本發(fā)明涉及一種生物實驗方法，尤其涉及一種枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細胞的方法。
背景技術：
晶狀體上皮細胞凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類型白內(nèi)障形成的細胞學基礎。晶狀體上皮細胞相當于晶狀體的外屏障，對晶狀體纖維起一定的保護作用，而且晶狀體上皮細胞擔負著晶狀體的生長、分化和損傷修復，在保持整個晶狀體透明性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起重要作用。已有研究證明晶狀體細胞在生長過程中易受到各種可避免或不可避免誘發(fā)因素的影響而發(fā)生晶狀體纖維將不再保持透明，繼而發(fā)生混濁,形成白內(nèi)障。晶狀體上皮細胞也是糖尿病性白內(nèi)障最早受累的細胞，當細胞處于高血糖外源性環(huán)境的刺激下，晶狀體上皮細胞凋亡與增殖失去平衡而發(fā)生細胞凋亡，晶狀體內(nèi)環(huán)境代謝失衡，最終引起白內(nèi)障的發(fā)生。
白內(nèi)障手術治療已日臻完善及廣泛應用，但仍然存在一定手術風險，因此尋找一種能治療及延緩白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的藥物是眼科一項重要的臨床及科學研究。白內(nèi)障的發(fā)生可能與遺傳、免疫因素及外傷、福射造成晶狀體正常的代謝失衡，發(fā)生晶狀體的混濁變性。由于其發(fā)病的多因性，但大概包括氧化應激、滲透應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等方面，枸杞菊花對晶狀體具有抗氧化、清除自由基、抗凋亡等藥理活性。但現(xiàn)有技術中，采用枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細胞的方法尚未見相關報道，因此，需要一種新方法誕生。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細胞的方法。
本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn)上述目的：
本發(fā)明包括以下步驟：
步驟一：原料選取：取寧夏枸杞10克，杭白菊5克；
步驟二：枸杞提取液的制備：選取無蛀蟲、無霉變的枸杞干果為原料，清洗晾干后，將每粒枸杞干果破碎成兩瓣，并置于加熱的容器(70℃-90℃)內(nèi)，之后向加熱的容器中加入枸杞干果，重量10倍的水(100ml)進行靜置浸泡5-8小時，然后，加熱煮沸至容器內(nèi)水的體積減少一半，之后停止加熱，過濾除渣，得到枸杞提取液，備用；
步驟三：菊花提取液的制備：選取菊花原材料，除去雜質(zhì)后，放入清水中進行振蕩清洗3-5min，撈出淋干后，置于菊花原材料重量50倍的95℃水中進行漂燙30min，之后，降溫至75-80℃浸泡40min，然后，過濾除渣，得到菊花提取液，備用；
步驟四：晶狀體細胞培養(yǎng)液的制備：按照體積比，取2-3份步驟一得到的枸杞提取液和1-2份步驟二得到的菊花提取液進行混合，之后，向混合液中加入干粉細胞培養(yǎng)基12.0g，至混合均勻，在室溫環(huán)境下進行0.22μm過濾除菌，之后，轉(zhuǎn)至于100ml的培養(yǎng)瓶中用于晶狀體細胞的培養(yǎng)；
步驟四：晶狀體細胞的培養(yǎng)：用上述制備得到的培養(yǎng)基，添加胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸鈉和青鏈霉素合劑等，并調(diào)整PH值為7.2-7.4，預熱備用，解凍晶狀體細胞于60cm培養(yǎng)皿預熱的培養(yǎng)基中，在飽和濕度、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜至貼壁，次日，換液繼續(xù)培養(yǎng)，等待細胞觀察及檢測。
進一步，所述步驟三中，枸杞提取液與菊花提取液的混合配比為2:1；所述步驟三中，適合晶狀體細胞的干粉培養(yǎng)基為12.0g的DMEM/F12進口培養(yǎng)基。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明是一種枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細胞的方法，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用不同配比枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體細胞，提高細胞增殖能力，減少氧化應激，降低細胞凋亡的細胞培養(yǎng)方法，可用于指導養(yǎng)肝明目用藥的理論基礎，具有推廣應用的價值。
具體實施方式
下面對本發(fā)明作進一步說明：
本發(fā)明包括以下步驟：
步驟一：原料選?。喝幭蔫坭?0克，杭白菊5克；
步驟二：枸杞提取液的制備：選取無蛀蟲、無霉變的枸杞干果為原料，清洗晾干后，將每粒枸杞干果破碎成兩瓣，并置于加熱的容器(70℃-90℃)內(nèi)，之后向加熱的容器中加入枸杞干果，重量10倍的水(100ml)進行靜置浸泡5-8小時，然后，加熱煮沸至容器內(nèi)水的體積減少一半，之后停止加熱，過濾除渣，得到枸杞提取液，備用；
步驟三：菊花提取液的制備：選取菊花原材料，除去雜質(zhì)后，放入清水中進行振蕩清洗3-5min，撈出淋干后，置于菊花原材料重量50倍的95℃水中進行漂燙30min，之后，降溫至75-80℃浸泡40min，然后，過濾除渣，得到菊花提取液，備用；
步驟四：晶狀體細胞培養(yǎng)液的制備：按照體積比，取2-3份步驟一得到的枸杞提取液和1-2份步驟二得到的菊花提取液進行混合，之后，向混合液中加入干粉細胞培養(yǎng)基12.0g，至混合均勻，在室溫環(huán)境下進行0.22μm過濾除菌，之后，轉(zhuǎn)至于100ml的培養(yǎng)瓶中用于晶狀體細胞的培養(yǎng)；
步驟四：晶狀體細胞的培養(yǎng)：用上述制備得到的培養(yǎng)基，添加胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸鈉和青鏈霉素合劑等，并調(diào)整PH值為7.2-7.4，預熱備用，解凍晶狀體細胞于60cm培養(yǎng)皿預熱的培養(yǎng)基中，在飽和濕度、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜至貼壁，次日，換液繼續(xù)培養(yǎng)，等待細胞觀察及檢測。
進一步，所述步驟三中，枸杞提取液與菊花提取液的混合配比為2:1；所述步驟三中，適合晶狀體細胞的干粉培養(yǎng)基為12.0g的DMEM/F12進口培養(yǎng)基。
實施例1：枸杞10g加100ml超純水浸提、除渣；菊花5g加50倍超純水浸提、除渣，將兩者混合，按照1:1混合過濾，再加入干粉培養(yǎng)基，待晶狀體細胞培養(yǎng)。
實施例2：枸杞10g加100ml超純水浸提、除渣；菊花5g加50倍超純水浸提、除渣，將按照體積比為2:1混合，過濾，再加入干粉培養(yǎng)基，待晶狀體細胞培養(yǎng)。
實施例3：枸杞10g加100ml超純水浸提、除渣；菊花5g加50倍超純水浸提、除渣，將按照體積比為1:2混合，過濾，再加入干粉培養(yǎng)基，待晶狀體細胞培養(yǎng)。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。