarygasflow(arb)：10；Sprayvoltage：3.9kV；Iontransfertubetempatature：320℃；Vaporizertempatature：300℃。采取一級質(zhì)譜全掃描，F(xiàn)T質(zhì)量分析器，正離子模式，分辨率15000，提取離子流masstolerance：10ppm。Transwell體系檢測MSCs對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-Sy5y細(xì)胞凋亡的影響使用96孔的Transwell(膜孔徑為4μM)培養(yǎng)技術(shù)，下層培養(yǎng)SH-Sy5y，待細(xì)胞長到孔底的80％左右，將用炎癥因子(10ng/ml的IFN-γ+10ng/ml的TNF-α)預(yù)處理過夜的MSCs加入Transwell的上層培養(yǎng)孔中。共培養(yǎng)6小時，加入終濃度為50μM的6-OHDA，培養(yǎng)18小時。棄去上層細(xì)胞后，向下層細(xì)胞中加入CCK8進(jìn)行細(xì)胞活力的檢測。同時收集細(xì)胞，利用AnnexinV和PI進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。過表達(dá)人源IDO的iNOS-/-鼠源MSCs(mMSC-IDO)的制備將小鼠iNOS啟動子(ATG上游5,050bp基因序列)和人源IDO基因序列(GenBank登錄號NG_028155)克隆到去除CMV啟動子序列的pCMS-EGFP載體中，使人IDO基因的表達(dá)受到小鼠iNOS啟動子的調(diào)控(圖4)，然后將質(zhì)粒穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染到iNOS基因缺失的小鼠MSC細(xì)胞內(nèi)，從而得到“人源化”的MSCs(以下稱為IDO-MSCs)(參見CancerResearch，2014；74:1576-1587)。其中用于擴(kuò)增人源IDO的cDNA全長的引物序列如下：Forward：5’-AATTTCTCACTGCCCCTGTG-3’(SEQIDNO:15)；Reverse：5’-AATGGGTAATGACAGGAATGC-3’(SEQIDNO:16)。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析兩組之間的基因表達(dá)差異以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析。各組之間的差異以Student’sT檢驗(yàn)，兩組間的關(guān)聯(lián)采用線性回歸分析。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例1、炎癥因子預(yù)處理的MSCs(Cytokine-primedMSCs，pMSCs)能夠顯著緩解小鼠帕金森疾病(PD)1、pMSCs細(xì)胞移植對小鼠PD疾病的緩解作用促炎因子(IFN-γ+TNF-α)預(yù)處理的MSCs制備：以10ng/ml終濃度的IFN-γ和10ng/ml終濃度的TNF-α加入到MSCs培養(yǎng)基中，處理12-24小時，獲得促炎因子預(yù)處理的MSCs，即pMSCs。為模擬體內(nèi)免疫環(huán)境對MSCs的影響，擬采用促炎因子體外預(yù)處理細(xì)胞的方法，在接近體內(nèi)治療的實(shí)際情況的情形進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PD小鼠經(jīng)過6-OHDA紋狀體注射后1周，同側(cè)紋狀體注射人臍帶來源的MSCs(注射量為5×104個細(xì)胞/只)，以PBS作為對照，兩周后腹腔注射阿樸嗎啡進(jìn)行旋轉(zhuǎn)檢測。結(jié)果如圖1b所示，與正常培養(yǎng)的MSCs比較，促炎因子(IFN-γ+TNF-α)預(yù)處理的MSCs(pMSCs)能夠有效降低PD小鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，顯著緩解疾病。采用免疫組化技術(shù)檢測酪氨酸羥基化酶(TH)在紋狀體和黑質(zhì)區(qū)內(nèi)的表達(dá)水平，結(jié)果表明pMSCs能夠顯著提高黑質(zhì)區(qū)和紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的存活，如圖1c。同時，免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，pMSCs治療后小鼠腦黑質(zhì)和紋狀體區(qū)的酪氨酸羥化酶的表達(dá)水平有一定程度的回復(fù)(圖2)。這些結(jié)果表明，促炎因子(IFN-γ+TNF-α)預(yù)處理的人源MSCs能夠顯著緩解小鼠PD疾病。2、pMSCs對神經(jīng)細(xì)胞SH-Sy5y的神經(jīng)保護(hù)作用SH-Sy5y是人神經(jīng)瘤母細(xì)胞系，采用6-OHDA刺激可以作為PD體外細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)中，利用Transwell體系，檢測MSCs是否對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-Sy5y細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。