本發(fā)明涉及一種基于干細(xì)胞的生物技術(shù)，是一種簡(jiǎn)便的用于分離間充質(zhì)干細(xì)胞的線粒體的方法。

背景技術(shù)：

線粒體是細(xì)胞中重要的一種細(xì)胞器，是真核細(xì)胞特有的，存在于絕大多數(shù)活細(xì)胞中，負(fù)責(zé)能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中的能源物質(zhì)―脂肪、糖、部分氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過(guò)偶聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。研究線粒體內(nèi)外膜，呼吸鏈酶及線粒體DNA等成分的結(jié)構(gòu)、功能及理化性質(zhì)已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要課題。近年來(lái)的研究顯示，無(wú)論是正常細(xì)胞的衰老進(jìn)程，還是腫瘤細(xì)胞的癌變，或者干細(xì)胞的增殖、分化，都與線粒體密切相關(guān)。人們通常認(rèn)為，線粒體大量存在于代謝旺盛的細(xì)胞中，如動(dòng)物的心肌、肝、腎等細(xì)胞，大量制備線粒體就是從這些器官組織及細(xì)胞中提取。

隨著干細(xì)胞生物學(xué)及線粒體研究的迅速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)線粒體（mitochondria）在干細(xì)胞的增殖、分化、老化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。近幾年，人們分離具有活性的干細(xì)胞線粒體，用于線粒體的體內(nèi)移植（cell-free transplantation），治療遺傳性疾病或者損傷性疾病。這些對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是要在離體的線粒體上進(jìn)行的。

隨著線粒體研究的深入發(fā)展，分離線粒體的方法不斷改進(jìn)。然而，人們主要研究心、肝、腦等主要耗能的器官組織的線粒體，因此分離這些組織和細(xì)胞的線粒體的方法較為成熟, 對(duì)于干細(xì)胞線粒體的研究較少, 其提取方法不很成熟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：在以前研究的基礎(chǔ)上提供一種更為簡(jiǎn)便、有效的適用于干細(xì)胞的線粒體分離方法。

本發(fā)明通過(guò)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的線粒體。經(jīng)過(guò)詹納斯綠B（Janus green B）染法或者M(jìn)itoTracker Red熒光染色方法，證實(shí)本方法獲得的絕大部分線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有較好的ATP活性，可以用于干細(xì)胞線粒體生理功能的測(cè)定，也可以用于細(xì)胞移植治療。本發(fā)明提供的干細(xì)胞線粒體分離方案，分離獲得的線粒體純度高，活性好；方法簡(jiǎn)便、不需要研磨，為一個(gè)簡(jiǎn)單、有效的實(shí)用方法。

本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種適用于干細(xì)胞的線粒體分離方法，該方法包括如下步驟：

1)將傳代擴(kuò)增（P₁-P₃代）的間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記鑒定，向骨、軟骨和脂肪分化能力鑒定；

2)0.25%胰酶消化，離心850g，5min收集細(xì)胞；用PBS重懸清洗離心數(shù)次；

3)采用細(xì)胞線粒體提取試劑盒(Mitochondria Isolation Kit, #89874，ThermoFisher Scientific），根據(jù)試劑盒的操作手冊(cè)，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，以確定要配制的線粒體提取液的用量；碎冰上配制線粒體提取液：A液是裂解液，C是終止反應(yīng)液，臨用前在A液中加入PMSF（1mmol/L ，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；

4)取A液重懸PBS清洗過(guò)后的細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移到EP管中（方便渦旋），渦旋，碎冰上靜置2 min，重?cái)?shù)次；然后，加入C液中止裂解，用移液槍頭輕柔的混合均勻（勿渦旋），立即離心，管里的沉淀留待第5步操作，上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，離心；離心后可以見(jiàn)到白色的沉淀（即線粒體），棄上清，用C液重懸沉淀；

5)第4步中第一次離心下來(lái)的EP管中的沉淀，再用A液重懸，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，重復(fù)第4步的操作；

6)將第4步和第5步的結(jié)果混合放在一起，離心，離心后棄上清，C液重懸管底的沉淀（即線粒體），馬上使用或者-80度保存。

在采用上述技術(shù)方案的同時(shí)，本發(fā)明還可以采用或者組合采用以下進(jìn)一步的技術(shù)方案：

所述分離方法的目的是分離離體培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的線粒體。

用于分離的原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，是在傳代P₁-P₃之間。

用于分離的原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，自P₀代開(kāi)始一直用10% FBS低糖DMEM(葡萄糖含量為1100毫克/升)培養(yǎng)基，在37℃, 5%CO₂及一定濕度條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，在線粒體分離前48小時(shí)，更換為10% FBS高糖DMEM（葡萄糖含量為4500毫克/升），以促進(jìn)線粒體的生成。

本方案適用于其他各種干細(xì)胞的線粒體分離，包括胚胎來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞等其他各種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本方案分離得到的線粒體，可以用于線粒體移植，作為無(wú)細(xì)胞治療策略，可用于神經(jīng)、心臟、肝臟、腎臟等組織器官損傷的修復(fù)再生。

本方案分離得到的線粒體，可以用于線粒體生理病理功能的應(yīng)用檢測(cè)。

本方案分離得到的線粒體，也可以被線粒體裂解液或其它適當(dāng)裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western Blot、雙向電泳等蛋白分析。

本發(fā)明的有益效果是：

1)適用于間充質(zhì)干細(xì)胞分離獲得線粒體；

2)分離獲得的線粒體純度高（>97%）；

3)分離獲得的線粒體活性好；

4)方法簡(jiǎn)便、不需要研磨。

附圖說(shuō)明

圖1是采用高糖和低糖培養(yǎng)基處理48h后BMSCs線粒體生成的對(duì)比圖。

圖2是損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的耗氧率指標(biāo)對(duì)照?qǐng)D。增加了本發(fā)明分離所得線粒體以后，損傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的耗氧率明顯升高。

