本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域、細胞免疫學(xué)及腫瘤免疫治療領(lǐng)域，涉及一種Tlr7a誘導(dǎo)增強型DC-NK細胞的制備方法和抗腫瘤過繼免疫治療應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是困擾人類健康的重大疾病，但由于其高度的復(fù)雜性、多樣性、可變性和異質(zhì)性，一直找不到一種理想的治療方法。針對腫瘤患者無法自主產(chǎn)生更有效的殺傷效應(yīng)細胞，科學(xué)家們發(fā)明了過繼性免疫療法。過繼性免疫療法是現(xiàn)今用于研究腫瘤治療的熱點，而且在臨床得到廣泛的應(yīng)用。

NK細胞即自然殺傷細胞主要表達CD3^-CD56⁺表型，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機體抗腫瘤、抗感染免疫的第一道防線。與T淋巴細胞不同的是，NK細胞不需要腫瘤特異性抗原識別就可以直接殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞。在臨床上，NK細胞對黑素瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膀胱癌和白血病等腫瘤治療有明顯療效。

樹突狀細胞(DCs)是唯一的最有效的抗原提呈細胞，可以有效激活T細胞。作為免疫反應(yīng)的發(fā)起者，DCs在介導(dǎo)免疫細胞抗腫瘤過程中起著重要作用，DC和NK細胞在抗惡性腫瘤的使用中有協(xié)同效應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有細胞技術(shù)的不足，通過優(yōu)化刺激DC-NK細胞培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，提供了一種Tlr7a(結(jié)構(gòu)式如下圖所示)誘導(dǎo)增強型DC-NK細胞的制備方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)DC-NK細胞培養(yǎng)后，細胞毒活性提高不顯著等問題。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.084(brs,1H),9.954(s,1H),6.486(s,2H),4.249(t,J＝3.60Hz,2H),3.693(t,J＝5.20Hz,2H),3.584(t,J＝3.60Hz,2H),3.266(s,3H),2.205(t,J＝6.00Hz,2H),1.844(t,J＝5.60Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.15,160.09,152.67,149.75,147.88,98.61,70.62,65.65,58.45,38.86,31.14,23.80.MS(ESI)calculated for C₁₂H₁₇N₅O₅,m/z[M+1]312.1230；found 334.1120(M+Na)⁺.

本發(fā)明所提供的人DC-NK細胞，是指以DC細胞為輔助，NK細胞為主效應(yīng)細胞，與K562細胞共培養(yǎng)18小時對腫瘤細胞殺傷活性可達90％左右。

為實現(xiàn)上述目的，設(shè)計一種增強DC-NK細胞活性的制備方法，包括如下步驟：

1)采集人的外周靜脈血，梯度離心獲得單個核細胞；

4)第15天收集DC-NK細胞。

2)分離DC細胞和NK細胞，加入一系列細胞因子和Tlr7a刺激，培養(yǎng)7～9天；

3)混合DC和NK細胞，Tlr7a誘導(dǎo)刺激共培養(yǎng)3～6天；

4)第15天收集DC-NK細胞。

作為優(yōu)選，所述步驟1)從患者的靜脈穿刺采集外周血，轉(zhuǎn)移至含有肝素鈉抗凝溶液的離心管中，混合均勻，進行離心，獲得血清和全血細胞，上層血漿滅活備用。

進一步地，所述步驟1)全血細胞用生理鹽水稀釋，淋巴分離液密度梯度離心分離單個核細胞，生理鹽水重懸單個核細胞，離心收集單個核細胞。

如權(quán)利要求2所述的一種Tlr7a誘導(dǎo)增強型DC-NK細胞的制備方法，其特征在于：所述步驟2)具體包括：將步驟1)中收集的單個核細胞重懸于含5～20％自體滅活血漿的RPMI-GT-T551^TM培養(yǎng)基等無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度(1～2)×10⁶/ml左右，37℃、5％的CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；于培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，分離貼壁細胞和上清細胞，貼壁細胞為DC細胞，加入含有Tlr7a、rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α的培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激培養(yǎng)，上清細胞為NK異質(zhì)性細胞群，加入含有Tlr7a、rhIFN-γ、rhIL-2、rhIL-1和CD3McAb的培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激培養(yǎng)，置于37℃、5％的CO₂恒溫培養(yǎng)箱中孵育；培養(yǎng)7～9天，流式分選NK細胞

如權(quán)利要求2所述的一種Tlr7a誘導(dǎo)增強型DC-NK細胞的制備方法，其特征在于：所述步驟2)具體包括：將步驟2)培養(yǎng)的DC和NK混合培養(yǎng)，共孵育3～6天，每2天補加含有IL-2、Tlr7a的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第15天，收集DC-NK細胞。

如權(quán)利要求2所述的一種Tlr7a誘導(dǎo)增強型DC-NK細胞的制備方法，其特征在于：所述加入的Tlr7a的濃度為0.05ug/ml～50ug/ml，rhGM-CSF為100～1000IU/ml、rhIL-4為100～1000IU/ml，rhTNF-α為10～200IU/ml，rhIFN-γ為100～1000IU/ml，rhIL-2為100～1000IU/ml，rhIL-1為100～1000IU/ml，CD3McAb為100～1000IU/ml。

本發(fā)明的目的是得到一種可以用于臨床的高效抗腫瘤過繼免疫活性細胞。

上述方法培養(yǎng)的DC-NK細胞與常規(guī)培養(yǎng)制備的DC-NK細胞相比，其對K562細胞的殺傷活性都明顯增加，體外實驗時殺瘤活性達到90％以上，明顯高于常規(guī)方法培養(yǎng)的DC-NK細胞。本方法可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的以及殺傷活性強的DC-NK細胞，同時也具有制備成本低廉、工序簡單、條件易控、對設(shè)備的要求較低、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢。本發(fā)明還提供了DC-NK細胞體外制備的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。通過本發(fā)明所制備的DC-NK細胞應(yīng)用可用于癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防等。