結(jié)果表明，促炎因子(IFN-γ+TNF-α，終濃度分別為10ng/ml)預(yù)處理的MSCs能夠顯著提高SH-Sy5y細(xì)胞存活率，其培養(yǎng)上清也具有相似的作用效果。同時發(fā)現(xiàn)，促炎因子(IFN-γ+TNF-α，終濃度分別為10ng/ml)預(yù)處理的MSCs可以緩解6-OHDA誘導(dǎo)的SH-Sy5y細(xì)胞調(diào)亡。3、MSCs在PD小鼠腦組織內(nèi)的存活率低下本發(fā)明人采用病毒轉(zhuǎn)染的方法使MSCs過表達(dá)GFP蛋白，從而可以利用GFP進(jìn)行MSCs的標(biāo)記。隨后將GFP標(biāo)記的MSCs注射入小鼠的腦紋狀體區(qū)，在不同時間點(diǎn)觀察MSCs在PD小鼠腦內(nèi)的遷移和存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs大量聚集在注射部位即紋狀體區(qū)，在注射后7天，仍能觀察到一定數(shù)量的細(xì)胞，但數(shù)量已明顯減少，注射后14天在腦組織內(nèi)幾乎很難找到MSCs細(xì)胞，表明植入的人源MSCs能夠在小鼠腦內(nèi)短期存活，不具有明顯的遷移能力。這提示，MSCs在小鼠腦內(nèi)有限的遷移和存活能力有可能不足以分化成神經(jīng)元修復(fù)受損的神經(jīng)(圖3)。該實(shí)驗(yàn)排除了移植的MSCs在腦內(nèi)分化為神經(jīng)元進(jìn)而修復(fù)受損神經(jīng)的可能性，可以間接支持本發(fā)明中的MSCs的旁分泌的治療效果。實(shí)施例2、炎癥因子預(yù)處理的MSCs對PD小鼠氧化應(yīng)激的影響1、pMSCs移植顯著降低PD小鼠腦組織紋狀體區(qū)的氧化應(yīng)激反應(yīng)為了檢測pMSCs(制備方法同實(shí)施例1)對PD小鼠腦組織區(qū)氧化應(yīng)激水平的影響，本發(fā)明人提取了對照組和治療組PD小鼠的腦紋狀體的組織樣品，檢測樣品中總自由基包括ROS、RNS等的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射6-OHDA后，小鼠腦紋狀體區(qū)的ROS/RNS水平顯著提高，當(dāng)移植入pMSCs后，ROS/RNS的水平恢復(fù)到正常小鼠水平(圖4a)。同樣，本發(fā)明人也檢測了各組樣品中的一氧化氮(NO)的含量，結(jié)果與ROS/RNS的變化趨勢相似(圖4b)。這些結(jié)果表明，pMSCs移植顯著降低PD小鼠腦紋狀體區(qū)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。2、pMSCs移植顯著提高PD小鼠抗氧化應(yīng)激能力為了檢測pMSCs對PD小鼠腦組織區(qū)抗氧化應(yīng)激能力的影響，本發(fā)明人提取了對照組和治療組PD小鼠的腦紋狀體的組織樣品，檢測抗氧化應(yīng)激相關(guān)分子的含量或酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，治療后小鼠病灶部位的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的酶活力顯著提高，谷胱甘肽(GSH)的含量也明顯增加(圖5)。這些結(jié)果表明，pMSCs能夠顯著提高PD小鼠腦組織病灶部位的抗氧化應(yīng)激能力。3、pMSCs提高神經(jīng)細(xì)胞系SH-sy5y的抗氧化應(yīng)激能力體外實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人利用transwell培養(yǎng)體系，將SH-Sy5y與MSCs或pMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，在細(xì)胞共培養(yǎng)6小時后加入終濃度為50uM的6-OHDA培養(yǎng)18小時后，檢測SH-Sy5y的細(xì)胞活性以及胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平。結(jié)果顯示，pMSCs能夠顯著降低6-OHDA引起的SH-Sy5y胞內(nèi)活性氧(ROS)的累積(圖6a)，同時能夠顯著提高SH-sy5y細(xì)胞的SOD酶活，并且提高谷胱甘肽的含量(圖6b)。上述結(jié)果表明，pMSCs能夠提高神經(jīng)細(xì)胞SH-sy5y的抗氧化應(yīng)激能力。實(shí)施例3、炎癥因子預(yù)處理的MSCs通過IDO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用1、人源MSCs的Kynureninepathway(KP)的鑒定有證據(jù)表明，犬尿酸途徑(kynureninepathway，KP)是色氨酸代謝的主要路徑，其中，吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)是色氨酸分解代謝(犬尿氨酸途徑)中催化起始反應(yīng)的酶，并且是該過程的限速酶，將色氨酸轉(zhuǎn)化為N-formylkynurenine，隨后分解為一系列統(tǒng)稱為kynurenines的代謝產(chǎn)物，如圖7所示，主要包括犬尿酸(kynurenine，KYN)，犬尿喹啉酸(kynurenicacid，KYNA)，鄰氨基苯甲酸(anthranilicacid，AA)，3羥犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine，3HK)，3羥鄰氨苯甲酸(3-hydroxyanthranilicacid，3HAA)，喹啉酸(quinolinicacid，QUIN)以及2-吡啶甲酸picolinicacid(PIC)。