圖3是損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的細(xì)胞外酸化率指標(biāo)對(duì)照?qǐng)D。細(xì)胞外酸化率反應(yīng)細(xì)胞外產(chǎn)酸能力間接顯示糖酵解能力，從圖中可以顯然看出，增加了本發(fā)明分離所得的線粒體以后，細(xì)胞外酸化率明顯下降。

圖4是氧糖剝奪損傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的氧耗率與酸化率比值。如圖所示，損傷神經(jīng)元的數(shù)據(jù)偏在左下角，說(shuō)明是無(wú)氧糖酵解的能量代謝特征，但是增加了本發(fā)明分離所得的線粒體以后，數(shù)據(jù)向右上角移動(dòng)，表明氧化磷酸化程度增加。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的線粒體的分離。

采用本實(shí)施例的方法分離來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具體包括以下步驟：

1)將傳代擴(kuò)增（P₁-P₃代）的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記鑒定，向骨、軟骨和脂肪分化能力鑒定。

2)2×10⁷個(gè)（BMSCs），0.25%胰酶消化，離心850g，5min收集細(xì)胞；用PBS重懸清洗離心2次。

3)采用細(xì)胞線粒體提取試劑盒(Mitochondria Isolation Kit, #89874，ThermoFisher Scientific），根據(jù)操作手冊(cè)，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，以確定要配制的線粒體提取液的用量。冰上配制線粒體提取液：A液是裂解液，C是終止反應(yīng)液。臨用前在A液中以1:100的比例加入PMSF（2ml A液 +20 μl PMSF）。

4)取A液2 ml重懸PBS清洗過(guò)后的細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移到7 ml EP管中（方便渦旋），渦旋30 S，冰浴精確放置2 min（不要超過(guò)），重復(fù)3數(shù)次；然后，加入2 ml C液中止裂解，用移液槍頭輕柔的混合均勻（勿渦旋）。分裝到4個(gè)1.5 ml的EP管中，每管1 ml，立即離心（2000g，10min），每管的沉淀留待第5步操作，上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml EP管中，離心（12000 g，10 min）；離心后可以見(jiàn)到白色的沉淀（即線粒體），棄上清，用C液重懸沉淀（200 μl/管）。

5)第4步中第一次離心下來(lái)的4個(gè)1.5 ml EP管中的沉淀，再用A液總共2 ml重懸，轉(zhuǎn)移至7 ml EP管中，重復(fù)第4步的操作。

6)將第4步和第5步兩次的結(jié)果放在一起，離心（12000g，10min），離心后棄上清，200 μl C液重懸，馬上使用或者-80度保存。

實(shí)施例2：離體培養(yǎng)的BMSCs線粒體生成（mitochondria mass）的測(cè)定。

1×10⁴ BMSCs線粒體種植于黑色底透的96孔板（Corning）。一組細(xì)胞（n=42），用10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)48h。另外一組細(xì)胞（n=42），用10%FBS高糖DMEM 培養(yǎng)48h。然后加入200nM MitoTrack red (Invitrogen)在培養(yǎng)基中用于染色和標(biāo)記線粒體。先在37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)染色20min，然后PSB漂流3次，每次10min，最后用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)紅色熒光強(qiáng)度。高糖培養(yǎng)基48h培養(yǎng)的BMSCs的熒光強(qiáng)度為281.3±15.03，顯著高于低糖培養(yǎng)基BMSCs的熒光強(qiáng)度202.7±12.37，說(shuō)明高糖處理顯著增加了線粒體的生成。

實(shí)施例3：線粒體ATP含量測(cè)定。

采用碧云天ATP測(cè)定試劑盒，將ATP測(cè)定試劑平衡至室溫后，取100μl加入96孔黑色底透板上，再加入新鮮提取的線粒體10μl，震蕩30 S，靜置5min，立即上機(jī)(Glomaxtm96 MicroplateLuminometer)測(cè)定。線粒體蛋白的定量測(cè)定，按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。取試劑盒中的A液和B液按50：1的比例混勻，在酶標(biāo)板中加入待測(cè)樣品加2μl待測(cè)樣本，再加18μl PBS，再加入200μl BCA孵育液，混勻后，37℃金屬浴30min。酶標(biāo)儀562nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔的吸光度值，再計(jì)算出樣品的蛋白濃度。然后根據(jù)ATP與蛋白的量，計(jì)算出單位蛋白的ATP含量。結(jié)果顯示，1×10⁶ BMSCs分離獲得的線粒體蛋白量為100±50μg，ATP的含量為12±5nmol/mg protein。

實(shí)施例4：干細(xì)胞線粒體改善氧糖剝奪(OGD)神經(jīng)元的能量代謝特征。

采用海馬細(xì)胞能量代謝實(shí)時(shí)測(cè)定儀XF96（Seahorse XF Extracellular Flux Analyzers），檢測(cè)VSC4.1運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的有氧代謝（氧化磷酸化）的指標(biāo)耗氧率(OCR)，糖酵解的指標(biāo)酸化率（ECAR），以及OCR/ECAR情況。1×10⁴ VSC4.1 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元種植于96孔板中，先給予OGD(4h)損傷處理，然后分兩組：一組每孔加入新鮮分離的5μg線粒體 (n=8)，一組每孔不加線粒體(n=8)。圖2結(jié)果顯示，線粒體顯著改善了損傷神經(jīng)元的能量代謝特征，使得損傷神經(jīng)元從無(wú)氧糖酵解方式向有氧代謝的氧化磷酸化方式方向轉(zhuǎn)變。