本發(fā)明是在腫瘤免疫治療中使用的一種Tlr7a誘導(dǎo)增強型DC-NK細胞的制備方法，使得NK細胞活性增加，制備出更有效的腫瘤殺傷性細胞，稱之為Tlr7a-DC-NK。經(jīng)過Tlr7a刺激的DC和NK細胞活化，共同培養(yǎng)，產(chǎn)生共協(xié)同殺傷作用，具有更好的殺瘤活性。

附圖說明

圖1：DC-NK和Tlr7a-DC-NK細胞增殖曲線圖。

圖2：采用CCK-8檢測試劑盒進行各組不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源DC-NK進行細胞毒性檢測(n＝3)。通過不同方式培養(yǎng)，在第15天取細胞通過CCK-8試劑盒進行細胞毒活性檢測。DC-NK組：指普通培養(yǎng)法培養(yǎng)的DC-NK細胞；Tlr7a-DC-NK組：指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方法。橫坐標：表示效靶細胞比值，E∶T＝2.5∶1、E∶T＝5∶1、E∶T＝10∶1分別表示效應(yīng)細胞與靶細胞的比值為2.5∶1、5∶1、10∶1。

具體實施方式

下面用實例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。

實施例1

本實施例1是分離獲得的PBMCs并進行培養(yǎng)。包括以下步驟：

從患者的靜脈穿刺采集患者外周血100ml，轉(zhuǎn)移至含有肝素鈉的抗凝管中，上下混合均勻，經(jīng)淋巴分離液密度梯度離心獲得單個核細胞。具體步驟為：將混合均勻的全血1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，吸取上層液體，即血漿，56℃滅活30分鐘后，2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，備用。用生理鹽水1:1稀釋沉淀的全血細胞，人淋巴細胞分離液和稀釋的全血細胞液按1∶2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分，1300轉(zhuǎn)/分，均離心7分鐘，即得到單個核細胞。

收集的單個核細胞重懸于含5～20％自體滅活血漿的RPMI-GT-T551^TM培養(yǎng)基等無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度(1～2)×10⁶/ml左右，37℃、5％的CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h；于培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，分離貼壁細胞和上清細胞，貼壁細胞為DC細胞，加入含有Tlr7a、rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α的培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激培養(yǎng)，上清細胞為NK異質(zhì)性細胞群，加入含有Tlr7a、rhIFN-γ、rhIL-2、rhIL-1和CD3McAb的培養(yǎng)基誘導(dǎo)刺激培養(yǎng)，置于37℃、5％的CO₂恒溫培養(yǎng)箱中孵育；培養(yǎng)9天，流式分選NK細胞。加入的Tlr7a的濃度為10ug/ml，rhGM-CSF為500IU/ml、rhIL-4為500IU/ml，rhTNF-α為50IU/ml，rhIFN-γ為300IU/ml，rhIL-2為1000IU/ml，rhIL-1為100IU/ml，CD3McAb為50ng/ml。

將培養(yǎng)的DC和NK混合培養(yǎng)，共孵育6天，每2天補加含有IL-2、Tlr7a的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第15天，收集DC-NK細胞。

對兩組細胞進行細胞計數(shù)檢測增殖能力。結(jié)果見圖1、表1。

表1：不同培養(yǎng)方式對外周血來源DC-NK細胞增殖能力影響(n＝3)

結(jié)果顯示，Tlr7a-DC-NK比DC-NK增殖能力顯著提高(P<0.05)。

對兩組細胞進行細胞毒活性檢測。包括以下步驟：

取培養(yǎng)第15天的DC-NK細胞，檢測對K562腫瘤細胞株的殺傷活性。

調(diào)整K562的細胞密度為5×10⁴/孔，96孔板，每孔200ul，分別按1:2.5、1:5、1:10的比例與各組DC-NK細胞混合，各濃度均設(shè)置3復(fù)孔，同時設(shè)置單獨靶細胞(腫瘤細胞)對照、單獨效應(yīng)細胞(DC-NK細胞)對照和單獨培養(yǎng)基空白對照。

置于37℃、5％C0₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18小時后，每孔加入20ul的CCK-8溶液，再培養(yǎng)4h，然后用酶標儀于450nm波長處測定吸光度(OD)值。

根據(jù)公式：殺瘤率(％)＝[1-(實驗組OD值-效應(yīng)細胞組OD值)]/(效應(yīng)細胞組OD值)×100％，計算殺瘤效率。其中，公式中各OD值均為減去空白對照組OD值后的值。結(jié)果見圖2、表2。

表2：不同培養(yǎng)方式對外周血來源DC-NK細胞毒活性影響(n＝3)

結(jié)果顯示，在2.5:1效靶比之下，兩組無顯著差異，在5:1和10:1效靶比之下，Tlr7a-DC-NK比DC-NK組的殺傷活性均顯著提高(P<0.05)。

結(jié)果說明，DC-NK細胞經(jīng)過改進的方案誘導(dǎo)后，其殺傷性細胞的增殖能力和細胞毒活性顯著提高。本方法可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的以及殺傷活性更強的DC-NK細胞，同時具有制備成本低廉、工序簡單、條件易控、對設(shè)備的要求較低、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢。通過本發(fā)明所制備的DC-NK細胞(Tlr7a-DC-NK)應(yīng)用可用于癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防，有更好的治療優(yōu)勢和臨床應(yīng)用前景。