其中，KYNA和QUIN在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，KYNA作為 NMDA受體的拮抗劑，具有神經(jīng)保護(hù)的作用。相反，QUIN是NMDA受體的激動劑，具有神經(jīng)毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，3HK和3HAA能夠產(chǎn)生大量的氧自由基(ROS)，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。QUIN是3-HK與3-HAA的下游代謝產(chǎn)物，這一分支的過度活化與很多神經(jīng)退行性疾病如帕金森，阿爾茲海默等的發(fā)生密切相關(guān)。已有研究人員在神經(jīng)退行性病患腦組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了KP代謝途徑的異常，尤其是KP代謝產(chǎn)物中KYNA和QUIN間的失衡。另有研究證明，將KYN注射入小鼠體內(nèi)，能夠緩解PD癥狀，這被認(rèn)為是KYN轉(zhuǎn)化為KYNA后發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用導(dǎo)致的。通常，KP途徑主要存在于巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，在炎癥因子或LPS的刺激下，IDO表達(dá)顯著上調(diào)，KP代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等生理作用。但對于MSCs，這一代謝途徑尚未被完全鑒定。本發(fā)明人首先利用realtime-PCR的分析方法檢測了MSCs的KP途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)情況，以人原代巨噬細(xì)胞作為陽性對照。結(jié)果如圖8a所示，在炎癥因子IFN-γ(終濃度10ng/ml)和TNF-α(終濃度10ng/ml)的刺激下，IDO1和KYNase表達(dá)明顯上調(diào)，KATI和KATII在有無因子刺激下均有一定程度的表達(dá)。相較于巨噬細(xì)胞，MSCs表達(dá)極低水平的KYNOHase和HAO，這提示人源MSCs很有可能缺失產(chǎn)生3HK和3HAA的代謝分支。接下來，本發(fā)明人利用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中各代謝產(chǎn)物的水平。結(jié)果如圖8b所示，MSCs在炎癥因子刺激下，產(chǎn)生大量的KYN，KYNA和AA，而相應(yīng)的3HAA和3HK則檢測不到。這表明，人源MSCs的KP途徑缺失產(chǎn)生神經(jīng)毒性的QUIN的代謝分支，相反，會產(chǎn)生大量具有神經(jīng)保護(hù)作用的代謝產(chǎn)物KYNA。提示介導(dǎo)了MSCs在小鼠PD上的緩解作用。2、pMSCs移植后PD小鼠腦組織病損部位KP代謝產(chǎn)物水平的變化如實(shí)施例1相同的方法對6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型小鼠移植pMSCs或MSCs細(xì)胞。提取對照組和治療組PD小鼠的腦黑質(zhì)和紋狀體的組織樣品，利用高效液相色譜-質(zhì)譜檢測KP的相關(guān)代謝產(chǎn)物水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植pMSCs后，小鼠腦紋狀體內(nèi)KYN的水平明顯提高，如圖9。3、pMSCs與神經(jīng)細(xì)胞SH-sy5y共培養(yǎng)后KP代謝產(chǎn)物水平的變化SH-sy5y與MSCs共培養(yǎng)體系及培養(yǎng)方法見實(shí)施例1(2)的方法。本發(fā)明人檢測了SH-sy5y與MSCs共培養(yǎng)體系中KP代謝產(chǎn)物的水平，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，加入pMSCs后，共培養(yǎng)體系內(nèi)的KYN，KYNA的水平顯著提高。而加入6-OHDA后，卻檢測不到AA。這有可能6-OHDA對負(fù)責(zé)產(chǎn)生AA的酶KYNase有抑制作用。另外，與之前結(jié)果相似，在細(xì)胞共培養(yǎng)上清中仍然檢測不到3HAA和3HK(圖10)。KYN和KYNA水平的顯著升高提示，pMSCs通過這兩個代謝產(chǎn)物發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。4、IDO敲除逆轉(zhuǎn)pMSCs對PD小鼠及神經(jīng)細(xì)胞SH-Sy5y的神經(jīng)保護(hù)作用為了驗(yàn)證炎癥因子(IFN-γ+TNF-α)預(yù)處理的MSCs是否通過高表達(dá)的IDO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，本發(fā)明人采用病毒轉(zhuǎn)染的方法將特異性針對IDO的siRNA(sc-45939-c，SantaCruzbiotechnology)以及對照siRNA(sc-108080，SantaCruzbiotechnology)轉(zhuǎn)入MSCs細(xì)胞中。結(jié)果如圖11所示，特異性針對IDO的siRNA可以顯著下調(diào)IDO的表達(dá)水平(圖11a)。高壓液相色譜-質(zhì)譜分析表明，轉(zhuǎn)入IDO特異siRNA的MSCs細(xì)胞(IDOKD)在炎癥因子的刺激下，與對照細(xì)胞相比，KYN、KYNA的水平顯著降低(圖11b)。將細(xì)胞移植入PD小鼠腦內(nèi)，通過動物行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，IDO基因敲低使MSCs細(xì)胞失去了緩解小鼠PD疾病的能力(圖11c)。將MSCs與神經(jīng)細(xì)胞Sh-sy5y共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IDO基因敲低的MSCs喪失了清除6-OHDA引起的氧自由基以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抵抗凋亡的作用(圖11d，e)。5、iNOS-/-鼠源MSCs過表達(dá)人源IDO后能夠顯著緩解小鼠帕金森疾病本發(fā)明人將鼠源MSCs細(xì)胞的iNOS基因置換成人的IDO基因，從而模擬人的MSCs，即將小鼠iNOS啟動子和人源IDO基因序列克隆到質(zhì)粒，使人IDO基因的表達(dá)受到小鼠iNOS啟動子的調(diào)控，然后將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到iNOS 基因缺失的小鼠MSCs細(xì)胞內(nèi)，從而得到“人源化”的MSCs(以下稱為mMSC-IDO)。在該細(xì)胞中，人IDO基因的表達(dá)受到小鼠iNOS基因啟動子的調(diào)控，從而達(dá)到模擬人MSCs的目的。當(dāng)mMSC-IDO受到炎癥因子IFN-γ(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)刺激后可以表達(dá)人的IDO(圖12a)。高效液相色譜-質(zhì)譜分析表明，在炎癥因子刺激下能夠產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物KYN和KYNA(圖12b)。將mMSC-IDO細(xì)胞及對照細(xì)胞移植入PD小鼠腦紋狀體區(qū)，通過動物行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照細(xì)胞相比，過表達(dá)IDO后mMSC-IDO細(xì)胞能夠顯著緩解小鼠PD疾病(圖12c)。上述結(jié)果證明，IDO及其代謝產(chǎn)物在介導(dǎo)MSCs的神經(jīng)保護(hù)中的關(guān)鍵作用。實(shí)施例4、KP代謝產(chǎn)物對小鼠PD疾病及神經(jīng)細(xì)胞的作用1、KYNA和KYN能夠顯著緩解小鼠PD疾病由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源MSCs由于KYN-OHase和3HAO表達(dá)量極低而導(dǎo)致其KP代謝途徑中缺失產(chǎn)生神經(jīng)毒性的QUIN的代謝分支。由于體內(nèi)的KYN在酶KATI和KATII的作用下會轉(zhuǎn)化為KYNA，因此，MSCs產(chǎn)生的KYN和KYNA會賦予其顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。事實(shí)上，本發(fā)明人對IDO的基因敲低以及過表達(dá)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了這一點(diǎn)。那么對于MSCs分泌出來的KYN、KYNA以及AA，哪個代謝產(chǎn)物介導(dǎo)了MSCs的體內(nèi)作用。為了解決上述問題，本發(fā)明人將代謝產(chǎn)物分別注入PD小鼠體內(nèi)，檢測其對PD疾病的影響。KYN及AA采取腹腔注射的方式，而KYNA由于不能穿越血腦屏障，本發(fā)明人采取腦紋狀體原位注射的方式。在疾病誘導(dǎo)第7天開始腹腔注射KYN及AA，結(jié)果如圖13a所示，KYN能夠顯著降低阿樸嗎啡誘導(dǎo)的PD小鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，AA沒有明顯效果。同樣在疾病誘導(dǎo)第7天腦紋狀體注射KYNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KYNA同樣能顯著緩解PD疾病，如圖13b。2、KYNA對神經(jīng)細(xì)胞系SH-sy5y的保護(hù)作用為了驗(yàn)證KYNA的神經(jīng)保護(hù)作用，本發(fā)明人將不同劑量的KYNA加入SH-sy5y培養(yǎng)液中，隨后加入6-OHDA(終濃度50μM)，利用CCK8檢測細(xì)胞 活性。結(jié)果如圖14所示，KYNA能夠顯著緩解6-OHDA對SH-sy5y的毒性作用，對其具有神經(jīng)保護(hù)作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3